PT2147096E

PT2147096E - Polipéptidos do factor vii modificados e suas utilizações

Info

Publication number: PT2147096E
Application number: PT87428520T
Authority: PT
Inventors: Edwin L Madison; Christopher D Thanos; Sandra Waugh Ruggles; Shaun Coughlin
Original assignee: Catalyst Biosciences Inc
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2015-07-21
Also published as: ECSP099735A; RU2009141510A; NZ593611A; JP2016155836A; JP2014042523A; CO6231052A2; KR20100016462A; PL2147096T3; NI200900187A; MX2009010997A; KR20150067772A; US20100166729A9; HK1134520A1; ZA201109181B; UA101155C2; US20090098103A1; WO2008127702A3; JP2010523150A; NZ579985A; SG174077A1

Description

DESCRIÇÃO "Polipéptidos do factor VII modificados e suas utilizações"

CAMPO DO INVENTO São disponibilizadas proteínas terapêuticas modificadas. Em particular, são disponibilizados polipéptidos do factor VII modificados, que incluem o factor Vila e outras formas do factor VII, e suas utilizações.

ANTECEDENTES A hemostasia consiste no processo fisiológico complexo que conduz à cessação da hemorragia. As plaquetas, as proteínas plasmáticas, os vasos sanguíneos e as células endoteliais são os três componentes deste processo que desempenham um papel importante nos eventos que ocorrem imediatamente após uma lesão dos tecidos e que, em circunstâncias normais, resultam na formação rápida de um coágulo. Central neste processo é a cascata de coagulação, uma série de eventos proteolíticos em que determinadas proteínas plasmáticas (ou factores de coagulação) são activadas sequencialmente numa "cascata" por outro factor de coagulação previamente activado, conduzindo à rápida geração de trombina. As grandes quantidades de trombina produzidas nesta cascata actuam, em seguida, para clivar o fibrinogénio nos péptidos de fibrina que são necessários para a formação de coágulos.

Os factores de coagulação circulam como zimogénios de cadeia única inactivos e são activados mediante clivagem numa ou mais posições, para gerar uma forma activada da proteína com duas cadeias. 0 factor VII (FVII), uma proteína plasmática dependente da vitamina K, circula inicialmente no sangue como um zimogénio. 0 zimogénio do FVII é activado através da clivagem proteolítica num único local, Arg152-Ile153, resultando numa protease com duas cadeias unidas por meio de uma ligação dissulfureto única (FVIIa). 0 FVIIa liga-se ao seu cofactor, o factor tecidual (TF), para formar um complexo em que o FVIIa pode activar eficazmente o factor X (FX) em FXa, iniciando, desta forma, a série de eventos que resultam na formação da fibrina e na hemostasia.

Embora na maioria dos casos se atinja uma hemostasia normal, os defeitos no processo podem conduzir a perturbações hemorrágicas nas quais o tempo necessário para a formação de coágulos é prolongado. Tais perturbações podem ser congénitas ou adquiridas. Por exemplo, a hemofilia A e B são doenças hereditárias caracterizadas por deficiências no factor VIII (FVIII) e no factor IX (FIX), respectivamente. A terapêutica substitutiva é o tratamento tradicional para a hemofilia A e B e envolve a administração intravenosa de FVIII ou FIX, quer preparados a partir do plasma humano quer como proteínas recombinantes. Em muitos casos, contudo, os doentes desenvolvem anticorpos (também conhecidos como inibidores) contra as proteínas infundidas, o que reduz ou anula a eficácia do tratamento. 0 FVIIa recombinante (Novoseven®) foi aprovado para o tratamento de doentes com hemofilia A ou B que possuem inibidores para o FVIII ou o FIX, sendo também utilizado para parar episódios hemorrágicos ou prevenir sangramentos associados a traumatismos e/ou cirurgias. 0 FVIIa recombinante também foi aprovado para o tratamento de doentes com deficiência congénita do FVII e está a ser cada vez mais usado de formas que não vêm descritas na bula, tal como no tratamento de hemorragias associadas a outras perturbações hemostáticas congénitas ou adquiridas, traumatismos e cirurgias em doentes não-hemofílicos. A utilização do FVIIa recombinante para promover a formação de coágulos sublinha a sua importância crescente como agente terapêutico. A terapia com FVIIa deixa uma necessidade médica significativa por satisfazer. Por exemplo, com base em dados de ensaios clínicos, é necessária uma média de 3 doses de FVIIa ao longo de um período de tempo de 6 horas ou mais para controlar episódios hemorrágicos agudos em doentes hemofílicos. São necessárias variantes mais eficazes do FVIIa para reduzir estes requisitos. Assim, entre os objectivos destes pedido, um objectivo é disponibilizar polipéptidos do FVII modificados que são concebidos para terem propriedades terapêuticas melhoradas. WO 2004/083661 disponibiliza variantes do FVII ou FVIIa compreendendo pelo menos uma modificação de aminoácidos na posição 196, 237 ou 341 em relação ao hFVII ou hFVIIa. As variantes apresentam maior actividade coagulante, isto é, um tempo de coagulação reduzido, em comparação com o rhFVIIa. WO 2004/111242 fornece variantes do domínio Gla do factor VII humano ou do factor Vila humano, compreendendo 1-15 modificações de aminoácidos em relação ao factor VII humano ou ao factor Vila humano, em gue um resíduo de aminoácido hidrofóbico foi introduzido por substituição na posição 34, ou possuindo uma substituição de aminoácidos na posição 36, ou possuindo substituições de aminoácidos nas posições 10 e 32 e pelo menos uma substituição de aminoácidos adicional numa posição seleccionada entre as posições 74, 77 e 116.

SUMÁRIO

Numa primeira concretização, o invento disponibiliza um polipéptido do factor VII (FVII) modificado compreendendo: um domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste para efectuar uma ligação aos f osf olípidos, por meio do gual o polipéptido do FVII modificado apresenta uma afinidade acrescida para os fosfolípidos ou uma ligação acrescida aos fosfolípidos em comparação com um polipéptido do FVII não modificado gue não contém o domínio Gla heterólogo, em gue: a porção suficiente contém 30 ou mais aminoácidos contíguos do domínio Gla heterólogo e o domínio Gla heterólogo é seleccionado entre um domínio Gla presente no factor IX (FIX), no factor X (FX), na protrombina, na proteína C, na proteína S, na osteocalcina, na proteína 6 específica da paragem do crescimento (Gas6) e na proteína Z; e uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais gue aumentam a resistência à antitrombina III (AT-III), aumentam a afinidade para o factor tecidual (TF), aumentam a actividade intrínseca, aumentam a actividade coagulante ou catalítica dependente do TF, aumentam a actividade coagulante, modificam a conformação do polipéptido para alterar o carácter zimogénico, aumentam a actividade catalítica ou coagulante desviando o eguilíbrio entre as conformações do FVIIa fortemente activas e menos activas no sentido das conformações fortemente activas, aumentam a resistência às proteases, diminuem a glicosilação, aumentam a glicosilação, reduzem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade e/ou facilitam a ligação de grupos químicos.

Numa concretização adicional, o invento proporciona uma molécula de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido do FVII modificado deste tipo, um vector compreendendo tal nucleótido e uma célula compreendendo um vector deste tipo.

Numa concretização adicional, o invento fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma concentração ou uma quantidade terapeuticamente eficaz deste polipéptido do FVII modificado, desta molécula de ácidos nucleicos, deste vector ou desta célula, num veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa concretização adicional, o invento disponibiliza um polipéptido do FVII modificado deste tipo para utilizar no tratamento de uma doença ou de uma afecção que é tratada através da administração de FVII ou de um pró-coagulante.

Numa concretização adicional, o invento disponibiliza a utilização de uma tal composição farmacêutica na preparação de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença ou de uma afecção que é tratada através da administração de FVII ou de um pró-coagulante. São aqui disponibilizados polipéptidos do factor VII (FVII) modificados. Em particular, são aqui disponibilizados polipéptidos do FVII modificados que apresentam actividades pró-coagulantes. Os polipéptidos do FVII são modificados na respectiva sequência primária em comparação com um polipéptido do FVII não modificado e podem incluir inserções, deleções e substituições de aminoácidos. Os polipéptidos do FVII modificados aqui fornecidos incluem polipéptidos do FVII que apresentam uma resistência acrescida aos efeitos inibitórios do inibidor da via do factor tecidual (TFPI de Tissue Factor Pathway Inhibitor), uma resistência acrescida aos efeitos inibitórios da antitrombina III (AT-III), uma menor ligação de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida, uma actividade catalítica acrescida na presença e/ou na ausência de TF e/ou uma ligação acrescida às plaquetas activadas. Os polipéptidos do FVII modificados podem conter qualquer combinação das modificações aqui fornecidas, por meio das quais uma ou mais actividades ou propriedades do polipéptido são modificadas em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Normalmente, o polipéptido do FVII modificado retém a actividade pró-coagulante. São aqui também disponibilizadas moléculas de ácidos nucleicos, vectores e células que codificam/expressam os polipéptidos do FVII modificados. Composições farmacêuticas, artigos de manufactura, kits e métodos de tratamento são igualmente aqui disponibilizados. Os polipéptidos do FVII incluem variantes alélicas e variantes de espécie, bem como polipéptidos e outras variantes que possuem modificações que afectam outras actividades e/ou propriedades. Os fragmentos activos dos polipéptidos do FVII que incluem uma modificação aqui disponibilizada estão também incluídos. Os polipéptidos exemplificativos de polipéptidos do FVII são aqueles que incluem a sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO:3, bem como suas variantes possuindo uma identidade de sequência de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais com aquela sequência.

Os polipéptidos do factor VII (FVII) são modificados na respectiva sequência primária em comparação com um polipéptido do FVII não modificado e podem incluir inserções, deleções e substituições de aminoácidos. Os polipéptidos do FVII modificados aqui fornecidos incluem polipéptidos do FVII que apresentam uma resistência acrescida aos efeitos inibitórios do TFPI, uma resistência acrescida aos efeitos inibitórios da AT-III, uma menor ligação de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida, uma actividade catalítica acrescida na presença e/ou na ausência de TF (factor tecidual) e/ou uma ligação acrescida às plaquetas activadas. Os polipéptidos do FVII modificados podem conter qualquer combinação das modificações aqui fornecidas, por meio das quais uma ou mais actividades ou propriedades do polipéptido são modificadas em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Os polipéptidos do FVII podem incluir outras modificações que alteram outras propriedades e/ou actividades. Normalmente, o polipéptido do FVII modificado retém a actividade pró-coagulante. São aqui também disponibilizadas moléculas de ácidos nucleicos, vectores e células que codificam/expressam os polipéptidos do FVII modificados. Composições farmacêuticas, artiqos de manufactura, kits e métodos de tratamento são igualmente aqui disponibilizados.

Em particular, são disponibilizados polipéptidos do factor VII (FVII) modificados, suas variantes alélicas e de espécie, fragmentos activos ou outras suas variantes. São aqui disponibilizados polipéptidos do FVII, incluindo suas variantes alélicas e de espécie ou seus fragmentos activos, que contêm uma modificação que está numa posição correspondente à posição D196, K197 ou K199 num polipéptido do FVII com uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO: 3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido do FVII, incluindo suas variantes alélicas e de espécie, fragmentos activos e outros polipéptidos do FVII modificados em termos de outras actividades ou propriedades. Os polipéptidos do FVII contêm pelo menos uma modificação numa posição correspondente à posição D196, K197 ou K199 num polipéptido do FVII contendo uma sequência de aminoácidos conforme ilustrada na SEQ ID NO:3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido do FVII. A modificação é uma inserção de e/ou substituição por um aminoácido hidrofóbico ou ácido seleccionado entre Vai (V), Leu (L) , lie (I), Phe (F) , Trp (W) , Met (M) , Tyr (Y) , Cys (C) , Asp (D) e Glu (E) . Quando é disponibilizado um fragmento activo, o fragmento activo inclui esta modificação. Por exemplo, são disponibilizados polipéptidos do factor VII (FVII) modificados, suas variantes alélicas e de espécie, fragmentos activos ou outras suas variantes que também incluem uma substituição seleccionada entre D196F, D196W, D196L, D196I, D196Y, K197E, K197D, K197L, K197M, Kl 971, K197V, K197F, K197W, K199D, K199E e K197Y.

Adicionalmente, os polipéptidos do FVII modificados que são disponibilizados podem conter uma modificação adicional, incluindo uma substituição, inserção ou deleção de aminoácidos, noutra posição do polipéptido do FVII. Em alguns exemplos, a modificação adicional é uma substituição de aminoácidos numa posição correspondente a uma posição seleccionada entre D196, K197, K199, G237, T239, R290 e K341, em que a primeira modificação e a segunda modificação dão-se ao nível de aminoácidos diferentes. Estas modificações podem incluir, embora não estejam limitadas a elas, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D e K341Q. Outros exemplos de modificações que são inserções de aminoácidos incluem, embora não estejam limitados a elas, quaisquer das seguintes inserções: G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, Dl96K197insK, Dl96K197insR, Dl 96K197insY, Dl 9 6K197insW, D196K197insA, Dl96K197insM, Kl 971198insE, Kl 97119 8 insY, K197I198insA e K197I198insS. Outros polipéptidos do FVII modificados exemplificativos incluem as seguintes modificações: D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, Dl 96R/K197M/K199E, D196R/K197M/ K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, K196V/K197E, K197E/K341Q, K197L/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q ou Kl97E/K199E/K341Q. São igualmente disponibilizados polipéptidos do FVII modificados, incluindo suas variantes alélicas e de espécie, fragmentos activos ou outras suas variantes, que também podem conter modificações de aminoácidos correspondentes a qualquer uma ou mais de uma das modificações D196R, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197E, K197D, K197L, K197M, K197M, Kl 971, K197V, K197F, K197W, K199D, K199E, G237W, G237I, G237V, R290M, R290V, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, Dl 9 6K197insK, D196K197insR, Dl96K197insY, Dl 96K197insW, Dl 9 6K197insA, D196K197insM, Kl 971198insE, Kl 971198insY, K197I198insA ou K197I198insS num polipéptido do FVII possuindo uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO:3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido do FVII. Adicionalmente, estes polipéptidos do FVII modificados podem conter uma modificação adicional, incluindo uma substituição, inserção ou deleção de aminoácidos, noutra posição do polipéptido do FVII. Em alguns exemplos, a modificação adicional pode ser uma substituição de aminoácidos numa posição correspondente a uma posição seleccionada entre D196, K197, K199, G237, T239, R290 e K341, em que a modificação adicional está numa posição diferente da primeira modificação. Por exemplo, o polipéptido do FVII modificado pode conter adicionalmente uma substituição de aminoácidos seleccionada entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, Kl 971, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D e K341Q. Polipéptidos exemplificativos deste polipéptido do FVII modificado são aqueles que incluem modificações seleccionadas entre D196R/R290E, D196R/R290D, D196R/K197E/ K199E, D196K/K197E/K199E, D196E/K197E/K199E/R290E, D196R/ K197M/K199E, Dl 96R/K197M/K199E/R29OE, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, K197L/K341Q, G237V/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, K197E/K199E/K341Q e K196V/K197E.

Em alguns casos, um polipéptido do factor VII (FVII) modificado, incluindo suas variantes alélicas e de espécie, seus fragmentos activos ou outras suas variantes, pode incluir duas ou mais modificações num polipéptido do FVII, em que pelo menos duas das modificações de aminoácidos correspondem a D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, Kl 971, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341 R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, Dl96K197insK, Dl96K197insR, Dl 9 6K197insY, D196K197insW, Dl96K197insA, Dl 96K197insM, Kl 97119 8 insE, Kl 971198insY, K197I198insA ou K197I198insS num polipéptido do FVII possuindo ou incluindo uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID N0:3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido do FVII. 0 polipéptido pode incluir mais de duas modificações, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 modificações.

Exemplos destes polipéptidos são os polipéptidos do FVII que incluem modificações seleccionadas entre D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, Dl 96R/K197E/K199E, D196K/K197E/ K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, Dl 96R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, D196V/K197E, K197E/K341Q, K197L/K341Q, G237V/K341Q, Kl97E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, Kl97E/K199E/K341Q e Kl97E/G237V/M298Q.

Qualquer um dos polipéptidos do FVII modificados referidos acima pode apresentar uma resistência acrescida ao inibidor da via do factor tecidual (TFPI) em comparação com o polipéptido do FVII não modificado. Em alguns exemplos, o polipéptido do FVII modificado apresenta uma resistência ao TFPI de pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais. Adicionalmente, estes polipéptidos do FVII modificados também podem conter um domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste para efectuar uma ligação aos fosfolípidos. São aqui também disponibilizados polipéptidos do FVII modificados que contêm um domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste, por exemplo 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais do domínio Gla heterólogo, para efectuar uma ligação aos fosfolípidos. Todos os polipéptidos do FVII modificados referidos acima podem também incluir uma troca do domínio Gla, incluindo as trocas do domínio Gla aqui exemplificadas e descritas.

Um domínio Gla heterólogo pode ser seleccionado entre os domínios Gla do factor IX (FIX) , do factor X (FX) , da protrombina, da proteína C, da proteína S, da osteocalcina, da proteína Gla da matriz, da proteína 6 específica da paragem do crescimento (Gas6) ou da proteína Z. Em alguns exemplos, o domínio Gla heterólogo no polipéptido do FVII modificado aqui fornecido possui uma sequência de aminoácidos ilustrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-115, 117 e 118, ou uma porção suficiente desta para efectuar uma ligação aos fosfolípidos. As modificações no polipéptido do FVII podem ser realizadas por remoção da totalidade ou de uma parte contígua do domínio Gla nativo do FVII, que pode incluir os aminoácidos 1-45 num polipéptido do FVII possuindo ou incluindo uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO:3, ou resíduos correspondentes num polipéptido do FVII, e substituição pelo domínio Gla heterólogo, ou por uma porção suficiente deste para efectuar uma ligação aos fosfolípidos, por exemplo para aumentá-la. Tais modificações podem resultar na apresentação por parte do polipéptido do FVII modificado de uma ligação acrescida aos fosfolípidos em comparação com o polipéptido do FVII não modificado. Por exemplo, o polipéptido do FVII modificado pode apresentar um acréscimo da ligação aos fosfolípidos de pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais.

Os polipéptidos do FVII modificados podem ter a totalidade ou uma parte contígua do domínio Gla nativo do FVII removida e substituída pelo domínio Gla heterólogo, ou por uma porção suficiente deste para efectuar uma ligação aos fosfolípidos. Exemplos destes polipéptidos são aqueles em que o domínio Gla nativo do FVII inclui os aminoácidos 1-45 num polipéptido do FVII possuindo ou incluindo uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO:3, ou resíduos correspondentes num polipéptido do FVII. As modificações do domínio Gla incluem, embora não estejam limitadas a estas, as modificações seleccionadas entre Gla Swap FIX, Gla Swap FX, Gla Swap Prot C, Gla Swap Prot S e Gla Swap Thrombin.

Em virtude de uma troca do domínio Gla, o polipéptido do FVII modificado pode apresentar uma ligação acrescida aos fosfolípidos. Este aumento pode resultar numa ligação acrescida aos fosfolípidos de pelo menos ou cerca de 0,5%; 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais.

Os polipéptidos do FVII modificados contendo domínios Gla heterólogos podem conter modificações adicionais em posições que resultam numa resistência acrescida ou que apresentam uma resistência acrescida ao inibidor da via do factor tecidual (TFPI) em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Exemplos destas modificações são uma ou mais modificações de aminoácidos em posições seleccionadas entre as posições D196, K197, K199, G237, T239, R290 e K341 num polipéptido do FVII possuindo ou incluindo uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO: 3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido do FVII. Especificamente, tais modificações podem incluir uma ou mais modificações de aminoácidos seleccionadas entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, Dl 96K197insK, Dl 9 6K197insR, D196K197insY, Dl96K197insW, Dl 96K197insA, Dl 96K197insM, Kl 971198insE, Kl 971198insY, K197I198insA e K197I198insS. Por exemplo, os polipéptidos do FVII modificados contendo um domínio Gla heterólogo também podem conter substituições e/ou inserções de aminoácidos como, embora não limitadas a, D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, Dl 96R/K197E/K199E, Dl 96K/K197E/K199E, D196R/ K197E/K199E/R290E, Dl 96R/K197M/K199E e Dl 96R/K197M/K199E/ R290E.

Em alguns casos, tais modificações adicionais resultam num aumento da resistência ao TFPI do polipéptido modificado em comparação com o polipéptido do FVII que não contém a modificação, isto é, o polipéptido do FVII não modificado.

Qualquer um dos polipéptidos do FVII modificados descritos acima, incluindo aqueles que apresentam uma resistência acrescida ao TFPI ou uma ligação acrescida aos fosfolípidos, ou qualquer combinação delas, pode conter adicionalmente outras modificações, incluindo quaisquer modificações descritas na técnica. Tais modificações de aminoácidos adicionais podem aumentar a resistência à antitrombina III (AT-III), aumentar a ligação e/ou a afinidade para os fosfolípidos, aumentar a afinidade para o factor tecidual (TF), aumentar a actividade intrínseca, modificar a conformação do polipéptido para alterar o carácter zimogénico, incluindo modificar a conformação para uma forma mais idêntica ao zimogénio ou uma forma menos idêntica ao zimogénio, aumentar a resistência às proteases, diminuir a glicosilação, aumentar a glicosilação, reduzir a imunogenicidade, aumentar a estabilidade e/ou facilitar a ligação de grupos químicos. Por exemplo, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem conter modificação/modificações na posição Q176, M298 ou E296 num polipéptido do FVII possuindo ou incluindo uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID N0:3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido do FVII. Em alguns exemplos, os polipéptidos do FVII modificados podem conter adicionalmente modificações de aminoácidos seleccionadas entre Q176A, M298Q, E296V e/ou E296A. Em outros exemplos, os polipéptidos do FVII modificados podem conter adicionalmente, além da troca do domínio Gla e/ou de outras modificações indicadas, uma ou mais das seguintes modificações de aminoácidos adicionais:S278C/V302C, L279C/N301C, V280C/V301C, S281C/V299C, inserção de uma tirosina na posição 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, LY41C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, VI5 8Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M3 9 ID, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ K316S, S314N/ K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T, VI858D/G237V/E296V/M298Q, K197E/G237V/M298Q, Kl97E/G237V/M298Q/K34IQ, K197E/K199E/ G2 37V/M2 9 8Q/K341Q, G237V/M298Q, G237V/M298Q/K341Q, M298Q/Gla Swap FIX, K197E/M298Q e M298Q/K341D.

Qualquer um dos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados pode conter uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais que aumentam a resistência à antitrombina III (AT-III), aumentam a ligação aos fosfolípidos e/ou a afinidade para os fosfolípidos, aumentam a afinidade para o factor tecidual (TF), aumentam a actividade intrínseca, modificam a conformação do polipéptido para alterar o carácter zimogénico, aumentam a resistência às proteases, diminuem a glicosilação, aumentam a glicosilação, reduzem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade e/ou facilitam a ligação de grupos químicos. Por exemplo, um carácter zimogénico alterado pode conferir uma forma mais idêntica ao zimogénio ou uma forma menos idêntica ao zimogénio. Tais polipéptidos do FVII modificados podem incluir, por exemplo, a substituição das posições 300-322, 305-322, 300-312 ou 305-312 pelos aminoácidos correspondentes da tripsina, da trombina ou do FX, ou a substituição das posições 310-329, 311-322 ou 233-329 pelos aminoácidos correspondentes da tripsina.

Os polipéptidos modificados aqui disponibilizados incluem aqueles polipéptidos em que o polipéptido do FVII não modificado contém apenas uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO:3 ou inclui uma sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO:3. Os polipéptidos do FVII modificados exemplificativos são polipéptidos que possuem ou incluem uma sequência de aminoácidos ilustrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 18-43, 125-150 e 206-250, ou suas variantes alélicas ou de espécie ou outras suas variantes. A variante alélica ou de espécie ou outra variante pode ter uma identidade de sequência de 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais com o polipéptido ilustrado na SEQ ID NO: 3, excluindo a(s) modificação/modificações de aminoácido(s). As fontes dos polipéptidos do FVII incluem os seres humanos e outras espécies não-humanas. Os polipéptidos podem ser polipéptidos maduros ou polipéptidos precursores. Em algumas concretizações, apenas a sequência primária do polipéptido do FVII é modificada. Além disso, os polipéptidos do FVII podem incluir uma modificação química ou uma modificação pós-traducional, por exemplo, embora não exclusivamente, uma glicosilação, uma carboxilação, uma hidroxilação, uma sulfonação, uma fosforilação, uma albuminação ou uma conjugação com outro grupo funcional, por exemplo um grupo polietilenoglicol (PEG).

Os polipéptidos do FVII modificados podem ser disponibilizados como polipéptidos de cadeia única, como misturas de formas de cadeia única e formas com duas cadeias ou múltiplas cadeias, ou como formas com duas cadeias, formas com três cadeias ou outras formas com múltiplas cadeias. Os polipéptidos do FVII modificados podem ser fornecidos como polipéptidos inactivos ou activados. A activação pode ser efectuada, por exemplo, por clivagem proteolítica, por auto-activação, clivagem pelo factor IX (FIXa), clivagem pelo factor X (FXa), clivagem pelo factor XII (FXIIa) ou clivagem pela trombina.

Os polipéptidos do FVII modificados normalmente retêm uma ou mais actividades ou propriedades do polipéptido do FVII não modificado. As modificações podem incluir modificações em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 posições de aminoácidos, desde que o polipéptido conserve pelo menos uma actividade do FVII do polipéptido do FVII não modificado. A retenção da actividade pode ser de pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da actividade do polipéptido do FVII não modificado. As actividades incluem, por exemplo, a ligação ao factor tecidual (TF), a activação do factor X (FX), a activação do factor IX (FIX), a ligação aos fosfolipidos e a actividade de coagulação. As actividades podem ser aumentadas ou diminuídas. Entre os polipéptidos modificados aqui disponibilizados encontram-se aqueles em que a actividade de coagulação é aumentada. A actividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo. São também disponibilizadas moléculas de ácidos nucleicos que incluem uma sequência de nucleótidos que codifica qualquer um dos polipéptidos do FVII modificados. São igualmente disponibilizados vectores, tais como vectores procarióticos ou vectores eucarióticos, incluindo vectores de mamíferos e vectores virais. Os vectores virais exemplificativos incluem os vectores de adenovirus, vírus adeno-associados, retrovirus, vírus do herpes, lentivírus, vírus pox e citomegalovírus. São também disponibilizadas células contendo as moléculas de ácidos nucleicos ou os vectores. As células podem ser células eucarióticas, por exemplo células de mamífero ou de levedura, ou procarióticas. As células de mamífero incluem, por exemplo, as células renais de hamster bebé (BHK-21) ou as células 293 e as células CHO. As células podem ser crescidas em condições de acordo com as quais o polipéptido do FVII modificado é expresso. O polipéptido pode ser segregado. Os polipéptidos do FVII modificados produzidos por tais células são disponibilizados. São também fornecidas composições que contêm os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados. Em particular, são disponibilizadas composições farmacêuticas que contêm tais polipéptidos. As composições podem conter uma concentração ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido do FVII modificado, ou de uma molécula de ácidos nucleicos, ou de um vector ou de uma célula aqui disponibilizados, num veiculo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser formuladas para administração de dose única ou administração de doses múltiplas. A composição farmacêutica pode encontrar-se em qualquer forma, tal como um liquido, um gel ou um sólido, e pode ser disponibilizada em cápsulas, recipientes e outros veículos apropriados. Elas podem ser formuladas para diluição antes da administração ou em qualquer forma adequada. A quantidade pode depender da perturbação tratada e/ou do indivíduo tratado e, se necessário, pode ser determinada empiricamente. A composição farmacêutica pode ser formulada para qualquer via de administração, incluindo, por exemplo, a administração local, sistémica ou tópica, ou pode ser formulada para uma administração oral, nasal, pulmonar, bocal, transdérmica, subcutânea, intraduodenal, entérica, parentérica, intravenosa ou intramuscular. As composições farmacêuticas podem ser formuladas para permitir uma libertação controlada. São também disponibilizados métodos de tratamento e utilizações das composições para tratamento. As composições farmacêuticas são administradas, ou formuladas para administração, a um sujeito que tem uma doença ou uma afecção que é tratada através da administração de FVII, incluindo o tratamento através da administração de FVII activo (FVIIa). 0 tratamento com a composição farmacêutica melhora ou alivia os sintomas associados à doença ou à afecção. A administração pode ser seguida ou acompanhada pela monitorização do sujeito para detectar alterações nos sintomas associados à doença ou à afecção mediada pelo FVII. As doenças ou afecções tratadas incluem, embora não estejam limitadas a estes exemplos, perturbações da coagulação sanguínea, perturbações hematológicas, perturbações hemorrágicas, hemofilias, uma deficiência do factor VII e sangramentos. Os exemplos incluem a hemofilia A ou a hemofilia B ou a hemofilia C. A hemofilia pode ser congénita ou adquirida, por exemplo devido a uma complicação hemorrágica resultante de uma cirurgia ou de um traumatismo. A hemorragia pode manifestar-se como hemartroses agudas, artropatia hemofílica crónica, hematomas, hematúria, hemorragias no sistema nervoso central, hemorragias gastrintestinais ou hemorragia cerebral e pode resultar, por exemplo, de uma cirurgia ou de uma extracção dentária, como, por exemplo, uma angioplastia, uma cirurgia do pulmão, uma cirurgia abdominal, uma cirurgia à coluna, uma cirurgia cerebral, uma cirurgia vascular, uma cirurgia dentária ou uma cirurgia de transplante de órgão, por exemplo um transplante de medula óssea, coração, pulmão, pâncreas e fígado. 0 sujeito pode ter auto-anticorpos para o factor VIII ou o factor IX. 0 tratamento pode ser acompanhado por, ou administrado sequencial ou intervaladamente com, um ou mais factores de coagulação adicionais, tais como, por exemplo, factores de coagulação recombinantes ou purificados a partir do plasma, pró-coagulantes, como a vitamina K, um derivado da vitamina K e inibidores da proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos vermelhos e corticosteróides. As composições farmacêuticas podem ser usadas juntamente com composições que contêm estes outros factores de coagulação. São disponibilizados artigos de manufactura que contêm um material de acondicionamento e uma composição farmacêutica do invento contida dentro do material de acondicionamento e, opcionalmente, instruções de administração. Por exemplo, o polipéptido do FVII modificado presente na composição farmacêutica pode destinar-se ao tratamento de uma doença ou de uma perturbação mediada pelo FVII e o material de acondicionamento pode incluir um rótulo que indica que o polipéptido do FVII modificado é utilizado para o tratamento de uma doença ou de uma perturbação mediada pelo FVII. São também disponibilizados kits contendo as composições farmacêuticas e um dispositivo para administração da composição e, opcionalmente, instruções de administração.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 representa a cascata de coagulação. A figura ilustra a via intrínseca e a via extrínseca de coagulação para a produção independente do FXa e a convergência das vias numa via comum para gerar a trombina e a fibrina necessárias para a formação de um coágulo. Estas vias estão interligadas. A figura representa a ordem das moléculas envolvidas na cascata de activação, em que um zimogénio é convertido numa protease activada através da clivagem de uma ou mais ligações peptidicas. A protease activada actua em seguida como protease de activação para a molécula de zimogénio seguinte na cascata, resultando por fim na formação do coágulo. A Figura 2 ilustra o modelo da coagulação baseado em superficies celulares (ver, por exemplo, Hoffman et ai. (2001) Thromb Haemost 85:958-965) . A figura representa os eventos de coagulação como estando separados em três fases, em que a iniciação da coagulação é efectuada através da activação do FX em FXa pelo complexo TF/FVIIa presente na célula portadora do TF, resultando na produção de uma pequena quantidade de trombina após activação pelo complexo FXa/FVa. A amplificação tem lugar quando a trombina se liga e activa as plaquetas e inicia a activação de quantidades suficientes dos factores de coagulação apropriados para formar os complexos FVIIIa/FIXa e FVa/FXa. A propagação da coagulação ocorre na superfície de um grande número de plaquetas activadas no local da lesão, resultando num aumento drástico da produção de trombina que é suficientemente grande para gerar bastante fibrina a partir do fibrinogénio para formar um coágulo no local da lesão. A Figura 3 representa os mecanismos pelos quais o FVIIa pode iniciar a formação de trombina. A figura ilustra a via de geração de trombina dependente do TF do FVIIa, que actua na superfície de uma célula portadora do TF e envolve a complexação do FVIIa com o TF antes da activação do FX em Fxa. A figura também mostra a via de geração de trombina independente do TF do FVIIa, durante a qual o FVIIa se liga aos fosfolípidos presentes na plaqueta activada e activa o FX em FXa, que em seguida se complexa com o FVa para clivar a protrombina em trombina. A Figura 4 representa o complexo inibidor quaternário que se forma quando o complexo TFPI/FXa se liga ao complexo TF/FVIIa. O TFPI contém três domínios de Kunitz. O domínio de Kunitz 2 (K-2) interage com o FXa e inibe-o, enquanto o domínio de Kunitz 1 (K-l) interage com o FVIIa e inibe-o. A Figura 5 representa o alinhamento da sequência de aminoácidos dos primeiros domínios de Kunitz de (a) BPTI5L15 (posições de aminoácidos 1 a 55 da SEQ ID NO: 106) e TFPI-2 (posições de aminoácidos 14-65 da SEQ ID NO:105) e (b) TFPI-1 (posições de aminoácidos 26-76 da SEQ ID NO:102) e TFPI-2 (posições de aminoácidos 14-65 da SEQ ID NO:105), e mostra os aminoácidos conservados. A Figura 6 representa o modelo de homologia utilizado para determinar os resíduos de contacto na interface da interacção entre o FVIIa e o TFPI. A estrutura do domínio de Kunitz 1 (Kl) do TFPI-2 foi retirada da estrutura cristalina do complexo tripsina/TFPI e modelada sobre o BPTI5L15 na estrutura cristalina do complexo TF/FVIIa/BPTI5L15. Recorreu-se à mutagénese in silico para ajustar os aminoácidos correspondentes do TFPI-1 Kl ao modelo. Os resíduos de contacto do FVIIa que provavelmente estão envolvidos na interacção com o TFPI, ao nível da interface proteína-proteína, foram identificados e estabelecidos como candidatos a mutagénese no desenvolvimento de polipéptidos do FVII resistentes ao TFPI. A Figura 7 representa o modelo da interacção entre o FVIIa e o TFPI. Em particular, a figura ilustra os resíduos de contacto do FVII que estão presentes na interface da interacção entre o FVIIa e o TFPI, e os correspondentes resíduos de contacto do TFPI, que formam contactos electrostáticos complementares.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Plano geral A. Definições B. Descrição geral da hemostasia 1. Adesão e agregação plaquetárias 2. Cascata de coagulação a. Iniciação b. Amplificação c. Propagação 3. Regulação da coagulação C. Factor VII (FVII)

1. Estrutura e organização do FVII 2. Modificações pós-traducionais

3. Processamento do FVII

4. Activação do FVII

5. Função do FVII a. Actividade do FVIIa dependente do factor tecidular b. Actividade do FVIIa independente do factor tecidular 6. O FVII como vim biofármaco D. Polipéptidos do FVII modificados 1. Resistência aos inibidores

a. TFPI

Modificações para obter uma resistência acrescida ao TFPI b. Antitrombina III (AT-III)

Modificações para obter uma resistência acrescida à AT-III 2. Ligação às plaquetas activadas

Modificação por introdução de vim domínio Gla heterólogo 3. Combinações e modificações adicionais a. Modificações que aumentam a actividade intrínseca b. Modificações que aumentam a resistência às proteases c. Modificações que aumentam a ligação aos fosfolípidos d. Modificações que alteram a glicosilação e. Modificações que facilitam a ligação de grupos químicos f. Mutantes combinados do FVII exemplares

E. Concepção e métodos para modificar o FVII 1. Racionais 2. Empíricos (isto é, rastreio) a. Mutagénese aleatória b. Mutagénese dirigida c. Rastreio

3. Selecção de variantes do FVII

F. Produção de polipéptidos do FVII 1. Vectores e células 2. Sistemas de expressão a. Expressão procariótica b. Levedura c. Insectos e células de insecto d. Células de mamifero e. Plantas 2. Purificação 3. Proteínas de fusão 4. Modificações do polipéptido 5. Sequências nucleotídicas G. Avaliação das actividades dos polipéptidos do FVII modificados 1. Ensaios in vitro a. Modificação pós-traducional b. Actividade proteolítica c. Actividade de coagulação d. Ligação a outras proteínas e/ou inibição por outras proteínas e. Ligação aos fosfolípidos 2. Modelos animais não humanos 3. Ensaios clínicos H. Formulação e administração 1. Formulações a. Regimes posológicos b. Formas farmacêuticas 2. Administração de polipéptidos do FVII modificados 3. Administração de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos do FVII modificados (terapia génica) I. Utilizações terapêuticas 1. Perturbações hemorrágicas congénitas a. Hemofilia

b. Deficiência do FVII c. Outras 2. Perturbações hemorrágicas adquiridas a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia b. Outras coagulopatias c. Hemorragia adquirida após transplante d. Hemorragia induzida pela terapêutica anticoagulante e. Hemofilia adquirida 3. Hemorragias associadas a traumatismo e cirurgia J. Terapêuticas de Combinação K. Artigos de manufactura e kits L. Exemplos

A. DEFINIÇÕES

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o significado habitualmente atribuído por um perito na especialidade a que o(s) invento(s) pertence(m). Na eventualidade de existir uma pluralidade de definições para os termos neste documento, os termos nesta secção prevalecem. Quando é feita referência a um URL ou outro elemento identificador ou endereço similar, está subentendido que tais elementos identificadores podem mudar e que determinada informação particular existente na Internet pode aparecer e desaparecer, mas que é possível encontrar informação equivalente através de pesquisa na Internet. A referência aos mesmos comprova a disponibilidade e a difusão pública dessa informação.

Tal como aqui utilizado, o termo via de coagulação ou cascata de coagulação refere-se à série de eventos de activação que conduz à formação de um coágulo de fibrina insolúvel. Na via ou cascata de coagulação, uma proteína inactiva de uma protease de serina (também denominada um zimogénio) é convertida numa protease activa através da clivagem de uma ou mais ligações peptídicas, que actua depois como a protease de activação para a molécula de zimogénio seguinte na cascata. Na etapa proteolítica final da cascata, o fibrinogénio é clivado proteoliticamente pela trombina em fibrina, que é subsequentemente reticulada no local da lesão para formar um coágulo.

Tal como aqui utilizado, o termo "hemostasia" refere-se ao estancamento da hemorragia ou do fluxo sanguíneo num órgão ou numa parte do corpo. 0 termo hemostasia pode englobar o processo completo de coagulação sanguínea para impedir a perda de sangue após uma lesão nos vasos sanguíneos, até à dissolução subsequente do coágulo de sangue após a reparação dos tecidos.

Tal como aqui utilizado, o termo "coagulação" refere-se à formação de um coágulo de fibrina insolúvel, ou ao processo por meio do qual os factores de coagulação do sangue interagem na cascata de coagulação, resultando por fim na formação de um coágulo de fibrina insolúvel.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma "protease" é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas covalentes. Estas designações incluem as formas do zimogénio e as suas formas activadas de cadeia única, duas cadeias e múltiplas cadeias. Para efeitos de clareza, as referências a proteases referem-se a todas as formas. As proteases incluem, por exemplo, as proteases de serina, as proteases de cisteina, as proteases aspárticas, as proteases de treonina e as metaloproteases, dependendo da actividade catalítica do seu sítio activo e do mecanismo de clivagem das ligações peptídicas de um substrato-alvo.

Tal como aqui utilizado, o termo proteases de serina ou endopeptidases de serina refere-se a uma classe de peptidases que é caracterizada pela presença de um resíduo de serina no sítio activo da enzima. As proteases de serina participam numa gama variada de funções no corpo, incluindo a coagulação sanguínea e a inflamação, funcionando também como enzimas digestivas nos procariotas e nos eucariotas. 0 mecanismo de clivagem pelas proteases de serina baseia-se no ataque nucleofílico de uma ligação peptídica visada por uma serina. A cisteina, a treonina ou as moléculas de água associadas ao aspartato ou aos metais também podem desempenhar este papel. As cadeias laterais alinhadas da serina, da histidina e do aspartato formam uma tríada catalítica comum à maioria das proteases de serina. 0 sítio activo das proteases de serina tem a forma de uma fissura onde o substrato polipeptídico se liga.

Tal como aqui utilizado, o termo factor VII (FVII, F7; também designado por factor 7, factor de coagulação VII, factor sérico VII, acelerador da conversão da protrombina sérica, SPCA, proconvertina e eptacog alfa) refere-se a uma protease de serina que faz parte da cascata de coagulação. 0 FVII inclui um domínio Gla, dois domínios EGF (EGF-1 e EGF-2) e um domínio protease de serina (ou domínio peptidase Sl) que é grandemente conservado entre todos os membros da família de peptidases SI de proteases de serina, como por exemplo na quimiotripsina. A sequência de um precursor do FVII exemplificativo possuindo um péptido de sinal e um propéptido está ilustrada na SEQ ID NO: 1. Um polipéptido do FVII maduro exemplificativo está ilustrado na SEQ ID N0:3. 0 FVII existe como um zimogénio de cadeia única, um polipéptido semelhante ao zimogénio com duas cadeias e uma forma totalmente activada com duas cadeias. A activação total, que se verifica após a modificação conformacional de uma forma semelhante ao zimogénio, tem lugar após a ligação ao seu cofactor, o factor tecidual. Também é possível introduzir mutações que resultam na modificação conformacional na ausência do factor tecidual. Por conseguinte, a referência ao FVII inclui as suas formas de cadeia única e com duas cadeias, incluindo a forma semelhante ao zimogénio com duas cadeias e a forma totalmente activada com duas cadeias. A referência ao polipéptido do FVII também inclui os polipéptidos precursores e os polipéptidos do FVII maduros nas formas de cadeia única ou com duas cadeias, as suas formas truncadas que possuem actividade, e inclui as variantes alélicas e as variantes de espécie, as variantes codificadas por variantes de splicing e outras variantes, incluindo os polipéptidos que possuem uma identidade de sequência de pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais com o polipéptido precursor ilustrado na SEQ ID NO: 1 ou com a sua forma madura. Os polipéptidos do FVII modificados, como aqueles das SEQ ID NOS:18-43, 125-150 ou 206-150 e suas variantes, estão incluídos. Estão também incluídos aqueles polipéptidos que retêm pelo menos uma actividade de um FVII, como a ligação ao TF, a ligação ao factor X, a ligação aos fosfolípidos e/ou a actividade coagulante de um FVII. Retenção da actividade significa que a actividade pode ser alterada, por exemplo reduzida ou aumentada, em comparação com um FVII de tipo selvagem, desde que o nível de actividade conservado seja suficiente para produzir um efeito detectável. Os polipéptidos do FVII incluem, embora não estejam limitados a estes exemplos, as isoformas específicas de tecidos e suas variantes alélicas, as moléculas sintéticas preparadas através da tradução de ácidos nucleicos, as proteínas produzidas por síntese química, como as sínteses que incluem a união de polipéptidos mais curtos, as proteínas produzidas através de métodos recombinantes, as proteínas isoladas de células e tecidos humanos e não-humanos e os polipéptidos do FVII quiméricos e suas formas modificadas. Os polipéptidos do FVII também incluem os fragmentos ou partes do FVII que têm um comprimento suficiente ou que incluem regiões apropriadas para reter pelo menos uma actividade (se necessário após activação) de um polipéptido maduro completo. Os polipéptidos do FVII incluem igualmente aqueles polipéptidos que contêm modificações químicas ou pós-traducionais e aqueles que não contêm modificações químicas ou pós-traducionais. Tais modificações incluem, embora não exclusivamente, a peguilação, a albuminação, a glicosilação, a farnesilação, a carboxilação, a hidroxilação, a fosforilação e outras modificações dos polipéptidos conhecidas na técnica.

Os polipéptidos do FVII exemplificativos são aqueles polipéptidos de origem mamífera, incluindo os polipéptidos humanos. As sequências de aminoácidos exemplificativas do FVII de origem humana estão ilustradas nas SEQ ID NOS: 1, 2 e 3. Os exemplos de variantes de um tal polipéptido do FVII humano incluem qualquer um dos polipéptidos precursores ilustrados nas SEQ ID NOS: 44-100. Os polipéptidos do FVII também incluem quaisquer polipéptidos de origem não-humana, incluindo, embora não limitados a, polipéptidos do factor VII murinos, caninos, felinos, leporinos, aviários, bovinos, ovinos, porcinos, equinos, ranídeos, de peixes e de outros primatas. Os exemplos de polipéptidos do FVII de origem não-humana incluem, por exemplo, a vaca (Bos taurus, SEQ ID NO:4), o ratinho (Mus musculus, SEQ ID NO:5), o chimpanzé-pigmeu (Pan paniscus, SEQ ID NO:6), o chimpanzé (Pan troglodytes, SEQ ID NO:7), o coelho (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO: 8), o rato (Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 9), o macaco-rhesus (Macaca mulatta, SEQ ID NO:10), o porco (Sus scrofa, SEQ ID NO:ll), o cão (Canis familiaris, SEQ ID NO:12), o peixe-zebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO:13), o peixe-balão japonês (Fugu rubripes, SEQ ID NO:14), a galinha (Gallus gallus, SEQ ID NO:15), o orangotango (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO: 16) e o gorila (Gorilla gorilla, SEQ ID NO:17) .

Um perito na especialidade reconhece que as posições referenciadas do polipéptido do factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) diferem em 60 resíduos de aminoácidos quando são comparadas com o polipéptido precursor do FVII-isoforma a ilustrado na SEQ ID NO: 1, que é o polipéptido do factor VII-isoforma a contendo as sequências do péptido de sinal e do propéptido. Assim, o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 3 "corresponde" ao sexagésimo primeiro (61-) resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 1. Um perito na especialidade também reconhece que as posições referenciadas do polipéptido do factor VII maduro (SEQ ID NO: 3) diferem em 38 resíduos de aminoácidos quando são comparadas com o polipéptido precursor do FVI I ilustrado na SEQ ID NO:2, que é o polipéptido do factor VII-isoforma b contendo as sequências do péptido de sinal e do propéptido. Assim, o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 3 "corresponde" ao trigésimo nono (39-) resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

Tal como aqui utilizado, o termo resíduos correspondentes refere-se a resíduos que surgem em loci alinhados. Os polipéptidos relacionados ou variantes são alinhados através de qualquer método conhecido pelos peritos na especialidade. Estes métodos tipicamente maximizam as correspondências e incluem métodos como a utilização de alinhamentos manuais, a utilização de numerosos programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos pelos peritos na especialidade. Ao alinhar as sequências dos polipéptidos, um perito na especialidade pode identificar os resíduos correspondentes, utilizando os resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Por exemplo, alinhando as sequências de polipéptidos do factor VII, um perito na especialidade pode identificar os resíduos correspondentes, utilizando os resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Por exemplo, a alanina na posição de aminoácido 1 (Al) da SEQ ID NO: 3 (factor VII maduro) corresponde à alanina na posição de aminoácido 61 (A61) da SEQ ID NO:l e à alanina na posição de aminoácido 39 (A39) da SEQ ID NO:2. Noutros casos, é possível identificar regiões correspondentes. Por exemplo, o domínio Gla corresponde às posições de aminoácidos Al a F45 da SEQ ID NO:3, às posições de aminoácidos A61 a S105 da SEQ ID NO: 1 e às posições de aminoácidos A39 a S83 da SEQ ID NO:2. Um perito na especialidade também pode recorrer aos resíduos de aminoácidos conservados como guias para encontrar os resíduos de aminoácidos correspondentes entre as sequências humanas e não-humanas. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos S43 e E163 da SEQ ID NO:3 (humana) correspondem a S83 e E203 da SEQ ID NO: 4 (bovina). As posições correspondentes também podem basear-se em alinhamentos estruturais, por exemplo utilizando alinhamentos das estruturas proteicas simulados computacionalmente. Noutros casos, é possível identificar regiões correspondentes.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma "pró-região", um "propéptido" ou uma "pró-sequência" refere-se a uma região ou um segmento que é clivado para produzir uma proteína madura. Tal pode incluir segmentos que actuam para suprimir a actividade proteolítica, mascarando a maquinaria catalítica e impedindo, assim, a formação do intermediário catalítico (isto é, através de oclusão estérea do local de ligação do substrato) . Uma pró-região é uma sequência de aminoácidos posicionada na extremidade amino-terminal de um polipéptido maduro biologicamente activo e pode ter apenas alguns aminoácidos ou pode ser uma estrutura multidomínios.

Tal como aqui utilizado, o termo "factor VII maduro" refere-se a um polipéptido do FVII desprovido de uma sequência sinal e de uma sequência do propéptido. Normalmente, uma sequência sinal direcciona uma proteína para secreção através da via do retículo endoplasmático (RE) e do complexo de Golgi e é clivada após a inserção no RE durante a tradução. Um propéptido normalmente actua ao nível da modificação pós-traducional da proteína e é clivado antes da secreção da proteína a partir da célula. Assim, um polipéptido do FVII maduro é geralmente uma proteína segregada. Num exemplo, um polipéptido do FVII humano maduro está ilustrado na SEQ ID N0:3. A sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO:3 difere da sequência dos polipéptidos precursores apresentada nas SEQ ID NOS: 1 e 2, na medida em que a SEQ ID NO:3 não contém a sequência sinal, que corresponde aos resíduos de aminoácidos 1-20 das SEQ ID NOS:1 e 2, e também não contém a sequência do propéptido, que corresponde aos resíduos de aminoácidos 21-60 da SEQ ID NO:l e aos resíduos de aminoácidos 21-38 da SEQ ID NO:2. A referência a um polipéptido do FVII maduro engloba a forma do zimogénio de cadeia única e a forma com duas cadeias.

Tal como aqui utilizado, o termo "tipo selvagem" ou "nativo" em referência ao FVII refere-se a um polipéptido do FVII codificado por um gene do FVII nativo ou de ocorrência natural, incluindo as variantes alélicas, que está presente num organismo, incluindo um ser humano e outros animais, na natureza. A referência ao factor VII de tipo selvagem sem menção a uma espécie pretende abranger qualquer espécie de um factor VII de tipo selvagem. Entre os polipéptidos do FVII de tipo selvagem estão incluídos o polipéptido precursor codificado, seus fragmentos e suas formas processadas, tal como uma forma madura desprovida do péptido de sinal, bem como quaisquer suas formas modificadas ou processadas pré- ou pós-traducionalmente. Entre os polipéptidos do FVII nativo estão igualmente incluídos aqueles polipéptidos que são modificados pós-traducionalmente, incluindo, embora não exclusivamente, a modificação por glicosilação, carboxilação e hidroxilação. Os polipéptidos do FVII nativo também incluem as formas de cadeia única e com duas cadeias. Por exemplo, os seres humanos expressam FVII nativo. As sequências de aminoácidos de exemplos de FVII humano de tipo selvagem estão apresentadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, de variantes alélicas nas SEQ ID NOS :44-100 e as suas formas maduras. Outros animais também produzem FVII nativo, incluindo, embora não exclusivamente, a vaca (Bos taurus, SEQ ID NO:4), o ratinho (Mus musculus, SEQ ID NO:5), o chimpanzé-pigmeu (Pan paniscus, SEQ ID NO:6), o chimpanzé (Pan troglodytes, SEQ ID NO:7), o coelho (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO:8), o rato (Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 9), o macaco-rhesus (Macaca mulatta, SEQ ID NO:10), o porco (Sus scrofa, SEQ ID NO:ll), o cão (Canis familiaris, SEQ ID NO:12), o peixe-zebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO:13), o peixe-balão japonês (Fugu rubripes, SEQ ID NO:14), a galinha (Gallus gallus, SEQ ID NO:15), o orangotango (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO: 16) e o gorila (Gorilla gorilla, SEQ ID NO:17) .

Tal como aqui utilizado, o termo variantes de espécie refere-se a variantes nos polipéptidos entre diferentes espécies, incluindo diferentes espécies de mamíferos, como o ratinho e o ser humano.

Tal como aqui utilizado, o termo variantes alélicas refere-se a variações nas proteínas entre membros da mesma espécie.

Tal como aqui utilizado, o termo variante de splicing refere-se a uma variante produzida através do processamento diferencial de um transcrito primário de ADN genómico que resulta em mais de um tipo de ARNm.

Tal como o termo é aqui utilizado, um zimogénio refere-se a uma protease que é activada por clivagem proteolítica, incluindo a clivagem para maturação, por exemplo a clivagem para activação, e/ou por formação de complexos com outra (s) proteína (s) e/ou cofactor(es) . Um zimogénio é um precursor inactivo de uma enzima proteolítica. Estes precursores são geralmente maiores, embora não necessariamente maiores, do que a forma activa. Relativamente às proteases de serina, os zimogénios são convertidos em enzimas activas por clivagem específica, incluindo a clivagem catalítica e autocatalítica, ou pela ligação de um cofactor de activação que gera uma enzima activa. Por exemplo, em geral, os zimogénios estão presentes numa forma de cadeia única. Os zimogénios geralmente são inactivos e podem ser convertidos em polipéptidos activos maduros através da clivagem catalítica ou autocatalítica num ou mais locais proteolíticos, para produzir um polipéptido com múltiplas cadeias, por exemplo um polipéptido com duas cadeias. Assim, um zimogénio é uma proteína enzimaticamente inactiva que é convertida numa enzima proteolítica através da acção de um activador. A clivagem pode ser realizada por auto-activação. Várias proteínas de coagulação são zimogénios. Elas estão inactivas, mas são clivadas e activadas ao verificar-se a iniciação do sistema de coagulação após uma lesão vascular. No que diz respeito ao FVII, os polipéptidos estão presentes no plasma sanguíneo como zimogénios até à clivagem por proteases, por exemplo, o factor IX activado (FIXa), o factor X activado (FXa) , o factor XII activado (FXIIa) ou a trombina, ou por auto-activação para produzir uma forma semelhante ao zimogénio com duas cadeias, que depois requer uma modificação conformacional adicional para adquirir a actividade total.

Tal como o termo é aqui utilizado, um polipéptido ou uma proteína "semelhante ao zimogénio" refere-se a uma proteína que foi activada por clivagem proteolít ica, mas que ainda apresenta propriedades que estão associadas a um zimogénio, por exemplo, uma actividade fraca ou inexistente, ou uma conformação que se assemelha à conformação da forma de zimogénio da proteína. Por exemplo, quando não está ligada ao factor tecidual, a forma activada do FVII com duas cadeias é uma proteína semelhante ao zimogénio; ela retém uma conformação semelhante ao zimogénio do FVII não clivado e, por conseguinte, apresenta uma actividade muito fraca. Ao ligar-se ao factor tecidual, a forma activada do FVII com duas cadeias sofre uma modificação conformacional e adquire a sua actividade total como um factor de coagulação.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma sequência de activação refere-se a uma sequência de aminoácidos num zimogénio que constitui o local necessário para a clivagem para activação ou a clivagem para maturação, de modo a formar uma protease activa. A clivagem de uma sequência de activação pode ser catalisada autocataliticamente ou por parceiros de activação.

Tal como o termo é aqui utilizado, a clivagem para activação é um tipo de clivagem para maturação, que induz uma modificação conformacional que é necessária para o desenvolvimento da actividade enzimática total. Esta é uma via de activação clássica, por exemplo, para as proteases de serina, em que uma clivagem gera uma nova extremidade N-terminal que interage com as regiões conservadas da protease, como Aspl94 na quimiotripsina, para induzir as alterações conformacionais necessárias para a actividade. A activação pode resultar na produção de formas das proteases com múltiplas cadeias. Nalguns casos, as formas das proteases de cadeia única podem apresentar actividade proteolítica.

Tal como aqui utilizado, o termo "factor VII activado" ou "FVIIa" refere-se a qualquer forma de um polipéptido do FVII com duas cadeias. Uma forma com duas cadeias resulta normalmente de clivagem proteolítica, mas pode ser produzida sinteticamente. Assim, o factor VII activado inclui a forma semelhante ao zimogénio com duas cadeias com uma actividade coagulante fraca, uma forma totalmente activada (com uma actividade cerca de lOOOx superior) que surge após a ligação ao factor tecidual e as formas mutadas que existem numa forma com duas cadeias totalmente activada ou que sofrem modificação conformacional para uma forma totalmente activada. Por exemplo, uma forma de cadeia única do polipéptido do FVII (ver, por exemplo, SEQ ID NO:3) é clivada proteoliticamente entre os resíduos de aminoácidos R152 e 1153 do polipéptido do FVII maduro. Os produtos de clivagem, a cadeia pesada do FVII e a cadeia leve do FVII, que são mantidas unidas por uma ligação dissulfureto (entre os resíduos de aminoácidos 135C e 162C no FVII da SEQ ID N0:3), formam a enzima FVII activada com duas cadeias. A clivagem proteolítica pode ser efectuada, por exemplo, pelo factor IX activado (FIXa), o factor X activado (FXa), o factor XII activado (FXIIa) ou a trombina, ou por auto-activação.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma "propriedade" de um polipéptido do FVII refere-se a uma propriedade física ou estrutural, por exemplo a estrutura tridimensional, o pi, a semivida, a conformação e outras características físicas similares.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma "actividade" de um polipéptido do FVII refere-se a qualquer actividade apresentada por um polipéptido do factor VII. Estas actividades podem ser testadas in vitro e/ou in vivo e incluem, embora não estejam limitadas a estes exemplos, a actividade de coagulação ou coagulante, a actividade pró-coagulante, a actividade proteolítica ou catalítica, por exemplo realizar a activação do factor X (FX) ou a activação do factor IX (FIX); a antigenicidade (a capacidade de ligação a um anticorpo anti-FVII ou de competição com um polipéptido pela ligação a um anticorpo anti-FVII); a capacidade de ligação ao factor tecidual, ao factor X ou ao factor IX e/ou a capacidade de ligação aos fosfolípidos. A actividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo utilizando ensaios reconhecidos, por exemplo, medindo a coagulação in vitro ou in vivo. Os resultados destes ensaios indicam que um polipéptido apresenta uma actividade que pode ser correlacionada com a actividade do polipéptido in vivo, em que a actividade in vivo pode ser designada por actividade biológica. Os ensaios para determinar a funcionalidade ou a actividade de formas modificadas do FVII são conhecidos pelos peritos na especialidade. Os exemplos de ensaios para determinar a actividade de um polipéptido do FVII incluem o ensaio do tempo de protromboplastina (TP) ou o ensaio do tempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) para avaliar a actividade coagulante, ou ensaios cromogénicos com substratos sintéticos, conforme descritos nos Exemplos 4, 5 e 11, para avaliar a actividade catalítica ou proteolítica.

Tal como aqui utilizado, o termo "apresenta pelo menos uma actividade" ou "retém pelo menos uma actividade" refere-se à actividade apresentada por um polipéptido do FVII modificado em comparação com um polipéptido do FVII não modificado da mesma forma e sob as mesmas condições. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado numa forma com duas cadeias é comparado com um polipéptido do FVII não modificado numa forma com duas cadeias, nas mesmas condições experimentais, em que a única diferença entre os dois polipéptidos é a modificação em estudo. Noutro exemplo, um polipéptido do FVII modificado numa forma de cadeia única é comparado com um polipéptido do FVII não modificado numa forma de cadeia única, nas mesmas condições experimentais, em que a única diferença entre os dois polipéptidos é a modificação em estudo. Tipicamente, um polipéptido do FVII modificado que retém ou apresenta pelo menos uma actividade de um polipéptido do FVII não modificado da mesma forma retém uma quantidade suficiente da actividade, de forma que, quando é administrado in vivo, o polipéptido do FVII modificado é terapeuticamente eficaz como um agente terapêutico pró-coagulante. Em geral, para que um polipéptido do FVII modificado retenha a eficácia terapêutica como um pró-coagulante, a quantidade de actividade que é retida é de ou é de cerca de 0,5%; 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da actividade de um polipéptido do FVII não modificado da mesma forma que apresenta eficácia terapêutica como um pró-coagulante. A quantidade de actividade que é necessária para manter a eficácia terapêutica como um pró-coagulante pode ser determinada empiricamente, se necessário. Normalmente, a retenção de 0,5% a 20%, 0,5% a 10%, 0,5% a 5% de uma actividade é suficiente para reter a eficácia terapêutica como um pró-coagulante in vivo.

Está subentendido que a actividade apresentada ou retida por um polipéptido do FVII modificado pode ser qualquer actividade, incluindo, embora não exclusivamente, a actividade de coagulação ou coagulante, a actividade pró-coagulante, a actividade proteolítica ou catalítica, por exemplo realizar a activação do factor X (FX) ou a activação do factor IX (FIX); a antigenicidade (a capacidade de ligação a um anticorpo anti-FVII ou de competição com um polipéptido pela ligação a um anticorpo anti-FVII); a capacidade de ligação ao factor tecidual, ao factor X ou ao factor IX e/ou a capacidade de ligação aos fosfolípidos. Em alguns casos, um polipéptido do FVII modificado pode reter uma actividade que é aumentada em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Em alguns casos, um polipéptido do FVII modificado pode reter uma actividade que é reduzida em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. A actividade de um polipéptido do FVII modificado pode ser qualquer nível percentual da actividade do polipéptido não modificado, em que ambos os polipéptidos estão na mesma forma, incluindo, embora não exclusivamente, 1% da actividade, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da actividade em comparação com o polipéptido que não contém a modificação em questão. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado pode apresentar uma actividade acrescida ou reduzida em comparação com o polipéptido do FVII não modificado da mesma forma. Por exemplo, pode reter pelo menos cerca de ou 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% da actividade do polipéptido do FVII não modificado. Em outras concretizações, a alteração na actividade é pelo menos cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes ou mais vezes superior ao FVII não modificado. O nível particular a reter é uma função da utilização prevista do polipéptido e pode ser determinado empiricamente. A actividade pode ser medida, por exemplo, utilizando ensaios in vitro ou in vivo, como aqueles descritos aqui ou nos Exemplos abaixo.

Tal como aqui utilizado, o termo "actividade de coagulação" ou " actividade coagulante" ou "actividade pró-coagulante" refere-se à capacidade de um polipéptido para efectuar a coagulação. Os ensaios para avaliar a actividade coagulante são conhecidos pelos peritos na especialidade e incluem o ensaio do tempo de protromboplastina (TP) ou o ensaio do tempo de tromboplastina parcial activada (TTPa).

Tal como aqui utilizados, os termos "actividade catalítica" ou "actividade proteolítica" em referência ao FVII referem-se à capacidade de uma proteína do FVII para catalisar a clivagem proteolítica de um substrato e são usados indistintamente. Os ensaios para avaliar estas actividades são conhecidos na técnica. Por exemplo, a actividade proteolítica do FVII pode ser medida utilizando substratos cromogénicos como Spectrozyme FVIIa (CH3S02-D-CHA-But-Arg-pNA), em que a clivagem do substrato é controlada por absorvância e a velocidade de hidrólise do substrato é determinada por regressão linear.

Tal como aqui utilizado, o termo "actividade intrínseca" em referência ao FVII refere-se à actividade catalítica, proteolítica e/ou coagulante de uma proteína do FVII na ausência do factor tecidual.

Tal como aqui utilizado, o termo domínio (normalmente uma sequência de três ou mais, geralmente 5 ou 7 ou mais aminoácidos) refere-se a uma parte de uma molécula, por exemplo proteínas ou os ácidos nucleicos codificantes, que é estrutural e/ou funcionalmente distinta de outras partes da molécula e é identificável. Por exemplo, os domínios incluem aquelas partes de uma cadeia polipeptídica que podem formar uma estrutura independentemente enrolada dentro de uma proteína constituída por um ou mais motivos estruturais e/ou que é reconhecida em virtude de uma actividade funcional, por exemplo a actividade proteolítica. Uma proteína pode ter um ou mais de um domínios diferentes. Por exemplo, um domínio pode ser identificado, definido ou distinguido por homologia da sua sequência com membros da família relacionados, como seja a homologia com motivos que definem um domínio protease ou um domínio Gla. Noutro exemplo, um domínio pode ser diferenciado através da sua função, por exemplo através da actividade proteolítica, ou de uma capacidade para interagir com uma biomolécula, por exemplo a ligação ao ADN, a ligação a um ligando e a dimerização. Um domínio pode apresentar independentemente uma função ou actividade biológica, de modo que esse domínio, independentemente ou fundido com outra molécula, pode desempenhar uma actividade, tal como, por exemplo, uma actividade proteolítica ou a ligação a um ligando. Um domínio pode ser uma sequência linear de aminoácidos ou uma sequência não-linear de aminoácidos. Muitos polipéptidos contêm uma pluralidade de domínios. Esses domínios são conhecidos e podem ser identificados pelos peritos na especialidade. As definições são disponibilizadas neste documento para efeitos de exemplificação, mas subentende-se que o reconhecimento de domínios particulares pelo nome está perfeitamente dentro da perícia na técnica. Em caso de necessidade, é possível utilizar software apropriado para identificar os domínios.

Tal como o termo é aqui utilizado, um domínio protease é a parte cataliticamente activa de uma protease. A referência a um domínio protease de uma protease inclui as formas de cadeia única, com duas cadeias e com múltiplas cadeias de qualquer uma destas proteínas. Um domínio protease de uma proteína contém todas as propriedades indispensáveis dessa proteína necessárias para a sua actividade proteolítica, como, por exemplo, o centro catalítico. Relativamente ao FVII, o domínio protease partilha homologia e característica estrutural com os domínios protease da família da quimiotripsina/tripsina, incluindo a tríade catalítica. Por exemplo, no polipéptido do FVII maduro ilustrado na SEQ ID NO:3, o domínio protease corresponde às posições de aminoácidos 153 a 392.

Tal como o termo é aqui utilizado, um domínio gama-carboxiglutamato (Gla) refere-se à porção de uma proteína, por exemplo uma proteína dependente da vitamina K, que contém modificações pós-traducionais dos resíduos de glutamato, geralmente da maior parte, mas não de todos os resíduos de glutamato, por carboxilação dependente da vitamina K para formar Gla. 0 domínio Gla é responsável pela ligação de alta afinidade de iões cálcio e pela ligação a fosfolípidos carregados negativamente. Tipicamente, o domínio Gla começa na extremidade N-terminal da forma madura das proteínas dependentes da vitamina K e termina com um resíduo aromático conservado. Num polipéptido do FVII maduro, o domínio Gla corresponde às posições de aminoácidos 1 a 45 do polipéptido exemplificativo ilustrado na SEQ ID NO:3. Os domínios Gla são bem conhecidos e os seus locus podem ser identificados em polipéptidos particulares. Os domínios Gla das várias proteínas dependentes da vitamina K partilham homologia de sequência, estrutural e funcional, incluindo a aglomeração de resíduos hidrofóbicos em posição N-terminal num trecho hidrofóbico que medeia a interacção com os fosfolípidos carregados negativamente presentes na membrana da superfície celular. Outros exemplos de polipéptidos contendo um domínio Gla incluem, embora não estejam limitados a estes, o FIX, o FX, a protrombina, a proteína C, a proteína S, a osteocalcina, a proteína Gla da matriz, a proteína 6 específica da paragem do crescimento (Gas6) e a proteína Z. Os domínios Gla destas e de outras proteínas exemplificativas estão ilustrados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-121.

Tal como aqui utilizado, o termo "nativo" ou "endógeno" em referência a um domínio Gla refere-se ao domínio Gla que ocorre naturalmente associado à totalidade ou a uma parte de um polipéptido que possui um domínio Gla. Para efeitos desta descrição, um domínio Gla nativo é em referência a um polipéptido do FVII. Por exemplo, o domínio Gla nativo do FVII, ilustrado na SEQ ID NO:119, corresponde aos aminoácidos 1-45 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3.

Tal como o termo é aqui utilizado, um domínio Gla heterólogo refere-se ao domínio Gla de um polipéptido, da mesma espécie ou de uma espécie diferente, que não é um domínio Gla do FVII. Os exemplos de domínios Gla heterólogos são os domínios Gla de polipéptidos que contêm um domínio Gla, incluindo, embora não exclusivamente, o FIX, o FX, a protrombina, a proteína C, a proteína S, a osteocalcina, a proteína Gla da matriz, a proteína 6 específica da paragem do crescimento (Gas6) e a proteína Z. Os domínios Gla destas e de outras proteínas exemplificativas estão ilustrados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-118, 120 e 121.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma parte contígua de um domínio Gla refere-se a pelo menos dois ou mais aminoácidos adjacentes, tipicamente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 ou mais, até à totalidade dos aminoácidos que constituem um domínio Gla.

Tal como o termo é aqui utilizado, "uma porção suficiente de um domínio Gla para efectuar uma ligação aos fosfolípidos" inclui pelo menos um aminoácido, tipicamente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 ou mais aminoácidos do domínio, mas menos da totalidade dos aminoácidos que constituem o domínio, desde que o polipéptido que contém essa porção apresente uma ligação aos fosfolípidos.

Tal como aqui utilizado, o termo "substituir" em relação a um domínio Gla ou "troca do domínio Gla" refere-se ao processo por meio do qual o domínio Gla endógeno de uma proteína é substituído, utilizando métodos recombinantes, sintéticos ou outros, pelo domínio Gla de outra proteína. No contexto de uma "troca do domínio Gla", um "domínio Gla" é qualquer selecção de aminoácidos de um domínio Gla e regiões adjacentes que é suficiente para reter a actividade de ligação aos fosfolípidos. Tipicamente, uma troca do domínio Gla envolverá a substituição de entre 40 e 50 aminoácidos da proteína endógena por entre 40 e 50 aminoácidos de outra proteína, mas pode envolver menos ou mais aminoácidos.

Tal como o termo é aqui utilizado, um domínio factor de crescimento epidérmico (EGF) (EGF-1 ou EGF-2) refere-se à parte de uma proteína que partilha uma homologia de sequência com uma porção específica de 30 a 40 aminoácidos da sequência do factor de crescimento epidérmico (EGF). O domínio EGF inclui seis resíduos de cisteína que estão envolvidos (no EGF) em ligações dissulfureto. A estrutura principal de um domínio EGF consiste numa folha de duas cadeias, seguida de uma volta para uma folha curta de duas cadeias em posição C-terminal. O FVII contém dois domínios EGF: EGF-1 e EGF-2. Estes domínios correspondem às posições de aminoácidos 46-82 e 87-128, respectivamente, do polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3.

Tal como aqui utilizados, os termos "polipéptido não modificado" ou "FVII não modificado" e suas variações gramaticais referem-se a um polipéptido de partida que é seleccionado para ser sujeito a modificação da forma aqui disponibilizada. 0 polipéptido de partida pode ser uma forma de tipo selvagem, que ocorre naturalmente, de um polipéptido. Adicionalmente, o polipéptido de partida pode estar alterado ou mutado, diferindo de uma isoforma de tipo selvagem nativa, mas é em todo o caso aqui designado por um polipéptido não modificado de partida relativamente aos polipéptidos subsequentemente modificados que são aqui produzidos. Assim, as proteínas já existentes conhecidas na técnica que tenham sido modificadas para apresentar um aumento ou uma diminuição desejados de uma actividade ou propriedade particular, em comparação com uma proteína de referência não modificada, podem ser seleccionadas e usadas como o polipéptido não modificado de partida. Por exemplo, uma proteína que tenha sido modificada a partir da sua forma nativa através de uma ou mais modificações de aminoácidos individuais e possua ou um aumento ou uma diminuição de uma propriedade pretendida, por exemplo uma modificação num resíduo ou resíduos de aminoácidos para alterar a glicosilação, pode ser uma proteína-alvo, aqui designada por não modificada, seleccionada para modificação subsequente da mesma ou de uma propriedade diferente. Os exemplos de polipéptidos do FVII modificados conhecidos na técnica incluem qualquer polipéptido do FVII descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. n.os 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 e 6806063; nas Publicações de Patentes U.S. n.os 20030100506 e 20040220106; e nas Publicações de Patentes Internacionais n.os WO1988010295, WO200183725, W02003093465, WO200338162, W02004083361, W02004108763, W02004029090, W02004029091, W02004111242 e WO2005123916.

Tal como aqui utilizados, os termos "polipéptidos do factor VII modificados" e "factor VII modificado" referem-se a um polipéptido do FVII que possui uma ou mais diferenças de aminoácidos em comparação com um polipéptido do factor VII não modificado. As uma ou mais diferenças de aminoácidos podem ser mutações de aminoácidos, tal como uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos, ou podem ser inserções ou deleções de domínios completos, e quaisquer suas combinações. Tipicamente, um polipéptido do FVII modificado possui uma ou mais modificações na respectiva sequência primária em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais diferenças de aminoácidos em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Todas as modificações estão contempladas, desde que o polipéptido resultante apresente pelo menos uma actividade do FVII associada a um polipéptido do FVII nativo, como, por exemplo, a actividade catalítica, a actividade proteolítica, a capacidade de ligação ao FT ou a capacidade de ligação às plaquetas activadas.

Tal como aqui utilizado, o termo "inibidores da coagulação" refere-se a proteínas ou moléculas que actuam para inibir ou impedir a coagulação ou formação de coágulos. A inibição ou impedimento da coagulação pode ser observado in vivo ou in vitro e pode ser determinado utilizando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, embora não limitado a estes exemplos, o ensaio do tempo de protromboplastina (TP) ou o ensaio do tempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) .

Tal como aqui utilizado, o inibidor da via do factor tecidual (TFPI, também designado por TFPI-1) é um inibidor de tipo Kunitz que está envolvido na formação de um complexo inibidor quaternário TF/FVIIa/TFPI/FXa no qual a actividade do FVIIa é inibida. O TFPI é expresso como duas formas precursoras diferentes após splicing alternativo, os precursores TFPla (SEQ ID NO:101) e TFPI (SEQ ID NO:103), que são clivados durante a secreção para produzir uma proteína madura com 276 aminoácidos (SEQ ID NO:102) e outra proteína madura com 223 aminoácidos (SEQ ID NO:104), respectivamente. O TFPI contém 3 domínios de Kunitz, dos quais o domínio de Kunitz 1 é responsável pela ligação e inibição do FVIIa.

Tal como aqui utilizado, o termo TFPI-2 (também conhecido como proteína placentária 5 (PP5) e inibidor de proteases de serina associado à matriz (MSPI)) refere-se a um homólogo do TFPI. A proteína TFPI-2 madura de 213 aminoácidos (SEQ ID NO: 105) contém três domínios de tipo Kunitz que apresentam uma identidade de sequência primária de 43%, 35% e 53% com os domínios de tipo Kunitz 1, 2, e 3, respectivamente, do TFPI-1. O TFPI-2 desempenha um papel na regulação da digestão e remodelação da matriz extracelular e não se crê que seja um factor importante na via de coagulação.

Tal como o termo é aqui utilizado, a antitrombina III (AT-111) é um inibidor das proteases de serina (serpina) . A AT-III é sintetizada como uma proteína precursora contendo 464 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:122), que é clivada durante a secreção para libertar uma antitrombina madura de 432 aminoácidos (SEQ ID NO:123).

Tal como aqui utilizado, o termo cofactores refere-se a proteínas ou moléculas que se ligam a outras proteínas ou moléculas específicas para formar um complexo activo. Em alguns exemplos, a ligação a um cofactor é necessária para uma actividade proteolítica óptima. Por exemplo, o factor tecidual (TF) é um cofactor do FVIIa. A ligação do FVIIa ao TF induz alterações conformacionais que resultam numa actividade proteolítica acrescida do FVIIa para os seus substratos, FX e FIX.

Tal como aqui utilizado, o termo factor tecidual (TF) refere-se a uma glicoproteína transmembranar de 263 aminoácidos (SEQ ID NO:124) que actua como um cofactor para o FVIIa. É expresso de forma constitutiva pelas células do músculo liso e pelos fibroblastos e ajuda a iniciar a coagulação mediante ligação ao FVII e ao FVIIa, quando estas células entram em contacto com a corrente sanguínea após uma lesão nos tecidos.

Tal como aqui utilizado, o termo plaqueta activada refere-se a uma plaqueta que foi activada pela ligação de moléculas como o colagénio, o tromboxano A2, o ADP e a trombina, para sofrer várias modificações ao nível da morfologia, do fenótipo e da função que, no final, promovem a coagulação. Por exemplo, uma plaqueta activada muda de forma, adoptando uma forma mais amorfa com dedos projectados. As plaquetas activadas também experimentam uma "cambalhota" da membrana celular, de modo que a fosfatidilserina e outros fosfolípidos carregados negativamente que normalmente estão presentes no folheto interno da membrana celular sofrem uma translocação para a superfície exterior virada para o plasma. Estas membranas das plaquetas activadas fornecem a superfície na qual muitas das reacções da cascata de coagulação são realizadas. As plaquetas activadas também segregam vesículas contendo factores pró-coagulantes como o vWF, o FV, a trombina, o ADP e o tromboxano A2 e aderem umas às outras para formar um rolhão plaquetário, que é estabilizado pela fibrina para se transformar num coágulo.

Tal como aqui utilizado, o termo ligação e/ou afinidade acrescida para as plaquetas activadas, e quaisquer suas variações gramaticais, refere-se a uma capacidade melhorada de um polipéptido ou uma proteína, por exemplo um polipéptido do FVII, para se ligar à superfície de uma plaqueta activada, em comparação com um polipéptido ou proteína de referência. Por exemplo, a capacidade de um polipéptido do FVII modificado para se ligar às plaquetas activadas pode ser maior do que a capacidade do polipéptido do FVII não modificado para se ligar às plaquetas activadas. A ligação e/ou a afinidade de um polipéptido para as plaquetas activadas pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a ligação e/ou a afinidade de um polipéptido não modificado. Os ensaios para determinar a ligação e/ou a afinidade de um polipéptido para as plaquetas activadas são conhecidos na técnica. A ligação de um polipéptido do FVII às plaquetas activadas é mediada através da interacção dos aminoácidos presentes no domínio Gla do polipéptido do FVII com os fosfolípidos carregados negativamente, como a fosfatidilserina, na plaqueta activada. Como tal, os métodos para determinar a ligação de polipéptidos, como os polipéptidos do FVII, às plaquetas activadas utilizam membranas e vesículas que contêm fosfolípidos, por exemplo fosfatidilserina. Por exemplo, a capacidade de um polipéptido para se ligar a uma plaqueta activada é reflectida pela capacidade do polipéptido para se ligar a vesículas fosfolipídicas, e esta pode ser medida por meio de técnicas de dispersão de luz.

Tal como aqui utilizado, o termo ligação e/ou afinidade acrescida para os fosfolípidos, e quaisquer suas variações gramaticais, refere-se a uma capacidade melhorada de um polipéptido ou uma proteína para se ligar aos fosfolípidos, em comparação com um polipéptido ou proteína de referência. Os fosfolípidos podem incluir quaisquer fosfolípidos, mas incluem em particular a fosfatidilserina. A ligação e/ou a afinidade de um polipéptido para os fosfolípidos pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a ligação e/ou a afinidade de um polipéptido não modificado. Os ensaios para determinar a afinidade e/ou a ligação de um polipéptido aos fosfolípidos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a ligação de um polipéptido do FVII às vesículas fosfolipídicas pode ser determinada através da dispersão relativa da luz a 902 em relação à luz incidente. A intensidade da dispersão da luz com as vesículas fosfolipídicas sozinhas e com as vesículas fosfolipídicas mais o FVII é medida para determinar a constante de dissociação. Também é possível utilizar a ressonância de plasma de superfície, por exemplo num instrumento do tipo biossensor BIAcore, para medir a afinidade dos polipéptidos do FVII para as membranas fosfolipídicas.

Tal como aqui utilizado, o termo "resistência acrescida aos inibidores" ou "resistência acrescida ao TFPI" ou "resistência acrescida à AT-III" refere-se a qualquer nível de redução da sensibilidade de um polipéptido aos efeitos inibitórios de um inibidor, como o TFPI ou a AT-III, em comparação com um polipéptido de referência, por exemplo um polipéptido do FVII não modificado. Por exemplo, o TFPI, complexado com o FXa, liga-se ao complexo TF/FVIIa. Ao fazê-lo, inibe a actividade do FVIIa. Assim, um polipéptido do FVII modificado que reduz ou impede a ligação do TFPI ao complexo TF/FVIIa e, por conseguinte, reduz ou impede a inibição da actividade do FVIIa mediada pelo TFPI, apresenta uma resistência acrescida ao TFPI. A resistência acrescida a um inibidor, como o TFPI, pode ser analisada mediante avaliação da ligação de um polipéptido do FVII modificado a um inibidor. A resistência acrescida a um inibidor, como o TFPI, também pode ser determinada por medição da actividade intrínseca ou da actividade coagulante de um polipéptido do FVII na presença do TFPI. Os ensaios para determinar a ligação de um polipéptido a um inibidor, como o TFPI ou a ATUI, são conhecidos na técnica. No caso de inibidores não-covalentes, como por exemplo o TFPI, pode medir-se uma k±. No caso de inibidores covalentes, como por exemplo a AT-III, pode medir-se uma constante de velocidade de segunda ordem para a inibição. Adicionalmente, também é possível utilizar a ressonância de plasma de superfície, por exemplo num instrumento do tipo biossensor BIAcore, para medir a ligação dos polipéptidos do FVII ao TFPI, à AT-III ou a outros inibidores. Contudo, no caso de inibidores covalentes como a AT-III, só é possível medir uma on-rate utilizando o BIAcore. Os ensaios para determinar o efeito inibidor, por exemplo, do TFPI na actividade coagulante ou na actividade intrínseca do FVII também são conhecidos na técnica. Por exemplo, a capacidade de um polipéptido do FVII modificado para clivar o seu substrato FX, na presença ou na ausência do TFPI, pode ser medida e a extensão em que o TFPI inibe a reacção determinada. Este resultado pode ser comparado com a capacidade de um polipéptido do FVII não modificado para clivar o seu substrato FX, na presença ou na ausência do TFPI. Um polipéptido modificado que apresenta uma resistência acrescida a um inibidor apresenta, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da resistência aos efeitos de um inibidor em comparação com um polipéptido não modificado.

Tal como aqui utilizado, o termo "actividade biológica" refere-se às actividades in vivo de um composto ou às respostas fisiológicas que ocorrem após a administração in vivo de um composto, uma composição ou outra mistura. A actividade biológica engloba, assim, os efeitos terapêuticos e a actividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. As actividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro concebidos para testar ou usar tais actividades. Assim, para efeitos deste documento, uma actividade biológica de um polipéptido do FVII engloba a actividade coagulante.

Tal como aqui utilizado, o termo "avaliar" e suas variações gramaticais pretende incluir a determinação quantitativa e qualitativa no sentido de obter um valor absoluto para a actividade de um polipéptido, bem como obter um indice, uma razão, uma percentagem, um valor visual ou outro valor indicativo do nível da actividade. A avaliação pode ser directa ou indirecta. Por exemplo, a detecção da clivagem de um substrato por um polipéptido pode efectuar-se por medição directa do produto, ou pode ser medida indirectamente determinando a actividade resultante do substrato clivado.

Tal como aqui utilizado, o termo "numeração da quimiotripsina" refere-se à numeração de aminoácidos de um polipéptido da quimiotripsina madura da SEQ ID NO:107. É possível efectuar o alinhamento de um domínio protease de outra protease, como por exemplo o domínio protease do factor VII, com a quimiotripsina. Nesta situação, os aminoácidos do factor VII que correspondem aos aminoácidos da quimiotripsina recebem a numeração dos aminoácidos da quimiotripsina. As posições correspondentes podem ser determinadas mediante este alinhamento por um perito na especialidade, recorrendo a alinhamentos manuais ou utilizando os numerosos programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP). As posições correspondentes também podem basear-se em alinhamentos estruturais, por exemplo utilizando alinhamentos das estruturas proteicas simulados computacionalmente. A menção de que os aminoácidos de um polipéptido correspondem aos aminoácidos numa dada sequência apresentada refere-se aos aminoácidos identificados no seguimento do alinhamento do polipéptido com a sequência apresentada para maximizar a identidade ou a homologia (em que os aminoácidos conservados estão alinhados) usando um algoritmo de alinhamento padrão, como o algoritmo GAP. Os correspondentes números da quimiotripsina das posições de aminoácidos 153 a 606 do polipéptido do FVII ilustrado na SEQ ID NO: 3 são disponibilizados na Tabela 1. As posições de aminoácidos em relação à sequência apresentada na SEQ ID NO:3 estão em tipo de letra normal, os resíduos de aminoácidos nessas posições estão em negrito e os números da quimiotripsina correspondentes estão em itálico. Por exemplo, do alinhamento do factor VII maduro (SEQ ID NO:3) com a quimiotripsina madura (SEQ ID NO:107), a isoleucina (I) na posição de aminoácido 153 do factor VII recebe a numeração da quimiotripsina 116. Os aminoácidos subsequentes são numerados em conformidade. Num exemplo, um ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 210 do factor VII maduro (SEQ ID NO:3) corresponde à posição de aminoácido E70 baseada na numeração da quimiotripsina. Quando existe um resíduo numa protease, mas não está presente na quimiotripsina, o resíduo de aminoácido recebe uma notação de uma letra. Por exemplo, os resíduos na quimiotripsina que fazem parte de uma volta com o aminoácido 60 baseado na numeração da quimiotripsina, mas estão inseridos na sequência do factor VII comparada com a quimiotripsina, são designados, por exemplo, por K60a, I60b, K60c ou N60d. Estes resíduos correspondem a K197, 1198, K199 e N200, respectivamente, na numeração referente à sequência do factor VII maduro (SEQ ID NO:3).

Tabela 1. Numeração da quimiotripsina do factor VII

Tal como aqui utilizado, o termo ácidos nucleicos inclui o ADN, o ARN e seus análogos, incluindo os ácidos nucleicos peptídicos (PNA) e suas misturas. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. Quando é feita uma referência a sondas ou iniciadores, que idealmente estão marcados, por exemplo com um marcador detectável, tal como um marcador fluorescente ou um radiomarcador, são contempladas moléculas de cadeia simples. Estas moléculas possuem normalmente um comprimento adequado para que o seu alvo seja estatisticamente único ou de baixo número de cópias (normalmente menos de 5, geralmente menos de 3) , de modo a pesquisar uma biblioteca ou iniciar uma síntese numa biblioteca. Geralmente, uma sonda ou um iniciador contém pelo menos 14, 16 ou 30 nucleótidos contíguos de uma sequência complementar de, ou idêntica a, um gene de interesse. As sondas e os iniciadores podem ter comprimentos de 10, 20, 30, 50, 100 ou mais nucleótidos.

Tal como o termo é aqui utilizado, um péptido refere-se a um polipéptido que possui de 2 a 40 aminoácidos de comprimento.

Tal como aqui utilizados, os aminoácidos que surgem nas várias sequências de aminoácidos aqui disponibilizadas são identificados de acordo com as suas abreviaturas conhecidas de três letras ou de uma letra (Tabela 1). Os nucleótidos que surgem nos vários fragmentos de ácidos nucleicos são designados pelas designações convencionais de uma letra habitualmente usadas na técnica.

Tal como o termo é aqui utilizado, um "aminoácido" é um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo ácido carboxílico. Um polipéptido contém dois ou mais aminoácidos. Para efeitos deste documento, os aminoácidos incluem os vinte aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos não-naturais e análogos de aminoácidos (isto é, aminoácidos em que o carbono α tem uma cadeia lateral).

De acordo com a nomenclatura convencional de polipéptidos descrita em J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969) e no Título 37, 1.821-1.822, do código de regulamentos federais (C.F.R.) adoptado, as abreviaturas para os resíduos de aminoácidos estão apresentadas na Tabela 1:

Tabela 2 - Tabela de correspondência

É de salientar que todas as sequências de resíduos de aminoácidos aqui representadas por fórmulas têm uma orientação da esquerda para a direita, na direcção convencional do extremo N-terminal para o extremo C-terminal. Além disso, a frase "resíduo de aminoácido" é definida de forma ampla para incluir os aminoácidos indicados na Tabela de Correspondência (Tabela 2) e os aminoácidos modificados e pouco comuns, como aqueles referidos no 37 C.F.R., 1.821-1.82. Adicionalmente, é de referir que um traço no início ou no final de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma liqação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos, a um grupo N-terminal como NH2, ou a um grupo C-terminal como COOH.

Tal como o termo é aqui utilizado, um "aminoácido hidrofóbico" inclui qualquer um dos aminoácidos considerados hidrofóbicos utilizando a escala de hidrofobicidade de Eisenberg. Os exemplos incluem os aminoácidos hidrofóbicos de ocorrência natural como a isoleucina, a fenilalanina, a valina, a leucina, o triptofano, a metionina, a alanina, a glicina, a cisteína e a tirosina (Eisenberg et al. , (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120) . Os aminoácidos hidrofóbicos que não são de ocorrência natural também estão incluídos.

Tal como o termo é aqui utilizado, um "aminoácido ácido" inclui, entre os aminoácidos de ocorrência natural, os resíduos de ácido aspártico e ácido glutâmico. Os aminoácidos ácidos que não são de ocorrência natural também estão incluídos.

Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácidos de ocorrência natural" refere-se aos 20 L-aminoácidos que existem nos polipéptidos.

Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido não-natural" refere-se a um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo ácido carboxílico que não é um dos aminoácidos de ocorrência natural indicados na Tabela 2. Os aminoácidos que não são de ocorrência natural incluem assim, por exemplo, os aminoácidos ou análogos de aminoácidos distintos dos 20 aminoácidos de ocorrência natural e incluem, embora não estejam limitados a estes, os D-estereoisómeros de aminoácidos. Os exemplos de aminoácidos não-naturais são conhecidos pelos peritos na especialidade e podem ser incluídos num polipéptido do factor VII modificado.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma construção de ADN é uma molécula de ADN linear ou circular, de cadeia simples ou de cadeia dupla, que contém segmentos de ADN combinados e justapostos de uma forma que não é encontrada na natureza. As construções de ADN existem em resultado de uma manipulação humana e incluem os clones e outras cópias de moléculas manipuladas.

Tal como o termo é aqui utilizado, um segmento de ADN é uma porção de uma molécula de ADN mais comprida que possui características especificadas. Por exemplo, um segmento de ADN que codifica um polipéptido especificado é uma porção de uma molécula de ADN mais comprida, como um plasmídeo ou um fragmento de um plasmídeo, que, quando é lida na direcção 5' para 3', codifica a sequência de aminoácidos do polipéptido especificado.

Tal como aqui utilizado, o termo polinucleótido designa um polímero de desoxirribonucleótidos ou de ribonucleótidos, de cadeia simples ou de cadeia dupla, lido da extremidade 5' para a extremidade 3'. Os polinucleótidos incluem o ARN e o ADN e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. 0 comprimento de uma molécula de polinucleótido é aqui apresentado em termos de nucleótidos (abreviado por "nt") ou de pares de bases (abreviado por "pb") . 0 termo nucleótidos é utilizado para as moléculas de cadeia simples e de cadeia dupla sempre que o contexto o permita. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla, ele é utilizado para indicar o comprimento total e deve ser entendido como sendo equivalente ao termo pares de bases. Os peritos na especialidade reconhecerão que as duas cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla podem diferir ligeiramente em termos de comprimento e que as suas extremidades podem ser desencontradas; assim, todos os nucleótidos numa molécula de polinucleótido de cadeia dupla não podem ser emparelhados. Estas extremidades desemparelhadas não terão, em geral, mais de 20 nucleótidos de comprimento.

Tal como aqui utilizado, o termo "sequência primária" refere-se à sequência de resíduos de aminoácidos num polipéptido.

Tal como aqui utilizado, o termo "similaridade" entre duas proteínas ou ácidos nucleicos refere-se à proximidade entre as sequências de aminoácidos das proteínas ou as sequências de nucleótidos dos ácidos nucleicos. A similaridade pode basear-se no grau de identidade e/ou homologia das sequências de resíduos e dos resíduos contidos nas mesmas. Os métodos para avaliar o grau de similaridade entre as proteínas ou os ácidos nucleicos são conhecidos pelos peritos na especialidade. Por exemplo, num método de avaliação da similaridade de sequências, duas sequências de aminoácidos ou de nucleótidos são alinhadas de um modo que produz um grau máximo de identidade entre as sequências. "Identidade" refere-se à extensão em que as sequências de aminoácidos ou de nucleótidos são invariantes. O alinhamento das sequências de aminoácidos, e até certo ponto das sequências de nucleótidos, também pode ter em consideração as diferenças conservativas e/ou as substituições frequentes de aminoácidos (ou de nucleótidos). As diferenças conservativas são aquelas que conservam as propriedades físico-químicas dos resíduos envolvidos. Os alinhamentos podem ser globais (alinhamento das sequências comparadas ao longo do comprimento total das sequências e incluindo todos os resíduos) ou local (alinhamento de uma parte das sequências que inclui apenas a região ou as regiões mais similares).

Tal como aqui utilizados, os termos "homologia" e "identidade" são utilizados indistintamente, mas homologia para as proteínas pode incluir as modificações de aminoácidos conservativas. Em geral, para identificar as posições correspondentes, as sequências de aminoácidos são alinhadas de modo a obter a correspondência de ordem mais elevada (ver, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data,

Part I, Griffin, A.M. & Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. & Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073) .

Tal como aqui utilizado, o termo "identidade de sequência" refere-se ao número de aminoácidos (ou de bases nucleotidicas) idênticos numa comparação entre um polipéptido (ou um polinucleótido) de teste e um polipéptido (ou um polinucleótido) de referência. Os polipéptidos homólogos referem-se a um número predeterminado de resíduos de aminoácidos idênticos ou homólogos. A homologia inclui as substituições de aminoácidos conservativas, assim como os resíduos idênticos. A identidade de sequência pode ser determinada através de programas de algoritmos de alinhamento convencionais, utilizados com penalizações por lacunas predefinidas estabelecidas por cada fornecedor. As moléculas de ácidos nucleicos homólogas referem-se a um número predeterminado de nucleótidos idênticos ou homólogos. A homologia inclui as substituições que não alteram o aminoácido codificado (isto é, as "substituições silenciosas"), assim como os resíduos idênticos. As moléculas de ácidos nucleicos substancialmente homólogas hibridam tipicamente em condições de estringência moderada ou de alta estringência ao longo de todo o comprimento do ácido nucleico ou ao longo de pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% da molécula de ácido nucleico completa de interesse. As moléculas de ácidos nucleicos que contêm codões degenerados em lugar de codões na molécula de ácido nucleico de hibridação também estão contempladas. (Para determinação da homologia de proteínas, é possível alinhar os aminoácidos conservatives, assim como os aminoácidos idênticos; neste caso, a percentagem de identidade e a percentagem de homologia varia.) Se duas moléculas quaisquer de ácidos nucleicos têm ou não sequências de nucleótidos (ou dois polipéptidos quaisquer têm sequências de aminoácidos) que são "idênticas" em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% pode ser determinado utilizando algoritmos computacionais conhecidos, como o programa "FAST A", usando, por exemplo, os parâmetros predefinidos de acordo com Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) (outros programas incluem o pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994) e Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)) . Por exemplo, a função BLAST da base de dados do National Center for Biotechnology Information pode ser usada para determinar a identidade. Outros programas disponíveis comercialmente ou disponíveis ao público incluem o programa DNAStar "MegAlign" (Madison, Wisconsin) e o programa "Gap" do Genetics Computer Group da Universidade do Wisconsin (UWG) (Madison, Wisconsin)). A percentagem de homologia ou de identidade das moléculas de proteínas e/ou de ácidos nucleicos pode ser determinada, por exemplo, mediante comparação da informação das sequências utilizando um programa computacional GAP (por exemplo, Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), conforme revisto por Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Resumidamente, um programa GAP define a similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, os nucleótidos ou os aminoácidos) que são similares, dividido pelo número total de símbolos na sequência mais curta das duas sequências. Os parâmetros predefinidos para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para as identidades e 0 para as não-identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), conforme descrita por Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalização de 3,0 por cada lacuna e uma penalização adicional de 0,10 por cada símbolo em cada lacuna; e (3) nenhuma penalização por lacunas finais.

Por conseguinte, tal como aqui utilizado, o termo "identidade" representa uma comparação entre um polipéptido ou polinucleótido de teste e um polipéptido ou polinucleótido de referência. Num exemplo não limitativo, o termo "idêntico em pelo menos 90% a" refere-se a percentagens de identidade de 90 a 100% em relação aos polipéptidos de referência. A identidade a um grau de 90% ou superior é indicativa do facto de que, assumindo para efeitos de exemplificação que se compara um polipéptido de teste e um polipéptido de referência com um comprimento de 100 aminoácidos, não mais de 10% (isto é, 10 de 100) dos aminoácidos no polipéptido de teste diferem dos aminoácidos do polipéptido de referência. É possível efectuar comparações idênticas entre polinucleótidos de teste e de referência. Tais diferenças podem representar-se como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente ao longo do comprimento total de uma sequência de aminoácidos ou podem agrupar-se numa ou mais localizações de comprimento variável até ao máximo permitido, por exemplo, 10/100 diferenças de aminoácidos (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de ácidos nucleicos ou de aminoácidos. Ao nível de homologias ou identidades superiores a cerca de 85-90%, o resultado deverá ser independente do programa e do conjunto de parâmetros para as lacunas; tais níveis elevados de identidade podem ser avaliados facilmente, frequentemente sem necessitar de software.

Tal como aqui utilizados, está igualmente subentendido que os termos "substancialmente idêntico" ou "similar" variam com o contexto conforme reconhecido pelos peritos na especialidade relevante, mas que esses peritos são capazes de avaliar esse facto.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma sequência alinhada refere-se à utilização de homologia (similaridade e/ou identidade) para alinhar as posições correspondentes numa sequência de nucleótidos ou de aminoácidos. Tipicamente, alinham-se duas ou mais sequências que estão relacionadas por uma identidade de 50% ou superior. Um conjunto alinhado de sequências refere-se a 2 ou mais sequências que estão alinhadas em posições correspondentes e pode incluir o alinhamento de sequências derivadas de ARN, como EST e outros ADNc, com uma sequência de ADN genómico.

Tal como aqui utilizado, o termo "híbrida especificamente" refere-se à hibridação, através do emparelhamento de bases complementares, de uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um oligonucleótido) com uma molécula de ácido nucleico alvo. Os peritos na especialidade estão familiarizados com os parâmetros in vitro e in vivo que afectam a hibridação específica, como o comprimento e a composição da molécula particular. Os parâmetros particularmente relevantes para a hibridação in vitro incluem ainda a temperatura de hibridação e de lavagem, a composição do tampão e a concentração de sais. As condições de lavagem exemplificativas para remover as moléculas de ácidos nucleicos gue não estão ligadas de forma especifica, em condições de alta estringência, são SSPE 0,lx; SDS a 0,1%; 652C; e em condições de estringência moderada, são SSPE 0,2x; SDS a 0,1%; 502C. Na técnica conhecem-se condições de estringência equivalentes. Um perito pode ajustar facilmente estes parâmetros para obter a hibridação específica de uma molécula de ácido nucleico com uma molécula de ácido nucleico alvo apropriada para uma aplicação particular.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma proteína ou polipéptido isolado ou purificado, ou uma sua porção biologicamente activa, está substancialmente livre de material celular ou de outras proteínas contaminantes provenientes da célula ou tecido do qual a proteína deriva, ou substancialmente livre de precursores químicos ou de outros produtos químicos quando é sintetizada quimicamente. Pode determinar-se que as preparações estão substancialmente livres se aparentarem estar livres de impurezas facilmente detectáveis conforme determinado por métodos de análise convencionais, como a cromatografia de camada fina (CCF), a electroforese em gel e a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), utilizados pelos peritos na especialidade para avaliar essa pureza, ou suficientemente puras de modo que uma purificação adicional não alteraria de forma detectável as propriedades físicas e químicas, como as actividades proteolítica e biológica, da substância. Os métodos de purificação dos compostos para produzir compostos substancial e quimicamente puros são conhecidos pelos peritos na especialidade. Um composto substancial e quimicamente puro pode, contudo, ser uma mistura de estereoisómeros. Nesses casos, uma purificação adicional poderia aumentar a actividade específica do composto. O termo substancialmente livre de material celular inclui as preparações de proteínas em que a proteína é separada dos componentes celulares das células de onde é isolada ou produzida de modo recombinante. 0 termo substancialmente livre de material celular poderá incluir as preparações de proteínas proteases contendo menos de cerca de 30% (em peso seco) de proteínas não-proteases (aqui também denominadas proteína contaminante), geralmente menos de cerca de 20% de proteínas não-proteases ou 10% de proteínas não-proteases ou menos de cerca de 5% de proteínas não-proteases. Quando a proteína protease ou uma sua porção activa é produzida de modo recombinante, também está substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos de, cerca de, ou é igual a 20%, 10% ou 5% do volume da preparação da proteína protease.

Tal como aqui utilizado, o termo substancialmente livre de precursores químicos ou de outros produtos químicos inclui as preparações de proteínas proteases em que a proteína é separada dos precursores químicos ou de outros produtos químicos que estão envolvidos na sua síntese. O termo inclui as preparações de proteínas proteases contendo menos de cerca de 30% (em peso seco) , 20%, 10%, 5% ou menos de precursores químicos ou de componentes ou produtos químicos não-proteases .

Tal como aqui utilizado, o termo produção por métodos recombinantes através da utilização de técnicas de ADN recombinante refere-se à utilização dos métodos bem conhecidos de biologia molecular para expressar proteínas codificadas por um ADN clonado.

Tal como aqui utilizado, o termo vector (ou plasmídeo) refere-se a elementos discretos que são utilizados para introduzir um ácido nucleico heterólogo nas células, quer para a sua expressão quer para a sua replicação. Os vectores normalmente permanecem epissómicos, embora possam ser concebidos para realizar a integração de um gene ou de uma sua porção num cromossoma do genoma. Os vectores que são cromossomas artificiais, como os cromossomas artificiais bacterianos, os cromossomas artificiais de leveduras e os cromossomas artificiais de mamíferos, também estão contemplados. A selecção e utilização de tais vectores são bem conhecidas pelos peritos na especialidade.

Tal como aqui utilizado, o termo expressão refere-se ao processo pelo qual o ácido nucleico é transcrito em ARNm e traduzido em péptidos, polipéptidos ou proteínas. Se o ácido nucleico for derivado de ADN qenómico, e caso seja seleccionado um organismo ou uma célula hospedeira eucariótica apropriada, a expressão pode incluir o processamento, como seja o splicing do ARNm.

Tal como o termo é aqui utilizado, um vector de expressão inclui os vectores capazes de expressar um ADN que está ligado funcionalmente a sequências reguladoras, por exemplo regiões promotoras, que são capazes de realizar a expressão desses fragmentos de ADN. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e de terminação e, opcionalmente, podem incluir uma ou mais origens de replicação, uma ou mais marcas de selecção, um amplificador, um sinal de poliadenilação e elementos similares. Os vectores de expressão são geralmente derivados de ADN plasmídico ou virai ou podem conter elementos de ambos. Assim, um vector de expressão refere-se a uma construção de ADN ou de ARN recombinante, tal como um plasmídeo, um fago, um vírus recombinante ou outro vector, que, ao ser introduzido numa célula hospedeira apropriada, resulta na expressão do ADN clonado. Os vectores de expressão apropriados são bem conhecidos pelos peritos na especialidade e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem epissómicos ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeira.

Tal como aqui utilizado, o termo vector também inclui os "vectores de vírus" ou "vectores virais". Os vectores virais são vírus manipulados que estão ligados funcionalmente a genes exógenos para transferir (como veículos ou vaivéns) os genes exógenos para as células.

Tal como o termo é aqui utilizado, um adenovirus refere-se a qualquer um de um grupo de vírus contendo ADN que causam conjuntivite e infecções do tracto respiratório superior nos seres humanos.

Tal como aqui utilizado, o termo ADN nu refere-se ao ADN livre de histonas que pode ser utilizado para vacinas e terapia génica. 0 ADN nu é o material genético que é passado de célula para célula durante um processo de transferência génica denominado transformação ou transfecção. Na transformação ou transfecção, o ADN purificado ou nu que é captado pela célula receptora fornecerá à célula receptora uma nova caracteristica ou fenótipo.

Tal como aqui utilizado, o termo ligado funcionalmente quando se refere a segmentos de ADN significa que os segmentos são dispostos de modo a actuarem de forma concertada para os respectivos fins pretendidos, por exemplo, a transcrição inicia-se no promotor e prossegue através do segmento codificante até à sequência de terminação.

Tal como o termo é aqui utilizado, um agente que modula a actividade de uma proteína ou a expressão de um gene ou ácido nucleico diminui ou aumenta ou altera de outro modo a actividade da proteína ou, de alguma forma, regula positiva ou negativamente ou altera de outro modo a expressão do ácido nucleico na célula.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fusão" refere-se a um polipéptido ligado funcionalmente a um polipéptido diferente. Uma proteína quimérica ou de fusão aqui disponibilizada pode incluir um ou mais polipéptidos do FVII, ou uma sua parte, e um ou mais polipéptidos diferentes destinados a qualquer uma ou mais de uma das seguintes funções: sinais de controlo transcricionais/traducionais, sequências sinal, uma marca para localização, uma marca para purificação, parte de um domínio de uma imunoglobulina G e/ou um agente de direccionamento. Um polipéptido do FVII quimérico também inclui aqueles polipéptidos cujas regiões ou domínios endógenos do polipéptido foram trocados com outro polipéptido. Estas proteínas quiméricas ou de fusão incluem aquelas produzidas por técnicas recombinantes como proteínas de fusão, aquelas produzidas por meios químicos, tal como por acoplamento químico através, por exemplo, do acoplamento a grupos sulfidrilo, e aquelas produzidas por qualquer outro método de acordo com o qual pelo menos um polipéptido (isto é, o FVII), ou uma sua parte, é ligado directamente ou indirectamente através de elemento(s) de ligação a outro polipéptido.

Tal como aqui utilizado, o termo ligado funcionalmente quando diz respeito a uma proteína de fusão refere-se a um polipéptido de uma protease e um polipéptido de uma não-protease que estão fundidos in-frame um ao outro. 0 polipéptido da não-protease pode ser fundido com a extremidade N-terminal ou C-terminal do polipéptido da protease.

Tal como o termo é aqui utilizado, um agente de direccionamento é qualquer grupo, por exemplo uma proteína ou uma sua parte eficaz, que proporciona uma ligação específica a uma molécula da superfície celular, como um receptor de superfície celular, que em alguns casos pode internalizar um conjugado ligado ou uma parte deste. Um agente de direccionamento também pode ser um agente que promove ou facilita, por exemplo, o isolamento ou a purificação por afinidade do conjugado; a união do conjugado a uma superfície; ou a detecção do conjugado ou de complexos contendo o conjugado.

Tal como aqui utilizado, o termo derivado ou análogo de uma molécula refere-se a uma parte derivada da molécula ou a uma versão modificada da molécula.

Tal como aqui utilizado, o termo "doença ou perturbação" refere-se a uma afecção patológica num organismo resultante de uma causa ou afecção incluindo, mas não limitada a, infecções, afecções adquiridas e afecções genéticas, e caracterizada por sintomas identificáveis. As doenças e perturbações de interesse neste documento são aquelas que envolvem a coagulação, incluindo aquelas mediadas por proteínas de coagulação e aquelas em que as proteínas de coagulação têm um papel na etiologia ou na patologia. As doenças e as perturbações também incluem aquelas que são causadas pela ausência de uma proteína, como na hemofilia, sendo de particular interesse aqui aquelas perturbações onde não se verifica coagulação devido a uma deficiência ou defeito numa proteína de coagulação.

Tal como aqui utilizado, o termo "pró-coagulante" refere-se a qualquer substância que promove a coagulação sanguínea.

Tal como aqui utilizado, o termo "anticoagulante" refere-se a qualquer substância que inibe a coagulação sanguínea.

Tal como aqui utilizado, o termo "hemofilia" refere-se a uma perturbação hemorrágica causada por uma deficiência num dos factores de coagulação do sangue. A hemofilia pode ser o resultado, por exemplo, de ausência, expressão reduzida ou função reduzida de um factor de coagulação. 0 tipo mais comum de hemofilia é a hemofilia A, que resulta de uma deficiência no factor VIII. 0 segundo tipo mais comum de hemofilia é a hemofilia B, que resulta de uma deficiência no factor IX. A hemofilia C, também denominada deficiência de FXI, é uma forma mais branda e menos comum de hemofilia.

Tal como aqui utilizado, o termo "hemofilia congénita" refere-se a tipos de hemofilia que são herdados. A hemofilia congénita resulta de mutação, deleção, inserção ou outra modificação de um gene de um factor de coagulação, em que a produção do factor de coagulação está ausente, é reduzida ou não funcional. Por exemplo, as mutações hereditárias em genes de factores de coagulação, como o factor VIII e o factor IX, resultam nas hemofilias congénitas hemofilia A e B, respectivamente.

Tal como aqui utilizado, o termo "hemofilia adquirida" refere-se a um tipo de hemofilia que se desenvolve na idade adulta devido à produção de auto-anticorpos que inactivam o FVIII.

Tal como aqui utilizado, o termo "perturbação hemorrágica" refere-se a uma afecção em que o sujeito tem uma capacidade diminuída para controlar o sangramento. As perturbações hemorrágicas podem ser herdadas ou adquiridas e podem resultar, por exemplo, de defeitos ou deficiências na via de coagulação, defeitos ou deficiências na actividade plaquetária ou defeitos vasculares.

Tal como aqui utilizado, o termo "perturbação hemorrágica adquirida" refere-se a perturbações hemorrágicas que resultam de deficiências na coagulação causadas por afecções como doença hepática, deficiência de vitamina K ou terapêutica com varfarina ou outro anticoagulante.

Tal como o termo é aqui utilizado, "tratar" um sujeito que tem uma doença ou afecção significa que um polipéptido, uma composição ou outro produto aqui disponibilizado é administrado ao sujeito.

Tal como aqui utilizados, um agente terapêutico, um regime terapêutico, um radioprotector ou um agente quimioterapêutico referem-se a fármacos e terapêuticas farmacológicas convencionais, incluindo vacinas, que são bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Os agentes radioterapêuticos são bem conhecidos na técnica.

Tal como aqui utilizado, o termo tratamento significa qualquer forma na qual os sintomas de uma afecção, perturbação ou doença são melhorados ou beneficamente alterados de outro modo. Assim, o tratamento engloba a profilaxia, a terapêutica e/ou a cura. 0 tratamento também engloba qualquer utilização farmacêutica das composições deste invento. 0 tratamento engloba igualmente qualquer utilização farmacêutica de um FVII modificado e das composições aqui disponibilizadas.

Tal como o termo é aqui utilizado, melhoria dos sintomas de uma doença ou perturbação particular através de um tratamento, tal como a administração de uma composição farmacêutica ou de outro agente terapêutico, refere-se a qualquer redução, permanente ou temporária, duradoura ou transitória, dos sintomas que pode ser atribuída ou associada à administração da composição ou agente terapêutico.

Tal como aqui utilizado, o termo prevenção ou profilaxia refere-se a métodos nos quais o risco de desenvolver uma doença ou afecção é reduzido. A profilaxia inclui a redução do risco de desenvolver uma doença ou afecção e/ou a prevenção do agravamento dos sintomas ou da progressão de uma doença ou a redução do risco de agravamento dos sintomas ou de progressão de uma doença.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma quantidade eficaz de um composto ou composição para tratar uma doença particular é uma quantidade que é suficiente para melhorar, ou de algum modo reduzir, os sintomas associados à doença. Esta quantidade pode ser administrada como uma dose única ou pode ser administrada de acordo com um regime, por meio dos quais é eficaz. A quantidade pode curar a doença, embora tipicamente seja administrada para melhorar os sintomas da doença. Normalmente, é necessária uma administração repetida para obter uma melhoria desejada dos sintomas.

Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose terapeuticamente eficaz" refere-se a um agente, um composto, um material ou uma composição contendo um composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico. Uma quantidade eficaz é a quantidade de um agente terapêutico necessária para prevenir, curar, melhorar, parar ou parar parcialmente um sintoma de uma doença ou perturbação.

Tal como aqui utilizado, o termo "doente" ou "sujeito" a tratar inclui seres humanos e/ou animais não-humanos, incluindo mamíferos. Os mamíferos incluem primatas como seres humanos, chimpanzés, gorilas e macacos; animais domesticados como cães, cavalos, gatos, porcos, cabras, vacas; e roedores como ratinhos, ratos, hamsters e gerbos.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre dois ou entre mais artigos. A associação pode ser espacial ou referir-se à utilização dos dois ou mais artigos para um fim comum.

Tal como o termo é aqui utilizado, uma composição refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos ou compostos (por exemplo, agentes, moduladores, reguladores, etc.) . Pode ser uma solução, uma suspensão, um líquido, um pó, uma pasta, formulações aquosas ou não-aquosas ou qualquer combinação destes.

Tal como o termo é aqui utilizado, um "artigo de manufactura" é um produto que é produzido e vendido. Tal como utilizado ao longo deste pedido, o termo pretende englobar os ácidos nucleicos e os polipéptidos de proteases modificados contidos em artigos de acondicionamento.

Tal como aqui utilizado, o termo fluido refere-se a qualquer composição que pode fluir. Assim, os fluidos englobam as composições que estão na forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras composições similares.

Tal como o termo é aqui utilizado, um "kit" refere-se a uma combinação embalada, que opcionalmente inclui reagentes e outros produtos e/ou componentes para executar métodos utilizando os elementos da combinação. Por exemplo, disponibilizam-se kits contendo um ácido nucleico ou um polipéptido de protease modificado aqui disponibilizado e outro artigo para um fim que inclui, embora não esteja limitado a, administração, diagnóstico e avaliação de uma actividade ou propriedade biológica. Opcionalmente, os kits incluem instruções de utilização.

Tal como aqui utilizado, o termo anticorpo inclui fragmentos de anticorpos, como os fragmentos Fab, que são constituídos por uma cadeia leve e pela região variável de uma cadeia pesada.

Tal como o termo é aqui utilizado, um receptor refere-se a uma molécula que tem uma afinidade para um ligando particular. Os receptores podem ser moléculas de ocorrência natural ou moléculas sintéticas. Os receptores também podem ser designados na técnica por anti-ligandos.

Tal como aqui utilizado, o termo animal inclui qualquer animal, tal como, embora não exclusivamente, primatas incluindo seres humanos, gorilas e macacos; roedores como ratinhos e ratos; aves como galinhas; ruminantes como cabras, vacas, veados, ovelhas; ovinos como porcos e outros animais. Os animais não-humanos excluem os seres humanos como o animal contemplado. As proteases aqui disponibilizadas provêm de qualquer fonte, animal, vegetal, procariótica e fúngica.

Tal como aqui utilizado, o termo terapia génica envolve a transferência de um ácido nucleico heterólogo, como o ADN, para determinadas células, células-alvo, de um mamífero, particularmente um ser humano, com uma perturbação ou afecção para a qual essa terapia é desejada. 0 ácido nucleico, como o ADN, é introduzido nas células-alvo seleccionadas, por exemplo directamente ou num vector ou outro veículo de entrega, de uma forma que permite que o ácido nucleico heterólogo, como o ADN, seja expresso e um produto terapêutico codificado desse modo seja produzido. Em alternativa, o ácido nucleico heterólogo, como o ADN, pode de algum modo mediar a expressão do ADN que codifica o produto terapêutico ou pode codificar um produto, como um péptido ou um ARN, que de algum modo medeia, directa ou indirectamente, a expressão de um produto terapêutico. A terapia genética também pode ser usada para entregar um ácido nucleico codificando um produto génico que substitui um gene defeituoso, ou suplementa um produto génico, produzido pelo mamífero ou pela célula na qual é introduzido. 0 ácido nucleico introduzido pode codificar um composto terapêutico, tal como uma protease ou uma protease modificada, que não é normalmente produzido no hospedeiro mamífero ou que não é produzido em quantidades terapeuticamente eficazes ou num momento terapeuticamente útil. 0 ácido nucleico heterólogo, como o ADN, que codifica o produto terapêutico pode ser modificado antes da introdução nas células do hospedeiro atingido, de forma a melhorar ou alterar de outro modo o produto ou a sua expressão. A terapia genética também pode envolver a entrega de um inibidor ou repressor ou outro modulador da expressão génica.

Tal como aqui utilizado, o termo ácido nucleico heterólogo é um ácido nucleico que não é normalmente produzido in vivo pela célula na qual é expresso, ou que é produzido pela célula, mas está num locus diferente ou é expresso de forma diferente, ou que medeia ou codifica mediadores que modificam a expressão do ácido nucleico endógeno, como o ADN, afectando a transcrição, a tradução ou outros processos bioquímicos reguláveis. 0 ácido nucleico heterólogo geralmente não é endógeno à célula na qual é introduzido, mas foi obtido a partir de outra célula ou foi preparado sinteticamente. 0 ácido nucleico heterólogo pode ser endógeno, mas é um ácido nucleico que é expresso a partir de um locus diferente ou é modificado na sua expressão. Geralmente, embora não necessariamente, este ácido nucleico codifica ARN e proteínas que não são normalmente produzidos pela célula ou não são produzidos da mesma forma na célula em que é expresso. Um ácido nucleico heterólogo, como o ADN, também pode designar-se por ácido nucleico estranho, como o ADN. Assim, o termo ácido nucleico heterólogo ou ácido nucleico estranho inclui uma molécula de ácidos nucleicos que não está presente na orientação ou posição exacta em que a sua molécula de ácidos nucleicos homóloga, como o ADN, é encontrada num genoma. Também pode referir-se a uma molécula de ácidos nucleicos de outro organismo ou espécie (isto é, exógena).

Qualquer ácido nucleico, como o ADN, que um perito na especialidade reconheça ou considere ser heterólogo ou estranho à célula em que o ácido nucleico é expresso está aqui englobado pelo termo ácido nucleico heterólogo. 0 termo ácido nucleico heterólogo inclui um ácido nucleico adicionado exogenamente que também é expresso endogenamente. Os exemplos de ácidos nucleicos heterólogos incluem, embora não estejam limitados a estes, um ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras detectáveis, tal como uma proteína que confere resistência a drogas, um ácido nucleico que codifica substâncias terapeuticamente eficazes, tais como agentes anticancerosos, enzimas e hormonas, e um ácido nucleico, como o ADN, que codifica outros tipos de proteínas, tais como anticorpos. Os anticorpos que são codificados por um ácido nucleico heterólogo podem ser segregados ou expressos na superfície da célula na qual o ácido nucleico heterólogo foi introduzido.

Tal como o termo é aqui utilizado, um produto terapeuticamente eficaz para terapia génica é um produto que é codificado por um ácido nucleico heterólogo, tipicamente ADN, que, com a introdução do ácido nucleico num hospedeiro, é expresso um produto que melhora ou elimina os sintomas, manifestações de uma doença herdada ou adquirida, ou que cura a doença. As moléculas de ácidos nucleicos biologicamente activas, como os ARNi e as moléculas anti-senso, também estão incluídas.

Tal como aqui utilizada, a menção de que um polipéptido "consiste essencialmente" numa sequência mencionada de aminoácidos significa que apenas está presente a porção mencionada, ou um seu fragmento, do polipéptido completo. 0 polipéptido pode opcionalmente incluir, e geralmente inclui, aminoácidos adicionais de outra fonte ou pode ser inserido noutro polipéptido.

Tal como aqui utilizadas, as formas singulares "um", "uma, "o" e "a" incluem os referentes plurais excepto se o contexto ditar claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a um composto que compreende "um domínio extracelular" inclui os compostos com um ou uma pluralidade de domínios extracelulares.

Tal como os termos são aqui utilizados, os intervalos e as quantidades podem ser expressos como "cerca de" um valor ou intervalo particular. "Cerca de" também inclui a quantidade exacta. Assim, "cerca de 5 bases" significa "cerca de 5 bases" e também "5 bases".

Tal como aqui utilizado, o termo "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância subsequentemente descrito ocorre ou não ocorre, e que a descrição inclui casos em que o referido evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo é não substituído ou é substituído.

Tal como aqui utilizadas, as abreviaturas para quaisquer grupos protectores, aminoácidos e outros compostos, salvo indicação em contrário, estão de acordo com as suas abreviaturas reconhecidas de uso comum ou com a Comissão da IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica (ver (1972) Biochem. 11:726) . B. Descrição geral da hemostasia São aqui disponibilizados polipéptidos do factor VII (FVII) modificados. Estes polipéptidos do FVII foram concebidos para possuir uma actividade coagulante acrescida. Por conseguinte, estes polipéptidos têm uma variedade de usos e aplicações, por exemplo, como agentes terapêuticos para modular a hemostasia e outros processos biológicos relacionados. Para entender as modificações aqui disponibilizadas e a utilização destas moléculas de FVII modificadas, é vantajoso ter uma compreensão do sistema hemostático e da cascata de coagulação sanguínea. A discussão seguinte fornece esse contexto, introdutório a uma discussão do factor VII e suas modificações. A hemostasia é o mecanismo fisiológico que estanca o sangramento resultante de uma lesão na vasculatura. A hemostasia normal depende de componentes celulares e de proteínas plasmáticas solúveis e envolve uma série de eventos de sinalização que, eventualmente, conduzem à formação de um coágulo de sangue. A coagulação inicia-se rapidamente após ocorrer uma lesão no vaso sanguíneo e as células endoteliais serem danificadas. Na fase primária da coagulação, as plaquetas são activadas para formar um rolhão hemostático no local da lesão. Segue-se a hemostasia secundária envolvendo os factores de coagulação plasmáticos, os quais actuam numa cascata proteolítica que resulta na formação de fibras de fibrina que fortalecem o rolhão plaquetário.

Ao verificar-se a lesão no vaso, a circulação sanguínea para a área lesionada imediata é limitada por constrição vascular, permitindo que as plaquetas adiram ao colagénio fibrilar recentemente exposto no tecido conjuntivo subendotelial. Esta adesão depende do factor de von Willebrand (vWF), que se liga ao endotélio no espaço de três segundos após a ocorrência da lesão, facilitando desse modo a adesão e a agregação plaquetárias. A activação das plaquetas agregadas resulta na secreção de uma variedade de factores, incluindo o ADP, o ATP, o tromboxano e a serotonina. As moléculas de adesão, o fibrinogénio, o vWF, a trombospondina e a fibronectina também são libertados. Esta secreção promove uma adesão e uma agregação plaquetárias adicionais, uma maior activação das plaquetas e da constrição dos vasos sanguíneos e a exposição à superfície da plaqueta dos fosfolípidos aniónicos, que actuam como plataformas para a montagem dos complexos de enzimas da coagulação sanguínea. As plaquetas mudam de forma conduzindo à formação de pseudópodes, o que facilita adicionalmente a agregação a outras plaquetas e resulta num rolhão plaquetário frouxo.

Simultaneamente, tem inicio uma cascata de coagulação de peptidases (a cascata de coagulação). A cascata de coagulação implica uma série de eventos de activação envolvendo clivagens proteoliticas. Nesta cascata, uma proteína inactiva de uma protease de serina (também designada por zimogénio) é convertida através da clivagem de uma ou mais ligações peptídicas numa protease activa, que actua em seguida como protease de activação para a molécula de zimogénio seguinte na cascata, resultando por fim na formação do coágulo através da reticulação da fibrina. Por exemplo, a cascata gera moléculas activadas como a trombina (a partir da clivagem da protrombina), que activa adicionalmente as plaquetas e também produz fibrina a partir da clivagem do fibrinogénio. A fibrina forma depois um polímero reticulado à volta do rolhão plaquetário para estabilizar o coágulo. Com a reparação da lesão, a fibrina é digerida pelo sistema fibrinolítico, cujos componentes principais são o plasminogénio e o activador do plasminogénio do tipo tecidual (tPA). Estas proteínas são ambas incorporadas na fibrina polimerizada, onde interagem para produzir a plasmina que, por sua vez, actua sobre a fibrina para dissolver o coágulo pré-formado. Durante a formação do coágulo, os inibidores dos factores de circulação também circulam através do sangue para impedir a formação de coágulos além do local da lesão. A interacção do sistema, desde a lesão até à formação do coágulo e subsequente fibrinólise, está descrita abaixo. 1. Adesão e agregação plaquetárias A coagulação do sangue é activamente contornada em condições normais. 0 endotélio vascular sustenta a vasodilatação, inibe a adesão e a activação plaquetárias, suprime a coagulação, reforça a clivagem da fibrina e tem um carácter anti-inflamatório. As células do endotélio vascular segregam moléculas como o óxido nitroso (NO) e a prostaciclina, que inibem a agregação plaquetária e dilatam os vasos sanguíneos. A libertação destas moléculas activa as guanilato-ciclases solúveis (sGC) e a proteína cinase I dependente de cGMP (cGKI) e aumenta os níveis de monofosfato de guanosina cíclico (cGMC), que provocam a relaxação do músculo liso na parede do vaso. Além disso, as células endoteliais expressam ADPases na superfície celular, como CD39, que controlam a activação e a agregação plaquetárias ao converterem o ADP libertado das plaquetas em nucleótidos de adenina inibidores plaquetários. 0 endotélio também desempenha um papel importante na regulação das enzimas na cascata fibrinolítica. As células endoteliais promovem directamente a geração de plasmina através da expressão de receptores de plasminogénio (anexina II) e urocinase, assim como da secreção de activadores do plasminogénio do tipo urocinase e do tipo tecidual, em que todos eles promovem a clearance do coágulo. Numa camada final de regulação protrombótica, as células endoteliais desempenham um papel activo na inibição da cascata de coagulação através da produção de sulfato de heparano, que aumenta a cinética da inibição da trombina e de outros factores de coagulação pela antitrombina III.

Em condições de traumatismo vascular agudo, contudo, os mecanismos vasoconstritores predominam e o endotélio passa a ser protrombótico, pró-coagulante e pró-inflamatório. Esta situação é alcançada mediante uma redução dos agentes de dilatação endotelial: adenosina, NO e prostaciclina e através da acção directa do ADP, serotonina e tromboxano nas células do músculo liso vascular para promover a sua contracção (Becker, Heindl et al. . 2000) . O factor desencadeador principal para a modificação da função endotelial que conduz à formação do trombo hemostático é a perda da barreira celular endotelial entre o sangue e os componentes da matriz extracelular (ECM) (Ruggeri (2002) Nat Med 8:1227-1234). As plaquetas circulantes identificam e distinguem as áreas de lesões endoteliais e aderem ao subendotélio exposto. A sua interacção com os vários substratos trombogénicos e com agonistas libertados ou produzidos localmente resulta na activação plaquetária. Este processo é descrito como tendo duas fases 1) adesão: a amarra inicial a uma superfície e 2) agregação: a coesão plaqueta-plaqueta (Savage et al. (2001) Curr Opin Hematol 8:270-276). A adesão plaquetária inicia-se quando as plaquetas circulantes se ligam ao colagénio exposto através da interacção com proteínas de ligação ao colagénio presentes na superfície celular e através da interacção com o vWF, também presente no endotélio. A proteína vWF é uma estrutura multimérica de tamanho variável que é segregada pelo endotélio em duas direcções: basolateralmente e para a corrente sanguínea. 0 vWF também se liga ao factor VIII, o que é importante para a estabilização do factor VIII e para a sua sobrevivência na circulação. A adesão e subsequente activação plaquetária é obtida quando o vWF se liga, via o seu domínio Al, a GPIb (parte do complexo receptor glicoproteico das plaquetas GPIb-IX-V). A interacção entre o vWF e a GPIb é regulada pela força de cisalhamento, de modo que um aumento na tensão de cisalhamento resulta num aumento correspondente da afinidade do vWF para a GPIb. A integrina 1 2, também conhecida nos leucócitos como VLA-2, é o principal receptor de colagénio nas plaquetas e a interacção através deste receptor gera os sinais intracelulares que contribuem para a activação plaquetária. A ligação através de 12 facilita o envolvimento do receptor de colagénio de menor afinidade, GP VI. Este faz parte da superfamília de imunoglobulinas e é o receptor que gera os sinais intracelulares mais potentes para a activação plaquetária. A activação das plaquetas resulta na libertação de difosfato de adenosina (ADP), que é convertido em tromboxano A2. A activação plaquetária também resulta na expressão superficial dos receptores glicoproteicos Ilb-IIIa (GP Ilb-Illa) das plaquetas. Os receptores GP Ilb-IIIa permitem a aderência das plaquetas entre si (isto é, a agregação) em virtude de as moléculas de fibrinogénio unirem as plaquetas através destes receptores. Isto resulta na formação de um rolhão plaquetário no local da lesão para ajudar a evitar uma perda adicional de sangue, enquanto o tecido vascular danificado liberta factores que iniciam a cascata de coagulação e a formação de uma rede de fibrina estabilizadora à volta do rolhão plaquetário. 2. Cascata de coagulação A via de coagulação é uma via proteolítica em que cada enzima está presente no plasma como um zimogénio, ou forma inactiva. A clivagem do zimogénio é regulada para libertar a forma activa a partir da molécula precursora. Os cofactores das proteases activadas, como as glicoproteínas FVIII e FV, também são activados na reacção em cascata e desempenham um papel na formação do coágulo. A via funciona como uma série de ciclos de feedback positivo e negativo que controlam o processo de activação, em que o objectivo final consiste em produzir trombina; esta pode depois converter o fibrinogénio solúvel em fibrina para formar um coágulo. Os factores na coagulação normalmente recebem um número sob a forma de numeral romano, com um "a" minúsculo adicionado para indicar uma forma activada. A Tabela 3 abaixo apresenta uma lista exemplificativa dos factores, incluindo o seu nome comum e o seu papel na cascata de coagulação. Em geral, estas proteínas participam na coagulação sanguínea através de uma ou mais das vias intrínseca, extrínseca ou comum da coagulação (ver a Figura 1). Conforme discutido abaixo, estas vias estão interligadas e crê-se que a coagulação sanguínea ocorre através de um modelo de activação baseado em superfícies celulares, em que o factor VII (FVII) é o iniciador primário da coagulação.

Tabela 3

*Tabela adaptada de M.W.King (2006) em med.unibs.it/~marchesi/blood.html A geração de trombina tem sido historicamente dividida em três vias, as vias intrínseca (sugerindo que todos os componentes da via são intrínsecos ao plasma) e extrínseca (sugerindo que um ou mais componentes da via são extrínsecos ao plasma), que fornecem percursos alternativos para a geração do factor X activado (FXa), e a via comum final que resulta na formação da trombina (Figura. 1). Estas vias participam conjuntamente num processo interligado e interdependente para efectuar a coagulação. Foi desenvolvido um modelo da coagulação baseado em superfícies celulares que descreve estas vias (Figura 2) (Hoffman et ai. (2001) Thromb Haemost 85:958-965). Neste modelo, as vias "extrínseca" e "intrínseca" decorrem em diferentes superfícies celulares, a célula portadora do factor tecidual (TF) e a plaqueta, respectivamente. 0 processo de coagulação é separado em fases distintas - iniciação, amplificação e propagação - durante as quais as vias extrínseca e intrínseca actuam a vários níveis para produzir a grande quantidade de trombina necessária para converter quantidades suficientes de fibrinogénio em fibrina para a formação do coágulo. a. Iniciação 0 FVII é considerado o factor de coagulação responsável por iniciar a cascata de coagulação, em que esta iniciação está dependente da sua interacção com o TF. 0 TF é uma glicoproteina transmembranar expressa por uma variedade de células, como as células do músculo liso, os fibroblastos, os monócitos, os linfócitos, os granulócitos, as plaquetas e as células endoteliais. As células mielóides e as células endoteliais apenas expressam o TF quando são estimuladas, por exemplo por citocinas pró-inflamatórias. As células do músculo liso e os fibroblastos, contudo, expressam o TF de forma constitutiva. Por conseguinte, quando estas células entram em contacto com a corrente sanguínea no seguimento de uma lesão dos tecidos, a cascata de coagulação inicia-se rapidamente através da ligação do TF ao factor VII ou ao factor Vila presentes no plasma.

Tal como discutido abaixo, a maioria do FVII presente no sangue encontra-se na forma de zimogénio, com uma pequena quantidade, aproximadamente 1%, presente como FVIIa. Na ausência de ligação do TF, contudo, mesmo o FVIIa possui caracteristicas semelhantes ao zimogénio e não apresenta uma actividade significativa até ser complexado com o TF. Assim, o FVII plasmático requer activação através de clivagem proteolitica, e uma modificação conformacional adicional através da interacção com o TF, para adquirir a actividade total. Foi demonstrado que uma série de proteases, incluindo os factores IXa, Xa, Xlla e a trombina, são capazes de efectuar a clivagem do FVII in vitro, um processo que é acelerado na presença de TF. 0 próprio FVIIa também pode activar o FVII na presença de TF, um processo denominado auto-activação. As pequenas quantidades de FVIIa presentes no sangue devem-se provavelmente à activação por FXa e/ou FIXa (Wildgoose et al. (1992) Blood 80:25-28 e Butenas et al. (1996) Biochemistry 35:1904-1910). Podem, assim, formar-se complexos TF/FVIIa através da ligação directa do FVIIa ao TF, ou através da ligação do FVII ao TF e subsequente activação do FVII em FVIIa por uma protease plasmática, como FXa, FIXa, FXIIa ou o próprio FVIIa. O complexo TF/FVIIa permanece ancorado à célula portadora do TF onde activa pequenas quantidades do FX em FXa, naquela que é conhecida como a "via extrínseca" da coagulação. 0 complexo TF/FVIIa cliva igualmente pequenas quantidades do FIX em FIXa. 0 FXa associa-se ao seu cofactor FVa para formar também um complexo na célula portadora do TF, que pode depois converter a protrombina em trombina. A pequena quantidade de trombina produzida é, contudo, inadequada para sustentar a formação de fibrina necessária para uma coagulação completa. Adicionalmente, quaisquer FXa e FIXa activos são inibidos na circulação pela antitrombina III (AT-III) e outras serpinas, que estão discutidas em maior detalhe abaixo. Isto normalmente impediria a formação de um coágulo na circulação. Na presença de uma lesão, contudo, os danos na vasculatura resultam na agregação e activação plaquetária neste local de formação da trombina, permitindo assim a amplificação do sinal de coagulação. b. Amplificação A amplificação tem lugar quando a trombina se liga às plaquetas, activando-as. As plaquetas activadas libertam FV a partir dos seus grânulos alfa, que é activado pela trombina em FVa. A trombina também liberta e activa o FVIII a partir do complexo FVIII/vWF presente na membrana das plaquetas e cliva o FXI em FXIa. Estas reacções geram plaquetas activadas que têm FVa, FVIIIa e FIXa na sua superfície, o que prepara o palco para o grande aumento da produção de trombina durante a fase de propagação. c. Propagação A propagação da coagulação verifica-se na superfície de numerosas plaquetas no local da lesão. Como descrito acima, as plaquetas activadas têm FXIa, FVIIIa e FVa na sua superfície. É aqui que a via extrínseca se processa. 0 FXIa activa o FIX em FIXa, que pode depois ligar-se ao FVIIIa. Este processo, além das pequenas quantidades de FIXa que são geradas através da clivagem do FIX pelo complexo TF/FVIIa na célula portadora do TF, produz um grande número de complexos FXIa/FVIIIa que, pelo seu lado, podem activar quantidades significativas do FX em FXa. As moléculas de FXa ligam-se ao FVa para gerar os complexos protrombinase que activam a protrombina em trombina. A trombina actua num ciclo de feedback positivo para activar ainda mais plaquetas e inicia novamente os processos descritos para a fase de amplificação.

Muito em breve, existe um número suficiente de plaquetas activadas com os complexos apropriados para gerar o pico de trombina que é suficientemente grande para produzir quantidades suficientes de fibrina a partir do fibrinogénio, de modo a formar um coágulo hemostático de fibrina. 0 fibrinogénio é um dímero solúvel no plasma que, quando é clivado pela trombina, liberta o fibrinopéptido A e o fibrinopéptido B. 0 fibrinopéptido B é depois clivado pela trombina, e os monómeros de fibrina formados por esta segunda clivagem proteolítica formam espontaneamente um gel insolúvel. A fibrina polimerizada é unida por forças não covalentes e electrostáticas e é estabilizada pelo factor XlIIa (FXIIIa), uma enzima de transamidação, produzido pela clivagem do FXIII pela trombina. A trombina também activa o TAFI, que inibe a fibrinólise mediante redução da produção de plasmina na superfície do coágulo. Adicionalmente, a própria trombina é incorporada na estrutura do coágulo para uma estabilização adicional. Estes agregados de fibrina insolúveis (coágulos), juntamente com as plaquetas agregadas (trombos), bloqueiam o vaso sanguíneo danificado e impedem a hemorragia subsequente. 3. Regulação da coagulação

Durante a coagulação, a cascata é regulada por processos constitutivos e estimulados para inibir a formação adicional de coágulos. Há várias razões para estes mecanismos reguladores. Primeiro, a regulação é necessária para limitar a isquemia dos tecidos através da formação de coágulos de fibrina. Segundo, a regulação impede a trombose generalizada ao localizar a formação do coágulo apenas no local da lesão no tecido. A regulação é obtida pelos catiões de várias moléculas inibidoras. Por exemplo, a antitrombina III (AT-III) e o inibidor da via do factor tecidual (TFPI) actuam de forma constitutiva para inibir os factores na cascata de coagulação. A AT-III inibe a trombina, o FIXa e o FXa, ao passo que o TFPI inibe o FXa e o complexo FVIIa/TF. Um factor adicional, a proteína C, que é estimulado via activação plaquetária, regula a coagulação por clivagem proteolítica e inactivação do FVa e FVIIIa. A proteína S reforça a actividade da proteína C. Adicionalmente, outro factor que contribui para a inibição da coagulação é a proteína integral da membrana trombomodulina, que é produzida pelas células do endotélio vascular e que actua como um receptor para a trombina. A ligação da trombina à trombomodulina inibe as actividades procoagulantes da trombina e também contribui para a activação da proteína C. A fibrinólise, a degradação do coágulo de fibrina, também proporciona um mecanismo para regular a coagulação. Os multímeros de fibrina reticulada num coágulo são degradados em polipéptidos solúveis pela plasmina, uma protease de serina. A plasmina pode ser gerada a partir do seu precursor inactivo, o plasminogénio, e recrutada para o local de um coágulo de fibrina de duas formas: por interacção com o activador do plasminogénio tecidual (tPA) na superfície de um coágulo de fibrina e por interacção com o activador do plasminogénio do tipo urocinase (uPA) numa superfície celular. 0 primeiro mecanismo parece ser o principal responsável pela dissolução de coágulos nos vasos sanguíneos. 0 segundo, embora capaz de mediar a dissolução de coágulos, pode desempenhar um papel preponderante na remodelação tecidular, na migração celular e na inflamação. A dissolução do coágulo também é regulada de duas formas. Primeiro, uma activação da plasmina e uma fibrinólise eficientes verificam-se apenas em complexos formados na superfície do coágulo ou numa membrana celular, ao passo que as proteínas livres presentes no sangue são catalisadores ineficientes e são rapidamente inactivados. Segundo, os activadores do plasminogénio e a plasmina são inactivados por moléculas como o inibidor do activador do plasminogénio tipo 1 (PAI-1) e o PAI-2, que actuam sobre os activadores do plasminogénio, e a 2-antiplasmina e a 2-macroglobulina, que inactivam a plasmina. Em circunstâncias normais, o equilíbrio oportuno entre a coagulação e a fibrinólise resulta numa formação e clearance eficientes dos coágulos após uma lesão vascular, enquanto impede simultaneamente episódios trombóticos ou hemorrágicos indesejados.

Um resumo de factores de coagulação, cofactores e proteínas reguladoras exemplificativos e respectivas actividades está apresentado na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4

*Tabela adaptada de M.W.King (2006) med.unibs.it/~marchesi/blood.html C. Factor VII (FVII) 0 factor VII é uma glicoproteína protease de serina dependente da vitamina K, que é sintetizada nos animais, incluindo os mamíferos, como um zimogénio de cadeia única no fígado e segregada para a corrente sanguínea. Como descrito acima, o FVII é a protease de coagulação responsável por iniciar a cascata de eventos proteolíticos que levam à geração de trombina e à deposição de fibrina. Faz parte da via extrínseca, embora os efeitos da sua actividade a jusante também influenciem grandemente a via intrínseca. Este papel integral na formação do coágulo despertou um interesse significativo no FVII como alvo para terapias hemostáticas e anticoagulantes clínicas. Por exemplo, desenvolveu-se FVII activado recombinante (rFVIIa) como um agente hemostático para ser utilizado em sujeitos hemofílicos e em sujeitos com outras afecções hemorrágicas. São aqui disponibilizados polipéptidos do FVII modificados que foram concebidos para ter uma actividade de coagulação acrescida ao serem activados e que podem actuar como agentes terapêuticos melhorados para tratar doenças e afecções receptivas à terapêutica com o factor VII.

1. Estrutura e organização do FVII 0 gene do FVII humano (F7) está localizado no cromossoma 13, na posição 13q34, e tem 12,8 kb de comprimento com 9 exões. 0 gene do FVII partilha uma similaridade organizacional significativa com genes que codificam outras proteínas dependentes da vitamina K, como a protrombina, o factor IX, o factor X e a proteína C. 0 ARNm do FVII sofre splicing alternativo para produzir dois transcritos: a variante 1 (N.2 de acesso Genbank NM_000131, apresentada na SEQ ID NO: 108) e a variante 2 (N.2 de acesso Genbank NM_019616, apresentada na SEQ ID NO: 109) . O transcrito da variante 2, que é a forma mais abundante no fígado, não inclui o exão lb e, por conseguinte, codifica um polipéptido precursor mais curto de 444 aminoácidos (precursor do FVII -isoforma b; SEQ ID NO:2) em comparação com o polipéptido precursor de 466 aminoácidos codificado pelo transcrito da variante 1 (precursor do FVII - isoforma a; SEQ ID NO:l). Os aminoácidos que não estão presentes no polipéptido precursor do FVII - isoforma b correspondem às posições de aminoácidos 22 a 43 do precursor do FVII - isoforma a. Estes aminoácidos fazem parte da sequência do propéptido, o que resulta num propéptido truncado na isoforma b do FVII. Os polipéptidos precursores são constituídos pelos seguintes segmentos e domínios: um péptido de sinal hidrofóbico (aa 1-20 das SEQ ID NO:l e 2), um propéptido (aa 21-60 da SEQ ID NO:l e aa 21-38 da SEQ ID NO:2), um domínio Gla (aa 39-83 da SEQ ID NO:1 e aa 61-105 da SEQ ID NO: 2), um domínio factor de crescimento epidérmico tipo B (EGF tipo 1, aa 84-120 da SEQ ID NO: 1 e aa 106-142 da SEQ ID NO: 2), um domínio factor de crescimento epidérmico tipo A (EGF tipo 2, aa 125-166 da SEQ ID NO: 1 e aa 147-188 da SEQ ID NO: 2) e um domínio protease de serina (aa 191-430 da SEQ ID NO: 1 e aa 213-452 da SEQ ID NO: 2). A forma madura do polipéptido do FVII de 406 aminoácidos (SEQ ID NO: 3) não tem o péptido de sinal nem as sequências do propéptido e é idêntica em termos de comprimento e sequência, independentemente do precursor da isoforma que a originou. Na forma madura do polipéptido do FVII, as posições de aminoácidos correspondentes para os domínios mencionados acima são as seguintes: domínio Gla (aa 1-45 da SEQ ID NO: 3), EGF tipo 1 (aa 46-82 da SEQ ID NO: 3), EGF tipo 2 (aa 87- 128 da SEQ ID NO: 3) e domínio protease de serina (aa 153-392 da SEQ ID NO: 3). O domínio Gla do FVII é um motivo de ligação à membrana que, na presença de iões cálcio, interage com as membranas fosfolipídicas que incluem fosfatidilserina. 0 domínio Gla também desempenha um papel na ligação ao cofactor do FVIIa, o factor tecidual (TF) . Complexado com o TF, o domínio Gla do FVIIa está carregado com sete iões Ca2+, projecta três cadeias laterais hidrofóbicas na direcção da membrana celular para interacção com os fosfolípidos presentes na superfície celular e tem um contacto significativo com o domínio C-terminal do TF. 0 domínio Gla é conservado entre as proteínas dependentes da vitamina K, como a protrombina, os factores de coagulação VII, IX e X e as proteínas C, S e Z. Estas proteínas necessitam de vitamina K para a síntese pós-traducional de ácido -carboxiglutâmico, um aminoácido que se aglomera na extremidade N-terminal do domínio Gla destas proteínas. Todos os resíduos glutâmicos presentes no domínio são potenciais locais de carboxilação e muitos deles estão, por conseguinte, modificados por carboxilação.

Além do domínio Gla, a proteína do FVII madura também contém dois domínios tipo EGF. 0 primeiro domínio tipo EGF (EGF tipo 1 ou EGF1) é um domínio EGF de ligação ao cálcio, em que seis cisteínas centrais conservadas formam três pontes dissulfureto. 0 domínio EGF1 do FVII liga-se apenas a um ião Ca2+, mas com uma afinidade significativamente superior à observada para o domínio Gla (Banner et al. (1996) Nature 380:41-46). Este ião Ca2+ ligado promove a forte interacção existente entre o domínio EGF1 do FVII e o TF (Osterbund et al. (2000) Eur J Biochem 267:6204-6211) . O segundo domínio tipo EGF (EGF tipo 2 ou EGF2) não é um domínio de ligação ao cálcio, mas também forma 3 pontes dissulfureto. Tal como os outros domínios no FVII, o domínio EGF2 interage com o TF. Está também ligado via pontes dissulfureto ao domínio protease, com o qual partilha uma grande interface de contacto.

Finalmente, o domínio protease de serina do FVII é o domínio responsável pela actividade proteolítica do FVIIa. A sequência de aminoácidos do FVII no seu domínio catalítico apresenta uma identidade de sequência elevada e uma similaridade de estrutura terciária elevada com outras proteases de serina, como a tripsina e a quimiotripsina (Jin et ai. (2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517) . Por exemplo, estas proteases de serina partilham uma triade catalítica comum H57, D102, S195, com base na numeração da quimiotripsina. Ao contrário de outras proteases de serina, contudo, a clivagem do FVIIa não é suficiente para completar a conversão do zimogénio numa enzima totalmente activa. Em vez disso, como discutido abaixo, o FVIIa é activado alostericamente na sua função catalítica pela ligação ao receptor de superfície celular TF, que induz uma modificação conformacional no domínio protease do FVIIa, passando-o de um estado inactivo semelhante ao zimogénio para uma enzima cataliticamente activa. Uma região de hélice-volta entre o sítio de ligação do cofactor e o sítio activo (isto é, posições de resíduos de aminoácidos 305-321, correspondentes aos resíduos 163-170 com base na numeração da quimiotripsina) do FVIIa é importante para a alosteria e o carácter zimogénico do FVIIa (Persson et ai. (2004) Biochem J., 379: 497-503). Esta região é composta por uma hélice α curta (posições de resíduos de aminoácidos 307 a 312) seguida de uma volta. A porção N-terminal da hélice forma parte da interface entre o domínio protease e o TF e contém um certo número de resíduos que são importantes para a função proteolítica e a ligação óptima ao TF. Uma comparação da estrutura cristalina do FVIIa sozinho e do FVIIa complexado com o TF indica que a hélice α sofre uma modificação conformacional significativa quando o FVIIa se liga ao TF. A hélice α do FVIIa sozinho surge distorcida, encurtada e orientada de forma diferente. Isto afecta as estruturas em volta adjacentes, afastando-as do sítio activo. Em contraste, a hélice α do FVIIa quando este está complexado com o TF está estabilizada, e as voltas vizinhas estão mais próximas do sítio activo. Esta estabilização é efectuada através de mecanismos que envolvem pelo menos a metionina na posição de aminoácido 306 (resíduo de aminoácido Met164 na numeração da quimiotripsina) do FVII (Pike et al. (1999) PNAS 8925-8930). 2. Modificações pós-traducionais 0 polipéptido precursor do FVII (qualquer uma das isoformas do gene do factor VII) é direccionado para a via secretora celular pelo péptido de sinal hidrofóbico, inserindo-se no retículo endoplasmático (RE) para iniciar a translocação através da membrana. Enquanto a proteína é translocada através da membrana do RE, o péptido de sinal de 20 aminoácidos é clivado e removido por uma peptidase de sinal no lúmen do RE, após o que o polipéptido sofre modificações pós-traducionais adicionais, incluindo a N-glicosilação e a O-glicosilação, a carboxilação dependente da vitamina K dos ácidos glutâmicos N-terminais para formar ácidos -carboxiglutâmicos e a hidroxilação do ácido aspártico em ácido -hidroxiaspártico. O propéptido proporciona um local de ligação para uma carboxilase dependente da vitamina K, que reconhece uma hélice α anfipática de 10 resíduos no propéptido do FVII. Após a ligação, a carboxilase efectua a carboxilação na posição de 10 resíduos de ácido glutâmico presentes no domínio Gla do polipéptido do FVII, produzindo resíduos de carboxiglutamilo nas posições E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 e E95 em relação à sequência de aminoácidos do precursor do FVII apresentada na SEQ ID NO: 2. Estas posições correspondem às posições E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 e E35 do polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3. Para uma actividade óptima, a molécula de FVII requer cálcio, que se liga ao polipéptido e facilita as modificações conformacionais necessárias para a ligação do FVIIa ao TF e aos lípidos. O domínio Gla -carboxilado liga sete iões Ga com uma afinidade variável, o que induz a modificação conformacional que permite que o domínio Gla interaja com o domínio C-terminal do TF e também com as fosfatidilserinas ou outros fosfolípidos carregados negativamente na membrana das plaquetas. A N-glicosilação é efectuada através da transferência de GlC3Man9 (GlcNAc) para dois resíduos de asparagina no polipéptido do FVII, em posições que correspondem aos resíduos de aminoácidos 145 e 262 da proteína madura (SEQ ID NO: 3) . A O-glicosilação tem lugar nos resíduos de aminoácidos 52 e 60 do polipéptido maduro e a hidroxilação para um ácido -hidroxiaspártico verifica-se no resíduo de ácido aspártico na posição 63. Estes resíduos de serina O-glicosilada e o resíduo de ácido aspártico -hidroxilado encontram-se no domínio EGF-1 do FVII. Estas modificações são realizadas no RE e no complexo de Golgi antes do processamento final do polipéptido para a sua forma madura.

3. Processamento do FVII 0 polipéptido do pro-FVII modificado é transportado através do lúmen de Golgi para o compartimento trans-Golgi, onde o propéptido é clivado por uma propeptidase imediatamente antes da secreção da proteína a partir da célula. A PACE/furina [onde PACE é um acrónimo de Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme (enzima de clivagem de aminoácidos básicos emparelhados) ] é uma endopeptidase localizada na membrana de Golgi que cliva muitas proteínas no lado carboxi-terminal do motivo de sequência Arg-[qualquer resíduo]-(Lys ou Arg)-Arg. Esta propeptidase cliva as glicoproteínas dependentes da vitamina K, como os polipéptidos do pro-factor IX e do pro-vWF (Himmelspach et ai. (2000) Thromb Research 97; 51-67), libertando o propéptido da proteína madura. A inclusão de um local de reconhecimento de PACE/furina apropriado nos precursores do Factor VII recombinante facilita o correcto processamento e secreção do polipéptido recombinante (Margaritas et ai. (2004) Clin Invest 113(7) : 1025-1031) . A PACE/furina ou outra enzima propeptidase do tipo subtilisina é provavelmente responsável pelo processamento proteolítico do pro-FVII em FVII. Esta enzima pode reconhecer e ligar-se ao motivo de consenso -Arg-Arg-Arg-Arg- nas posições de aminoácidos 35-38 da sequência apresentada na SEQ ID NO:l e 57-60 da sequência apresentada na SEQ ID NO:2, clivando o propéptido e libertando a proteína madura para ser segregada.

4. Activação do FVII A grande maioria do FVII presente no sangue está na forma de um zimogénio de cadeia única inactivado, embora uma pequena quantidade esteja presente numa forma activada com duas cadeias. A activação do FVII verifica-se com a clivagem proteolitica da ligação Arg152-Ile153 (posições em relação ao polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID N0:3), dando origem a um polipéptido com duas cadeias contendo uma cadeia leve de 152 aminoácidos (cerca de 20 kDa) unida por meio de uma ponte dissulfureto a uma cadeia pesada de 254 aminoácidos (cerca de 30 kDa) . A cadeia leve do FVIIa contém o domínio Gla e os domínios tipo EGF, enquanto a cadeia pesada contém a parte catalítica ou protease de serina da molécula. A conversão do FVII de cadeia única no FVIIa com duas cadeias é mediada através da clivagem por FIXa, FXa, FXIIa ou trombina, ou de uma forma autocatalítica pelo FVIIa endógeno (Butenas et al. (1996) Biochem 35:1904-1910; Nakagaki et al. (1991) Biochem 30:10819-10824). A quantidade vestigial de FVIIa que existe efectivamente em circulação é provavelmente resultado da acção do FXa e FIXa.

Como discutido acima, a clivagem do FVII a partir da sua forma de zimogénio para FVIIa não é suficiente para proporcionar a actividade total. O FVIIa requer a associação com o TF para desenvolver a sua actividade total (Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569-26574) . Devido a este requisito, o FVIIa sozinho possui características semelhantes ao zimogénio, apresentando um enrolamento e uma forma de zimogénio e exibindo uma actividade relativamente baixa. Esta característica semelhante ao zimogénio do FVIIa na ausência da sua associação com o TF torna-o relativamente resistente à antitrombina III (AT-III) e outras serpinas, que em geral actuam principalmente sobre as formas activas das proteases de serina e não sobre a forma de zimogénio. Além disso, o TFPI, o principal inibidor da actividade do complexo TF/FVIIa, também não se liga eficientemente à forma não complexada "inactiva" do FVIIa.

Ao complexar-se com o TF, o FVIIa sobre uma modificação conformacional que permite a actividade total da molécula. Todos os domínios do FVII estão envolvidos na interacção com o TF, mas as modificações conformacionais que ocorrem estão localizadas no dominio protease do FVIIa. Por exemplo, as modificações conformacionais que têm lugar no seguimento da interacção alostérica do FVIIa com o TF incluem a criação de urn exo-sitio macromolecular estendido de ligação do substrato. Este sítio de ligação estendido reforça grandemente a activação proteolítica do factor X mediada pelo FVII. A actividade do FVIIa é adicionalmente aumentada (isto é, mil vezes) quando a sua interacção é com o TF expresso na superfície celular. Isto é assim porque as membranas fosfolipídicas contendo fosfolípidos carregados negativamente, como a fosfatidilserina, são um local de interacção de outros factores de coagulação dependentes da vitamina K, como o FIX e o FX, que se ligam através dos seus domínios Gla. Assim, a concentração local destas proteínas dependentes da vitamina K é elevada na superfície celular, promovendo a sua interacção com o complexo TF/FVIIa.

5. Função do FVII

Embora o FVIIa apresente uma actividade acrescida após a activação alostérica pelo TF, há indicações da existência de mecanismos em que o FVIIa sozinho pode iniciar a coagulação. Assim, o FVII pode actuar de uma forma dependente do TF e de uma forma independente do TF. Esta última via pode desempenhar um papel muito mais pequeno na hemostasia normal, mas pode ser significativa quando considerada no contexto de perturbações hemorrágicas e do seu tratamento. a. Actividade do FVIIa dependente do factor tecidual

0 FVII circulante liga-se ao TF na superfície celular e é activado pelo FIXa, FXa ou trombina, ou de uma forma autocatalítica pelo FVIIa endógeno como descrito acima. Em alternativa, a quantidade muito pequena do FVIIa circulante pode ligar-se directamente ao TF. 0 complexo TF/FVIIa liga-se depois a uma pequena fracção do FX plasmático e o domínio catalítico do FVIIa cliva o FX para produzir FXa. Quando o FXa se complexa com o FVa e activa a protrombina em trombina, forma-se trombina na superfície da célula portadora do TF através da via extrínseca (Figura 3). 0 FIX também é activado pelo complexo TF/FVIIa, fornecendo um elo para a via intrínseca que funciona na superfície da plaqueta activada. Os sistemas de feedback positivo na cascata de coagulação descrita acima proporcionam os meios pelos quais são produzidas grandes quantidades de trombina, que cliva o fibrinogénio em fibrina para formar um coágulo. b. Actividade do FVIIa independente do factor tecidual

Além do mecanismo dependente do TF para a activação do FX em FXa, há indicações de que o FVIIa também pode activar o FX na ausência do TF. As plaquetas activadas efectuam a translocação de fosfatidilserinas e de outros fosfolípidos carregados negativamente para a superfície exterior virada para o plasma (Hemker et ai. (1983) Blood Cells 9:303-317). Estes fornecem "receptores" alternativos através dos quais o FVIIa se pode ligar, embora com uma afinidade relativamente baixa que é 1000 vezes inferior à afinidade de ligação do FVIIa para o TF (Monroe et ai. (1997) Br J Haematol 99:542-7). Esta interacção é mediada através de resíduos no domínio Gla (Harvey et al. (2003) 278:8363-8369). O FVIIa pode depois converter o FX em FXa e o FIX em FIXa na superfície das plaquetas activadas (Hoffman et al. (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9:S61-S65). O FXa permanece associado à superfície plaquetária, onde se pode ligar ao FVa e gerar uma quantidade suficiente de trombina a partir da protrombina, ao passo que o FIXa acabado de formar se junta ao FVIIIa para catalisar a activação de mais FX em FXa (Figura 3) . A hemostasia na ausência do TF pode depois ser obtida através dos mecanismos de feedback positivo e propagação descritos acima. É notável, contudo, que embora o FVIIIa possa contribuir para o processo de coagulação na plaqueta activada, a sua presença não é necessária para a geração de trombina no mecanismo independente do TF (Figura 3) . Assim, na ausência do FVIII, como acontece nos doentes hemofílicos, há indicações de que o FVIIa pode iniciar e/ou amplificar a geração de trombina através deste mecanismo secundário e efectuar a formação do coágulo. 6. 0 FVII como vim biofármaco 0 FVII actua para iniciar a coagulação sanguínea. 0 FVIIa recombinante (NovoSeven®; rFVIIa) está aprovado para o tratamento de episódios hemorrágicos ou para a prevenção de hemorragias durante procedimentos cirúrgicos ou invasivos em doentes com hemofilia A ou B que possuem inibidores para o Factor VIII ou o Factor IX e em doentes com deficiência congénita do Factor VII. 0 Novoseven® é uma preparação geneticamente manipulada do factor Vila, que é produzida num sistema de expressão de mamíferos utilizando células renais de hamster bebé (BHK). 0 agente é praticamente idêntico ao factor Vila derivado do plasma em termos da sua estrutura e função (Ratko et ai. (2004), P & T, 29: 712-720). A administração do FVIIa recombinante (rFVIIa) revelou-se eficaz na promoção da coagulação sanguínea em doentes que sofrem de hemofilia, tendo-se verificado que o tratamento com doses do FVIIa é seguro e bem tolerado em sujeitos humanos. A utilização do rFVIIa foi tipicamente efectuada em doentes que desenvolveram inibidores (isto é, aloanticorpos) para o factor VIII ou o factor IX. A utilização do rFVIIa como coagulante foi alargada ao tratamento de outras perturbações hemorrágicas, por exemplo a trombastenia de Glanzmann; outros eventos associados a hemorragia extensa, por exemplo em resultado de traumatismo ou cirurgia incluindo, embora não exclusivamente, transplantes de fígado, cirurgia da próstata e hemorragia traumática; coagulopatias neonatais, doença hepática grave; transplante de medula óssea, trombocitopenias e perturbações da função plaquetária; reversão urgente da anticoagulação oral; deficiências congénitas dos factores V, VII, X e XI; e doença de von Willebrand com inibidores para o factor de von Willebrand. É necessária uma dose elevada do rFVII para obter um efeito terapêutico. A dose e o regime posológico exigidos para a administração do rFVII variam consoante a indicação clínica. Por exemplo, a dose convencional do rFVII para episódios hemorrágicos em doentes com hemofilia A ou hemofilia B que têm aloanticorpos é de 90 pg/kg administrado por injecção intravenosa (IV). Como o rFVII tem uma semivida de 2 horas, é necessária a dosagem repetida. A dose adicional pode ser administrada de duas em duas horas até à obtenção da hemostasia. 0 intervalo de dose pode ser alterado dependendo da gravidade da afecção. Por exemplo, as doses entre 35 - 120 pg/kg revelaram-se eficazes. A dose e o regime posológico também podem variar com outras indicações. Por exemplo, os doentes com hemofilia A ou hemofilia B submetidos a um procedimento cirúrgico podem receber uma dose inicial de 90 pg/kg imediatamente antes da cirurgia, com administração da dose repetida de duas em duas horas durante e após a cirurgia. Dependendo da gravidade da cirurgia e do episódio hemorrágico, a infusão em bolus intravenoso pode continuar a intervalos de duas a seis horas até ao restabelecimento. Em doentes com deficiência congénita do FVII, o rFVII é tipicamente administrado para evitar o sangramento durante a cirurgia ou outros procedimentos invasivos, numa dose de 15 -30 pg/kg a intervalos de 4-6 horas até à obtenção da homeostasia. O mecanismo de acção do rFVIIa para iniciar a hemostasia explica a necessidade da dose elevada. Os doentes hemofílicos têm uma fase de iniciação da coagulação normal, em que o complexo TF/FVIIa activa o FX para FXa e conduz à produção de trombina no local da célula portadora do TF. Em seguida, contudo, o processo de coagulação é interrompido, uma vez que os doentes hemofílicos não têm o FVIII (hemofilia A) ou o FIX (hemofilia B) e não são portanto capazes de formar os complexos FVIIIa/FIXa na superfície da plaqueta activada, que normalmente servem para activar quantidades elevadas do FX em FXa nas fases de amplificação e propagação previamente descritas. Devido à presença de inibidores, como o TFPI e a AT-III, o FXa que é produzido na célula portadora do TF após a clivagem por TF/FVIIa não consegue difundir-se facilmente entre as superfícies celulares. Como resultado, não se verifica a geração em grande escala de trombina na superfície da plaqueta activada e não se forma um coágulo. Há indicações de que o efeito hemostático de doses elevadas do rFVIIa pode ser obtido utilizando a geração do FXa por rFVIIa dependente do TF e/ou independente do TF nas plaquetas activadas (Figura 3). A geração de trombina dependente do TF pode ser maximizada muito rapidamente com a saturação das moléculas de TF com o FVIIa endógeno e o rFVIIa. Em algumas ocasiões, o rFVIIa em dose elevada pode ligar-se às plaquetas activadas e converter o FX em FXa. 0 FXa associado à superfície activa o FVa para gerar uma quantidade suficiente de trombina conducente à hemostasia. Como o rFVII se liga à superfície das plaquetas com uma afinidade baixa, pode ser necessária uma dose mais elevada do rFVII para a geração da trombina. A activação do FXa nas plaquetas activadas assegura que a hemostasia mediada pelo rFVIIa está localizada no local da lesão.

Um meio que permita obter uma dose reduzida do rFVIIa pode melhorar a sua utilidade e eficiência como fármaco. São aqui disponibilizados polipéptidos do FVII modificados. Entre estes encontram-se polipéptidos do FVII modificados que apresentam uma resistência acrescida ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida, uma actividade catalítica acrescida na presença e/ou na ausência de TF e/ou uma ligação acrescida às plaquetas activadas. Estes polipéptidos do FVII podem apresentar uma actividade coagulante acrescida. Os polipéptidos do FVII aqui disponibilizados podem ser utilizados em tratamentos para iniciar a hemostasia mediante um mecanismo dependente do TF e/ou independente do TF, de modo a produzir FXa e gerar trombina. D. Polipéptidos do FVII modificados São aqui disponibilizados polipéptidos do FVII modificados. Os polipéptidos do FVII apresentam alterações em uma ou mais actividades ou propriedades em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. As actividades ou propriedades que podem ser alteradas em resultado da modificação incluem, embora não estejam limitadas a estas, a actividade de coagulação ou coagulante, a actividade pró-coagulante, a actividade proteolítica ou catalítica, por exemplo realizar a activação do factor X (FX) ou a activação do factor IX (FIX); a antigenicidade (a capacidade de ligação a um anticorpo anti-FVII ou de competição com um polipéptido pela ligação a um anticorpo anti-FVII), a capacidade de ligação ao factor tecidual, ao factor X ou ao factor IX, a capacidade de ligação à superfície celular das plaquetas activadas, a capacidade de ligação aos fosfolípidos, a semivida, a estrutura tridimensional, o pi e/ou a conformação. Tipicamente, os polipéptidos do FVII modificados apresentam actividade pró-coagulante. São aqui disponibilizados polipéptidos do FVII modificados que apresentam uma actividade coagulante acrescida após activação a partir da sua forma de zimogénio de cadeia única. Tais polipéptidos do FVII modificados podem ser utilizados no tratamento de perturbações ou eventos hemorrágicos, como hemofilias ou lesões, em que os polipéptidos do FVII podem actuar para promover a coagulação sanguínea. Entre estes polipéptidos do FVII modificados estão incluídos aqueles que possuem uma resistência acrescida aos inibidores, como o inibidor da via do factor tecidual (TFPI) e a antitrombina III (AT-III), aqueles que possuem uma actividade catalítica acrescida na presença e/ou na ausência de TF, aqueles que têm propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida, e aqueles que têm uma ligação e/ou uma afinidade acrescida para a superfície plaquetária. Em particular, estes polipéptidos do FVII modificados podem ser usados em doenças ou afecções para proporcionar uma actividade coagulante, ao mesmo tempo que contornam a necessidade de FVIIIa e FIXa. Num exemplo, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser usados em doentes hemofílicos que têm auto-anticorpos para o FVIIIa e o FIXa. Por isso, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados oferecem vantagens, incluindo uma diminuição da quantidade de FVII que é necessário administrar para manter uma concentração de FVII activo no soro suficiente para a hemostasia. Este facto pode conduzir, por exemplo, a doses e/ou frequências de dosagem mais baixas para obter efeitos biológicos comparáveis, um início mais rápido dos benefícios terapêuticos, uma melhoria mais rápida dos episódios hemorrágicos agudos, maior conforto e aceitação por parte dos sujeitos e uma atenuação dos efeitos secundários não benéficos.

As modificações num polipéptido do FVII podem ser efectuadas em qualquer forma de um polipéptido do FVII, incluindo as variantes alélicas e de espécie, as variantes de splicing, as variantes conhecidas na técnica ou as moléculas híbridas ou quiméricas do FVII. Por exemplo, as modificações aqui disponibilizadas podem ser efectuadas num polipéptido precursor do FVII apresentado nas SEQ ID NOS: 1 ou 2, num polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO :3 ou em quaisquer suas variantes de espécie, alélicas ou modificadas e fraqmentos activos possuindo uma identidade de sequência de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com qualquer um dos polipéptidos do FVII apresentados nas SEQ ID NOS: 1-3. As variantes alélicas do FVII incluem, embora não estejam limitadas a estas, quaisquer daqueles polipéptidos precursores com uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 18-74. Os exemplos de variantes de espécie que podem ser aqui modificadas incluem, embora não exclusivamente, polipéptidos humanos e não-humanos, incluindo os polipéptidos do FVII de vaca, ratinho, chimpanzé-pigmeu, chimpanzé, coelho, rato, macaco-rhesus, porco, cão, peixe-zebra, peixe-balão, galinha, orangotango e gorila, cujas sequências estão apresentadas nas SEQ ID NOS: 4-17, respectivamente. As modificações num polipéptido do FVII podem ser efectuadas num polipéptido do FVII que também contém outras modificações, como aquelas descritas na técnica, incluindo modificações na sequência primária e modificações que não são na sequência primária do polipéptido. A modificação dos polipéptidos do FVII também inclui a modificação de polipéptidos que são híbridos de diferentes polipéptidos do FVII, bem como de polipéptidos do FVII sintéticos preparados de forma recombinante, sintetizados ou construídos através de outros processos conhecidos na técnica com base na sequência de polipéptidos conhecidos. Por exemplo, com base no alinhamento do FVII com outros membros da família de factores de coagulação, como o factor IX (FIX) ou o factor X (FX), identificam-se facilmente os domínios homólogos entre os membros da família. Podem construir-se variantes quiméricas dos polipéptidos do FVII, em que um ou mais aminoácidos ou domínios inteiros na sequência de aminoácidos do FVII são substituídos utilizando a sequência de aminoácidos do membro da família correspondente. Adicionalmente, os polipéptidos do FVII quiméricos incluem aqueles polipéptidos em que um ou mais aminoácidos ou domínios inteiros na sequência de aminoácidos do FVII humano são substituídos utilizando a sequência de aminoácidos de uma espécie diferente (ver, por exemplo, Williamson et ai. (2005) J Thromb Haemost 3:1250-6). Tais proteínas quiméricas podem ser aqui utilizadas como o polipéptido do FVII não modificado de partida.

As modificações aqui disponibilizadas de um polipéptido de referência, não modificado, de partida incluem substituições, adições ou deleções de aminoácidos ou quaisquer combinações destas. Por exemplo, os polipéptidos do FVII modificados incluem aqueles polipéptidos com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas. Disponibilizam-se aqui também polipéptidos do FVII modificados com duas ou mais modificações em comparação com um polipéptido do FVII de referência de partida. Os polipéptidos do FVII modificados incluem aqueles polipéptidos com 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas. Qualquer modificação aqui disponibilizada pode ser combinada com qualquer outra modificação conhecida por um perito na especialidade, desde que o polipéptido do FVII modificado resultante apresente uma actividade de coagulação acrescida quando se encontra na sua forma activada ou com duas cadeias. Tipicamente, os polipéptidos do FVII modificados apresentam uma actividade coagulante acrescida. As actividades ou propriedades que podem ser alteradas em resultado da modificação incluem, embora não estejam limitadas a estas, uma actividade de coagulação ou coagulante, uma actividade pró-coagulante, uma actividade proteolítica ou catalítica, por exemplo realizar a activação do factor X (FX) ou a activação do factor IX (FIX); uma antigenicidade (a capacidade de ligação a um anticorpo anti-FVII ou de competição com um polipéptido pela ligação a um anticorpo anti-FVII), a capacidade de ligação ao factor tecidual, ao factor inibidor do factor tecidual (TFPI), à antitrombina III, ao factor X ou ao factor IX, a capacidade de ligação à superfície das plaquetas activadas, a capacidade de ligação aos fosfolípidos, a semivida sérica, a estrutura tridimensional, o pi e/ou a conformação. Entre os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados incluem-se aqueles que possuem uma resistência acrescida ao inibidor da via do factor tecidual (TFPI), uma resistência acrescida à antitrombina III (AT-III), uma actividade catalítica acrescida na presença e/ou na ausência de TF, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida sérica, uma actividade intrínseca acrescida e/ou uma afinidade acrescida para as plaquetas activadas e/ou uma ligação acrescida às plaquetas activadas.

Em alguns exemplos, uma modificação pode afectar duas ou mais propriedades ou actividades de um polipéptido do FVII. Por exemplo, uma modificação pode resultar numa resistência acrescida ao TFPI e numa actividade catalítica acrescida do polipéptido do FVII modificado em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser analisados relativamente a cada propriedade e cada actividade para identificar a gama de efeitos de uma modificação. Tais ensaios são conhecidos na técnica e estão descritos abaixo.

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados também incluem os polipéptidos do FVII que são adicionalmente modificados pela maquinaria celular e incluem, por exemplo, polipéptidos glicosilados, -carboxilados e -hidroxilados.

As modificações aqui disponibilizadas para um polipéptido do FVII são efectuadas para aumentar a resistência ao TFPI, aumentar a resistência à AT-III, melhorar as propriedades farmacocinéticas, por exemplo aumentar a semivida sérica, aumentar a actividade catalítica na presença e/ou na ausência de TF e/ou aumentar a afinidade para as plaquetas activadas e/ou a ligação às plaquetas activadas. Por exemplo, um polipéptido do FVII pode incluir uma modificação/modificações que aumentam uma ou ambas as propriedades de resistência ao TFPI e ligação às plaquetas. Noutros exemplos, qualquer modificação aqui disponibilizada pode ser combinada com qualquer outra modificação conhecida por um perito na especialidade, desde que o polipéptido do FVII modificado resultante apresente uma actividade de coagulação acrescida quando se encontra na sua forma com duas cadeias. Tipicamente, esta actividade de coagulação acrescida deve-se a uma resistência acrescida ao TFPI, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida sérica, uma resistência acrescida à AT-III, uma glicosilação modificada, uma actividade catalítica acrescida e/ou uma ligação acrescida aos fosfolípidos e/ou uma afinidade acrescida para os fosfolípidos. Em alguns exemplos, as modificações que são introduzidas num polipéptido do FVII para alterar uma actividade ou propriedade especifica também, ou em vez disso, podem afectar outra actividade ou propriedade. Assim, as modificações aqui disponibilizadas podem afectar a propriedade ou actividade que foram projectadas para afectar e uma ou mais propriedades ou actividades diferentes. Por exemplo, as modificações efectuadas num polipéptido do FVII para aumentar a resistência ao TFPI também podem melhorar as propriedades farmacocinéticas, tal como a semivida sérica. Em alguns exemplos, uma única modificação, por exemplo a substituição de um único aminoácido, altera 2, 3, 4 ou mais propriedades ou actividades de um polipéptido do FVII. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser analisados relativamente a cada propriedade e cada actividade para identificar a gama de efeitos de uma modificação. Tais ensaios são conhecidos na técnica e estão descritos abaixo.

As modificações aqui disponibilizadas podem ser efectuadas através de técnicas de ADN recombinante convencionais, conforme prática de rotina para um perito na especialidade. Pode utilizar-se qualquer método conhecido na técnica para efectuar a mutação de qualquer um ou mais de um dos aminoácidos numa proteína-alvo. Os métodos incluem a mutagénese dirigida convencional das moléculas de ácidos nucleicos codificantes (utilizando, por exemplo, um kit, como o kit QuikChange disponível através de Stratagene) ou métodos de síntese de polipéptidos em fase sólida. Adicionalmente, as proteínas quiméricas modificadas aqui disponibilizadas (isto é, troca do domínio Gla) podem ser geradas através de técnicas de ADN recombinante de rotina. Por exemplo, os polipéptidos quiméricos podem ser gerados utilizando enzimas de restrição e metodologias de clonagem para a subclonagem de rotina dos componentes desejados do polipéptido quimérico.

Outras modificações que são ou não ao nível da sequência primária do polipéptido também podem ser incluídas num polipéptido do FVII modificado, ou seu conjugado, incluindo, mas não exclusivamente, a adição de um grupo carboidrato, a adição de um grupo polietilenoglicol (PEG), a adição de um domínio Fc, etc. Por exemplo, tais modificações adicionais podem ser efectuadas para aumentar a estabilidade ou a semivida da proteína.

Os polipéptidos do FVII modificados resultantes incluem aqueles que são polipéptidos activos ou polipéptidos do zimogénio de cadeia única ou aqueles que são polipéptidos semelhantes ao zimogénio de cadeia única ou com duas cadeias. Por exemplo, qualquer polipéptido modificado aqui disponibilizado que é um polipéptido do zimogénio de cadeia única pode ser auto-activado ou activado por outros factores de coagulação para produzir um FVII modificado que é uma forma com duas cadeias (isto é, FVIIa). As actividades de um polipéptido do FVII modificado manifestam-se tipicamente na sua forma com duas cadeias.

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem apresentar uma resistência acrescida ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, uma actividade catalítica acrescida na presença e/ou na ausência de TF, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida sérica, e/ou uma ligação acrescida aos fosfolípidos e/ou uma afinidade acrescida para os fosfolípidos. Tipicamente, estas propriedades e/ou actividades dos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados são produzidas ao mesmo tempo que outras actividades ou propriedades do FVII são retidas, tais como, mas não exclusivamente, a ligação ao TF e/ou a ligação e activação do FX. Assim, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados retêm a ligação ao TF e/ou a ligação e activação do FX em comparação com uma forma de tipo selvagem ou de partida do polipéptido do FVII. Tipicamente, esta actividade é substancialmente inalterada (menos de 1%, 5%, 10%, 20% ou 30% alterada) em comparação com uma proteína de tipo selvagem ou de partida. Em outros exemplos, a actividade de um polipéptido do FVII modificado é aumentada ou é diminuída em comparação com um polipéptido do FVII de tipo selvagem ou de partida. A actividade pode ser avaliada in vitro, ex vivo ou in vivo e pode ser comparada com a actividade do polipéptido do FVII não modificado, tal como por exemplo o polipéptido do FVII nativo, de tipo selvagem, maduro (SEQ ID NO: 3), o polipéptido precursor do FVII de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1 ou 2) ou qualquer outro polipéptido do FVII conhecido pelos peritos na especialidade que é usado como material de partida.

Por conseguinte, em virtude das modificações aqui disponibilizadas, os polipéptidos do FVII modificados podem apresentar uma actividade de coagulação acrescida de uma forma dependente do TF e/ou independente do TF. Tipicamente, a actividade de coagulação acrescida dos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados pode ser observada in vitro em ensaios apropriados, ou in vivo, por exemplo com a administração a um sujeito, tal como um sujeito humano ou não-humano. A actividade acrescida dos polipéptidos do FVII modificados pode ser intensificada em pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a actividade do polipéptido do FVIIa não modificado ou de partida. 1. Resistência acrescida aos inibidores

Tal como a maioria dos sistemas biológicos, a cascata de coagulação é regulada por mecanismos positivos e negativos. Estes mecanismos actuam frequentemente através da inibição ou do reforço da actividade de um ou mais factores envolvidos na cascata, quer directa quer indirectamente. Daqui advém que os factores de coagulação terapêuticos que são resistentes aos mecanismos inibitórios que regulam negativamente a sua actividade têm interesse. Em particular, os polipéptidos do FVII modificados que são resistentes às moléculas inibidoras que normalmente inibem a actividade do FVII têm interesse. O principal regulador do complexo TF/FVIIa é o inibidor da via do factor tecidual (TFPI). Igualmente inibidor da actividade do FVIIa, se bem que em menor grau, é a antitrombina III (ATUI) .

a. TFPI 0 inibidor da via do factor tecidual é um polipéptido de cadeia única codificado por 9 exões e localizado no cromossoma 2q31-q32.1. 0 TFPI (também designado por TFPI-1) é um inibidor de tipo Kunitz que é sintetizado principalmente pelas células endoteliais e contém uma região amino-terminal carregada negativamente, três domínios inibidor de tipo Kunitz em série e uma cauda carboxi-terminal altamente básica (Wun et ai., J. Biol. Chem. 263:6001 (1988)). Através de splicing alternativo do ARNm, produzem-se duas formas diferentes do TFPI: TFPla e . O TFPI é uma proteína segregada com um peso molecular de aproximadamente 46 kDa. O polipéptido precursor tem 304 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO:101) e é processado através da clivagem do péptido de sinal de 28 aminoácidos, resultando na secreção de uma glicoproteína madura com 276 aminoácidos (SEQ ID NO:102) . A proteína madura contém 18 resíduos de cisteína e forma 9 pontes dissulfureto quando está correctamente enrolada. A sequência principal também contém três locais de consenso de N-glicosilação Asn-X-Ser/Thr, os resíduos de asparagina localizados nas posições 145, 195 e 256. Os domínios de

Kunitz 1 e 2 são responsáveis pela ligação e inibição do complexo TF/FVIIa e do FXa, respectivamente (ver, por exemplo, Figura 4) . O domínio de Kunitz 3, que não possui actividade inibitória das proteases, e a extremidade C-terminal do TFPI revelaram estar envolvidos na sua localização na superfície celular (Piro et ai. (2004) Circulation 110:3567-3572). O TFPI é uma forma do TFPI resultante d esplicing alternativo, na qual o domínio de Kunitz 3 e a região C-terminal do TFPI são substituídos por uma região C-terminal não relacionada que dirige a ligação de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). O polipéptido precursor (SEQ ID NO:103) é processado para uma proteína madura com 223 aminoácidos (SEQ ID NO:104). Com base na massa da proteína, o TFPI (28 kDa) é consideravelmente mais pequeno do que o TFPI (36 kDa) . Ambos migram com a mesma massa molecular aparente (46 kDa) em electroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), o que sugere uma diferença em termos de modificações pós-traducionais. Os TFPI e estão presos à superfície celular de uma forma dependente do GPI. 0 TFPI contém uma âncora de GPI na sua extremidade C-terminal, ao passo que o TFPI aparentemente se prende a uma proteína(s) ligada(s) ao GPI ainda não identificada(s). Embora o TFPI represente apenas 20% do TFPI total de superfície, é responsável pela maior parte da actividade anti-TF/FVIIa, o que sugere um possível papel alternativo para o TFPI da superfície celular, tal como a ligação e clearance do FXa (Piro et al. (2005) J Thromb

Haemost 3:2677-2683) . O TFPI inibe a cascata de coagulação pelo menos de duas formas: através da ligação ao sítio activo do FXa e através da inactivação do complexo TF/FVIIa (ver, por exemplo, Figura 4). O primeiro domínio de Kunitz liga-se ao FVIIa, enquanto o segundo domínio liga-se ao FXa (Girard et al. (1989) Nature 338:518-520) . O TFPI livre liga-se muito lentamente ao FVIIa em comparação com a sua ligação ao FXa. Uma vez ligado ao FXa, contudo, o complexo TFPI/FXa apresenta uma forte afinidade para o complexo TF/FVIIa. A sua interacção resulta na formação de um complexo heterotetramérico na superfície da célula endotelial, no qual o FVIIa é cataliticamente inactivo (Figura 4). Por conseguinte, esta estrutura quaternária impede o início da cascata de coagulação pelo complexo TF/FVIIa.

Existe pelo menos um outro homólogo do TFPI nos seres humanos, o TFPI-2, também conhecido como proteína placentária 5 (PP5) e inibidor de proteases de serina associado à matriz (MSPI). O TFPI-2 é um inibidor de proteases de serina de tipo Kunitz, associado à matriz, de 32 kDa, que apresenta actividade inibitória para um amplo espectro de proteases, incluindo a tripsina, a plasmina, a quimiotripsina, a catepsina G, a calicreína plasmática e o complexo factor Vlla-factor tecidual. A proteína TFPI-2 madura de 213 aminoácidos (SEQ ID NO:105) contém três domínios de tipo Kunitz que apresentam uma identidade de sequência primária de 43%, 35% e 53% com os domínios de tipo Kunitz 1, 2, e 3, respectivamente, do TFPI. O primeiro domínio de tipo Kunitz do TFPI-2 humano contém a totalidade dos elementos estruturais para a inibição das proteases de serina, embora estudos cinéticos e moleculares indiquem que o TFPI-2 é um inibidor mais eficaz da plasmina do que de várias outras proteases de serina, incluindo o complexo TF/FVIIa (Chand et al. (2004) J Biol Chem 27 9:1750 0-17507) . Crê-se que desempenha um papel importante na requlação da diqestão e remodelação da matriz extracelular. Neste contexto, uma síntese reduzida do TFPI-2 foi relacionada com numerosos processos patofisiológicos, tais como a inflamação, a angiogénese, a aterosclerose, a degeneração da retina e o crescimento/metástase de tumores (Chand et al. (2005) Thromb Haemost 94:1122-30). Assim, embora homólogo do TFPI, pensa-se que o TFPI-2 não é um factor com a mesma importância na via de coagulação. O alinhamento de sequências da sequência do domínio de Kunitz 1 do TFPI-1 e do TFPI-2 está apresentado na Figura 6b. A imunodepleção do TFPI num modelo de coelho aumentou a coagulação (Warn-Cramer et al. (1993) Arterioscl Thromb 13:1551-1557, Ragni et al. (2000) Circulation 102:113-117), indicando que a perturbação da formação do complexo quaternário TF/FVIIa-TFPI/Fxa pode inibir a regulação negativa da iniciação da coagulação pelo complexo TF/FVIIa. Adicionalmente, a perturbação da interacção do FVIIa com o TFPI pode diminuir a clearance do FVIIa. Uma clearance reduzida pode manifestar-se como uma maior semivida. O FVIIa preso ao TF da superfície celular também pode ser internalizado e degradado sem esgotar o TF na superfície celular. Esta forma de internalização e degradação é aumentada de forma significativa na presença de TFPI/FXa, que forma um complexo quaternário com o complexo TF/FVIIa na superfície celular. A internalização e a degradação que ocorrem após a ligação são mediadas através de uma via de poços revestidos, dependente de uma proteína relacionada com os receptores de lipoproteínas (LRP) de baixa densidade (Iakhiaev et al., (1999) J. Biol. Chem 274:36995-37003). O TFPI também pode ajudar a mediar a clearance do FVIIa através de outros mecanismos, como os mecanismos de clearance hepática ou renal.

Modificações para obter uma resistência acrescida ao

TFPI São aqui disponibilizados polipéptidos do FVII modificados que apresentam uma resistência acrescida ao TFPI. Esta resistência ao TFPI pode obter-se, por exemplo, através da mutação de um ou mais resíduos no FVII envolvidos na interacção e ligação ao TFPI para reduzir ou impedir essa ligação, tornando assim os polipéptidos do FVII modificados resistentes aos efeitos naturalmente inibitórios do TFPI em relação à iniciação da coagulação. Quando são avaliados num ensaio in vitro apropriado ou in vivo, por exemplo após administração a um sujeito como um fármaco pró-coagulante, os polipéptidos do FVII modificados resistentes ao TFPI podem exibir uma actividade coagulante acrescida em comparação com os polipéptidos do FVII não modificados. Entre os mutantes do FVIIa que apresentam uma resistência acrescida ao TFPI estão mutantes que têm uma maior semivida. Por exemplo, o mutante descrito no Exemplo 9 apresenta uma semivida maior. São aqui disponibilizados polipéptidos do FVII modificados que possuem uma ou mais mutações em resíduos envolvidos no contacto FVII/TFPI ou em resíduos bastante próximos da interface de interacção. Estes resíduos de contacto incluem o resíduo de ácido aspártico na posição 196 (D196, Asp196) , o resíduo de lisina na posição 197 (K197,

Lys197) , o resíduo de lisina na posição 199 (K199, Lys199) , o resíduo de treonina na posição 239 (T239, Thr239) , o resíduo de arginina na posição 290 (R290, Arg290 ) e o resíduo de lisina na posição 341 (K341, Lys341), em que a numeração é relativa às posições de aminoácidos de um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3. Quando são identificados utilizando a numeração da quimiotripsina, estes resíduos correspondem a D60, K60a, K60c, T99, R147 e K192 (Figura 7). Um resíduo que está bastante próximo da interface FVII/TFPI e que pode ser modificado para causar impedimento estéreo é o resíduo de glicina na posição 237 (G237, Gly237 ) de acordo com a numeração do FVII maduro, que corresponde a G97 (Gly97) segundo a numeração da quimiotripsina.

Os resíduos identificados podem ser modificados, por exemplo, por substituição ou deleção de aminoácidos. Em alternativa, podem usar-se inserções de aminoácidos para alterar a conformação de um resíduo de aminoácido visado ou a estrutura da proteína na proximidade de um resíduo de aminoácido visado. Por exemplo, os resíduos identificados podem ser substituídos por outro aminoácido, de modo a perturbar a interacção entre o FVII e o TFPI e inibir a ligação eficiente das duas proteínas, gerando assim um polipéptido do FVII modificado resistente ao TFPI. Por exemplo, está contemplada a substituição de um aminoácido que cause impedimento estéreo na interacção do FVII com o TFPI (isto é, a substituição de Gly237 (Gly97) por outro aminoácido maior). Noutras concretizações, os polipéptidos do FVII modificados resistentes ao TFPI podem ser gerados por substituição de um resíduo de contacto por um aminoácido alternativo, de modo a obter uma inversão da carga ou uma neutralização da carga na posição identificada. Estes tipos de mutações podem afectar significativamente as contribuições electrostáticas do aminoácido do FVII substituído e perturbar a interacção normal do resíduo de contacto com o(s) resíduo(s) de contacto do TFPI correspondentes. Por exemplo, um resíduo de ácido aspártico carregado negativamente no FVII, que normalmente poderia interagir favoravelmente com um resíduo de arginina carregado positivamente no TFPI, pode ser substituído por uma lisina carregada positivamente, para não só eliminar a interacção electrostática favorável original, como também criar uma força repulsiva entre os resíduos e interferir com a ligação eficiente das proteínas. Assim, esta mutação interfere com a ligação eficiente das proteínas. Portanto, um aminoácido carregado negativamente (isto é, um aminoácido ácido) como o ácido aspártico (Asp, D) ou o ácido glutâmico (Glu, E) pode ser substituído por um aminoácido carregado positivamente (isto é, um aminoácido básico) como a lisina (Lys, K), a arginina (Arg, R) ou a histidina (His, H) . Reciprocamente, um aminoácido básico como a lisina (Lys, K) , a arginina (Arg, R) ou a histidina (His, H) pode ser substituído por um aminoácido ácido como o ácido aspártico (Asp, D) ou o ácido glutâmico (Glu, E) . Qualquer resíduo de contacto pode também ser substituído por um aminoácido neutro como a alanina (Ala, A) , a tirosina (Tyr, Y) , a metionina (Met, M), a leucina (Leu, L), a isoleucina (lie, I), a valina (Vai, V) , a fenilalanina (Phe, F) , a prolina (Pro, P) , a glicina (Gly, G) , a serina (Ser, S) , a treonina (Thr, T) , a asparagina (Asn, N), a glutamina (Gin, Q), o triptofano (Trp, W) e a cisteína (Cys, C) . Os aminoácidos hidrofóbicos, que incluem a isoleucina (He, I), a fenilalanina (Phe, F) , a valina (Vai, V), a leucina (Leu, L), o triptofano (Trp, W), a metionina (Met, M), a alanina (Ala, A), a glicina (Gly, G), a cisteína (Cys, C) e a tirosina (Tyr, Y) , são exemplos de aminoácidos neutros.

Em algumas concretizações, a glicina na posição 237 segundo a numeração do FVII maduro é substituída, de modo que o novo aminoácido cause impedimento estéreo e iniba a interacção entre o FVII e o TFPI. A glicina é o aminoácido mais pequeno e mais simples, contendo apenas um único átomo de hidrogénio na sua cadeia lateral. Devido ao seu pequeno tamanho, a glicina cabe em espaços pequenos e pode adoptar conformações particulares que os outros aminoácidos não podem. A substituição da glicina na posição 237 por um aminoácido com uma cadeia lateral maior poderia causar impedimento estéreo com outros aminoácidos na proteína do FVII, alterando assim a conformação da interface de ligação ao TFPI, e/ou causar impedimento estéreo com aminoácidos na proteína do TFPI. Ambas as situações poderiam resultar numa interacção e ligação debilitadas do FVII ao TFPI, aumentando desse modo a resistência do polipéptido do FVII modificado aos efeitos inibitórios do TFPI. Qualquer um dos 19 aminoácidos naturais contém cadeias laterais maiores do que a glicina e poderia ser usado para modificar o polipéptido do FVII. Exemplos destes aminoácidos são o triptofano (Trp, W) , a isoleucina (He, I), a valina (Vai, V) e a treonina (Thr, T) ·

Em outros exemplos, efectuam-se inserções de aminoácidos no polipéptido do FVII próximo dos resíduos identificados, para interferir com a interacção entre o TFPI e o FVII. É possível inserir um ou mais resíduos de aminoácidos numa ou mais posições no polipéptido do FVII. Por exemplo, um resíduo de tirosina pode ser inserido entre D196 e K197 (correspondendo a D60 e K60a, respectivamente, segundo a numeração da quimiotripsina). Esta modificação é D196K197insY (isto é, D196 e K197 são as posições entre as quais foi inserida uma tirosina (insY)). Noutro exemplo, dois resíduos de aminoácidos são inseridos numa posição identificada como sendo importante para a interacção com o TFPI. Por exemplo, uma alanina e uma serina podem ser inseridas entre G237 e T238 (correspondendo a G97 e T98, respectivamente, segundo a numeração da quimiotripsina) , resultando na modificação G237T238insAS. Tais mutações de inserção poderiam resultar numa interacção e ligação debilitadas do FVII ao TFPI, aumentando desse modo a resistência do polipéptido do FVII modificado aos efeitos inibitórios do TFPI. A Tabela 5 fornece exemplos não limitativos de substituições de aminoácidos exemplificativas nos resíduos identificados, que correspondem às posições de aminoácidos de um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3. Conforme salientado, estes polipéptidos do FVII foram concebidos para aumentar a resistência ao TFPI através da inibição da ligação FVII/TFPI e, por conseguinte, têm uma actividade coagulante acrescida. Relativamente a tais mutações, o primeiro aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência do polipéptido do FVII maduro com referência à SEQ ID NO: 3 e o segundo aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido seleccionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos seleccionadas para mutação também são identificadas de acordo com o esquema de numeração da quimiotripsina. Na tabela 5 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) onde estão apresentadas as sequências de aminoácidos exemplificativas dos polipéptidos do FVII modificados está identificado, bem como quaisquer números de identificação dos polipéptidos.

Tabela 5

Numa concretização adicional, é possível gerar mutantes de combinação. Entre estes mutantes de combinação estão incluídos aqueles que possuem duas ou mais mutações dos resíduos D196, K197, K199, G237, T239, R290 ou K341 com base na numeração de um FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3 (correspondendo a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 e K192, respectivamente, com base na numeração da quimiotripsina). Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado pode possuir substituições de aminoácidos em 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 das posições identificadas. Como salientado acima, os resíduos são substituídos de modo a eliminar as interacções favoráveis entre o FVIIa e o TFPI, e a introduzir interacções desfavoráveis ou impedimentos estéreos numa ou mais posições. Por conseguinte, um polipéptido modificado pode apresentar 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 mutações que proporcionam um ou mais dos seguintes efeitos: impedimento estéreo, inversão da carga, neutralização da carga, outra interacção desfavorável ou uma sua combinação. Por exemplo, podem efectuar-se duas ou mais mutações pelas quais aminoácidos carregados negativamente como o ácido aspártico (Asp, D) ou o ácido glutâmico (Glu, E) podem ser substituídos por um aminoácido carregado positivamente como a lisina (Lys, K) , a arginina (Arg, R) ou a histidina (His, H) , ou vice-versa, ou podem efectuar-se substituições neutras por meio da substituição de qualquer aminoácido por, por exemplo, alanina (Ala, A), tirosina (Tyr, Y) metionina (Met, M) ou leucina (Leu, L) , isoleucina (lie, I), valina (Vai, V), fenilalanina (Phe, F) , prolina (Pro, P) ou glicina (Gly, G) , serina (Ser, S) , treonina (Thr, T) , asparagina (Asn, N) , glutamina (Gin, Q) , triptofano (Trp, W) e cisteina (Cys, C) ou qualquer sua combinação. Os aminoácidos hidrofóbicos, que incluem a isoleucina (lie, I), a fenilalanina (Phe, F) , a valina (Vai, V) , a leucina (Leu, L) , o triptofano (Trp, W) , a metionina (Met, M) , a alanina (Ala, A), a glicina (Gly, G), a cisteina (Cys, C) e a tirosina (Tyr, Y), são exemplos de aminoácidos neutros. Noutro exemplo, podem efectuar-se duas ou mais mutações em que pelo menos uma é uma inversão da carga ou uma neutralização da carga e outra é uma substituição que troca a glicina por aminoácidos que contêm uma cadeia lateral maior, como o triptofano (Trp, W) , a isoleucina (lie, I), a valina (Vai, V) e a treonina (Thr, T) . Noutros exemplos, pode

incluir-se uma mutação de inserção no polipéptido do FVII modificado juntamente com outras mutações de inserção, ou com uma ou mais substituições de aminoácidos, tais como substituições de aminoácidos que introduzem interacções desfavoráveis ou impedimentos estéreos entre o FVII e o TFPI. É possível incluir qualquer permutação de combinações num polipéptido do FVII modificado, utilizando as modificações apresentadas na Tabela 5 acima. Por exemplo, os polipéptidos do FVII aqui disponibilizados podem conter D196K e uma ou mais modificações de substituição adicionais na posição de aminoácido K197, K199, G237, T239, R290 e/ou K341, e/ou uma inserção após D196, K197 e/ou G237. Um perito na especialidade pode gerar facilmente todas as combinações possíveis, utilizando as modificações apresentadas na Tabela 5.

Por exemplo, as variantes do FVII compreendem aquelas variantes que incluem, como uma das suas mutações, uma substituição de aminoácido na posição 197, com base na numeração de um FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3. 0 resíduo de lisina que ocupa a posição 197 num polipéptido do FVII não modificado pode ser substituído por qualquer resíduo de aminoácido. Em algumas concretizações, a lisina é

substituída por um resíduo de tirosina (Y) , alanina (A) , ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), leucina (L), metionina (M) , isoleucina (I), valina (V) , fenilalanina (F) ou triptofano (W). Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado exemplificativo é um polipéptido que contém a substituição K197L ou K197E. Noutro exemplo, um polipéptido do FVII contendo uma modificação na posição 197 (como uma substituição, deleção ou adição) também pode incluir outra modificação noutra posição. Geralmente, esta outra modificação é numa posição contemplada para modular a interacção do FVII com o TFPI, por exemplo removendo uma interacção favorável, criando uma interacção desfavorável, introduzindo impedimento estéreo ou uma sua combinação. Entre estas modificações adicionais estão incluídas as modificações nas posições de aminoácidos correspondentes a D196, K199, G237, T239, R290 ou K341, como descrito acima. Outras modificações adicionais conhecidas na técnica, conforme descritas abaixo, também são consideradas. Assim, além da modificação na posição 197, um polipéptido do FVII pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais modificações de aminoácidos.

Por exemplo, as variantes do FVII exemplificativas que possuem pelo menos uma modificação na posição 197 incluem aquelas que contêm 2 substituições, como D196F e K197E, aquelas que contêm 3 substituições, como D196R, K197M e K199E, aquelas que contêm 4 substituições, como D196R, K197E, K199E e R290E, aquelas que contêm 5 substituições, como K197L, K199D, G237T, R290D e K341Q, aquelas que contêm 6 substituições, como D196F, K197L, K199E, G237V, T239A e R290D, e aquelas que contêm 7 substituições, como D196Y, K197L, K199A, G237T, T239A, R290D e K341R. Exemplos de mutantes de combinação do FVII que incluem, como uma das suas mutações, uma substituição de aminoácido na posição 197, com base na numeração de um FVII maduro ilustrado na SEQ ID NO:3, estão incluídos na Tabela 6.

Os polipéptidos do FVII exemplificativos que contêm duas ou mais substituições de aminoácidos em um ou mais dos resíduos de aminoácidos D196, K197, K199, G237, T239, R290 ou K341, correspondendo às posições de aminoácidos de um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3, são aqueles disponibilizados na Tabela 6. Na tabela, as posições de aminoácidos seleccionadas para mutação também são identificadas de acordo com o esquema de numeração da quimiotripsina. Tais modificações foram concebidas para aumentar a resistência ao TFPI através da inibição da ligação do FVII ao TFPI e, por conseguinte, aumentam a actividade de coagulação.

Tabela 6

Os polipéptidos do FVII contendo uma ou mais substituições de aminoácidos nos resíduos identificados acima também podem conter mutações adicionais, como as descritas na Publicação de patente internacional n.2 W02004/083361, Neuenschwander et ai., (1995) Biochemistry 34:8701-8707, Chang et ai., (1999) Biochemistry 38:10940-10948 e Iakhiaev et ai., (2001) Thromb. Haemost. 85:458-463. Assim, numa concretização, os polipéptidos do FVII aqui disponibilizados podem conter uma ou mais substituições de aminoácidos em um ou mais dos resíduos de aminoácidos Q176, D196, K197, K199, G237, T239, R290, E296, K341 e Q366, correspondendo às posições de aminoácidos de um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3. Por exemplo, a uma ou mais mutações adicionais podem incluir, embora não estejam limitadas a estas, qualquer uma ou mais das mutações Q176A, D196N, G237L, E296A, K341N, K341Q, K341E, Q366A, Q366E e Q3 6 6G. b. Antitrombina III (AT-III) A antitrombina III (também conhecida como antitrombina ou AT-III) é uma serpina (inibidor de proteases de serina) anticoagulante importante. A AT-III é sintetizada como uma proteína precursora contendo 464 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:122). No decurso da secreção, um péptido de sinal de 32 resíduos é clivado para gerar uma antitrombina humana madura com 432 aminoácidos (SEQ ID NO: 123) . A glicoproteína AT-III de 58 kDa circula no sangue e actua como um inibidor das proteases de serina (serpina) para inibir um número elevado de proteases de serina do sistema de coagulação. Os alvos principais da AT-III são a trombina e o factor Xa, embora a AT-III também iniba as actividades do FIXa, FXIa, FXIIa e, em menor extensão, do FVIIa. A acção da AT-III é fortemente intensificada pelos glicosaminoglicanos, como o sulfato de heparano que existe naturalmente ou as várias heparinas derivadas de tecidos que são amplamente usadas como anticoagulantes na prática clínica. A AT-III liga-se de uma forma extremamente específica a uma sequência pentassacarídea única presente na heparina, que induz uma modificação conformacional na volta do centro reactivo. Nessa conformação, a volta do centro reactivo da AT-III pode interagir mais eficientemente com o sítio reactivo da protease de serina e efectuar a inibição. A AT-III não é normalmente inibitória para o FVIIa plasmático livre, mesmo na presença de heparina, provavelmente devido à conformação semelhante ao zimogénio do FVIIa que impede uma interacção eficiente com a AT-III. Os efeitos inibitórios da AT-III, contudo, aumentam quando o FVIIa se complexa com o TF. A ligação da AT-III ao complexo TF/FVIIa pode libertar o FVIIa do TF e mantê-lo num complexo inactivo com a AT-III. A afinidade acrescida da AT-III para o FVIIa ligado ao TF, em comparação com o FVIIa sozinho, reflecte provavelmente a maturação do sítio activo do FVIIa quando está complexado com o TF, tornando-o assim receptivo à ligação com a AT-III (Rao et al. (1993) Blood 81:2600-2607).

Deste modo, o impacto da AT-III no FVIIa é proporcional à actividade intrínseca da própria molécula de FVIIa. Enquanto o FVIIa retém a sua conformação semelhante ao zimogénio, a AT-III tem pouco efeito. Se, no entanto, o FVIIa alterar a conformação para uma forma mais activa, por exemplo através da ligação ao TF ou de modificações específicas in vitro, a inibição pela AT-III aumenta significativamente. Os polipéptidos do FVIIa que são modificados para possuir uma actividade intrínseca acrescida exibem muitas vezes aumentos simultâneos da susceptibilidade à inibição pela AT-III. Por exemplo, a modificação de um ou mais aminoácidos no bolso de activação do FVIIa, por exemplo através de substituições de aminoácidos correspondentes às substituições K337A, L305V, M298Q, V158D e E296V (em relação à sequência do FVII maduro apresentada na SEQ ID NO:3), resulta numa sensibilidade acrescida do polipéptido do FVIIa à AT-III, inibindo deste modo a actividade do FVIIa em até 90% (Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588). Noutro exemplo, a indução de uma conformação mais semelhante ao zimogénio por modificação de aminoácidos envolvidos numa hélice do FVIIa, embora aumente a actividade da proteína do FVIIa modificada, também aumenta a sua susceptibilidade à AT-III (Persson et al. (2004)

Biochem J 379:497-503).

Modificações para obter uma resistência acrescida à AT-

III É possível efectuar modificações num polipéptido do FVII que aumentam a sua resistência à inibição pela AT-III. Geralmente, estes polipéptidos do FVII modificados retêm pelo menos uma actividade de um polipéptido do FVII. Tipicamente, estas modificações incluem uma ou mais substituições de aminoácidos em qualquer posição do polipéptido do FVII que está directamente envolvida na interacção do FVIIa (ou do complexo TF/FVIIa) com a AT-III ou em outros resíduos que afectam a posição ou a conformação de resíduos que estão directamente envolvidos nas interacções entre o FVIIa (ou o complexo TF/FVIIa) e a AT-III. Os polipéptidos do FVII modificados que têm uma resistência acrescida à AT-III podem apresentar uma redução na extensão da inibição em condições específicas, ou na constante de velocidade de sequnda ordem para a reacção de inibição pela AT-III de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a extensão da inibição ou a constante de velocidade de segunda ordem para a inibição do polipéptido do FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo, ex vivo ou in vitro. Os polipéptidos do FVII modificados são, por conseguinte, resistentes aos efeitos naturalmente inibitórios da AT-III relativamente à iniciação da coagulação. Quando são avaliados num ensaio in vitro ou ex vivo apropriado ou in vivo, por exemplo após administração a um sujeito como um fármaco pró-coagulante, os polipéptidos do FVII modificados resistentes à AT-III exibem uma actividade coagulante acrescida em comparação com os polipéptidos do FVII não modificados.

Tal como aqui descrito abaixo, um perito na especialidade pode conceber empírica ou racionalmente polipéptidos do FVII modificados que apresentam uma resistência acrescida à AT-III. Estes polipéptidos do FVII modificados podem ser testados em ensaios conhecidos pelos peritos na especialidade para determinar se exibem uma resistência acrescida à AT-III. Por exemplo, pode medir-se a contante de velocidade de segunda ordem da reacção de inibição pela AT-III para estes polipéptidos do FVIIa modificados. Em geral, um polipéptido do FVII modificado que possui uma resistência acrescida à AT-III exibirá uma ligação diminuída em condições específicas (por exemplo, após a injecção de uma quantidade fixa da proteína num doente) e/ou uma diminuição da inibição pela AT-III. Tipicamente, estes ensaios são efectuados numa forma com duas cadeias do FVII, tal como a forma activada do FVII (FVIIa) . Além disso, os ensaios para determinar os efeitos da AT-III são geralmente realizados na presença de heparina e na presença de factor tecidual, embora estes ensaios também possam ser efectuados na ausência de um ou de ambos os cofactores.

Os polipéptidos do FVII modificados que têm uma resistência acrescida à AT-III podem apresentar uma redução na extensão da inibição em condições específicas, ou na constante de velocidade de segunda ordem para a reacção de inibição pela AT-III de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a extensão da inibição ou a constante de velocidade de segunda ordem para a inibição do polipéptido do FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. Tais polipéptidos do FVII modificados resultantes que têm uma resistência acrescida à AT-III podem exibir uma redução na ligação e/ou na afinidade para a AT-III de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a ligação e/ou a afinidade do polipéptido do FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. A resistência acrescida à AT-III destes polipéptidos do FVII modificados também se pode manifestar como uma actividade de coagulação acrescida na presença de AT-III. A actividade de coagulação dos polipéptidos do FVII modificados em relação à AT-III pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a actividade de coagulação do polipéptido do FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo, ex vivo ou in vitro. 2. Ligação às plaquetas activadas

Também é possível efectuar modificações num polipéptido do FVII que aumentam a sua actividade coagulante durante a iniciação da coagulação dependente do TF e/ou independente do TF. O mecanismo proposto para a iniciação da coagulação independente do TF envolve a activação directa do FX e do FIX pelo FVIIa (que não está num complexo com o TF) e tem lugar na superfície de uma plaqueta activada. 0 FVIIa liga-se às plaquetas activadas através de uma interacção entre resíduos presentes no domínio Gla do polipéptido do FVII e as fosfatidilserinas e outros fosfolípidos carregados negativamente expressos na superfície das plaquetas. Esta interacção é relativamente fraca e provavelmente não desempenha um papel significativo no pico inicial da produção de trombina observado normalmente durante a coagulação, que é muito provavelmente um resultado da actividade dependente do TF. Como discutido acima, a iniciação da coagulação independente do TF e a interacção relativamente fraca do FVIIa com a superfície plaquetária poderia explicar a necessidade de administração de doses elevadas do rFVIIa para obter eficácia na clínica. Por exemplo, somente cerca de 1% do FVII existente no plasma na concentração de 10 nM está presente na forma de TF/FVIIa, mas a dose terapêutica de rFVIIa é de 90 pg/kg ou cerca de 50 nM no plasma, isto é, muito acima desta quantidade. Assim, as doses elevadas do rFVIIa compensam a ligação de baixa afinidade do rFVIIa às plaquetas activadas, resultando numa actividade coagulante suficiente do agente terapêutico durante o tratamento. Deste modo, os polipéptidos do FVII modificados que podem ser administrados em doses mais baixas devido a uma ligação acrescida às plaquetas activadas e/ou uma afinidade acrescida para as plaquetas activadas, suficiente para realizar a iniciação da coagulação, têm interesse terapêutico. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados foram concebidos para apresentar uma ligação acrescida às plaquetas activadas e/ou uma afinidade acrescida para as plaquetas activadas através da modificação do domínio Gla. A interacção dos resíduos no domínio Gla -carboxilado das proteínas plasmáticas dependentes da vitamina K, como o FVII, o FIX, o FX, a protrombina, a proteína C e a proteína S, com os fosfolípidos carregados negativamente na superfície das membranas é importante para a hemostasia. Os domínios Gla das proteínas plasmáticas dependentes da vitamina K contêm tipicamente cerca de 45 aminoácidos, dos quais 9 a 12 resíduos de ácido glutâmico são modificados pós-traducionalmente por carboxilação dependente da vitamina K para formar -carboxiglutamato (Gla). Os aminoácidos que formam o domínio Gla estão posicionados imediatamente após aqueles que constituem o péptido de sinal e o propéptido das proteínas, estando, assim, situados na extremidade N-terminal após o processamento e a clivagem dos polipéptidos precursores nas proteínas maduras. Por exemplo, os aminoácidos que formam o domínio Gla no FVII estão nas posições 39-83 do polipéptido precursor apresentado na SEQ ID N0:1, nas posições 61-105 do polipéptido precursor apresentado na SEQ ID NO:2 e nas posições 1 a 45 do polipéptido maduro apresentado na SEQ ID NO:3. Destes, os 10 resíduos de ácido glutâmico nas posições E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 e E35 do polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3 são modificados por carboxilação para gerar resíduos de -carboxiglutamato (Gla)

Como o ácido glutâmico é apenas um quelante fraco do

Ca2+ e o -carboxiglutamato é um quelante muito mais forte, este passo de modificação pela carboxilase dependente da vitamina K aumenta significativamente a afinidade de ligação do domínio Gla da proteína para o Ca2+. O cálcio também se liga ao domínio protease do FVIIa, onde facilita as modificações conformacionais necessárias para a aquisição da actividade óptima. Através da ligação a locais tanto no domínio Gla como no domínio protease do FVIIa, o cálcio reforça a ligação ao TF e aos fosfolípidos, assim como a eficiência catalítica para a activação do FX. O domínio Gla -carboxilado liga sete iões Ca com uma afinidade variável, o que induz a modificação conformacional que permite que o domínio Gla interaja com o domínio C-terminal do TF. A ligação do Ca2+ também promove a interacção do FVIIa com os fosfolípidos carregados negativamente na membrana das plaquetas, cuja maior parte consiste em fosfatidilserinas. A fosfatidilserina (FS) é um componente fundamental da membrana carregada negativamente que sustenta a coagulação sanguínea.

Na maioria das células, a FS está presente no folheto interno da membrana celular e, portanto, não está exposta ao plasma. Processos celulares específicos, como a activação das plaquetas, resultam na translocação da FS para a superfície exterior voltada para o plasma, oferecendo um local de ligação para o domínio Gla das proteínas dependentes da vitamina K (Hemker et al. (1983) Blood Cells 9:303-317) .

Além do seu envolvimento nas interacções do FVIIa com o TF e as plaquetas activadas, o domínio Gla do FVIIa também está implicado na ligação e activação do FX. Isto pode ocorrer através de um mecanismo indirecto, no qual o domínio Gla do FVIIa ajuda a alinhar a Lys165 e a Lys166 do TF com o domínio Gla do FX, um passo importante na activação do FX em FXa. Em alternativa, o domínio Gla do FVIIa interage directamente com o domínio Gla do FX para alinhar correctamente a enzima e o substrato antes da activação (Neuenschwander et al. (1994) J Biol Chem 269:8007-8013, Huang et al. (1996) J Biol Chem 271:21752-21757). A arginina na posição 36 do FVIIa revelou ser importante para a acostagem eficaz do domínio Gla do FX na ausência de fosfolípido, demonstrando que o domínio Gla do FVIIa participa em interacções proteína-proteína com o FX (Ruf et al. (1999) Biochemistry 38:1957-1966).

Embora os domínios Gla das diferentes proteínas plasmáticas dependentes da vitamina K apresentem uma homologia significativa, eles ligam-se às membranas fosfolipídicas carregadas negativamente com afinidades muito diferentes, com constantes de dissociação (Kd) que variam em mais de 1000 vezes. O FVII humano exibe uma das afinidades mais baixas para as membranas fosfolipídicas entre estas proteínas (McDonald et al. (1997) Biochemistry 36:5120-5127). As interacções precisas responsáveis pela ligação do domínio Gla à FS não são totalmente compreendidas, embora pareça provável que os resíduos de aminoácidos individuais presentes neste domínio contribuam para as diferentes afinidades observadas. Estudos prévios indicaram que existia uma correlação entre os aminoácidos nas posições 10, 32 e 33 (relativamente à proteína do FVII maduro) e a afinidade global para a membrana (McDonald et al. (1997) Biochemistry 36:5120-5127). A análise mutacional subsequente também revelou que resíduos específicos contribuem para a afinidade de ligação. Por exemplo, a substituição da histidina na posição 10 da forma madura da proteína C por uma prolina resultou numa diminuição de 3 vezes da afinidade para a membrana (Shen et al. (1997) Biochemistry 36:16025-16031). Reciprocamente, a mutação de resíduos específicos no domínio Gla das proteínas plasmáticas dependentes da vitamina K pode produzir proteínas com maior afinidade para a membrana e uma função melhorada. Os efeitos da mutação em determinadas posições dentro do domínio Gla não são, contudo, necessariamente conservados entre as diferentes proteínas. Por exemplo, a mutação da proteína C bovina por substituição de Q32E e N33D mediou um grande aumento da ligação à membrana, ao passo que as mutações correspondentes na proteína C humana representaram alterações mínimas na ligação. A mutação análoga do FVII humano (K32E) resultou num aumento de 13 vezes da afinidade de ligação em comparação com a proteína do FVII de tipo selvagem (Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369). a. Modificação por introdução de um domínio Gla heterólogo

Devido à sua afinidade de ligação relativamente baixa para as plaquetas activadas, o domínio Gla do FVII constitui um alvo para ser modificado com o objectivo de melhorar a interacção entre o FVII modificado e a membrana fosfolipídica, aumentando assim a actividade de coagulação. A modificação pode ser efectuada através da substituição de aminoácidos específicos que estão envolvidos nesta interacção (ver, por exemplo, Shah et al. PNAS 95: 4429-4234; Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369) . Em alternativa, a modificação pode ser efectuada através da substituição do domínio Gla completo pelo domínio Gla de outra proteína dependente da vitamina K, isto é, uma troca do domínio Gla. Este tipo de modificação resulta numa proteína quimérica, como aquela que foi produzida quando o domínio Gla da proteína C foi substituído pelo domínio Gla do FVII (Geng et al. (1997) Thromb Haemost 77:926-933) .

Tipicamente, esta modificação inclui a introdução, por exemplo por adição ou substituição, de um domínio Gla heterólogo, ou de uma porção suficiente deste para efectuar uma ligação aos fosfolípidos, numa região do polipéptido do FVII para gerar um polipéptido do FVII modificado quimérico. Em geral, este polipéptido do FVII quimérico retém pelo menos uma actividade do FVII. A ligação e/ou a afinidade dos polipéptidos do FVII modificados no domínio Gla para as plaquetas activadas pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a ligação e/ou a afinidade do polipéptido do FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. A ligação e/ou a afinidade dos polipéptidos do FVII modificados para as plaquetas activadas também se pode manifestar como uma actividade de coagulação acrescida. A actividade de coagulação dos polipéptidos do FVII modificados no domínio Gla pode ser aumentada em pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a actividade de coagulação do polipéptido do FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro.

Um domínio Gla, ou uma porção suficiente deste, compreendido em qualquer polipéptido pode ser utilizado como fonte de um domínio Gla heterólogo para introdução ou substituição de uma região de um polipéptido do FVII. Tipicamente, este domínio Gla heterólogo apresenta afinidade de ligação para os fosfolípidos, por exemplo, os fosfolípidos presentes na superfície de uma plaqueta activada. Geralmente, a escolha de um domínio Gla heterólogo recai num domínio que apresenta maior afinidade para os fosfolípidos em comparação com a afinidade do domínio Gla do FVII. O domínio Gla exacto, ou uma porção suficiente deste, utilizado como domínio heterólogo para modificar um polipéptido do FVII pode ser determinado racional ou empiricamente. Os exemplos de outros polipéptidos que contêm domínios Gla incluem, embora não estejam limitados a estes, o FIX, o FX, a protrombina, a proteína C, a proteína S, a osteocalcina, a proteína Gla da matriz, a proteína 6 específica da paragem do crescimento (Gas6) e a proteína Z. Os domínios Gla destas proteínas exemplificativas estão apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-118, 120 e 121. Por exemplo, podem introduzir-se 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou mais aminoácidos contíguos, ou o domínio Gla completo, de um domínio Gla heterólogo num polipéptido do FVII. Adicionalmente, a introdução do domínio Gla num polipéptido do FVII também pode incluir aminoácidos adicionais que não fazem parte do domínio Gla do polipéptido heterólogo, desde que os aminoácidos adicionais não enfraqueçam significativamente a capacidade de ligação aos fosfolípidos do domínio Gla introduzido.

Em alguns exemplos, a introdução é efectuada por adição do domínio Gla ao polipéptido do FVII, de modo que o domínio Gla heterólogo seja inserido dentro do domínio Gla endógeno ou noutra região ou domínio do polipéptido do FVII, contanto que o polipéptido do FVII modificado retenha pelo menos uma actividade do FVII. Nestes exemplos, o domínio Gla nativo do polipéptido do FVII é conservado no polipéptido, embora em alguns casos a sequência de aminoácidos que constitui o domínio Gla nativo esteja interrompida. Noutros exemplos, o domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste, é inserido adjacente ao domínio Gla nativo, quer na extremidade N-terminal quer na extremidade C-terminal, de modo que o domínio Gla nativo não seja interrompido. Num exemplo adicional, o domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste, é inserido dentro de outro domínio do polipéptido do FVII.

Disponibilizam-se aqui também polipéptidos do FVII modificados no domínio Gla em que a totalidade ou uma parte contígua do domínio Gla endógeno do FVII é removida e é substituída por um domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste para efectuar uma ligação aos fosfolípidos, contanto que o polipéptido do FVII modificado retenha pelo menos uma actividade do FVII. Esta modificação é também designada por uma troca do domínio Gla. Por exemplo, a totalidade ou uma parte do domínio Gla do FVII, conforme apresentado na SEQ ID NO:119, correspondendo aos aminoácidos 1-45 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, pode ser removida de um polipéptido do FVII e substituída por um domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste. A porção heteróloga inclui qualquer domínio Gla conhecido pelos peritos na especialidade que se liga aos fosfolípidos, incluindo, embora não limitado a, um domínio Gla possuindo a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-118, 120 e 121. Em alguns casos, uma porção suficiente de um domínio Gla, por exemplo uma porção suficiente de qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-118, 120 e 121 para efectuar uma ligação aos fosfolípidos, pode substituir o domínio Gla endógeno, ou uma parte do domínio Gla endógeno, do FVII. Por exemplo, o domínio Gla do FVII pode ser trocado pelo domínio Gla da proteína C apresentado na SEQ ID NO:113. O polipéptido do FVII modificado resultante contém um domínio

Gla da proteína C seguido dos seus próprios domínios EGF-1, EGF-2 e protease de serina.

Em alguns exemplos, o domínio Gla heterólogo contém mutações que contribuem adicionalmente para uma ligação acrescida às plaquetas activadas, devido a uma ligação acrescida aos fosfolípidos. Por exemplo, se o domínio Gla da proteína C for introduzido para gerar um polipéptido do FVII modificado, o domínio Gla da proteína C pode conter mutações de aminoácidos que conferem uma ligação acrescida aos fosfolípidos.

Em outros exemplos, o domínio Gla heterólogo pode conter mutações adicionais que conferem funções do tipo FVII ao domínio Gla. Por exemplo, como referido acima, a R36 do domínio Gla do FVII apresentado na SEQ ID NO: 119 pode estar envolvida em interacções com o FX. Por conseguinte, o domínio Gla heterólogo pode conter modificações adicionais, tais como quaisquer modificações necessárias para manter uma arginina na posição 36 do polipéptido do FVII maduro, conforme apresentado na SEQ ID NO:3, ou quaisquer outras modificações necessárias para manter as propriedades de activação do FX do polipéptido do FVIIa modificado (Ruf et ai. (1999) Biochem 38:1957-1966). Assim, em alguns exemplos, pode efectuar-se uma mutação correspondente a R36 no domínio Gla heterólogo. A posição correspondente pode ser determinada por um perito na especialidade, por exemplo através do alinhamento das sequências de aminoácidos.

Tal como aqui descrito abaixo, um perito na especialidade pode conceber empírica ou racionalmente polipéptidos do FVII modificados contendo um domínio Gla heterólogo, de modo que o polipéptido do FVII resultante retenha pelo menos uma actividade do FVII. Tipicamente, tais polipéptidos do FVII modificados retêm a sua capacidade de ligação e activação do FX. Em alguns casos, estes polipéptidos do FVII modificados também retêm a sua capacidade de ligação e activação do FIX. Os polipéptidos do FVII modificados no domínio Gla resultantes incluem aqueles que retêm a sua capacidade de ligação ao TF. Os polipéptidos do FVII modificados com trocas do domínio Gla também incluem aqueles que possuem uma actividade intrínseca acrescida na ausência de TF. Por conseguinte, os polipéptidos do FVII modificados no domínio Gla resultantes incluem aqueles que não se ligam ao TF ou que se ligam fracamente ao TF em comparação com o FVIIa de tipo selvagem. Tipicamente, tais polipéptidos do FVII modificados apresentam uma ligação acrescida aos fosfolípidos. Em particular, estes polipéptidos do FVII modificados apresentam uma ligação acrescida à fosfatidilserina. A ligação acrescida aos fosfolípidos pode ser avaliada em fosfolípidos isolados ou na superfície de plaquetas activadas. Estes ensaios são tipicamente realizados numa forma com duas cadeias do FVII, como a forma activada do FVII (FVIIa).

Disponibilizam-se aqui polipéptidos do FVII modificados que contêm um domínio Gla heterólogo. Os exemplos destes polipéptidos do FVII modificados são aqueles em que o domínio Gla endógeno é substituído pela totalidade ou por uma porção do domínio Gla de qualquer uma das proteínas FIX (SEQ ID NO:110), FX (SEQ ID N0:111), trombina (SEQ ID N0:112), proteína C (SEQ ID N0:113) ou proteína S (SEQ ID N0:114) . Tais polipéptidos do FVII modificados podem apresentar uma ligação acrescida às plaquetas activadas, resultando numa actividade coagulante acrescida. A Tabela 7 apresenta exemplos de modificações que podem ser feitas num polipéptido do FVII para substituir o domínio Gla endógeno pelo domínio Gla do FIX, do FX, da proteína C, da proteína S ou da trombina. A tabela fornece o nome da modificação (por exemplo, Gla Swap FX; troca do domínio Gla com FX) e os pormenores da modificação, incluindo as posições de aminoácidos ao nível das quais o domínio Gla exógeno é inserido no polipéptido do FVII e a sequência do domínio Gla exógeno. 0 identificador de sequência (SEQ ID NO) onde estão apresentadas as sequências de aminoácidos exemplificativas dos polipéptidos do FVII modificados também é fornecido, bem como quaisquer números de identificação dos polipéptidos. Por exemplo, a modificação "Gla swap FIX" (troca do domínio Gla com FIX) (AlY44delinsYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTT EFWKQY) envolve a deleção do domínio Gla endógeno do FVII através da deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3) e a inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla do FIX apresentado na SEQ ID NO: 110. De forma idêntica, a modificação Gla swap FX envolve a deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3) e a inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos Al a Y44 do domínio Gla do FX apresentado na SEQ ID NO: 111. A modificação Gla Swap

Thrombin (troca do domínio Gla com trombina) envolve a deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3) e a inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Al a Y44 do domínio Gla da trombina apresentado na SEQ ID NO: 112. A modificação Gla Swap Protein C (troca do domínio Gla com proteína C) envolve a deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3) e a inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Al a H44 do domínio Gla da proteína C apresentado na SEQ ID NO: 113. A modificação Gla Swap Protein S (troca do domínio Gla com proteína S) envolve a deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3) e a inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y44 do domínio Gla da proteína S apresentado na SEQ ID NO: 114.

Os polipéptidos do FVII modificados contendo um domínio Gla heterólogo podem apresentar uma actividade coagulante acrescida em dosagens mais baixas em comparação com uma molécula do FVII de tipo selvagem, como NovoSeven®, devido a uma ligação acrescida e/ou uma afinidade acrescida para as plaguetas activadas. A actividade de coagulação dos polipéptidos do FVII modificados no domínio Gla pode ser aumentada em pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a actividade de coagulação do polipéptido do FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo, ex vivo ou in vitro. 3. Combinações e modificações adicionais

Além da modificação dos polipéptidos do FVII para possuírem uma resistência acrescida ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, uma actividade catalítica acrescida dependente do TF e/ou independente do TF, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida, e/ou uma ligação e/ou afinidade acrescida para as membranas fosfolipídicas, os polipéptidos do FVII modificados agui disponibilizados também incluem aqueles polipéptidos que apresentam mais de uma das propriedades referidas acima. Por exemplo, um polipéptido do FVII pode ser modificado de forma que o polipéptido resultante apresente uma ligação e/ou afinidade acrescida para os fosfolípidos e também apresente uma resistência acrescida ao TFPI. Por conseguinte, um polipéptido do FVII pode ser modificado por introdução de um domínio Gla heterólogo de outra proteína plasmática dependente da vitamina K e por substituição de qualquer um ou mais de um dos aminoácidos nas posições 196, 197, 199, 237, 239, 290 ou 341 em relação ao polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3.

Adicionalmente, qualquer polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado também pode conter uma ou mais modificações diferentes descritas na técnica. Tipicamente, tais modificações adicionais são aquelas que resultam elas próprias numa actividade coagulante acrescida do polipéptido modificado e/ou numa estabilidade acrescida do polipéptido. Por conseguinte, os polipéptidos do FVII modificados resultantes apresentam uma actividade coagulante acrescida.

As modificações adicionais podem incluir, por exemplo, qualquer substituição, deleção ou inserção de aminoácidos conhecida na técnica, tipicamente qualquer uma que aumente a actividade coagulante e/ou a estabilidade do polipéptido do FVII. Qualquer polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais modificações adicionais de aminoácidos, contanto que o polipéptido do FVII modificado resultante retenha uma actividade do FVII do polipéptido não modificado ou de tipo selvagem.

Num exemplo, a modificação adicional pode ser feita na sequência do polipéptido do FVII, de modo que a sua interacção com outros factores, moléculas e proteínas seja alterada. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos que estão envolvidos na interacção com o factor tecidual (TF) podem ser substituídos, de forma que a afinidade do polipéptido do FVII modificado para o TF seja aumentada. Outras modificações incluem, mas não estão limitadas, a modificação de aminoácidos que estão envolvidos em interacções com o factor X, o factor IX, o TFPI e a AT-III.

Também é possível efectuar modificações adicionais num polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado que alteram a conformação ou o enrolamento do polipéptido. Estas incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais aminoácidos por uma cisteína, de modo a formar uma nova ligação dissulfureto, ou modificações que estabilizam uma conformação de hélice , conferindo assim uma actividade acrescida ao polipéptido do FVII modificado. É igualmente possível fazer modificações adicionais no polipéptido do FVII para originar modificações pós-traducionais. Por exemplo, o polipéptido pode ser modificado para incluir sítios de glicosilação adicionais, de modo que o polipéptido do FVII modificado resultante possua uma maior glicosilação em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. Também se podem fazer modificações para introduzir resíduos de aminoácidos que podem ser subsequentemente ligados a um grupo funcional químico, por exemplo um grupo que actue para aumentar a estabilidade do polipéptido do FVII modificado. Um polipéptido do FVII também pode ser alterado através da modificação de potenciais sítio (s) de clivagem das proteases endógenas, diminuindo assim a degradação da variante do FVIIa e aumentando a estabilidade do polipéptido do FVII modificado.

Adicionalmente, podem efectuar-se substituições, deleções ou inserções de aminoácidos no domínio Gla endógeno ou heterólogo, de modo que o polipéptido do FVII modificado apresente uma ligação e/ou afinidade acrescida para as membranas fosfolipídicas. Noutros exemplos, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem apresentar deleções no domínio Gla endógeno, ou substituições nas posições que normalmente estão gama-carboxiladas (US20070037746).

As secções seguintes descrevem exemplos não limitativos de modificações exemplares descritas na técnica para promover uma estabilidade acrescida e/ou uma actividade coagulante acrescida de um polipéptido do FVII. Como discutido acima, tais modificações também podem ser adicionalmente incluídas em qualquer polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado. As posições de aminoácidos referenciadas abaixo correspondem ao polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3. Podem efectuar-se mutações correspondentes em outros polipéptidos do FVII, tais como as variantes alélicas, de espécie ou de splicing do polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3. a. Modificações que aumentam a actividade intrínseca

Num exemplo, podem efectuar-se modificações adicionais num polipéptido do factor VII modificado aqui disponibilizado que resultam numa actividade catalítica acrescida para o factor X e/ou o factor IX. Por exemplo, as modificações podem ser feitas nos aminoácidos que estão envolvidos na interacção com o seu cofactor, TF, de forma que o polipéptido do FVII modificado resultante possua uma afinidade acrescida para o TF e, desse modo, exiba uma actividade acrescida para o FX e/ou o FIX. Também é possível fazer modificações no bolso de activação do polipéptido do FVII, de modo que a actividade intrínseca do polipéptido do FVII modificado para o FX e/ou o FIX seja aumentada em comparação com a actividade do polipéptido não modificado. Outra estratégia de modificação que resulta numa actividade acrescida envolve a modificação do polipéptido do FVII, de modo que o enrolamento e a conformação da proteína sejam alterados para uma forma mais activa ou um equilíbrio entre conformações fortemente activas e inactivas (ou menos activas) seja deslocado a favor da(s) conformação(ões) fortemente activa (s) . Também é possível obter um polipéptido mais activo através da modificação dos aminoácidos envolvidos nas cadeias do polipéptido do FVII.

Por exemplo, podem fazer-se substituições de aminoácidos que introduzem novos pares de cisteínas passíveis de formar ligações dissulfureto novas, que podem actuar para "bloquear" o polipéptido do FVII modificado numa forma mais activa.

Os exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídas nos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados para aumentar a actividade intrínseca do polipéptido do FVII modificado incluem, embora não exclusivamente, aquelas descritas em Persson et al. (2004)

Biochem J. 379:497-503, Maun et al. (2005) Prot Sei 14:1171- 1180, Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588, Persson et al. (2002) Eur J Biochem 269:5950-5955, Soejima et al. (2001) J Biol Chem 27 6:1722 9-17235, Soejima et al. (2002) J Biol

Chem 277:49027-49035, WO200183725, W02002022776, W02 002038162, W02003027147 , WO200338162, W02004029090 , W02004029091, W02004108763 e W02004111242. Os exemplos não limitativos de modificações de aminoácidos exemplares descritas na técnica, que podem resultar numa actividade intrínseca acrescida do polipéptido do FVII modificado, incluem qualquer uma ou mais das modificações S278C/V302C, L279C/N301C, V280C/V301C, S281C/V299C, S314E, L39E, L39Q, L39H, I42R, S43Q, S53N, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, T83K, E116D, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, VI581, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, R304Y, R304F, R304L, R304M, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, S314A, S314V, S3141, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K3371, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, F374P, F374A, F374V, F3741, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, a substituição das posições 300-322, 305-322, 300-312 ou 305-312 pelos aminoácidos correspondentes da tripsina, da trombina ou do FX e a substituição das posições 310-329, 311-322 ou 233-329 pelos aminoácidos correspondentes da tripsina. b. Modificações que aumentam a resistência às proteases

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados também podem conter modificações adicionais que resultam numa resistência acrescida do polipéptido às proteases. Por exemplo, podem fazer-se substituições de aminoácidos que removem um ou mais potenciais locais de clivaqem proteolítica. Os polipéptidos do FVII modificados podem pois ser convertidos em espécies mais resistentes às proteases, aumentando assim a estabilidade e a semivida do polipéptido modificado.

Os exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídas nos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados para aumentar a resistência às proteases incluem, embora não exclusivamente, aquelas descritas na Patente U.S. n.2 US5580560 ou no Pedido internacional publicado n.2 WO1988010295 e W02002038162. Os exemplos não limitativos de modificações exemplares descritas na técnica que podem resultar numa resistência acrescida do polipéptido do FVII modificado aos inibidores e/ou às proteases incluem qualquer uma ou mais das modificações K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32A, K32S, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, I42N, I42S, I42A, I42Q, Y44N, Y44S, Y44A, Y44Q, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, k34IE, K341Q, K341G, K341T, K341A e K341S. c. Modificações que aumentam a afinidade para os fosfolipidos A actividade coagulante do FVII pode ser melhorada aumentando a ligação e/ou a afinidade do polipéptido para os fosfolipidos, tais como os fosfolipidos expressos na superfície das plaquetas activadas. Por exemplo, é possível fazer substituições de aminoácidos adicionais em posições particulares do domínio Gla endógeno de um polipéptido do FVII que resultam num polipéptido do FVII modificado com uma capacidade acrescida de ligação à fosfatidilserina e a outros fosfolipidos carregados negativamente. Assim, tais modificações também podem ser incluídas num polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado, desde que esses polipéptidos do FVII modificados possuam um domínio Gla endógeno, isto é, não tenham sido sujeitos a uma modificação que resulte na substituição do domínio Gla endógeno pelo domínio Gla de outra proteína dependente da vitamina K.

Os exemplos de modificações adicionais para aumentar a ligação e/ou a afinidade para os fosfolípidos e que podem ser feitas num polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado que contenha um domínio Gla endógeno do FVII incluem, embora não exclusivamente, aquelas descritas em Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369, US20030100506, US20040220106, US20060240526, US6017882, US6693075, US6762286, WO200393465 e W02004111242.

Ilustrativas de tais modificações são qualquer uma ou mais de: uma inserção de uma tirosina na posição 4 ou modificação de qualquer uma ou mais de P10Q, P10E, P10D, P10N, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, K38E e K38D. d. Modificações que alteram a glicosilação A alteração dos níveis de glicosilação de uma proteína é descrita na técnica como uma forma de reduzir a imunogenicidade, aumentar a estabilidade, reduzir a frequência de administração e/ou reduzir os efeitos secundários adversos como a inflamação. Normalmente, isto obtém-se através do aumento dos níveis de glicosilação. 0(s) sítio (s) de glicosilação fornece(m) um local para a ligação de um grupo carboidrato no polipéptido, de forma que quando o polipéptido é produzido numa célula eucariótica capaz de efectuar a glicosilação, o polipéptido é glicosilado. Há quatro sítios de glicosilação naturais no FVII: dois sítios de N-glicosilação nas posições N145 e N322 e dois sítios de O-glicosilação nas posições S52 e S60, correspondendo às posições de aminoácidos no polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3. Numa concretização, podem fazer-se modificações adicionais num polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado, de modo que a glicosilação nos sítios referidos acima seja perturbada. Isto pode dar origem a um polipéptido do FVII modificado com uma actividade coagulante acrescida (ver, por exemplo, WO2005123916). Os exemplos não limitativos de modificações exemplares descritas na técnica que podem resultar numa redução da glicosilação e numa actividade acrescida do polipéptido do VII modificado, em comparação com um polipéptido do FVII não modificado, incluem, mas não estão limitadas a, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W e N322C.

Noutra concretização, é possível efectuar modificações adicionais na sequência de aminoácidos dos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados para introduzir sítios de glicosilação adicionais, aumentando assim o nível de glicosilação do polipéptido do FVII modificado em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. 0 sítio de glicosilação pode ser um sítio de N-glicosilação ou de 0-glicosilação. Os exemplos de modificações que podem ser efectuadas num polipéptido do FVII para introduzir um ou mais novos sítios de glicosilação incluem, embora não exclusivamente, aqueles que estão descritos em US6806063 e WO200393465. Os exemplos não limitativos de modificações exemplares descritas na técnica que podem resultar numa maior glicosilação do polipéptido do FVII modificado, em comparação com um polipéptido do FVII não modificado, incluem, mas não estão limitadas a, F4S, F4T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, 130N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/142T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T,K34IN/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T. e. Modificações para facilitar a ligação de grupos químicos É igualmente possível fazer modificações adicionais num polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado para facilitar a ligação subsequente de um grupo químico. Podem efectuar-se uma ou mais substituições ou inserções de aminoácidos, de modo a poder ligar um grupo químico a um polipéptido do FVII modificado via o aminoácido substituído. Por exemplo, uma cisteína pode ser introduzida num polipéptido do FVII modificado, à qual se pode ligar um grupo polietilenoglicol (PEG) para conferir uma estabilidade acrescida e uma maior semivida sérica. Outros resíduos de ligação incluem os resíduos de lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas concretizações, determinados resíduos de aminoácidos são substituídos para reduzir o número de potenciais posições de ligação. Por exemplo, o número de lisinas pode ser reduzido. Os exemplos de modificações que podem ser feitas na sequência de aminoácidos de um polipéptido do FVII que podem facilitar a ligação subsequente com um grupo químico incluem, embora não exclusivamente, aquelas que são descritas em US20030096338, US20060019336, US6806063, WO200158935 e W02002077218. Os exemplos não limitativos de modificações exemplares de um polipéptido do FVII que podem facilitar a ligação subsequente com um grupo químico incluem, mas não estão limitadas a, Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L390D, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, I30E, K32E, A34E, T37E, K38E, W41E, Y44E, S45E, D46C, LI 4 IE, E142E, K143E, R144E, L288E, R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, K316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, K18R, K32R, K38R, K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, K148R, K157R, K161R, K197R, K199R, K316R, K337R, K341R, K389R, K18Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, K18H, K32H, K38H, K62H, K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H e K389H. f. Modificações combinadas exemplares

Disponibilizam-se aqui polipéptidos do FVII modificados que têm duas ou mais modificações concebidas para afectar uma ou mais propriedades ou actividades de um polipéptido do FVII não modificado. Em alguns exemplos, as duas ou mais modificações alteram duas ou mais propriedades ou actividades do polipéptido do FVII. As modificações podem ser feitas nos polipéptidos do FVII, de modo a alterar uma ou mais das propriedades/actividades de resistência ao TFPI, resistência à AT-III, actividade intrínseca, actividade amidolítica, actividade catalítica (na presença ou na ausência de TF), ligação e/ou afinidade para os fosfolípidos, glicosilação, resistência às proteases, semivida e interacção com outros factores ou moléculas e/ou activação de outros factores ou moléculas, como o FX e o FIX. Tipicamente, as duas ou mais modificações são combinadas, de forma que o polipéptido do FVII modificado resultante possua uma actividade coagulante acrescida, uma duração aumentada da actividade coagulante e/ou um índice terapêutico melhorado em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. 0 polipéptido do FVIIa modificado poderá apresentar um início mais rápido da actividade coagulante, in vitro, ex vivo ou in vivo. As modificações podem incluir a substituição, inserção ou deleção de aminoácidos. A actividade coagulante acrescida, a duração aumentada da actividade coagulante, o início aumentado da actividade coagulante e/ou o índice terapêutico melhorado do polipéptido do FVII modificado contendo duas ou mais modificações podem ser aumentados em pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, em comparação com a actividade do polipéptido do FVIIa não modificado ou de partida.

Disponibilizam-se aqui polipéptidos do FVII modificados que contêm duas ou mais modificações que são introduzidas num polipéptido do FVII não modificado para alterar duas ou mais actividades ou propriedades. Os polipéptidos do FVII modificados podem conter 2, 3, 4, 5, 6 ou mais modificações. Além disso, cada modificação pode envolver um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado pode conter duas modificações, em que cada uma delas é a substituição de um único aminoácido. Noutro exemplo, um polipéptido do FVII modificado pode conter duas modificações, em que uma é a substituição de um único aminoácido e a outra envolve a deleção de mais de um resíduo de aminoácido e depois a inserção de mais de um resíduo de aminoácido. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado pode conter a substituição de aminoácidos M298Q (resíduos correspondendo a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3) para aumentar a actividade intrínseca e uma modificação "Gla Swap FIX", que envolve a deleção do domínio Gla endógeno do FVII através da deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3) e a inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla do FIX apresentado na SEQ ID NO:110.

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ter duas ou mais modificações seleccionadas apenas entre aquelas apresentadas nas Tabelas 5 a 8. Noutros exemplos, o polipéptido do FVII modificado contém duas ou mais modificações, em que uma ou mais modificações são seleccionadas entre aquelas apresentadas na Tabelas 5 a 8 e uma ou mais modificações são modificações adicionais que não estão apresentadas nas Tabelas 5 a 8, como por exemplo as modificações descritas na técnica. Em alguns exemplos, a uma ou mais modificações adicionais podem ser seleccionadas entre aquelas apresentadas na Secção D.3.a-e, acima. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado pode conter uma modificação num ou mais dos resíduos de aminoácidos D196, K197, K199, G237, T239, R290 ou K341, com base na numeração de um FVII maduro apresentado na SEQ ID N0:3 (correspondendo a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 e K192, respectivamente, com base na numeração da quimiotripsina), que pode aumentar a resistência ao TFPI, e uma modificação num ou mais resíduos de aminoácidos que afecta a actividade intrínseca, como por exemplo V158 e M298 (V21 e M156, respectivamente, com base na numeração da quimiotripsina). Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado pode conter duas substituições de aminoácidos que aumentam a resistência ao TFPI, como K197E e G237V, e uma substituição de aminoácidos que aumenta a actividade intrínseca, como M298Q, resultando num polipéptido do FVII com uma actividade coagulante acrescida.

As modificações combinadas exemplares não limitativas são fornecidas na Tabela 9. Estas modificações combinadas exemplares incluem duas ou mais modificações que foram concebidas para alterar duas ou mais actividades ou propriedades de um polipéptido do FVII, incluindo, mas não limitadas a, resistência ao TFPI, resistência à AT-III, actividade intrínseca, actividade amidolítica, actividade catalítica (na presença e/ou na ausência de TF), ligação e/ou afinidade para os fosfolípidos, glicosilação, resistência às proteases, semivida e interacção com outros factores ou moléculas e/ou activação de outros factores ou moléculas, como o FX e o FIX. Os polipéptidos do FVII modificados contendo tais modificações combinadas podem ter uma actividade coagulante acrescida, uma duração aumentada da actividade coagulante, um início aumentado da actividade coagulante e/ou um índice terapêutico melhorado. As modificações apresentadas na Tabela 8 abaixo utilizam a mesma nomenclatura e sistemas de numeração descritos nas Tabelas 5 a 7 acima. Por exemplo, a modificação "Gla Swap FIX" envolve a deleção do domínio Gla endógeno do FVII através da deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO:3) e a inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla do FIX apresentado na SEQ ID NO:110, como descrito acima. As posições de aminoácidos correspondem às posições de aminoácidos de um polipéptido do FVII maduro apresentado na SEQ ID NO: 3 e também são identificadas pelo esquema de numeração da quimiotripsina. Na Tabela 9 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) onde estão apresentadas as sequências de aminoácidos exemplares dos polipéptidos do FVII modificados é identificado, bem como quaisquer números de identificação dos polipéptidos.

E. Concepção e métodos para modificar o FVII

Disponibilizam-se aqui polipéptidos do FVII modificados. Os polipéptidos do FVII são modificados, de forma que podem apresentar alterações em uma ou mais actividades ou propriedades em comparação com um polipéptido do FVII não modificado. As actividades e propriedades que podem ser alteradas em resultado da modificação incluem, embora não estejam limitadas a estes exemplos, a actividade de coagulação ou coagulante, a actividade pró-coagulante, a actividade proteolítica ou catalítica, como a actividade que efectua a activação do factor X (FX) ou a activação do factor IX (FIX); a antigenicidade, por exemplo a antigenicidade avaliada através da capacidade de ligação a um anticorpo anti-FVII ou de competição com um polipéptido pela ligação a um anticorpo anti-FVII; a capacidade de ligação ao factor tecidual, ao factor X ou ao factor IX, a capacidade de ligação aos fosfolípidos, a semivida, a estrutura tridimensional, o pi e/ou a conformação. Entre os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados estão aqueles que possuem uma actividade coagulante acrescida. Entre estes encontram-se aqueles cujo aumento da actividade coagulante resulta de ou envolve uma resistência acrescida do FVII modificado ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida; uma actividade catalítica acrescida e/ou uma ligação acrescida às plaquetas activadas. Disponibilizam-se aqui métodos exemplares para identificar tais polipéptidos do FVII modificados, bem como os polipéptidos modificados. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado que apresenta uma resistência acrescida ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III e/ou uma ligação acrescida às plaquetas activadas pode ser produzido racional ou empiricamente: (a) visando racionalmente os locais que se considera estarem envolvidos nessas propriedades ou (b) testando empiricamente os polipéptidos do FVII modificados em ensaios funcionais quanto a resistência ao TFPI, resistência à AT-III, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como uma maior semivida, e/ou ligação acrescida aos fosfolípidos ou às plaquetas activadas. Em muitos casos, é possível utilizar uma combinação das abordagens de concepção racional e empírica para gerar os polipéptidos do FVII modificados.

Após a identificação de um domínio, região ou aminoácido a modificar utilizando uma abordagem racional ou empírica, pode utilizar-se qualquer método conhecido na técnica para efectuar a mutação de qualquer um ou mais de um dos aminoácidos numa proteína-alvo. Os métodos incluem a mutagénese dirigida convencional das moléculas de ácidos nucleicos codificantes (utilizando, por exemplo, um kit como o kit QuikChange disponível através de Stratagene) ou métodos de síntese de polipéptidos em fase sólida. Adicionalmente, as proteínas quiméricas modificadas aqui disponibilizadas (isto é, troca do domínio Gla) podem ser geradas através de técnicas de ADN recombinante de rotina. Por exemplo, os polipéptidos quiméricos podem ser produzidos utilizando enzimas de restrição e metodologias de clonagem para a subclonagem de rotina dos componentes desejados do polipéptido quimérico. Uma vez identificados e gerados, os polipéptidos do FVII modificados podem depois ser avaliados quanto à actividade, como a actividade catalítica ou a actividade coagulante, utilizando qualquer um ou mais de um dos vários ensaios conhecidos na técnica ou aqui descritos abaixo. 1. Racionais

Em alguns exemplos, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados foram concebidos através de uma modificação racional para aumentar a actividade coagulante. Num método assim, os domínios, regiões ou aminoácidos responsáveis pela actividade de um polipéptido do FVII são conhecidos ou podem ser determinados racionalmente. Por exemplo, várias bases de dados no domínio público disponibilizam informações de sequência e domínios relativas ao FVII de tipo selvagem (ver, por exemplo, o servidor de proteómica ExPASy em ca.expasy.org). É possível aceder a outras informações no domínio público para determinar os aminoácidos, regiões e/ou domínios num polipéptido do FVII que estão envolvidos numa interacção ou actividade específica. Tais fontes incluem, por exemplo, as revistas científicas, as bases de dados de sequências e de funções ou as bases de dados de patentes. Em alguns casos, utilizam-se os indícios directos para determinar a influência de um ou mais aminoácidos numa dada interacção ou actividade. Noutros exemplos, isto é extrapolado indirectamente a partir, por exemplo, de indícios ou informações sobre proteínas relacionadas que exibem actividades e/ou interacções similares. Nesses exemplos, aqueles aminoácidos que são responsáveis pela actividade ou interacção na proteína relacionada podem ser usados para determinar os aminoácidos correspondentes no polipéptido do FVII através do alinhamento do polipéptido relacionado com o polipéptido do FVII, com base em similaridades de sequência e/ou estruturais. Deste modo, os aminoácidos no polipéptido do FVII que provavelmente estão envolvidos numa dada actividade ou interacção podem ser determinados. Adicionalmente, pode usar-se a modelaqem por homologia para prever os resíduos que desempenham papéis importantes na formação e/ou estabilização de interacções proteína/proteína e esta informação pode ser utilizada para conceber variantes com propriedades melhoradas.

Uma vez os domínios, regiões e/ou aminoácidos responsáveis pela actividade de um polipéptido do FVII determinados, eles podem ser modificados de forma que as modificações resultem previsivelmente numa actividade coagulante acrescida do polipéptido. Este procedimento pode realizar-se de várias maneiras, dependendo da actividade ou da interacção visada. Em alguns exemplos, é possível fazer uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos que aumentam a afinidade do FVII modificado para outras proteínas ou moléculas.

Num exemplo, podem fazer-se modificações em qualquer domínio, região ou aminoácido(s) para alterar a afinidade ou a interacção do FVII modificado com outras proteínas, isto é, aumentá-la ou diminui-la dependendo da interacção particular que se pretende modificar. Para efectuar tal modificação, os domínios, regiões e/ou aminoácidos envolvidos nessa interacção, ou que se crê estarem envolvidos nessa interacção, são conhecidos ou podem ser determinados racionalmente. Por exemplo, um FVII modificado pode ser concebido racionalmente para ter uma interacção diminuída com uma proteína inibidora, como o TFPI ou a AT-III, de forma a aumentar a actividade coagulante do polipéptido do FVII modificado. Um método de concepção racional de um polipéptido do FVII para ter uma interacção diminuída com o TFPI é apresentado no Exemplo 1. Podem aplicar-se abordagens similares para aumentar ou diminuir a interacção do FVII com qualquer outro polipéptido que interaja ou se ligue ao FVII.

Por exemplo, o FVII foi modificado para apresentar uma resistência acrescida ao TFPI. 0 TFPI, num complexo com o FXa, liga-se ao complexo TF/FVIIa para formar um complexo quaternário no qual a actividade catalítica do FVIIa é inibida. 0 primeiro domínio de Kunitz do TFPI-1 (TFPI-1 Kl) é o domínio responsável pela interacção com o FVIIa e pela sua inibição. A identificação dos resíduos de aminoácidos no FVII que estão envolvidos nesta interacção pode facilitar a concepção de polipéptidos do FVII resistentes ao TFPI. É possível recorrer a várias abordagens para determinar quais os resíduos de aminoácidos no FVII que estão envolvidos nesta interacção, incluindo, embora não exclusivamente, a mutagénese, as abordagens de varrimento e uma concepção racional como a modelagem computacional. A estrutura cristalina do FVIIa num complexo com o TFPI pode ser usada como base para determinar os resíduos de contacto. Em alternativa, e como descrito no Exemplo 1, quando não está disponível uma estrutura cristalina, pode gerar-se um modelo computacional através de uma série de alinhamentos e de extrapolações a partir de estruturas e sequências conhecidas de proteínas relacionadas e das interacções entre elas.

Os resultados da modelagem computacional podem usar-se para identificar os resíduos que estão directamente envolvidos no contacto com uma proteína-alvo pretendida, como por exemplo o TFPI, e/ou aqueles resíduos que estão indirectamente envolvidos na interacção, por exemplo, devido a uma proximidade significativa dos resíduos de contacto. Por exemplo, utilizando os resultados da modelagem computacional descrita no Exemplo 1, efectuou-se um alinhamento dos primeiros domínios de Kunitz do TFPI-1 e do TFPI-2 para determinar quais são os resíduos de "contacto" correspondentes no TFPI-1 (Figura 5b) . Podem identificar-se aminoácidos de substituição, de modo a alterar a interacção do polipéptido do FVII com a proteína-alvo. Os aminoácidos de substituição podem compreender até à totalidade dos 19 outros aminoácidos de ocorrência natural, assim como aminoácidos "não naturais". Em alternativa, estes aminoácidos de substituição podem ser identificados por mutagénese in silico com base em pressupostos racionais da interacção. 0 Exemplo 1 apresenta uma abordagem in silico para a identificação de aminoácidos de substituição, em que a análise do modelo computacional revelou os resíduos envolvidos na complementaridade electrostática entre o Factor VII e o TFPI-1 Kl. Por exemplo, o resíduo D60 carregado negativamente do FVII (segundo a numeração da quimiotripsina) parece estar envolvido numa interacção electrostática com o resíduo R20 carregado positivamente do TFPI-1. Por conseguinte, este resíduo é um candidato a mutagénese para abolir a complementaridade electrostática com o R20 do TFPI, gerando assim um polipéptido do FVII modificado que possui uma resistência acrescida ao TFPI. Este processo pode ser efectuado por substituições com inversão da carga ou com neutralização da carga. Por exemplo, pode fazer-se uma substituição de aminoácidos para substituir o ácido aspártico carregado negativamente por uma lisina carregada positivamente. Esta substituição com inversão da carga estabelece uma interacção repulsiva entre cargas neste local e interfere com a ligação e interacção do TFPI com o FVIIa. Noutro exemplo, o resíduo D60 carregado negativamente do FVII pode ser substituído por uma arginina básica para anular a complementaridade electrostática positiva com o resíduo R20 do TFPI e introduzir uma interacção desfavorável. Estas modificações concebidas racionalmente podem efectuar-se num ou mais dos resíduos do FVII que, conforme determinado, estão envolvidos no contacto e interacção directos ou indirectos com resíduos do TFPI.

Noutro exemplo, as modificações racionais de um polipéptido do FVII podem efectuar-se com base em funções conhecidas dos domínios ou regiões do polipéptido. Por exemplo, sabe-se que o domínio Gla do FVII é responsável pela ligação do FVIIa aos fosfolípidos, tais como os fosfolípidos presentes nas plaquetas activadas, ainda que muito fracamente. Outras proteínas dependentes da vitamina K, como por exemplo o FIX, o FX, a protrombina, a proteína C e a proteína S, também possuem domínios Gla que realizam a ligação da proteína aos fosfolípidos carregados negativamente, em muitos casos com uma afinidade muito superior ao domínio Gla do FVII. Considera-se que a introdução de um domínio Gla heterólogo num polipéptido do FVII aumenta a afinidade do FVII para os fosfolípidos. Por exemplo, o FX (e o FXa) apresenta uma afinidade relativamente elevada para os fosfolípidos em comparação com a afinidade do FVII (e do FVIIa) . Por conseguinte, num exemplo, o domínio Gla do FX, ou uma porção suficiente do domínio Gla do FX para efectuar uma ligação aos fosfolípidos, pode ser introduzido num polipéptido do FVII para gerar um polipéptido do FVII modificado quimérico.

Se necessário, um polipéptido do FVII pode ser concebido através de uma combinação de métodos racionais e empíricos. Por exemplo, a ligação dos polipéptidos contendo um domínio Gla pode ser testada e rastreada para identificar quais os polipéptidos que apresentam a ligação e/ou a afinidade mais elevada para os fosfolípidos, por exemplo, nas superfícies das plaquetas. Em alternativa ou adicionalmente, uma série de polipéptidos do FVII contendo vários domínios Gla heterólogos introduzidos, ou porções suficientes destes, pode ser testada para determinar os polipéptidos quiméricos que exibem a afinidade e/ou ligação mais elevada aos fosfolípidos. 2. Empíricos (isto é, rastreio)

Os polipéptidos do FVII modificados também podem ser produzidos empiricamente e depois testados ou rastreados para identificar aqueles que possuem a actividade ou propriedade particular considerada. Por exemplo, os polipéptidos do FVII modificados podem ser gerados por mutação de qualquer um ou mais de um dos resíduos de aminoácidos de um polipéptido do FVII, utilizando qualquer método geralmente conhecido na técnica (ver também o Pedido U.S. publicado n.2 2004/0146938) . Estes polipéptidos do FVII modificados podem ser testados em ensaios de coagulação funcionais para determinar se são "hits" (sucessos) relativamente a uma actividade coagulante crescente. Os hits podem ser subsequentemente testados para determinar se apresentam uma resistência acrescida aos inibidores, como o TFPI ou a ATUI, e/ou uma ligação acrescida aos fosfolípidos ou propriedades farmacocinéticas melhoradas, como uma maior semivida, utilizando quaisquer ensaios aqui descritos ou conhecidos por um perito na especialidade.

Os exemplos de métodos para mutar o FVII incluem os métodos que resultam em mutagénese aleatória ao longo de toda a sequência ou os métodos que resultam na mutagénese dirigida de uma região ou domínio seleccionado da sequência do FVII. Num exemplo, o número de mutações efectuadas no polipéptido é de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40 ou mais. a. Mutagénese aleatória

Qualquer uma de várias abordagens gerais para a evolução dirigida de proteínas por mutagénese pode ser empregue. Qualquer uma destas, sozinha ou em combinação, pode ser usada para modificar um polipéptido como o FVII para obter uma propriedade desejada. Estes métodos incluem a mutagénese aleatória, em que os aminoácidos na sequência inicial da proteína são substituídos pela totalidade (ou um grupo) dos 20 aminoácidos naturais (assim como aminoácidos não naturais), em substituições únicas ou múltiplas em diferentes posições de aminoácidos na mesma molécula, ao mesmo tempo. Outro método, a mutagénese aleatória restrita, introduz a totalidade ou alguns dos 20 aminoácidos naturais (assim como aminoácidos não naturais) ou resíduos parciais face ao ADN. A parcialidade baseia-se na sequência do ADN e não na sequência da proteína de uma forma estocástica ou semiestocástica, respectivamente, dentro de regiões restritas ou predefinidas da proteína previamente identificadas como estando envolvidas na actividade biológica que está a sofrer "evolução". US 2004146938 descreve métodos exemplares para modificar uma protease. Adicionalmente, é possível utilizar qualquer método conhecido na técnica para modificar ou alterar a sequência do polipéptido de uma protease, como um polipéptido da protease FVII.

Os métodos de mutagénese aleatória incluem, por exemplo, a utilização de E. coli XLlred, a irradiação por UV, a modificação química, por exemplo por desaminação, alquilação ou agentes mutagénicos análogos a bases, ou os métodos por PCR como DNA shuffling, mutagénese via cassete, mutagénese aleatória sítio-dirigida ou PCR propenso a erros (ver, por exemplo, Pedido U.S. n.2 2006-0115874). Tais exemplos incluem, mas não estão limitados a, modificação química por hidroxilamina (Ruan, H., et ai. (1997) Gene 188:35-39), utilização de análogos de dNTP (Zaccolo, M., et ai. (1996) J.

Mol. Biol. 255:589-603) ou utilização de kits de mutagénese aleatória disponíveis comercialmente como, por exemplo, os kits de mutagénese aleatória com recurso a PCR GeneMorph (Stratagene) ou os kits de mutagénese aleatória Diversify (Clontech). O kit de mutagénese aleatória Diversify permite a selecção da taxa de mutação desejada para uma dada sequência de ADN (de 2 a 8 mutações/1000 pares de bases) mediante variação das quantidades de manganésio (Mn2+) ou de dGTP na mistura reaccional. A subida dos níveis de manganésio aumenta inicialmente a taxa de mutação, com um aumento adicional da taxa de mutação proporcionado pelo aumento da concentração de dGTP. É possível obter taxas de mutação ainda mais elevadas efectuando ciclos adicionais de PCR. b. Mutagénese dirigida

A mutação dirigida pode ser obtida efectuando uma ou mais mutações numa região predeterminada de uma sequência génica, por exemplo, em regiões do domínio protease que medeiam a actividade catalítica, regiões do domínio Gla que se ligam aos fosfolípidos, regiões do polipéptido do FVII que se ligam a inibidores ou moléculas como o TFPI, a AT-III ou o Zn2+, como aquelas aqui disponibilizadas, ou regiões da proteína que interagem com factores ou receptores envolvidos na clearance do FVIIa, como aquelas aqui disponibilizadas. Num exemplo, qualquer um ou mais dos aminoácidos de um polipéptido são mutados utilizando qualquer kit de mutagénese dirigida convencional como, por exemplo, o kit QuikChange (Stratagene). Noutro exemplo, qualquer um ou mais dos aminoácidos de uma protease são mutados através de mutagénese por saturação (Zheng et ai. (2004) Nucl. Acids. Res., 32:115) . Num exemplo, utiliza-se uma técnica de mutagénese por saturação em que o(s) resíduo(s) de uma região ou domínio são mutados para cada um dos 20 aminoácidos naturais possíveis (assim como aminoácidos não naturais) (ver, por exemplo, o método de Kunkle, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media Pa.). Nesta técnica, sintetiza-se um iniciador oligonucleotídico mutagénico degenerado que contém nucleótidos aleatorizados no(s) codão(ões) desejado(s) que codifica(m) o(s) aminoácido(s) seleccionado(s) . Os esquemas de aleatorização exemplares incluem a aleatorização NNS ou NNK, onde N representa qualquer nucleótido, S representa guanina ou citosina e K representa guanina ou timina. 0 iniciador mutagénico degenerado é hibridado com um molde de ADN de cadeia simples e adiciona-se ADN-polimerase para sintetizar a cadeia complementar do molde. Após ligação, o molde de ADN de cadeia dupla é transformado em E. coli para amplificação.

Num exemplo adicional, a mutagénese dirigida pode ser restringida a aminoácidos que são identificados como "pontos quentes" (hot spots) nos ciclos iniciais de rastreio. Por exemplo, após a selecção de polipéptidos do FVII modificados a partir de bibliotecas combinatórias mutadas aleatoriamente, pode observar-se um número desproporcionado de mutações em posições ou regiões específicas. Estas são designadas por "pontos quentes" e podem ser observadas em mais de um ciclo de mutagénese e rastreio. Os polipéptidos do FVII modificados podem depois ser sujeitos a ensaios funcionais para determinar se as mutações nos "pontos quentes" se correlacionam ou não com a(s) propriedade(s) ou actividade(s) desejada(s). Caso se verifique uma correlação entre os "pontos quentes" e a actividade ou propriedade desejada, a mutagénese dirigida pode depois ser usada para visar especificamente estes "pontos quentes" para uma mutagénese adicional. Esta estratégia permite uma mutagénese mais diversa e profunda em posições específicas particulares, em oposição à mutagénese mais superficial que ocorre após a mutagénese aleatória de uma sequência de um polipéptido. Por exemplo, a mutagénese por saturação pode ser usada para mutar "pontos quentes", por exemplo utilizando oligonucleótidos contendo NNt/g ou NNt/c nestas posições. c. Rastreio

Os polipéptidos modificados podem ser testados em ensaios de rastreio individualmente ou podem ser testados como colecções, por exemplo, em bibliotecas. Num exemplo, os polipéptidos variantes do FVII são produzidos aleatoriamente por mutagénese e clonados individualmente. A avaliação da actividade é depois efectuada individualmente em cada molécula mutante de proteína individual, após expressão da proteína e medição da actividade apropriada. Em alguns exemplos, os clones individuais podem ser analisados num array endereçável, onde estão fisicamente separados uns dos outros e a identidade de cada polipéptido individual é conhecida com base na sua localização no array. Por exemplo, se cada um for o único produto de uma reacção de mutagénese independente, a mutação especifica pode ser facilmente determinada sem necessidade de sequenciação. Em alternativa, a sequenciação pode ser efectuada nos polipéptidos modificados resultantes para determinar aquelas mutações que conferem uma actividade.

Noutro exemplo, os polipéptidos do FVII modificados podem ser rastreados como colecções ou numa biblioteca. Por exemplo, uma biblioteca de polipéptidos do FVII pode ser apresentada num pacote genético para efeitos de rastreio, que inclui, mas não está limitado a, qualquer vector replicável, como um fago, um virus ou uma bactéria, capaz de apresentar um grupo polipeptidico. A pluralidade de polipéptidos é apresentada por um pacote genético de uma forma que permite que o polipéptido se ligue e/ou interaja com um polipéptido-alvo. Os pacotes genéticos exemplares incluem, mas não estão limitados a, bacteriófagos (ver, por exemplo, Clackson et al. (1991) Making Antibody Fragments Using Phage Display Libraries, Nature, 352:624-628; Glaser et al. (1992) Antibody Engineering by Condon-Based Mutagenesis in a Filamentous Phage Vector System, J. Immunol., 149:3903 3913; Hoogenboom et al. (1991) Multi-Subunit Proteins on the Surface of Filamentous Phage: Methodologies for Displaying Antibody (Fate) Heavy and 30 Light Chains, Nucleic Acids Res., 19:4133-41370), baculovirus (ver, por exemplo, Boublik et al. (1995) Eukaryotic Virus Display: Engineering the Major Surface Glycoproteins of the Autographa California Nuclear Polyhedrosis Virus (ACNPV) for the Presentation of Foreign Proteins on the Virus Surface, Bio/Technology, 13:1079-1084), bactérias e outros vectores apropriados para apresentar uma proteína, tal como uma protease apresentada num fago. Por exemplo, os bacteriófagos de interesse incluem, embora não exclusivamente, o fago T4, o fago M13 e o fago Hl. Os pacotes genéticos são opcionalmente amplificados, por exemplo num hospedeiro bacteriano. A apresentação em fagos é conhecida pelos peritos na especialidade e está descrita, por exemplo, em Ladner et al.,

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Smith (1990) Science 249(4967):386-90).

As bibliotecas de polipéptidos variantes do FVII destinadas a rastreio também podem ser expressas à superfície de células, por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas. As células exemplares utilizadas para expressão na superfície celular incluem, mas não estão limitadas a, bactérias, leveduras, células de insecto, células de aves, células vegetais e células de mamífero (Chen and Georgiou (2002) Biotechnol Bioeng 79: 496-503) . Num exemplo, as células bacterianas utilizadas para a expressão são Escherichia coli.

Os polipéptidos variantes podem ser expressos como uma proteína de fusão com uma proteína que é expressa na superfície da célula, tal como uma proteína da membrana ou uma proteína associada à superfície celular. Por exemplo, uma protease variante pode ser expressa em E. coli como uma proteína de fusão com uma proteína da membrana externa de E. coli (por exemplo, OmpA), com uma molécula híbrida geneticamente manipulada constituída pela lipoproteína principal de E. coli (Lpp) e a proteína da membrana externa OmpA ou com uma proteína associada à superfície celular (por exemplo, subunidades flagelares e pili). Geralmente, guando as proteínas da membrana externa bacteriana são usadas para apresentar péptidos ou proteínas heterólogos, a apresentação é obtida através da inserção genética em sítios permissivos das proteínas transportadoras. A expressão de uma proteína ou péptido heterólogo depende das propriedades estruturais do domínio da proteína inserida, uma vez que o péptido ou proteína está mais limitado quando é inserido num sítio permissivo comparativamente com uma fusão na extremidade N-terminal ou C-terminal de uma proteína. Podem fazer-se modificações na proteína de fusão para melhorar a sua expressão, tal como a inserção de sequências espaçadoras ou de elementos de ligação peptídicos flexíveis ou a modificação da proteína bacteriana (por exemplo, por mutação, inserção ou deleção na sequência de aminoácidos). Enzimas, como a lactamase e a exoglucanase Cex de Cellulomonas fimi, foram expressas com êxito na superfície de E. coli como proteínas de fusão com Lpp-OmpA (Francisco J.A. and Georgiou G. Ann N Y Acad Sei. 745:372-382 (1994) e Georgiou G. et ai. Protein

Eng. 9:239-247 (1996)). Outros péptidos com 15-514 aminoácidos foram apresentados na segunda, terceira e quarta voltas externas na superfície de OmpA (Samuelson et ai. J. Biotechnol. 96: 129-154 (2002)). Assim, as proteínas da membrana externa podem transportar e apresentar produtos génicos heterólogos na superfície externa das bactérias. É igualmente possível utilizar outros formatos de apresentação para efectuar o rastreio de bibliotecas de polipéptidos variantes. Outros formatos de apresentação exemplares incluem as fusões proteína-ácido nucleico, a apresentação em ribozimas (ver, por exemplo, Hanes and Pluckthun (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 13:4937-4942), a apresentação em esferas (Lam, K. S. et ai. Nature (1991) 354, 82-84;, K. S. et ai. (1991) Nature, 354, 82-84;

Houghten, R. A. et ai. (1991) Nature, 354, 84-86; Furka, A. et ai. (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37, 487-493; Lam, K. S., et al. (1997) Chem. Rev., 97, 411-448; publicação de pedido de patente U.S. 2004-0235054) e os arrays de proteínas (ver, por exemplo, Cahill (2001) J. Immunol. Meth. 250:81-91, WO 01/40803, WO 99/51773 e US2002-0192673-A1).

Noutros casos específicos, pode ser vantajoso prender os polipéptidos variantes, ou as bibliotecas fágicas ou as células que expressam os polipéptidos variantes a um suporte sólido. Por exemplo, nalguns exemplos, as células expressando polipéptidos variantes do FVII podem ser adsorvidas naturalmente numa esfera, de modo que uma população de esferas contenha uma única célula por esfera (Freeman et al. Biotechnol. Bioeng. (2004) 86:196-200). Após a imobilização num suporte de vidro, as microcolónias podem ser crescidas e rastreadas com um substrato cromogénico ou fluorogénico. Noutro exemplo, os polipéptidos variantes do FVII, ou as bibliotecas fágicas ou as células que expressam as proteases variantes podem ser dispostos em microplacas de titulação e imobilizados.

De modo a identificar aqueles polipéptidos do FVII modificados que apresentam uma actividade coagulante acrescida, os polipéptidos do FVII modificados são rastreados individualmente ou numa biblioteca e testados em ensaios funcionais para identificar aqueles que apresentam uma resistência acrescida aos inibidores, como o TFPI e a AT-III, uma ligação acrescida aos fosfolípidos das plaquetas activadas, uma maior semivida e/ou exibem uma actividade catalítica acrescida. Esses ensaios estão aqui descritos ou são conhecidos pelos peritos na especialidade. Por exemplo, os polipéptidos do FVII modificados são testados quanto à actividade proteolítica. Os polipéptidos do FVII, sozinhos ou na presença de TF, são incubados com concentrações variáveis de um substrato cromogénico, como o substrato de peptidilo Spectrozyme FVIIa (CH3S02-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH) . A clivagem do substrato é controlada através da absorvância e a velocidade de hidrólise do substrato é determinada por regressão linear, utilizando software facilmente disponível. Num exemplo adicional, a resistência dos polipéptidos do FVII modificados ao TFPI ou à AT-III é avaliada através da incubação do inibidor com os polipéptidos do FVII que, em alguns casos, foram pré-incubados com o TF. A actividade do FVII é, em seguida, medida utilizando qualquer um ou mais dos ensaios de actividade ou de coagulação conhecidos na técnica, e a inibição pelo TFPI ou pela AT-III é avaliada mediante comparação da actividade dos polipéptidos do FVII incubados com o inibidor com a actividade dos polipéptidos do FVII que não foram incubados com o inibidor. A mutação especifica do polipéptido candidato pode ser determinada utilizando técnicas de ADN recombinante de rotina, como a sequenciação. Numa concretização, podem fazer-se combinações de "hits" para aumentar adicionalmente as propriedades e/ou actividades coagulantes do polipéptido do FVII modificado.

3. Selecção de variantes do FVII

Os polipéptidos variantes do FVII, concebidos e identificados por meio de qualquer uma ou mais das abordagens descritas acima, podem ser seleccionados para identificar aqueles polipéptidos do FVII candidatos que exibem as propriedades ou actividades desejadas. A selecção dos polipéptidos variantes do FVII tem por base 1) primeiro, o teste do polipéptido variante quanto à actividade ou propriedade especifica que está a ser modificada (isto é, resistência ao TFPI, resistência à AT-III, ligação de Zn2+, actividade catalítica, semivida, ligação e/ou afinidade para os fosfolípidos) e 2) segundo, o teste do polipéptido variante quanto à retenção de uma actividade do FVII necessária para a hemostasia e a coagulação. Entre as actividades do FVII que são necessárias para a coagulação inclui-se, por exemplo, a actividade enzimática, proteolítica ou catalítica, tal como efectuar a activação do factor X (FX) ou a activação do factor IX (FIX). Outras actividades do FVII que podem ser avaliadas incluem, mas não estão limitadas, a antigenicidade, a capacidade de ligação ao factor tecidual, ao factor X ou ao factor IX e a capacidade de ligação aos fosfolípidos. Assim, um polipéptido do FVII modificado, como qualquer um aqui disponibilizado ou identificado nos métodos aqui fornecidos, tem que reter algum nível, aumentado ou diminuído, de uma actividade do FVII necessária para a actividade coagulante. Os ensaios padrão conhecidos na técnica ou aqui descritos abaixo podem ser realizados in vitro ou in vivo, de modo a efectuar cada uma das duas avaliações referidas acima. Por exemplo, a actividade proteolítica ou catalítica do FVII pode ser avaliada utilizando vários métodos, incluindo a medição da clivagem de um substrato sintético ou a medição da activação do factor X (ver, por exemplo, os Exemplos 4, 5 e 11 abaixo), e a resistência ao TFPI ou à AT-III pode ser avaliada mediante determinação da inibição pelo TFPI ou a AT-III, respectivamente (ver, por exemplo, os Exemplos 7, 12 e 16) . Além disso, os ensaios in vivo para a actividade pró-coagulante, conforme descritos, por exemplo, nos Exemplos 8 e 14, também podem ser empregues. 0 efeito global de gualguer polipéptido variante do FVII candidato é exibir uma actividade pró-coagulante. Por exemplo, um polipéptido variante pode ter um aumento da sua resistência ao TFPI, resistência à AT-III, semivida e/ou ligação e/ou afinidade para os fosfolípidos, ao mesmo tempo gue também exibe um aumento da actividade catalítica. Este polipéptido do FVII seria seleccionado como uma variante do FVII candidata relativamente a uma actividade coagulante crescente.

Em alguns casos, contudo, um polipéptido do FVII que foi modificado para possuir uma actividade de coagulação melhorada devido a qualquer uma ou mais de uma resistência acrescida ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, uma maior semivida ou uma ligação e/ou afinidade acrescida para os fosfolípidos, também poderá exibir uma diminuição da actividade catalítica ou de outra actividade necessária para a coagulação em resultado da modificação particular. Estes efeitos poderiam resultar, por exemplo, de modificações conformacionais nos polipéptidos do FVII modificados que interferem com a ligação a outra molécula, modificações conformacionais que resultam num sítio activo alterado ou substituições de aminoácidos que envolvem directamente um ou mais resíduos de aminoácidos que são responsáveis pela interacção com outra molécula.

Deste modo, noutro exemplo, um polipéptido variante que tem um aumento da sua resistência ao TFPI, resistência à AT-III, semivida e/ou afinidade para os fosfolípidos poderá exibir uma diminuição concomitante da sua actividade catalítica. 0 nível de diminuição de uma actividade do FVII, tal como uma actividade catalítica, que seria aceitável para garantir uma actividade coagulante melhorada depende do aumento concomitante da propriedade que está a ser modificada para obter a melhoria (isto é, a resistência acrescida ao TFPI) e pode ser determinado empiricamente. Por conseguinte, os resultados das avaliações descritas acima podem ser pesados para identificar aqueles polipéptidos variantes que exibem propriedades melhoradas, ao mesmo tempo que retêm pelo menos uma actividade suficiente do FVII, ou seja, actividade catalítica, para produzir a coagulação. Tipicamente, quanto maior for o aumento da propriedade considerada na modificação (isto é, quanto maior for o aumento da resistência ao TFPI), maior será a redução aceitável na actividade proteolítica ou catalítica.

Por exemplo, um polipéptido do FVII que apresenta um aumento de 100 vezes da resistência ao TFPI ou à AT-III pode apresentar uma diminuição da actividade proteolítica ou catalítica que é reduzida em ou cerca de 1,5 vezes, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 vezes ou mais, em comparação com a actividade de um polipéptido do FVII não modificado, e ainda constituir um candidato viável relativamente a uma actividade coagulante crescente. Reciprocamente, se a resistência ao TFPI ou à AT-III for aumentada em 10 vezes, o nível de diminuição da actividade catalítica para sustentar uma actividade pró-coagulante global seria tipicamente uma redução de ou cerca de 1,5 vezes, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vezes ou mais, em comparação com a actividade catalítica de um polipéptido não modificado. Um perito na especialidade pode avaliar as modificações concomitantes na resistência ao TFPI, resistência à AT-III, ligação às plaquetas activadas, semivida e actividade proteolítica ou catalítica, ou qualquer outra actividade ou propriedade, para determinar se um polipéptido do FVII modificado seria ou não útil como um agente terapêutico pró-coagulante, por exemplo, para tratar episódios hemorrágicos em doentes hemofílicos.

F. Produção de polipéptidos do FVII

Os polipéptidos do FVII, incluindo os polipéptidos do FVII modificados, ou os seus domínios ou outro polipéptido dependente da vitamina K podem ser obtidos através de métodos bem conhecidos na técnica para a purificação de proteínas e a expressão de proteínas recombinantes. Qualquer método conhecido pelos peritos na especialidade para a identificação de ácidos nucleicos que codificam genes desejados pode ser usado. Qualquer método disponível na técnica para obter um clone de ADN genómico ou de ADNc completo (isto é, abrangendo toda a região codificante) que codifica um polipéptido do FVII ou outro polipéptido dependente da vitamina K, por exemplo a partir de uma célula ou de um tecido, por exemplo a partir do fígado, pode ser usado. Os polipéptidos do FVII modificados podem ser manipulados da forma aqui descrita, por exemplo por mutagénese dirigida. 0 FVII pode ser clonado ou isolado utilizando quaisquer métodos disponíveis conhecidos na técnica para a clonagem e o isolamento de moléculas de ácidos nucleicos. Estes métodos incluem a amplificação de ácidos nucleicos por PCR e o rastreio de bibliotecas, incluindo o rastreio por hibridação de ácidos nucleicos, o rastreio com base em anticorpos e o rastreio com base na actividade.

Os métodos de amplificação de ácidos nucleicos podem ser usados para isolar moléculas de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido do FVII, incluindo, por exemplo, os métodos de reacção em cadeia da polimerase (PCR de Polymerase Chain Reaction) . Um material contendo ácidos nucleicos pode ser usado como material de partida a partir do qual é isolada uma molécula de ácidos nucleicos que codifica um FVII. Por exemplo, é possível usar preparações de ADN e de ARNm, extractos celulares, extractos de tecidos (por exemplo, do fígado), amostras de fluidos (por exemplo, sangue, soro, saliva) e amostras de sujeitos saudáveis e/ou doentes nos métodos de amplificação. As bibliotecas de ácidos nucleicos também podem ser usadas como uma fonte de material de partida. Podem conceber-se iniciadores para amplificar uma molécula codificante do FVII. Por exemplo, os iniciadores podem ser concebidos com base em sequências expressas a partir das quais é produzido um FVII. Os iniciadores podem ser concebidos com base na tradução inversa de uma sequência de aminoácidos do FVII. As moléculas de ácidos nucleicos produzidas por amplificação podem ser sequenciadas, confirmando-se que codificam um polipéptido do FVII.

Uma molécula de ácidos nucleicos que codifica um FVII pode ser unida a sequências nucleotidicas adicionais, incluindo sequências adaptadoras contendo sitios de endonucleases de restrição para a clonagem do gene sintético num vector, por exemplo, um vector de expressão de proteínas ou um vector concebido para a amplificação das sequências de ADN que codificam a proteína central. Além disso, sequências nucleotidicas adicionais que especificam elementos de ADN funcionais podem ser ligadas funcionalmente a uma molécula de ácidos nucleicos que codifica um FVII. Os exemplos de tais sequências incluem, mas não estão limitados a, sequências promotoras concebidas para facilitar a expressão intracelular da proteína e sequências de secreção concebidas para facilitar a secreção da proteína. Sequências nucleotidicas adicionais, como as sequências que especificam regiões de ligação da proteína, também podem ser ligadas às moléculas de ácidos nucleicos que codificam um FVII. Tais regiões incluem, embora não estejam limitadas a estes exemplos, sequências para facilitar a captação do FVII em células-alvo específicas ou melhorar de outra forma a farmacocinética do gene sintético.

Os ácidos nucleicos identificados e isolados podem depois ser introduzidos num vector de clonagem apropriado. É possível utilizar um grande número de sistemas vector-hospedeiro conhecidos na técnica. Os vectores possíveis incluem, embora não exclusivamente, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema do vector tem que ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Tais vectores incluem, mas não estão limitados a, bacteriófagos como os derivados do fago lambda, ou plasmídeos como os derivados dos plasmídeos pBR322 ou pUC ou o vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, Califórnia). A introdução num vector de clonagem pode obter-se, por exemplo, por ligação do fragmento de ADN num vector de clonagem que possui extremidades coesivas complementares. A introdução pode ser realizada utilizando vectores de clonagem TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia). Se os sítios de restrição complementares utilizados para fragmentar o ADN não estiverem presentes no vector de clonagem, as extremidades das moléculas de ADN podem ser modificadas enzimaticamente. Em alternativa, qualquer sítio desejado pode ser produzido através da ligação de sequências nucleotídicas (adaptadores) aos extremos do ADN. Estes adaptadores ligados podem conter oligonucleótidos específicos sintetizados quimicamente que codificam sequências de reconhecimento de endonucleases de restrição. Num método alternativo, o vector clivado e o gene da proteína FVII podem ser modificados por adição de caudas homopoliméricas. As moléculas recombinantes podem ser introduzidas em células hospedeiras por, por exemplo, transformação, transfecção, infecção, electroporação e sonoporação, de modo a produzir muitas cópias da sequência génica.

Em exemplos específicos, a transformação das células hospedeiras com moléculas de ADN recombinante que incorporam o gene da proteína FVII isolado, ADNc ou uma sequência de ADN sintetizada permite a produção de múltiplas cópias do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades através de crescimento de transformantes, isolamento das moléculas de ADN recombinante a partir dos transformantes e, quando necessário, recuperação do gene inserido a partir do ADN recombinante isolado. 1. Vectores e células

Para a expressão recombinante de uma ou mais das proteínas do FVII, o ácido nucleico contendo a totalidade ou uma parte da sequência nucleotídica que codifica a proteína do FVII pode ser introduzido num vector de expressão apropriado, isto é, um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e a tradução da sequência codificante da proteína introduzida. Qualquer vector de expressão em células de mamíferos como, por exemplo, pCMV é ilustrativo de um tal vector. Os sinais transcricionais e traducionais necessários também podem ser fornecidos pelo promotor nativo de um gene do FVII e/ou pelas suas regiões flanqueantes. São também disponibilizados vectores contendo os ácidos nucleicos que codificam o FVII ou FVII modificado. Células contendo os vectores são igualmente disponibilizadas. As células incluem células eucarióticas e procarióticas, e os vectores são quaisquer vectores adequados para utilização nessas células. Células procarióticas e eucarióticas, incluindo células endoteliais, contendo os vectores são disponibilizadas. Tais células incluem células bacterianas, células de levedura, células fúngicas, Archea, células vegetais, células de insecto e células animais. As células são usadas para produzir um polipéptido do FVII ou polipéptido do FVII modificado, por meio do crescimento das células descritas acima em condições em que a proteína do FVII codificada é expressa pela célula e recuperação da proteína do FVII expressa. Para os fins deste invento, o FVII pode ser segregado para o meio.

Numa concretização, são disponibilizados vectores contendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que possui actividade de FVII e que contém a totalidade ou uma parte do polipéptido do FVII, ou múltiplas cópias dela. Os vectores podem ser seleccionados para expressão do polipéptido do FVII ou polipéptido do FVII modificado na célula ou de forma que a proteína do FVII seja expressa como uma proteína segregada. Quando o FVII é expresso, o ácido nucleico está ligado a um ácido nucleico que codifica um sinal de secreção, tal como a sequência sinal do factor de acasalamento d <£accharomyces cerevisiae, ou uma sua parte, ou a sequência sinal nativa. É possível utilizar uma variedade de sistemas vector-hospedeiro para expressar a sequência que codifica a proteína. Estes incluem, mas não estão limitados a, sistemas de células de mamíferos infectados por vírus (por exemplo, o vírus da vacina, um adenovirus e outros vírus), sistemas de células de insecto infectados por vírus (por exemplo, baculovírus), microrganismos como a levedura contendo vectores de levedura, ou bactérias transformadas com um bacteriófago, ADN, ADN plasmídico ou ADN cosmídico. Os elementos de expressão dos vectores variam em termos da respectiva força e especificidade. Dependendo do sistema vector-hospedeiro utilizado, qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados pode ser usado.

Quaisquer métodos conhecidos pelos peritos na especialidade para a introdução de fragmentos de ADN num vector podem ser utilizados para construir vectores de expressão contendo um gene quimérico, que compreende sinais de controlo transcricional/traducional apropriados e sequências codificantes de proteínas. Estes métodos podem incluir técnicas sintéticas e de ADN recombinante in vitro e recombinantes (recombinação genética) in vivo. A expressão das sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido do FVII ou polipéptido do FVII modificado, ou seus domínios, derivados, fragmentos ou homólogos, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácidos nucleicos para que os genes ou seus fragmentos sejam expressos num hospedeiro transformado com a(s) molécula(s) de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão das proteínas pode ser controlada por qualquer promotor/amplificador conhecido na técnica. Num exemplo, o promotor não é nativo dos genes de uma proteína do FVII. Os promotores que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a estes, o promotor precoce de SV40 (Bemoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), o promotor contido na longa repetição terminal em 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et ai. Cell 22:787-797 (1980)), o promotor da timidina-cinase do vírus do herpes (Wagner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1441-1445 (1981)), as sequências reguladoras do gene da metalotioneína (Brinster et ai., Nature 296:39-42 (1982)); vectores de expressão procariót icos como o promotor da -lactamase (Jay et ai., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5543) ou o promotor tac (DeBoer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:21-25 (1983)); ver também "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expressão em plantas contendo o promotor da nopalina-sintetase (Herrar-Estrella et ai., Nature 303:209-213 (1984)) ou o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Garder et ai., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)) e o promotor da enzima fotossintética ribulose-difosfato-carboxilase (Herrera-

Estrella et ai., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levedura e de outros fungos como o promotor

Gal4, o promotor da álcool-desidrogenase, o promotor da fosfoglicerol-cinase e o promotor da fosfatase alcalina; e as seguintes regiões de controlo transcricional de animais que apresentam especificidade de tecidos e foram usadas em animais transgénicos: região de controlo do gene da elastase 1 que é activa em células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); região de controlo do gene da insulina que é activa em células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), região de controlo do gene de imunoglobulina que é activa em células linfóides (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al. , Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), região de controlo do vírus de tumor mamário em ratinho que é activa em células testiculares, mamárias, linfóides e mastócitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), região de controlo do gene da albumina que é activa no fígado (Pinckert et al. , Genes and Devei. 1:268-276 (1987)), região de controlo do gene da alfa-fetoproteína que é activa no fígado (Krumlauf et al. , Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al. , Science 235:53-58 1987)), região de controlo do gene da alf a-l-ant itripsina que é activa no fígado (Kelsey et al., Genes and Devei. 1:161-171 (1987)), região de controlo do gene da beta-globina que é activa nas células mielóides (Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), região de controlo do gene da proteína básica de mielina que é activa em oligodendrócitos do cérebro (Readhead et al. , Cell 48:703-712 (1987)), região de controlo do gene da cadeia leve da miosina 2 que é activa no tecido músculoesquelético (Sani, Nature 314:283-286 (1985)) e região de controlo do gene da hormona libertadora de gonadotrofinas que é activa nos gonadotrofos do hipotálamo (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).

Numa concretização específica, é utilizado um vector que contém um promotor ligado funcionalmente a ácidos nucleicos que codificam um polipéptido do FVII ou polipéptido do FVII modificado, ou um seu domínio, fragmento, derivado ou homólogo, uma ou mais origens de replicação e, opcionalmente, uma ou mais marcas de selecção (por exemplo, um gene de resistência a antibiótico) . Os vectores e sistemas para expressão dos polipéptidos do FVII incluem os bem conhecidos vectores de Pichia (disponíveis, por exemplo, através de Invitrogen, San Diego, Califórnia), em particular aqueles concebidos para secreção das proteínas codificadas. Os vectores plasmídicos exemplares para expressão em células de mamíferos incluem, por exemplo, pCMV. Os vectores plasmídicos exemplares para transformação de células de E.coli incluem, por exemplo, os vectores de expressão pQE (disponíveis através de Qiagen, Valencia, Califórnia; ver também a literatura publicada pela Qiagen descrevendo o sistema). Os vectores pQE têm um promotor do fago T5 (reconhecido pela ARN-polimerase de E. coli) e um módulo de repressão duplo do operador lac para proporcionar uma expressão de alto nível, fortemente regulada, das proteínas recombinantes em E. coli, um local de ligação do ribossoma sintético (RBS II) para uma tradução eficiente, uma sequência que codifica a marca 6XHis, os terminadores transcricionais to e Tl, a origem de replicação ColEl e um gene da beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina. Os vectores pQE permitem a colocação de uma marca 6xHis quer na extremidade N-terminal quer na extremidade C-terminal da proteína recombinante. Estes plasmídeos incluem os plasmídeos pQE-32, pQE-30 e pQE-31 que proporcionam múltiplos locais de clonagem nas três grelhas de leitura e permitem a expressão de proteínas com uma marca 6xHis na extremidade N-terminal. Outros vectores plasmídicos exemplares para transformação de células de E. coli incluem, por exemplo, os vectores de expressão pET (ver Patente U.S. 4,952,496; disponíveis através de NOVAGEN, Madison, Wisconsin; ver também a literatura publicada pela Novagen descrevendo o sistema). Estes plasmídeos incluem o plasmídeo pET 11a, que contém o promotor T71ac, o terminador T7, o operador lac indutível de E. coli e o gene do repressor lac; o plasmídeo pET 12a-c, que contém o promotor T7, o terminador T7 e o sinal de secreção ompT de E. coli; e os plasmídeos pET 15b e pET19b (NOVAGEN, Madison, Wisconsin), que contêm uma sequência leader His-Tag™ para utilizar na purificação com uma coluna His e um sítio de clivagem da trombina que permite a clivagem após purificação na coluna, a região do promotor T7-lac e o terminador T7. 2. Sistemas de expressão

Os polipéptidos do FVII (modificados e não modificados) podem ser produzidos por quaisquer métodos conhecidos na técnica para a produção de proteínas, incluindo métodos in vitro e in vivo como, por exemplo, a introdução de moléculas de ácidos nucleicos que codificam um FVII numa célula hospedeira, animal hospedeiro e a expressão a partir das moléculas de ácidos nucleicos que codificam um FVII in vitro. Os polipéptidos do FVII e do FVII modificados podem ser expressos em qualquer organismo adequado para produzir as quantidades e formas exigidas de um polipéptido do FVII necessárias para a administração e tratamento. Os hospedeiros de expressão incluem organismos procarióticos e eucarióticos como E. coli, levedura, plantas, células de insecto, células de mamíferos, incluindo linhas celulares humanas, e animais transgénicos. Os hospedeiros de expressão podem diferir em termos dos seus níveis de produção das proteínas, assim como nos tipos de modificações pós-traducionais que estão presentes nas proteínas expressas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser efectuada com base nestes e outros factores, tais como considerações sobre regulamentação e segurança, custos de produção e a necessidade de purificação e métodos para realizá-la. A expressão em hospedeiros eucarióticos pode incluir a expressão em leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoria, em células de insecto como células de Drosophila e células de lepidópteros, e em plantas e células vegetais como o tabaco, o milho, o arroz, as algas e a lemna. As células eucarióticas para expressão também incluem linhas celulares de mamíferos como as células de ovário de hamster chinês (CHO) ou as células renais de hamster bebé (BHK). Os hospedeiros de expressão eucarióticos também incluem a produção em animais transgénicos, incluindo, por exemplo, a produção no soro, leite e ovos. Os animais transgénicos para a produção de polipéptidos do FVII de tipo selvagem são conhecidos na técnica (Publicação de patente U.S. n.2 20020166130 e 20040133930) e podem ser adaptados para a produção dos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados.

Estão disponíveis e são conhecidos pelos peritos na especialidade muitos vectores de expressão para a expressão do FVII. A escolha do vector de expressão é influenciada pela selecção do sistema de expressão hospedeiro. Esta selecção encontra-se no âmbito da perícia do perito na especialidade. Em geral, os vectores de expressão podem incluir promotores transcricionais e, opcionalmente, amplificadores, sinais traducionais e sinais de terminação transcricionais e traducionais. Os vectores de expressão que são usados para transformação estável possuem tipicamente uma marca de selecção que permite a selecção e manutenção das células transformadas. Em alguns casos, é possível utilizar uma origem de replicação para amplificar o número de cópias dos vectores nas células.

Os polipéptidos do FVII ou do FVII modificados também podem ser utilizados ou expressos como fusões de proteínas. Por exemplo, uma fusão pode ser gerada para adicionar uma funcionalidade adicional a um polipéptido. Os exemplos de proteínas de fusão incluem, mas não estão limitados a, fusões de uma sequência sinal, uma marca destinada a localização, por exemplo uma marca his6 ou uma marca myc, ou uma marca destinada a purificação, por exemplo, uma fusão GST, e uma sequência para dirigir a secreção da proteína e/ou a associação à membrana da proteína.

Numa concretização, o polipéptido do FVII ou os polipéptidos do FVII modificados podem ser expressos numa forma activa, em que a activação é obtida por auto-activação do polipéptido após secreção. Noutro exemplo, a protease é expressa numa forma de zimogénio, inactiva.

Os métodos de produção dos polipéptidos do FVII podem incluir a coexpressão de um ou mais polipéptidos heterólogos adicionais que podem ajudar na geração dos polipéptidos do FVII. Por exemplo, tais polipéptidos podem contribuir para o processamento pós-tradução dos polipéptidos do FVII. Os polipéptidos exemplares incluem, mas não estão limitados a, peptidases que ajudam a clivar sequências no precursor do FVII, como a sequência do propéptido, e enzimas que participam na modificação do polipéptido do FVII, tal como, por exemplo, por glicosilação, hidroxilação, carboxilação ou fosforilação. Uma peptidase exemplar que pode ser coexpressa com o FVII é a PACE/furina (ou PACE-SOL) , que ajuda na clivagem da sequência do propéptido do FVII. Uma proteína exemplar que ajuda na carboxilação do polipéptido do FVII é a enzima vitamina K epóxido-redutase (VKOR) sensível à varfarina, que produz vitamina K reduzida para ser utilizada como cofactor pela -carboxilase dependente da vitamina K (Wajih et ai., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607). Uma subunidade desta enzima, VKORC1, pode ser coexpressa com o polipéptido do FVII modificado para aumentar a carboxilação. O um ou mais polipéptidos adicionais podem ser expressos a partir do mesmo vector de expressão que o polipéptido do FVII ou a partir de um vector diferente. a. Expressão procariótica

Os procariotas, em especial E. coli, fornecem um sistema para produzir grandes quantidades de FVII (ver, por exemplo, Platis et ai. (2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30; e

Khalizzadeh et ai. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31 (2): 63-69). A transformação de E. coli é uma técnica rápida e simples bem conhecida pelos peritos na especialidade. Os vectores de expressão para E. coli podem conter promotores indutíveis, que são úteis para induzir níveis elevados de expressão proteica e para expressar proteínas que apresentam alguma toxicidade para as células hospedeiras. Os exemplos de promotores indutíveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor híbrido tac, os promotores T7 e SP6 e o promotor LPregulado pela temperatura. O FVII pode ser expresso no ambiente citoplasmático de E. coli. O citoplasma é um ambiente redutor e, para algumas moléculas, este facto pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis. Podem utilizar-se agentes redutores como o ditiotreitol e o -mercaptoetanol e agentes desnaturantes (por exemplo, guanidina-HCl e ureia) para ressolubilizar as proteínas. Uma abordagem alternativa é a expressão do FVII no espaço periplasmático das bactérias, que proporciona um ambiente oxidante e isomerases de dissulfureto e do tipo chaperonina conducentes à produção da proteína solúvel. Tipicamente, uma sequência leader que dirige a proteína para o periplasma é fundida com a proteína que se pretende expressar. 0 leader é depois removido por peptidases de sinal dentro do periplasma. Os exemplos de sequências leader direccionadas para o espaço periplasmático incluem o leader pelB do gene da pectato-liase e o leader derivado do gene da fosfatase alcalina. Em alguns casos, a expressão periplasmática permite a fuga da proteína expressa para o meio de cultura. A secreção das proteínas permite uma purificação rápida e simples a partir do sobrenadante de cultura. As proteínas que não são segregadas podem ser obtidas a partir do periplasma por lise osmótica. Tal como acontece na expressão citoplasmática, em alguns casos as proteínas podem tornar-se insolúveis, podendo recorrer-se a agentes desnaturantes e redutores para facilitar a solubilização e o reenrolamento. A temperatura de indução e de crescimento também pode influenciar os níveis de expressão e a solubilidade. Tipicamente, utilizam-se temperaturas entre 25°C e 37°C. Também é possível utilizar mutações para aumentar a solubilidade das proteínas expressas. Tipicamente, as bactérias produzem proteínas não glicosiladas. Assim, se as proteínas necessitarem de glicosilação para o seu funcionamento, a glicosilação pode ser adicionada in vitro após purificação a partir das células hospedeiras. b. Levedura

As leveduras como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis e Pichia pastoris são hospedeiros de expressão úteis para o FVII (ver, por exemplo, Skoko et ai. (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38 (Pt3) :257-65) . As leveduras podem ser transformadas com vectores de replicação epissómicos ou por integração cromossómica estável via recombinação homóloga. Tipicamente, utilizam-se promotores indutíveis para regular a expressão génica. Os exemplos destes promotores incluem GAL1, GAL7 e GAL5 e promotores da metalotioneína como CUP1. Os vectores de expressão incluem muitas vezes uma marca de selecção, como LEU2, TRP1, HIS3 e URA3, para selecção e manutenção do ADN transformado. As proteínas expressas em levedura são frequentemente solúveis, e a coexpressão com chaperoninas, como Bip e a proteína isomerase de dissulfureto, pode melhorar os níveis de expressão e a solubilidade. Adicionalmente, as proteínas expressas em levedura podem ser dirigidas para secreção utilizando fusões com péptidos de sinal, como o sinal de secreção do factor alfa de acasalamento de Saccharomyces cerevisiae, e fusões com proteínas da superfície celular de levedura, como o receptor de adesão utilizado no acasalamento Aga2p ou a glucoamilase de Arxula adeninivorans. Um sítio de clivagem de protease (por exemplo, a protease Kex-2) pode ser manipulado para remover as sequências fundidas dos polipéptidos à medida que estes saem da via de secreção. A levedura também é capaz de realizar a glicosilação nos motivos Asn-X-Ser/Thr. c. Insectos e células de insecto

Os insectos e as células de insecto, particularmente utilizando um sistema de expressão de baculovírus, são úteis para expressar polipéptidos como o FVII ou formas modificadas deste (ver, por exemplo, Muneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sei. 65(2) :219-23) . As células de insecto e as larvas de insecto, incluindo a expressão na hemolinfa, expressam níveis elevados de proteína e são capazes de realizar a maioria das modificações pós-traducionais utilizadas pelos eucariotas superiores. Os baculovírus têm uma gama de hospedeiros restrita, o que melhora a segurança e reduz as preocupações ligadas à regulamentação da expressão eucariótica. Tipicamente, os vectores de expressão utilizam um promotor como o promotor da poliedrina de baculovírus para um alto nível de expressão. Os sistemas de baculovírus habitualmente usados incluem baculovírus como o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) e o vírus da poliedrose nuclear de Bombyx mori (BmNPV) e uma linha de células de insecto como a linha celular Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl) . Para um alto nível de expressão, a sequência nucleotídica da molécula que se pretende expressar é fundida imediatamente a jusante do codão de iniciação da poliedrina do vírus. Os sinais de secreção de mamíferos são correctamente processados em células de insecto e podem ser usados para promover a secreção da proteína expressa para o meio de cultura. Adicionalmente, as linhas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl) produzem proteínas com padrões de glicosilação idênticos aos sistemas de células de mamíferos.

Um sistema de expressão alternativo em células de insecto é a utilização de células transformadas de forma estável. Linhas celulares como as células Schnieder 2 (S2) e

Kc (Drosophila melanogaster) e as células C7 (Aedes albopictus) podem ser usadas para expressão. 0 promotor da metalotioneína de Drosophila pode ser utilizado para induzir níveis elevados de expressão na presença de indução por metais pesados com cádmio ou cobre. Os vectores de expressão são tipicamente mantidos através da utilização de marcas de selecção como a neomicina e a higromicina. d. Células de mamíferos

Os sistemas de expressão em células de mamíferos podem ser utilizados para expressar os polipéptidos do FVII. As construções de expressão podem ser transferidas para as células de mamíferos por infecção virai, como o adenovirus, ou por transferência directa do ADN, por exemplo utilizando lipossomas, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e meios físicos como a electroporação e a microinjecção. Os vectores de expressão para as células de mamíferos incluem tipicamente um sítio cap para o ARNm, uma caixa TATA, uma sequência de iniciação da tradução (sequência de consenso Kozak) e elementos de poliadenilação. Estes vectores incluem frequentemente promotores-amplificadores da transcrição para um alto nível de expressão, por exemplo, o promotor-amplificador de SV40, o promotor de citomegalovírus (CMV) humano e a longa repetição terminal do vírus do sarcoma de Rous (RSV). Estes promotores-amplificadores são activos em muitos tipos de células. Os promotores e regiões amplificadoras que apresentam especificidade de tecidos e tipos celulares também podem ser utilizados para expressão. As regiões promotoras/amplificadoras exemplares incluem, mas não exclusivamente, as regiões de controlo de genes como o gene da elastase I, insulina, imunoglobulina, vírus do tumor mamário em ratinho, albumina, alfa-fetoproteína, alfa-1-antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadeia leve da miosina 2 e hormona libertadora de gonadotrofinas. É possível utilizar marcas de selecção para seleccionar e manter as células com a construção de expressão. Os exemplos de genes de marcas de selecção incluem, mas não exclusivamente, os genes da higromicina B-fosfotransferase, adenosina-desaminase, xantina/guanina- fosforribosiltransferase, aminoglicosldeo-fosfotransferase, dihidrofolato-redutase e timidina-cinase. A fusão com moléculas de sinalização da superfície celular, como TCR- e Fc RI- , pode dirigir a expressão das proteínas num estado activo na superfície celular.

Estão disponíveis muitas linhas celulares para expressão em mamíferos, incluindo células de ratinho, rato, humanas, macaco, galinha e hamster. As linhas celulares exemplares incluem, mas não estão limitadas a, células BHK (isto é, células BHK-21), 293-F, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, a linha celular de mieloma de ratinho NSO (não secretora) e outras linhas celulares de mieloma, linhas celulares de hibridoma e heterohibridoma, linfócitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 e HKB. Também estão disponíveis linhas celulares adaptadas a meios isentos de soro, o que facilita a purificação das proteínas segregadas a partir do meio de cultura celular. Um exemplo é a linha celular EBNA-1 isenta de soro (Pham et al. , (2003)

Biotechnol. Bioeng. 84:332-42) . A expressão de polipéptidos do FVII recombinantes que apresentam uma estrutura e modificações pós-traducionais idênticas ao FVII derivado do plasma é conhecida na técnica (ver, por exemplo, Jurlander et al. (2003) Semin Throm Hemost). Os métodos de optimização da expressão de proteínas dependentes da vitamina K são conhecidos. Por exemplo, a suplementação do meio de cultura com vitamina K ou a coexpressão de -carboxilases dependentes da vitamina K (Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36)31603— 31607) pode ajudar à modificação pós-traducional das proteínas dependentes da vitamina K, como os polipéptidos do FVII. e. Plantas

As plantas e as células de plantas transgénicas podem ser utilizadas para expressão do FVII. As construções de expressão são tipicamente transferidas para as plantas utilizando a transferência directa de ADN, como o bombardeamento com microprojécteis e a transferência para os protoplastos mediada por PEG, e a transformação mediada por Agrobacterium. Os vectores de expressão podem incluir sequências promotoras e amplificadoras, elementos de terminação da transcrição e elementos de controlo traducional. Os vectores de expressão e as técnicas de transformação estão geralmente divididos entre hospedeiros dicotiledóneos, como Arabidopsis e o tabaco, e hospedeiros monocotiledóneos, como o milho e o arroz. Os exemplos de promotores usados para expressão em plantas incluem o promotor do virus do mosaico da couve-flor, o promotor da nopalina-sintase, o promotor da ribose-difosfato-carboxilase e os promotores da ubiquitina e UBQ3. Marcas de selecção como a higromicina, a fosfomanose-isomerase e a neomicina-fosfotransferase são usadas com frequência para facilitar a selecção e manutenção das células transformadas. As células vegetais transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregados (tecido caloso) ou ser regeneradas em plantas integrais. Como as plantas têm padrões de glicosilação diferentes das células de mamíferos, este facto pode influenciar a escolha de produzir o FVII nestes hospedeiros. As células de plantas transgénicas também podem incluir algas manipuladas para produzir proteínas (ver, por exemplo, Mayfield et ai. (2003) PNAS 100:438-442) . Como as plantas têm padrões de glicosilação diferentes das células de mamíferos, este facto pode influenciar a escolha de produzir o FVII nestes hospedeiros. 2. Purificação

Os métodos para purificação dos polipéptidos do FVII a partir das células hospedeiras dependem das células hospedeiras e dos sistemas de expressão seleccionados. No caso de moléculas segregadas, as proteínas são geralmente purificadas a partir do meio de cultura após remoção das células. No caso de expressão intracelular, as células podem ser lisadas e as proteínas purificadas a partir do extracto. Quando se utilizam organismos transgénicos, como plantas e animais transgénicos, para a expressão, os tecidos ou órgãos podem ser utilizados como material de partida para preparar um extracto celular lisado. Adicionalmente, a produção em animais transgénicos pode incluir a produção dos polipéptidos no leite ou ovos, os quais podem ser recolhidos e depois, se necessário, as proteínas extraídas e subsequentemente purificadas utilizando métodos convencionais na técnica. 0 FVII pode ser purificado utilizando técnicas de purificação de proteínas padrão conhecidas na técnica, que incluem, mas não estão limitadas a, SDS-PAGE, cromatografia de exclusão molecular, precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de quelação e cromatografia de permuta iónica. Por exemplo, os polipéptidos do FVII podem ser purificados por cromatografia de permuta aniónica. Ilustrativo de um método para purificar os polipéptidos do FVII é a utilização de uma coluna de permuta iónica que permite a ligação de qualquer polipéptido com um domínio Gla funcional, seguida de eluição na presença de cálcio (ver, por exemplo, o Exemplo 3). As técnicas de purificação por afinidade também podem ser usadas para melhorar a eficiência e a pureza das preparações. Por exemplo, anticorpos, receptores e outras moléculas que ligam o FVII podem ser usados na purificação por afinidade. Noutro exemplo, a purificação também pode ser melhorada utilizando uma coluna de afinidade com TF solúvel (sTF) (Maun et al. (2005) Prot Sei 14:1171-1180) . Também é possível manipular as construções de expressão para adicionar uma marca de afinidade, como um epitopo myc, uma fusão GST ou His6, e purificá-las por afinidade com anticorpo myc, resina com glutationa e resina com Ni, respectivamente, para uma proteína. A pureza pode ser avaliada através de qualquer método conhecido na técnica, incluindo a electroforese em gel e coloração e as técnicas espectrofotométricas. A protease FVII pode ser expressa e purificada para estar numa forma inactiva (forma de zimogénio) ou, em alternativa, a protease expressa pode ser purificada para uma forma activa, tal como por autocatálise. Por exemplo, os polipéptidos do FVII que foram activados por clivagem proteolítica da ligação Arg152-Ile153 podem ser preparados in vitro (isto é, FVIIa; forma com duas cadeias) . Os polipéptidos do FVII podem ser inicialmente preparados por qualquer um dos métodos de produção aqui descritos, incluindo, mas não exclusivamente, a produção em células de mamífero, seguida de purificação. A clivagem dos polipéptidos do FVII para a forma activa da protease, FVIIa, pode ser obtida por vários meios. Por exemplo, a auto-activação durante a incubação com vesículas fosfolipídicas na presença de cálcio pode ser obtida em 45 minutos (Nelsestuen et ai. (2001) J Biol Chem 276:39825-31). Os polipéptidos do FVII também podem ser activados na totalidade através de incubação com o factor Xa, o factor Xlla ou o TF na presença de cálcio, com ou sem fosfolípidos (ver, por exemplo, o Exemplo 3 e Broze et ai. (1980) J Biol Chem 255:1242-1247, Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569-26574, Harvey et al. J Biol Chem 278 : 8363-8369) . 3. Proteínas de fusão São também disponibilizadas proteínas de fusão contendo um polipéptido do FVII modificado e um ou mais polipéptidos diferentes. Composições farmacêuticas contendo estas proteínas de fusão, formuladas para administração por uma via adequada, são disponibilizadas. As proteínas de fusão são formadas através da ligação, por qualquer ordem, do polipéptido do FVII modificado com um agente, tal como um anticorpo ou um seu fragmento, um factor de crescimento, um receptor, um ligando e outro agente similar, com o objectivo de facilitar a purificação de um polipéptido do FVII, alterar as propriedades farmacodinâmicas de um polipéptido do FVII, por exemplo, direccionando o polipéptido para uma célula ou tecido visado, e/ou aumentar a expressão ou a secreção do polipéptido do FVII. Tipicamente, qualquer proteína de fusão do FVII retém pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% da actividade coagulante em comparação com um polipéptido do FVII não fundido, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais da actividade coagulante em comparação com um polipéptido não fundido. A ligação de um polipéptido do FVII com outro polipéptido pode ser efectuada directa ou indirectamente via um elemento de ligação. Num exemplo, a união pode ser através de ligação química, por exemplo, por meio de agentes heterobifuncionais ou de ligações tiol ou de outras ligações idênticas. A fusão também pode ser produzida por meios recombinantes. A fusão de um polipéptido do FVII com outro polipéptido pode ocorrer na extremidade N-terminal ou C-terminal do polipéptido do FVII. Os exemplos não limitativos de polipéptidos que podem ser usados em proteínas de fusão com um polipéptido do FVII aqui disponibilizado incluem, por exemplo, um polipéptido de GST (glutationa-S-transferase) , um domínio Fc de imunoglobulina G ou uma sequência sinal heteróloga. As proteínas de fusão podem conter componentes adicionais, como a proteína de ligação à maltose (MBP) de E. coli, que ajudam à captação da proteína pelas células (ver, Pedido internacional PCT n.2 WO 01/32711) .

Uma proteína de fusão pode ser produzida por técnicas recombinantes convencionais. Por exemplo, os fragmentos de ADN que codificam as diferentes sequências dos polipéptidos podem ser ligados em fase de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, utilização de extremidades lisas ou coesivas para a ligação, digestão com enzimas de restrição para produzir as extremidades apropriadas, preenchimento das extremidades coesivas conforme apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar uniões indesejáveis e ligação enzimática. Noutro exemplo, o gene da fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais, incluindo os sintetizadores automáticos de ADN. Em alternativa, pode proceder-se à amplificação por PCR dos fragmentos génicos utilizando iniciadores de ancoragem que produzem overhangs complementares entre dois fragmentos génicos consecutivos, que podem ser subsequentemente hibridados e reamplifiçados para gerar uma sequência génica quimérica (ver, por exemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992) . Além disso, estão disponíveis comercialmente muitos vectores de expressão que já codificam um grupo para fusão (por exemplo, um polipéptido de GST). Um ácido nucleico que codifica o FVII pode ser clonado num vector de expressão destes, de forma que o grupo de fusão seja ligado em fase à proteína da protease. 4. Modificação dos polipéptidos

Os polipéptidos do FVII modificados podem ser preparados como cadeias polipept ídicas nuas ou como um complexo. Para algumas aplicações, pode ser desejável preparar o FVII modificado numa forma "nua", sem modificações pós-traducionais ou outras modificações químicas. As cadeias polipeptídicas nuas podem ser preparadas em hospedeiros apropriados que não modificam o FVII pós-traducionalmente. Estes polipéptidos também podem ser preparados em sistemas in vitro e utilizando a síntese química de polipéptidos. Para outras aplicações, podem pretender-se modificações particulares, incluindo a peguilação, a albuminação, a glicosilação, a carboxilação, a hidroxilação, a fosforilação ou outras modificações conhecidas. As modificações podem ser feitas in vitro ou, por exemplo, produzindo o FVII modificado num hospedeiro adequado que origina essas modificações. 5. Sequências nucleotídicas São aqui disponibilizadas moléculas de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos do FVII ou polipéptidos do FVII modificados. As moléculas de ácidos nucleicos incluem as variantes alélicas ou as variantes de splicing de qualquer polipéptido do FVII codificado. Ilustrativas das moléculas de ácidos nucleicos aqui disponibilizadas são quaisquer moléculas de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido do FVII modificado aqui disponibilizado, tais como quaisquer moléculas de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 18-43, 125-150 ou 206-250. Numa concretização, as moléculas de ácidos nucleicos aqui disponibilizadas têm uma identidade de sequência de pelo menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ou 99% ou hibridam em condições de estringência moderada ou de alta estringência ao longo de pelo menos 70% do comprimento total de qualquer ácido nucleico que codifica um polipéptido do FVII aqui disponibilizado. Noutra concretização, uma molécula de ácidos nucleicos pode incluir aquelas contendo sequências com codões degenerados que codificam qualquer um dos polipéptidos do FVII aqui disponibilizados. G. Avaliação das actividades dos polipéptidos do FVII modificados

As actividades e propriedades dos polipéptidos do FVII podem ser avaliadas in vitro e/ou in vivo. Os ensaios para efectuar esta avaliação são conhecidos pelos peritos na especialidade e correlacionam as actividades testadas e os resultados com as actividades terapêuticas e as actividades in vivo. Num exemplo, as variantes do FVII podem ser avaliadas em comparação com o FVII não modificado e/ou de tipo selvagem. Noutro exemplo, a actividade dos polipéptidos do FVII modificados pode ser avaliada após exposição, in vitro ou in vivo, ao TFPI ou à AT-III e comparada com a actividade dos polipéptidos do FVII modificados que não foram expostos ao TFPI ou à AT-III. Os ensaios in vitro incluem quaisquer ensaios laboratoriais conhecidos pelos peritos na especialidade, tais como, por exemplo, os ensaios baseados em células, incluindo ensaios de coagulação, ensaios de ligação, ensaios de proteínas e ensaios de biologia molecular. Os ensaios in vivo incluem os ensaios do FVII em modelos animais, assim como a administração a humanos. Em alguns casos, a actividade do FVII in vivo pode ser determinada através do teste do sangue, soro ou outro fluido corporal quanto a determinantes dos ensaios. As variantes do FVII também podem ser testadas in vivo para avaliar uma actividade ou propriedade, tal como o efeito terapêutico.

Tipicamente, os ensaios aqui descritos são em relação à forma activada com duas cadeias do FVII, isto é, FVIIa. Estes ensaios também podem ser realizados com a forma de cadeia única, por exemplo para fornecer um controlo negativo, já que essa forma tipicamente não contém a actividade proteolítica ou catalítica necessária para a actividade coagulante do FVII. Adicionalmente, tais ensaios também podem ser realizados na presença de cofactores, como o TF, o que em algumas circunstâncias aumenta a actividade do FVII. 1. Ensaios in vitro

Os ensaios in vitro exemplares incluem ensaios para avaliar a modificação e a actividade dos polipéptidos. As modificações podem ser avaliadas utilizando ensaios in vitro que avaliam a -carboxilação e outras modificações pós- traducionais, ensaios de proteínas e ensaios de conformação conhecidos na técnica. Os ensaios para determinação da actividade incluem, mas não estão limitados a, medição da interacção do FVII com outros factores de coagulação, como o TF, o factor X e o factor IX, ensaios proteolít icos para determinar a actividade proteolítica dos polipéptidos do FVII, ensaios para determinar a ligação e/ou a afinidade dos polipéptidos do FVII para as fosfatidilserinas e outros fosfolípidos e ensaios baseados em células para determinar o efeito dos polipéptidos do FVII na coagulação.

As concentrações dos polipéptidos do FVII modificados podem ser avaliadas através de métodos bem conhecidos na técnica que incluem, mas não estão limitados a, ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA de enzyme-linked immunosorbant assays), SDS-PAGE; os métodos de Bradford, Lowry, BCA; a absorvância no UV e outros métodos de marcação de proteínas quantificáveis, tais como, mas não limitados a, métodos imunológicos, radioactivos e fluorescentes e métodos relacionados. A avaliação dos produtos de clivagem das reacções de proteólise, incluindo a clivagem dos polipéptidos do FVII ou os produtos produzidos pela actividade de protease do FVII, pode ser efectuada utilizando métodos que incluem, mas não estão limitados a, clivagem de substrato cromogénico, HPLC, análise por SDS-PAGE, ELISA, transferência de Western, imuno-histoquímica, imunoprecipitação, sequenciação NH2-terminal e marcação de proteínas.

As propriedades estruturais dos polipéptidos do FVII modificados também podem ser avaliadas. Por exemplo, a cristalografia de raios X, a ressonância magnética nuclear (RMN) e a microscopia crioelectrónica dos polipéptidos do FVII modificados podem ser utilizadas para avaliar a estrutura tridimensional dos polipéptidos do FVII e/ou outras propriedades dos polipéptidos do FVII, como a ligação de Ca2+ ou do cofactor.

Adicionalmente, a presença e extensão de degradação do FVII podem ser medidas por técnicas padrão, como seja a electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e a transferência de Western das amostras contendo o FVII submetido a electroforese. Os polipéptidos do FVII que foram expostos a proteases também podem ser submetidos a sequenciação da extremidade N-terminal, para determinar a localização dos sítios de clivagem ou alterações nos sítios de clivagem dos polipéptidos do FVII modificados. a. Modificação pós-traducional

Os polipéptidos do FVII também podem ser avaliados quanto à presença de modificações pós-traducionais. Estes ensaios são conhecidos na técnica e incluem ensaios para medir a glicosilação, a hidroxilação e a carboxilação. Num ensaio exemplar para medir a glicosilação, a análise dos carboidratos pode ser efectuada, por exemplo, com a análise por SDS-PAGE dos polipéptidos do FVII expostos a

hidrazinólise ou tratamento com endoglicosidase. A hidrazinólise liberta os N-glicanos e os O-glicanos das glicoproteínas através de incubação com hidrazina anidra, ao passo que a libertação pela endoglicosidase envolve a enzima PNGase F, que liberta a maioria dos N-glicanos das glicoproteínas. A hidrazinólise ou o tratamento com endoglicosidase dos polipéptidos do FVII gera uma extremidade redutora que pode ser marcada com um marcador fluoróforo ou cromóforo. Os polipéptidos do FVII marcados podem ser analisados por electroforese de carboidratos assistida por fluoróforo (FACE). A marca fluorescente para os glicanos também pode ser usada para a análise e determinação do perfil de monossacarídeos de padrões de glicosilação complexos por HPLC. Os métodos de HPLC exemplares incluem a cromatografia de interacção hidrofílica, a interacção electrónica, a cromatografia de permuta iónica, a cromatografia de interacção hidrofóbica e a cromatografia de exclusão molecular. As sondas para glicanos incluem, mas não estão limitadas a, 3-(acetilamino)-6-aminoacridina (AA-Ac) e ácido 2-aminobenzóico (2-AA). Os grupos carboidrato também podem ser detectados através da utilização de anticorpos específicos que reconhecem o polipéptido do FVII glicosilado.

Um ensaio exemplar para medir a -hidroxilação compreende a análise por HPLC de fase reversa de polipéptidos do FVII que foram submetidos a hidrólise alcalina (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860). A carboxilação e -carboxilação dos polipéptidos do FVII podem ser avaliadas utilizando a espectrometria de massa com análise do tempo de voo e ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF), como descrito na técnica (ver, por exemplo, Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, Maum et al. Prot Sei 14:1171-1180). A interacção de um polipéptido do FVII contendo o propéptido (pro-FVII) com a enzima carboxilase responsável pela modificação -carboxilato pós-traducional também pode ser avaliada. A constante de dissociação (Kd) após incubação da enzima carboxilase com os polipéptidos do pro-FVII marcados com fluoresceina pode ser medida mediante determinação da quantidade de carboxilase ligada por anisotropia (Lin et ai. (2004) J Biol Chem 279:6560-6566). b. Actividade proteolítica

Os polipéptidos do FVII modificados podem ser testados quanto a actividade proteolítica. A actividade proteolítica do FVII pode ser medida utilizando substratos cromogénicos como Chromozym t-PA (MeS02-D-Phe-Gly-Arg-pNA), S-2288 (H-D-

Ile-Pro-Arg-pNA), S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA), S-2765 (Z-D-

Arg-Gly-Arg-pNA), Spectrozyme FXa e Spectrozyme FVIIa (CH3S02-D-CHA-But-Arg-pNA). Os polipéptidos do FVII, sozinhos ou na presença de TF, são incubados com concentrações variáveis do substrato cromogénico. A clivagem do substrato pode ser controlada através da absorvância, e a velocidade de hidrólise do substrato pode ser determinada por regressão linear utilizando software prontamente disponível. A activação dos substratos do factor de coagulação, como o FX, pelos polipéptidos do FVII também pode ser avaliada. Os polipéptidos do FVII, com ou sem pré-incubação com o TF, podem ser incubados com FX purificado (disponível comercialmente). A quantidade de FXa activo produzida em consequência da incubação com os polipéptidos do FVII é medida como a actividade do FXa sobre um substrato cromogénico, tal como S-2222 ou Spectrafluor FXa (CH3S02-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH), que é controlada através de alterações da absorvância (Harvey et ai. J Biol Chem 278:8363-8369, ver também o Exemplo 5 abaixo). Uma fonte de fosfolípidos também pode ser incluída na incubação do FVII e FX (Nelsestuen et ai. (2001) J Biol Chem 276:39825-31). c. Actividade de coagulação

Os polipéptidos do FVII podem ser testados relativamente a actividade de coagulação, utilizando ensaios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, alguns dos ensaios incluem, mas não estão limitados a, um ensaio de coagulação em duas etapas (Leibman et al., (1985) PNAS 82:3879-3883); o ensaio do tempo de protrombina (TP, que pode medir a actividade do FVIIa dependente do TF na via extrínseca) ; ensaios que são modificações do teste TP; o tempo de tromboplastina parcial activada (TTPa, que pode medir a actividade do FVIIa independente do TF) ; o tempo de coagulação activada (TCA); o tempo de coagulação activada do sangue total recalcifiçado; o tempo de coagulação pelo método de Lee-White ou a tromboelastografia (TEG) (Pusateri et al. (2005) Criticai Care 9:S15-S24). Por exemplo, a actividade de coagulação de um polipéptido do FVII modificado pode ser determinada através de um ensaio com base no TP, em que o FVII é diluído em plasma deficiente em FVII e misturado com reagente do tempo de protrombina (TF recombinante com fosfolípidos e cálcio), como aquele disponível como Innovin™ através de Dade Behring. A formação do coágulo é detectada opticamente, e o tempo para coagular é determinado e comparado com o plasma deficiente em FVII sozinho. d. Ligação a outras proteínas e/ou inibição por outras proteínas

Os ensaios de inibição podem ser usados para medir a resistência dos polipéptidos do FVII modificados a inibidores do FVII, como, por exemplo, o TFPI e a AT-III, ou a moléculas, como o Zn2+. A avaliação da inibição face a outros inibidores também pode ser testada e inclui, mas não exclusivamente, outros inibidores de proteases de serina e anticorpos específicos do FVII. A inibição pode ser avaliada através da incubação, por exemplo, do TFPI, AT-III ou Zn2+ com polipéptidos do FVII que foram previamente incubados com TF. A actividade do FVII pode depois ser medida utilizando qualquer um ou mais dos ensaios de actividade ou coagulação descritos acima, e a inibição pelo TFPI, AT-III ou Zn2+ pode ser determinada por comparação da actividade dos polipéptidos do FVII incubados com o inibidor com a actividade dos polipéptidos do FVII que não foram incubados com o inibidor.

Os polipéptidos do FVII podem ser testados quanto a ligação a outros factores de coagulação e inibidores. Por exemplo, as interacções directas e indirectas do FVII com cofactores, como o TF, substratos, como o FX e o FIX, e inibidores, como o TFPI, a antitrombina III e a heparina, podem ser avaliadas utilizando qualquer ensaio de ligação conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, imunoprecipitação, purificação em coluna, SDS-PAGE em condições não redutoras, ensaios BIAcore®, ressonância de plasma de superfície (SPR), transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), polarização de fluorescência (FP), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), dicroísmo circular (CD), ensaios de complementação proteica (PCA), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), dispersão de luz, equilíbrio de sedimentação, cromatografia de filtração em gel de zona reduzida, retardamento da mobilidade electroforética, transferência de Far-western, polarização de fluorescência, footprinting de proteínas via radical hidroxilo, apresentação em fagos e vários sistemas de dois híbridos. Num exemplo, a ligação de Zn2+ é avaliada utilizando análise de equilíbrio (Petersen et al., (2000) Protein Science 9:859-866). e. Afinidade para os fosfolipidos A ligação e/ou afinidade dos polipéptidos do FVII modificados para a fosfatidilserina (FS) e outros fosfolipidos pode ser determinada utilizando ensaios bem conhecidos na técnica. Fosfolipidos extremamente puros (por exemplo, concentrações conhecidas de FS de bovino e fosfatidilcolina (FC) de ovo, que estão disponíveis comercialmente, por exemplo através de Sigma, em solvente orgânico), podem ser usados para preparar vesículas fosfolipídicas unilamelares pequenas. A ligação dos polipéptidos do FVII a estas vesículas de FS/FC pode ser determinada através da dispersão relativa da luz a 902 em relação à luz incidente. A intensidade da dispersão da luz com as vesículas de FC/FS sozinhas e com as vesículas de FC/FS/FVII é medida para determinar a constante de dissociação (Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369). Também é possível utilizar a ressonância de plasma de superfície, por exemplo num instrumento do tipo biossensor BIAcore, para medir a afinidade dos polipéptidos do FVII para as membranas fosfolipídicas (Sun et al. Blood 101:2277-2284). 2. Modelos animais não humanos

Os modelos animais não humanos podem ser utilizados para avaliar a actividade, eficácia e segurança dos polipéptidos do FVII modificados. Por exemplo, os animais não humanos podem ser usados como modelos para uma doença ou afecção. Os animais não humanos podem ser injectados com substâncias que induzem uma doença e/ou um fenótipo antes da administração de variantes do FVII, tais como qualquer variante do FVII apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 18-43, 125-150 ou 206-250, para monitorizar os efeitos na progressão da doença. Os modelos genéticos também são úteis. É possível gerar animais, por exemplo ratinhos, que mimetizam uma doença ou afecção através da sobreexpressão, subexpressão ou knock-out (desactivação) de um ou mais genes, como, por exemplo, os ratinhos knock-out para o factor VIII que apresentam hemofilia A (Bi et al. (1995) Nat Gen 10:119-121) . Estes animais podem ser produzidos por meio de técnicas de produção de animais transgénicos bem conhecidas na técnica ou utilizando estirpes mutantes naturais ou induzidas. Os exemplos de modelos animais não humanos de doenças associadas ao FVII úteis incluem, mas não estão limitados a, modelos de perturbações hemorrágicas, em particular de hemofilia, ou de doença trombótica. Os modelos animais não humanos de lesão também podem ser utilizados para avaliar uma actividade, tal como a actividade de coagulação, dos polipéptidos do FVII. Estes modelos animais não humanos podem ser usados para monitorizar a actividade de variantes do FVII em comparação com um polipéptido do FVII de tipo selvagem.

Os modelos animais também podem ser usados para monitorizar a estabilidade, semivida e clearance dos polipéptidos do FVII modificados. Tais ensaios são úteis para comparar os polipéptidos do FVII modificados e para calcular as doses e os regimes posológicos para ensaios clínicos subsequentes em animais não humanos e em humanos. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado, tal como qualquer variante do FVII aqui disponibilizada, incluindo, por exemplo, qualquer uma apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 18-43, 125-150 ou 206-250, pode ser injectado na veia da cauda de ratinhos. Recolhem-se depois amostras de sangue em determinados momentos temporais após a injecção (por exemplo, minutos, horas e dias mais tarde) e, em seguida, o nivel dos polipéptidos do FVII modificados em amostras corporais que incluem, mas não estão limitadas a, soro ou plasma pode ser monitorizado em momentos temporais específicos, por exemplo, por ELISA ou radioimunoensaio. As amostras de sangue de vários momentos temporais após a injecção dos polipéptidos do FVII também podem ser testadas quanto a actividade de coagulação utilizando vários métodos, conforme descrito nos Exemplos 9 e 14. Estes tipos de estudos farmacocinéticos podem fornecer informações relativamente à semivida, clearance e estabilidade dos polipéptidos do FVII, o que pode ajudar a determinar as doses adequadas para administração como um pró-coagulante.

Os polipéptidos do FVII modificados, tais como qualquer polipéptido apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 18-43, 125-150 ou 206-250, podem ser testados quanto a eficácia terapêutica utilizando modelos animais para a hemofilia. Num exemplo não limitativo, um modelo animal como um ratinho pode ser utilizado. Os modelos murinos de hemofilia estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para testar os polipéptidos do FVII modificados. Por exemplo, um modelo de ratinho de hemofilia A, que é produzido por injecção com anticorpos anti-FVIII, pode ser usado para avaliar a actividade coagulante de polipéptidos do FVII (ver, por exemplo, os Exemplos 8 e 14 e Tranholm et ai. Blood (2003)102:3615-3620). Um modelo de ratinho de hemofilia B também pode ser usado para testar os polipéptidos do FVII (Margaritis et ai. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031) . Existem igualmente modelos de perturbações hemorrágicas que não são de ratinho. A actividade dos polipéptidos do FVII pode ser avaliada em ratos com hemorragia induzida por varfarina ou hemorragia induzida por melagatran (Diness et ai. (1992) Thromb Res 67:233-241, Elg et ai. (2001) Thromb Res 101:145-157) e em coelhos com hemorragia induzida por heparina (Chan et ai. (2003) J Thromb Haemost 1:760-765) . Cães consanguíneos com hemofilia A, hemofilia B e doença de von Willebrand que apresentam hemorragia grave também podem ser utilizados em estudos efectuados em animais não humanos com polipéptidos do FVII (Brinkhous et ai. (1989) PNAS 86:1382-1386). A actividade dos polipéptidos do FVII também pode ser avaliada num modelo de coelho de hemorragia, no qual é induzida trombocitopenia através de uma combinação de irradiação gama e utilização de anticorpos contra as plaquetas (Tranholm et ai. (2003) Thromb Res 109:217-223).

Além de animais com perturbações hemorrágicas generalizadas, os modelos de lesão e de traumatismo também podem ser usados para avaliar a actividade dos polipéptidos do FVII, bem como a sua segurança e eficácia como agente terapêutico coagulante. Os exemplos não limitativos destes modelos incluem um modelo de coelho de estenose coronária (Fatorutto et al. (2004) Can J Anaesth 51:672-679), um modelo de lesão hepática de grau V em porcos (Lynn et al. (2002) J Trauma 52:703-707), um modelo de lesão hepática de grau V em porcos (Martinowitz et al. (2001) J Trauma 50:721-729) e um modelo suino de aortomia (Sondeem et al. (2004) Shock 22:163-168) . 3. Ensaios clínicos

Estão disponíveis muitos ensaios para avaliar a actividade do FVII para utilização clínica. Esses ensaios podem incluir a avaliação da coagulação, estabilidade da proteína e semivida in vivo e ensaios fenotípicos. Os ensaios fenotípicos e os ensaios para avaliar o efeito terapêutico do tratamento com FVII incluem a avaliação dos níveis sanguíneos do FVII (por exemplo, medição do FVII sérico antes da administração e em momentos temporais após as administrações, incluindo após a primeira administração, imediatamente após a última administração e em momentos temporais intermédios, com correcção para o índice de massa corporal (IMC)), a avaliação da coagulação sanguínea in vitro após o tratamento com FVII usando os métodos descritos acima (por exemplo, ensaio de TP) e a resposta fenotípica ao tratamento com FVII, incluindo a melhoria dos sintomas ao longo do tempo em comparação com os sujeitos tratados com um FVII não modificado e/ou de tipo selvagem ou com placebo. Os doentes tratados com os polipéptidos do FVII podem ser monitorizados em termos de perda de sangue, necessidade de transfusão e hemoglobina. Os doentes podem ser monitorizados regularmente ao longo de um período de tempo no caso de administrações de rotina ou repetidas, ou após a administração em resposta a eventos agudos como hemorragia, traumatismo ou procedimentos cirúrgicos. H. Formulação e administração São aqui disponibilizadas composições destinadas a utilização no tratamento de perturbações hemorrágicas. Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido do factor VII tal como aqui descrito. As concentrações eficazes dos polipéptidos do FVII ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis são misturadas com um veiculo ou excipiente farmaceuticamente adequado para administração sistémica, tópica ou local. Os compostos são incluídos numa quantidade eficaz para tratar a perturbação seleccionada. A concentração de composto activo na composição dependerá das taxas de absorção, inactivação e excreção do composto activo, do regime posológico e da quantidade administrada, bem como de outros factores conhecidos pelos peritos na especialidade.

Os veículos ou excipientes farmacêuticos adequados para a administração dos compostos aqui disponibilizados incluem quaisquer daqueles veículos que os peritos na especialidade sabem ser apropriados para o modo de administração particular. As composições farmacêuticas que incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido do FVII aqui descrito também podem ser fornecidas como um pó liofilizado que é reconstituído, por exemplo com água estéril, imediatamente antes da administração. I. Formulações

As composições farmacêuticas contendo um FVII modificado podem ser formuladas de qualquer forma convencional, através da mistura de uma quantidade seleccionada do polipéptido com um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. A selecção do veículo ou excipiente encontra-se no âmbito da perícia da profissão e pode depender de vários parâmetros. Estes incluem, por exemplo, a via de administração (isto é, sistémica, oral, nasal, pulmonar, local, tópica ou qualquer outra via) e a perturbação tratada. As composições farmacêuticas aqui disponibilizadas podem ser formuladas para uma administração de dose única (directa) ou para diluição ou outra modificação. As concentrações dos compostos presentes nas formulações são eficazes para a entrega de uma quantidade, com a administração, que é eficaz para o tratamento pretendido. Tipicamente, as composições são formuladas para uma administração de dose única. Para formular uma composição, a fracção ponderai de um composto ou uma sua mistura é dissolvida, suspensa, dispersa ou misturada de outra forma com um veículo seleccionado, numa concentração eficaz, de modo que a afecção tratada seja aliviada ou melhorada.

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser formulados para administração a um sujeito como uma proteína do FVIIa com duas cadeias. Os polipéptidos do FVII modificados podem ser activados através de qualquer método conhecido na técnica antes da formulação. Por exemplo, o FVII pode sofrer auto-activação durante a purificação por cromatografia de permuta iónica (Jurlander et ai. (2001) Semin Thromb Hemost 27:373-384). Os polipéptidos do FVII modificados também podem ser activados através da incubação com o FXa imobilizado em esferas (Kemball-Cook et al. (1998) J Biol Chem 273:8516-8521) ou por quaisquer outros métodos conhecidos na técnica (ver também o Exemplo 3 abaixo). A inclusão de cálcio nestes processos assegura uma activação total e o correcto enrolamento da proteína do FVIIa modificada. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados também podem ser formulados para administração como uma proteína de cadeia única. Os polipéptidos do FVII de cadeia única podem ser purificados de forma a impedir a clivagem (ver, por exemplo, US6677440). Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser formulados para que as formas de cadeia única e com duas cadeias estejam contidas na composição farmacêutica, em qualquer proporção, através da selecção apropriada do meio para eliminar ou controlar a auto-activação. O composto pode ser suspenso numa forma micronizada ou outra forma adequada ou pode ser derivatizado para produzir um produto activo mais solúvel. A forma da mistura resultante depende de vários factores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no veículo ou excipiente seleccionado. As misturas resultantes são soluções, suspensões, emulsões e outras misturas idênticas e podem ser formuladas como uma mistura aquosa ou não aquosa, cremes, qéis, unquentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, preparações para irrigação, sprays, supositórios, ligaduras ou qualquer outra formulação adequada para uma administração sistémica, tópica ou local. No caso de uma administração interna local, por exemplo uma administração por via intramuscular, parentérica ou intra-articular, os polipéptidos podem ser formulados como uma solução ou suspensão num meio aquoso, como soro fisiológico tamponado isotonicamente, ou podem ser combinados com um suporte ou bioadesivo biocompativel destinado a administração interna. A concentração eficaz é suficiente para melhorar a afecção visada e pode ser determinada empiricamente. Para formular uma composição, a fracção ponderai do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou misturada de outra forma com um veiculo seleccionado, numa concentração eficaz, de modo que a afecção visada seja aliviada ou melhorada.

Geralmente, as composições farmaceuticamente aceitáveis são preparadas tendo em conta a aprovação de uma agência reguladora ou são preparadas de acordo com uma farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais e em humanos. As composições farmacêuticas podem incluir veículos como um diluente, adjuvante ou excipiente com o qual uma isoforma é administrada. Estes veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como a água e os óleos, incluindo aqueles provenientes do petróleo ou de origem animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, o óleo de soja, o óleo mineral e o óleo de sésamo. A água é um veículo típico quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. As soluções de soro fisiológico e as soluções aquosas de glicerol e dextrose também podem ser usadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injectáveis. As composições podem conter juntamente com um ingrediente activo: um diluente como a lactose, a sacarose, o fosfato dicálcico ou a carboximetilcelulose; um lubrificante como o estearato de magnésio, o estearato de cálcio e o talco; e um aglutinante como o amido, as gomas naturais como a goma-arábica, a gelatina, a glucose, os melaços, a polivinilpirrolidina, as celuloses e seus derivados, a povidona, as crospovidonas e outros aglutinantes similares conhecidos pelos peritos na especialidade. Os excipientes farmacêuticos aceitáveis incluem o amido, a glucose, a lactose, a sacarose, a gelatina, o malte, o arroz, a farinha, o giz, o gel de sílica, o estearato de sódio, o monoestearato de glicerol, o talco, o cloreto de sódio, o leite magro em pó, o glicerol, o propilenoglicol, a água e o etanol. Se desejado, uma composição também pode conter pequenas quantidades de agentes molhantes ou emulsionantes ou de agentes tampão do pH, por exemplo, o acetato, o citrato de sódio, os derivados de ciclodextrina, o monolaurato de sorbitano, a trietanolamina, o acetato de sódio, o oleato de trietanolamina e outros agentes similares. Estas composições podem adoptar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós e formulações de libertação prolongada. As cápsulas e os cartuchos, por exemplo, de gelatina para utilizar num inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó de um composto terapêutico e de uma base em pó adequada, como a lactose ou o amido. Uma composição pode ser formulada como um supositório, utilizando aglutinantes e veículos tradicionais como os triglicéridos. Uma formulação oral pode incluir veículos convencionais como os graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e outros agentes idênticos. As preparações pra administração oral também podem ser convenientemente formuladas com inibidores de proteases, como um inibidor de Bowman-Birk, um inibidor de Bowman-Birk conjugado, a aprotinina e o camostato. Os exemplos de veículos farmacêuticos adequados estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, geralmente numa forma purificada, juntamente com uma quantidade apropriada de veículo para proporcionar a forma destinada a uma administração correcta a um sujeito ou doente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração. Por exemplo, o FVII modificado pode ser formulado para administração parentérica por injecção (por exemplo, por injecção em bolus ou infusão contínua). As composições injectáveis podem adoptar a forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. A preparação injectável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injectável estéril num diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,4-butanodiol. Os óleos fixos estéreis são normalmente empregues como um meio solvente ou de suspensão. Para este fim, pode empregar-se qualquer óleo fixo brando, incluindo, mas não exclusivamente, os mono ou diglicéridos sintéticos, os ácidos gordos (incluindo o ácido oleico) , os óleos vegetais naturais como o óleo de sésamo, o óleo de coco, o óleo de amendoim, o óleo de semente de algodão e outros óleos, ou veículos gordos sintéticos como o oleato de etilo. Os tampões, os conservantes, os antioxidantes e os ingredientes adequados podem ser incorporados conforme necessário ou, em alternativa, podem constituir a formulação.

Os polipéptidos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente activo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes activos. Os polipéptidos podem ser preparados para uma entrega direccionada, por exemplo através da conjugação com um agente de direccionamento, tal como um anticorpo. As suspensões lipossómicas, incluindo os lipossomas direccionados para tecidos, também podem ser adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos pelos peritos na especialidade. Por exemplo, as formulações lipossómicas podem ser preparadas da forma descrita na Patente U.S. n.2 4,522,811. A entrega via lipossomas também pode incluir formulações de libertação lenta, incluindo matrizes farmacêuticas como os géis de colagénio e os lipossomas modificados com fibronectina (ver, por exemplo, Weiner et al. (1985) J Pharm Sei. 74(9) : 922-5) . As composições aqui disponibilizadas podem conter ainda um ou mais adjuvantes que facilitam a entrega, tais como, mas não limitados a, veículos inertes ou sistemas de dispersão coloidal. Os exemplos representativos e não limitativos destes veículos inertes podem ser seleccionados entre a água, o álcool isopropílico, os fluorocarbonetos gasosos, o álcool etílico, a polivinilpirrolidona, o propilenoglicol, um material produtor de gel, o álcool estearílico, o ácido esteárico, o espermacete, o monooleato de sorbitano e a metilcelulose, bem como combinações adequadas de dois ou mais destes veículos. 0 composto activo é incluído no veículo farmaceuticamente aceitável numa quantidade suficiente para produzir um efeito terapeuticamente útil, na ausência de efeitos secundários indesejáveis no sujeito tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente por meio do teste dos compostos em sistemas in vitro e in vivo conhecidos, como os ensaios aqui disponibilizados. a. Regimes posológicos A quantidade precisa ou dose administrada do agente terapêutico depende do polipéptido do FVII particular, da via de administração e de outras considerações, tais como a gravidade da doença e o peso e condição geral do sujeito. A administração local do agente terapêutico exigirá tipicamente uma dose mais pequena do que qualquer modo de administração por via sistémica, embora a concentração local do agente terapêutico possa, em alguns casos, ser mais elevada após a administração local do que aquela que pode ser obtida com segurança na administração sistémica. Se necessário, uma dose, uma duração e um protocolo de tratamento particulares podem ser determinados empiricamente ou extrapolados. Por exemplo, as doses exemplares de polipéptidos do FVII recombinantes e nativos podem ser usadas como ponto de partida para determinar as doses apropriadas. Por exemplo, um polipéptido do FVII recombinante (rFVIIa) que foi activado para rFVIIa, Novoseven®, foi administrado a doentes com hemofilia A ou hemofilia B que estão a sofrer um episódio hemorrágico, numa dose de 90 pg/kg por infusão em bolus durante 2 a 5 minutos, obtendo-se um nível circulante efectivo de pelo menos 2 pg/ml. A dose é repetida de duas em duas horas até à obtenção da hemostasia. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser eficazes em menores quantidades e/ou frequências de administração inferiores em comparação com esse FVII recombinante. Por exemplo, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser administrados numa dose de 80 pg/kg, 70 pg/kg, 60 pg/kg, 50 pg/kg, 40 pg/kg, 30 pg/kg, 20 pg/kg, 15 pg/kg ou menos. Em alguns exemplos, as doses podem ser mais elevadas, por exemplo 100 pg/kg, 110 pg/kg, 120 pg/kg ou superiores. A duração do tratamento e o intervalo entre as injecções variarão com a gravidade da hemorragia e a resposta do doente ao tratamento e podem ser ajustados em conformidade. Factores como o nivel de actividade e a semivida do FVII modificado, em comparação com o FVII não modificado, podem ser tidos em conta ao efectuar as determinações da dose. As doses e os regimes particulares podem ser determinados empiricamente.

Noutro exemplo, um polipéptido do FVII recombinante (rFVIIa) que foi activado para rFVIIa, Novoseven®, foi administrado a doentes com deficiência congénita do FVII que estão a sofrer um episódio hemorrágico, numa dose de 15-30 pg/kg por infusão em bolus durante 2 a 5 minutos. A dose é repetida a intervalos de 4-6 horas até à obtenção da hemostasia. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser eficazes em menores quantidades e/ou frequências de administração inferiores em comparação com esse FVII recombinante. Por exemplo, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser administrados numa dose de 20 pg/kg, 15 pg/kg, 10 pg/kg, 5 pg/kg, 3 pg/kg ou menos. Em alguns exemplos, as doses podem ser mais elevadas, por exemplo 35 pg/kg, 40 pg/kg, 45 pg/kg ou superiores. A duração do tratamento e o intervalo entre as injecções variarão com a gravidade da hemorragia e a resposta do doente ao tratamento e podem ser ajustados em conformidade. Factores como o nivel de actividade e a semivida do FVII modificado, em comparação com o FVII não modificado, podem ser usados ao efectuar as determinações da dose. Por exemplo, um polipéptido do FVII modificado que apresenta uma semivida mais longa do que um polipéptido do FVII não modificado pode ser administrado em doses mais baixas e/ou menos frequentemente do que o polipéptido do FVII não modificado. De modo idêntico, as doses necessárias para obter um efeito terapêutico utilizando um polipéptido do FVII modificado que apresenta uma actividade coagulante acrescida, em comparação com um polipéptido do FVII não modificado, podem ser reduzidas em frequência e quantidade. As doses e os regimes particulares podem ser determinados empiricamente por um perito na especialidade. b. Formas farmacêuticas

Os compostos farmacêuticos terapeuticamente activos e seus derivados são tipicamente formulados e administrados em formas farmacêuticas unitárias ou preparações multidose. As formulações podem ser disponibilizadas para administração a humanos e animais em formas farmacêuticas que incluem, mas não estão limitadas a, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parentéricas estéreis, soluções ou suspensões orais e emulsões óleo-água contendo quantidades adequadas dos compostos ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada do composto terapeuticamente activo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o excipiente, veículo ou diluente farmacêutico necessário. Os exemplos de formas farmacêuticas unitárias incluem as ampolas e seringas e os comprimidos ou cápsulas embalados individualmente. Em alguns exemplos, a dose unitária é fornecida como um pó liofilizado que é reconstituído antes da administração. Por exemplo, um polipéptido do FVII pode ser disponibilizado como um pó liofilizado que é reconstituído com uma solução apropriada para gerar uma solução monodose para injecção. Em alguns exemplos, o pó liofilizado pode conter o polipéptido do FVII e componentes adicionais, como sais, de modo que a reconstituição com água destilada estéril resulta num polipéptido do FVII numa solução tamponada ou de soro fisiológico. As formas farmacêuticas unitárias podem ser administradas em fracções ou múltiplos destas. Uma preparação multidose consiste numa pluralidade de formas farmacêuticas unitárias idênticas embaladas num recipiente único, para serem administradas numa forma farmacêutica unitária separada. Os exemplos de preparações multidose incluem os frascos de vidro, os frascos de comprimidos ou cápsulas ou os frascos de quartilhos ou galões. Assim, uma preparação multidose é um múltiplo de doses unitárias que não estão separadas na embalagem. 2. Administração de polipéptidos do FVII modificados

Os polipéptidos do FVII aqui disponibilizados (isto é, os compostos activos) podem ser administrados in vitro, ex vivo ou in vivo, através do contacto de uma mistura, tal como uma amostra de um fluido corporal ou de outro tecido, com um polipéptido do FVII. Por exemplo, ao administrar um composto ex vivo, uma amostra de fluido corporal ou de tecido de um sujeito pode ser colocada em contacto com os polipéptidos do FVII que estão a revestir um tubo ou um filtro, tal como, por exemplo, um tubo ou um filtro numa máquina de bypass. Ao efectuar a administração in vivo, os compostos activos podem ser administrados por qualquer via apropriada, por exemplo a via oral, nasal, pulmonar, parentérica, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intra-articular, intracisternal, intraocular, intraventricular, intratecal, intramuscular, intraperitoneal, intratraqueal ou tópica, bem como qualquer combinação de quaisquer duas ou mais delas, na forma liquida, semilíquida ou sólida, e são formulados de uma maneira apropriada para cada via de administração. Os polipéptidos do FVII modificados podem ser administrados uma vez ou mais de uma vez, por exemplo duas vezes, três vezes, quatro vezes ou qualquer número de vezes que seja necessário para obter um efeito terapêutico. As administrações múltiplas podem ser realizadas por qualquer via ou combinação de vias e podem ser administradas de hora em hora, de duas em duas horas, de três em três horas, de quatro em quatro horas ou mais. A via de administração mais adequada variará consoante o estado da doença que se pretende tratar, por exemplo a localização da perturbação hemorrágica. Em geral, os polipéptidos do FVII serão administrados por injecção intravenosa em bolus, com um tempo de administração (infusão) de aproximadamente 2-5 minutos. Noutros exemplos, os níveis sanguíneos desejáveis do FVII podem ser mantidos através de uma infusão contínua do agente activo conforme determinada pelos níveis plasmáticos. Deve salientar-se que o médico assistente saberá como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapêutica para uma dose mais baixa devido a toxicidade ou disfunção da medula óssea, fígado ou rins. Reciprocamente, o médico assistente também saberá como e quando ajustar o tratamento para níveis mais elevados caso a resposta clínica não seja adequada (excluindo efeitos secundários tóxicos). Noutros exemplos, a localização da perturbação hemorrágica pode indicar que a formulação do FVII é administrada por vias alternativas. Por exemplo, pode efectuar-se uma administração local, incluindo uma administração no cérebro (por exemplo, por via intraventricular) quando o doente está a sofrer uma hemorragia nesta região. De forma idêntica, para o tratamento de hemorragias nas articulações, pode realizar-se uma administração local por injecção do agente terapêutico na articulação (isto é, por via intra-articular, intravenosa ou subcutânea). Noutros exemplos, a administração tópica do agente terapêutico na pele, por exemplo formulado como um creme, um gel ou um unguento, ou a administração pulmonar por inalação ou por via intratraqueal pode ser apropriada quando a hemorragia está localizada nestas áreas.

Nos casos em que os polipéptidos do FVII modificados se destinam a ser formulados como uma preparação depot, as formulações de longa duração podem ser administradas através de implante (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos terapêuticos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel.

Se desejado, as composições podem apresentar-se numa embalagem, kit ou dispositivo distribuidor, que pode conter uma ou mais formas farmacêuticas unitárias compreendendo o ingrediente activo. A embalagem contém, por exemplo, uma folha metálica ou de material plástico, tal como um blister. A embalagem ou o dispositivo distribuidor pode vir acompanhado de instruções de administração. As composições contendo os agentes activos podem ser embaladas como artigos de manufactura que contêm um material de acondicionamento, um agente aqui disponibilizado e um rótulo que indica a perturbação para a qual o agente é fornecido. 3. Administração de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos do FVII modificados (terapia génica) São também disponibilizadas composições de moléculas de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos do FVII modificados e vectores de expressão codificando-os que são apropriados para terapia génica. Em vez de entregar a proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo, por exemplo por via sistémica ou outra via, ou ex vivo, por exemplo por remoção de células, incluindo os linfócitos, introdução do ácido nucleico nas mesmas e reintrodução no hospedeiro ou num receptor compatível.

Os polipéptidos do FVII modificados podem ser entregues às células e tecidos por meio da expressão de moléculas de ácidos nucleicos. Os polipéptidos do FVII modificados podem ser administrados como moléculas de ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos do FVII modificados, incluindo por técnicas ex vivo e expressão directa in vivo. Os ácidos nucleicos podem ser entregues às células e tecidos por qualquer método conhecido pelos peritos na especialidade. As sequências de ácidos nucleicos isoladas podem ser introduzidas em vectores para uma manipulação subsequente. Tal como aqui utilizado, o termo vector (ou plasmídeo) refere-se a elementos discretos que são usados para introduzir ADN heterólogo nas células, quer para a sua expressão quer para a sua replicação. A selecção e utilização de tais veículos encontram-se no âmbito da perícia do perito na especialidade.

Os métodos de administração de polipéptidos do FVII modificados através da expressão de moléculas de ácidos nucleicos codificantes incluem a administração de vectores recombinantes. 0 vector pode ser concebido para permanecer epissómico, tal como através da inclusão de uma origem de replicação, ou pode ser concebido para integrar-se num cromossoma na célula. Os polipéptidos do FVII modificados também podem ser usados em terapia de expressão génica ex vivo, utilizando vectores não virais. Por exemplo, as células podem ser manipuladas para expressar um polipéptido do FVII modificado, por exemplo integrando um ácido nucleico que codifica um polipéptido do FVII modificado numa localização genómica, quer ligado funcionalmente a sequências reguladoras quer posicionado de modo a estar ligado funcionalmente a sequências reguladoras numa localização genómica. Estas células podem depois ser administradas local ou sistemicamente a um sujeito, tal como um doente necessitado de tratamento.

Os vectores virais, incluindo por exemplo os adenovirus, os virus adeno-associados (VAA), os virus pox, os virus do herpes, os retrovirus e outros concebidos para terapia génica, podem ser utilizados. Os vectores podem permanecer epissómicos ou podem integrar-se em cromossomas do sujeito tratado. Um polipéptido do FVII modificado pode ser expresso por um virus, que é administrado a um sujeito necessitado de tratamento. Os vectores virais apropriados para terapia génica incluem os adenovirus, os virus adeno-associados (VAA), os retrovirus, os lentivirus, os virus da vacina e outros referidos acima. Por exemplo, a tecnologia de expressão por adenovirus é bem conhecida na técnica e os métodos de produção e administração de adenovirus também são bem conhecidos. Os serotipos de adenovirus estão disponíveis, por exemplo, a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland). 0 adenovirus pode ser usado ex vivo, por exemplo, as células são isoladas de um doente necessitado de tratamento e transduzidas com um vector de adenovirus que expressa um polipéptido do FVII modificado. Após um período de cultura adequado, as células transduzidas são administradas a um sujeito, local e/ou sistemicamente. Em alternativa, as partículas de adenovirus expressando um polipéptido do FVII modificado são isoladas e formuladas num excipiente farmaceuticamente aceitável para a entrega de uma quantidade terapeuticamente eficaz para prevenir, tratar ou melhorar uma doença ou afecção de um sujeito. Tipicamente, as partículas de adenovirus são administradas numa dose variável entre 1 partícula e 1014 partículas por quilograma de peso do sujeito, geralmente entre 106 ou 108 partículas e 1012 partículas por quilograma de peso do sujeito. Em algumas situações, é desejável fornecer uma fonte de ácidos nucleicos juntamente com um agente de direccionamento para as células, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana da superfície celular ou uma célula-alvo, ou um ligando para um receptor presente numa célula-alvo. 0 FVII também pode ser preparado para uma entrega direccionada em tipos celulares específicos. Por exemplo, os vectores adenovirais que codificam polipéptidos do FVII podem ser utilizados para uma expressão estável em células não divisíveis, tais como as células hepáticas (Margaritis et ai. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031) . Noutro exemplo, os vectores virais ou não virais que codificam os polipéptidos do FVII podem ser transduzidos em células isoladas para entrega subsequente. Os tipos celulares adicionais adequados para a expressão e entrega do FVII podem incluir, embora não exclusivamente, os fibroblastos e as células endoteliais.

As moléculas de ácidos nucleicos podem ser introduzidas em cromossomas artificiais e outros vectores não virais. Os cromossomas artificiais, como os ACE (ver Lindenbaum et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32 (21) :el72), podem ser manipulados para codificar e expressar a isoforma. Resumidamente, os cromossomas artificiais de mamíferos (MAC de Mammalian Artificial Chromosomes) proporcionam um meio para introduzir grandes cargas úteis de informação genética na célula, num formato de replicação autónoma e não integração. Único entre os MAC, o elemento de expressão em cromossoma artificial (ACE de Artificial Chromosome Expression) de mamífero com base em ADN satélite pode ser gerado de novo de forma reprodutível em linhas celulares de diferentes espécies e facilmente purificado a partir dos cromossomas das células hospedeiras. Os ACE de mamíferos purificados podem depois ser reintroduzidos numa variedade de linhas celulares receptoras, onde foram mantidos de modo estável durante períodos de tempo prolongados na ausência de pressão selectiva utilizando um sistema ACE. Utilizando esta abordagem, obteve-se a introdução específica de um ou dois alvos génicos em células LMTK(-) e CHO.

Outro método para introduzir os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos do FVII modificados é uma técnica em dois passos de substituição de genes em levedura, partindo de um genoma de adenovirus completo (Ad2; Ketner et al. (1994) PNAS 91: 6186-6190) clonado num cromossoma artificial de levedura (YAC de Yeast Artificial Chromosome) e de um plasmídeo que contém sequências de adenovirus para visar uma região específica no clone YAC, uma cassete de expressão para o gene de interesse e uma marca de selecção positiva e negativa. Os YAC são particularmente interessantes porque permitem a incorporação de genes maiores. Esta abordagem pode ser usada para a construção de vectores baseados em adenovirus, portadores de ácidos nucleicos que codificam quaisquer uns dos polipéptidos do FVII modificados descritos, para transferência génica para células de mamíferos ou animais completos.

Os ácidos nucleicos podem ser encapsulados num veiculo, como um lipossoma, ou introduzidos numa célula, tal como uma célula bacteriana, particularmente uma bactéria atenuada, ou introduzidos num vector viral. Por exemplo, quando se utilizam lipossomas, as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana da superfície celular associada à endocitose podem ser usadas para efeitos de direccionamento e/ou para facilitar a captação, por exemplo, proteínas da cápside ou seus fragmentos trópicos para um tipo celular particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização e proteínas que visam a localização intracelular e melhoram a semivida intracelular.

Para os métodos ex vivo e in vivo, as moléculas de ácidos nucleicos que codificam o polipéptido do FVII modificado são introduzidas em células provenientes de um dador adequado ou do sujeito que se pretende tratar. As células nas quais pode ser introduzido um ácido nucleico para fins de terapia incluem, por exemplo, qualquer tipo celular desejado e disponível que seja apropriado para a doença ou afecção que se pretende tratar, incluindo, mas não exclusivamente, as células epiteliais, as células endoteliais, os queratinócitos, os fibroblastos, as células musculares, os hepatócitos; as células sanguíneas como os linfócitos T, os linfócitos B, os monócitos, os macrófagos, os neutrófilos, os eosinófilos, os megacariócitos, os granulócitos; e vários progenitores ou células estaminais, em particular os progenitores hematopoiéticos ou células estaminais hematopoiéticas, por exemplo, as células estaminais obtidas da medula óssea, do sangue do cordão umbilical, do sangue periférico, do fígado fetal e de outras suas fontes.

Para o tratamento ex vivo, as células de um dador compatível com o sujeito que se pretende tratar ou as células do sujeito que se pretende tratar são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas e as células modificadas são administradas ao sujeito. 0 tratamento inclui a administração directa, tal como, por exemplo, encapsuladas em membranas porosas que são implantadas no doente (ver, por exemplo, Patente U.S. n.os 4,892,538 e 5,283, 187). As técnicas adequadas para a transferência de ácidos nucleicos para células de mamíferos in vitro incluem a utilização de lipossomas e de lípidos catiónicos (por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol) e os métodos de electroporação, microinjecção, fusão celular, DEAE-dextrano e precipitação com fosfato de cálcio. Os métodos de entrega de ADN podem ser usados para expressar os polipéptidos do FVII modificados in vivo. Tais métodos incluem a entrega de ácidos nucleicos via lipossomas e a entrega de ADN nu, incluindo a entrega local e sistémica, por exemplo utilizando a entrega por electroporação, ultra-sons e fosfato de cálcio. Outras técnicas incluem a microinjecção, a fusão celular, a transferência de genes mediada por cromossomas, a transferência de genes mediada por microcélulas e a fusão de esferoplastos. A expressão in vivo de um polipéptido do FVII modificado pode estar ligada à expressão de moléculas adicionais. Por exemplo, a expressão de um polipéptido do FVII modificado pode estar ligada à expressão de um produto citotóxico, por exemplo num virus manipulado ou expresso num virus citotóxico. Tais virus podem ser direccionados para um tipo celular particular que constitui um alvo de um efeito terapêutico. 0 polipéptido do FVII modificado expresso pode ser usado para reforçar a citotoxicidade do virus. A expressão in vivo de um polipéptido do FVII modificado pode incluir a ligação funcional de uma molécula de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido do FVII modificado a sequências reguladoras especificas, tal como um promotor especifico de células ou especifico de tecidos. Os polipéptidos do FVII modificados também podem ser expressos a partir de vectores que infectam e/ou se replicam especificamente em tipos celulares e/ou tecidos-alvo. Os promotores indutiveis podem ser usados para regular de forma selectiva a expressão dos polipéptidos do FVII modificados. Um sistema de expressão regulável exemplar é o sistema de expressão génica indutivel por doxiciclina, que foi usado para regular a expressão do FVII recombinante (Srour et ai. (2003) Thromb Haemost. 90(3) : 398-405) .

As moléculas de ácidos nucleicos, como ácidos nucleicos nus ou em vectores, cromossomas artificiais, lipossomas e outros veículos, podem ser administradas ao sujeito por administração sistémica, tópica, local e outras vias de administração. Quando é sistémica e in vivo, a molécula de ácidos nucleicos ou o veículo contendo a molécula de ácidos nucleicos podem ser direccionados para uma célula. A administração também pode ser directa, por exemplo através da administração de um vector ou de células que tipicamente visam uma célula ou um tecido. Por exemplo, as células tumorais e as células proliferativas podem ser células visadas para a expressão in vivo dos polipéptidos do FVII modificados. As células usadas para a expressão in vivo de um polipéptido do FVII modificado também incluem as células autólogas do doente. Estas células podem ser removidas de um doente, os ácidos nucleicos para a expressão de um polipéptido do FVII modificado introduzidos e as células depois administradas a um doente, por exemplo, por injecção ou enxerto. I. Utilizações terapêuticas

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser utilizados para o tratamento de qualquer afecção para a qual o FVII recombinante seja usado. Tipicamente, tais tratamentos incluem aqueles em que se pretende obter uma coagulação acrescida, por exemplo respostas hemostáticas aumentadas. Os polipéptidos do FVII modificados possuem actividade terapêutica sozinhos ou em combinação com outros agentes. Os polipéptidos modificados aqui disponibilizados foram concebidos para reter uma actividade terapêutica, mas apresentam propriedades modificadas, em particular uma resistência acrescida ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, uma actividade catalítica acrescida, uma maior semivida e/ou uma ligação e/ou afinidade acrescida para as plaquetas activadas. Estas propriedades modificadas podem, por exemplo, melhorar a eficácia terapêutica dos polipéptidos devido a uma actividade coagulante acrescida dos polipéptidos do FVII modificados. Esta secção fornece utilizações e métodos de administração exemplares. Estas terapêuticas descritas são exemplares e não limitam as aplicações dos polipéptidos do FVII modificados.

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser usados em vários métodos terapêuticos e de diagnóstico nos quais o FVII é empregue. Tais métodos incluem, mas não exclusivamente, os métodos de tratamento das afecções fisiológicas e médicas descritas e enumeradas abaixo. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem exibir uma melhoria das actividades e efeitos terapêuticos in vivo em comparação com o FVII de tipo selvagem, incluindo uma dose mais baixa para obter o mesmo efeito, e outras melhorias em termos da administração e do tratamento, tais como menos administrações e/ou administrações menos frequentes, efeitos secundários diminuídos e efeitos terapêuticos aumentados. Embora esteja subentendido que os polipéptidos do FVII modificados podem ser administrados como um zimogénio do FVII (isto é, a forma de cadeia única), os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados são tipicamente administrados na forma activada com duas cadeias após, por exemplo, auto-activação ou activação por outros factores de coagulação, tal como durante a purificação.

Em particular, os polipéptidos do FVII modificados destinam-se a ser utilizados em métodos terapêuticos em que o FVII foi utilizado para o tratamento. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de tratamento de doenças e perturbações, tais como, mas não limitadas a, perturbações da coagulação sanguínea, perturbações hematológicas, perturbações hemorrágicas, hemofilias como a hemofilia A, a hemofilia B e a deficiência do factor VII, e perturbações adquiridas do sangue, tal como a deficiência adquirida do factor VII causada por doença hepática. Os polipéptidos do FVII modificados também podem ser utilizados no tratamento de doenças e perturbações hemostáticas adicionais, tais como, mas não limitadas a, trombocitopenia (por exemplo, devido a regimes quimioterapêuticos) , doença de Von Willebrand, perturbações hereditárias das plaquetas (por exemplo, defeito de armazenamento plaquetário como as síndromes de Chediak-Higashi e Hermansky-Pudlak, disfunção do tromboxano A2, trombastenia de Glanzmann e síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemolítico-urémica, telangiectasia hemorrágica hereditária, também conhecida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) e coagulação intravascular disseminada.

Em algumas concretizações, as hemorragias que serão tratadas pelos polipéptidos do FVII verificam-se em órgãos como o cérebro, a região do ouvido interno, os olhos, o fígado, os pulmões, um tecido tumoral ou o tracto gastrintestinal. Noutras concretizações, a hemorragia é difusa, tal como na gastrite hemorrágica e na hemorragia uterina abundante. Os doentes com perturbações hemorrágicas, como, por exemplo, a hemofilia A e B, estão muitas vezes em risco de sofrer complicações hemorrágicas durante uma cirurgia ou devido a um traumatismo. Estas hemorragias podem manifestar-se como hemartroses agudas (sangramento nas articulações), artropatia hemofílica crónica, hematomas (por exemplo, muscular, retroperitoneal, sublingual e retrofaríngeo), hematúria (sangramento a partir do tracto renal), hemorragias no sistema nervoso central, hemorragias gastrintestinais (por exemplo, hemorragias do tracto gastrintestinal alto) e hemorragia cerebral, que também podem ser tratadas com os polipéptidos do FVII modificados. Adicionalmente, qualquer hemorragia associada a uma cirurgia (por exemplo, uma hepatectomia) ou uma extracção dentária pode ser tratada com os polipéptidos do FVII modificados. Numa concretização, os polipéptidos do FVII modificados podem ser usados para tratar episódios hemorrágicos devido a um traumatismo, ou uma cirurgia ou uma contagem de plaquetas ou actividade plaquetária reduzida num sujeito. Os métodos exemplares para os doentes submetidos a uma cirurgia incluem os tratamentos para prevenir a hemorragia e os tratamentos antes, durante ou após cirurgias como, mas não limitadas a, uma cirurgia cardíaca, uma angioplastia, uma cirurgia do pulmão, uma cirurgia abdominal, uma cirurgia à coluna, uma cirurgia cerebral, uma cirurgia vascular, uma cirurgia dentária ou uma cirurgia de transplante de órgão, incluindo um transplante de medula óssea, coração, pulmão, pâncreas ou fígado. 0 tratamento de doenças e afecções com os polipéptidos do FVII modificados pode ser realizado por qualquer via de administração apropriada, incluindo, mas não exclusivamente, a administração por injecção, pulmonar, oral e transdérmica, utilizando formulações adequadas como aqui descritas. 0 tratamento é tipicamente efectuado por administração intravenosa em bolus.

Se necessário, uma dose, uma duração e um protocolo de tratamento particulares podem ser determinados empiricamente ou extrapolados. Por exemplo, as doses exemplares de polipéptidos do FVII recombinantes e nativos podem ser usadas como ponto de partida para determinar as doses apropriadas. Por exemplo, um polipéptido do FVII recombinante (rFVIIa) que foi activado para rFVIIa, Novoseven®, foi administrado a doentes com hemofilia A ou hemofilia B que estão a sofrer um episódio hemorrágico, numa dose de 90 pg/kg por infusão em bolus durante 2 a 5 minutos, obtendo-se um nivel circulante efectivo de pelo menos 2 pg/ml, com uma semivida média de 2,7 horas. A dose é repetida de duas em duas horas até à obtenção da hemostasia. Os polipéptidos do FVII modificados que têm uma actividade coagulante acrescida, devido a uma resistência acrescida ao TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, uma actividade catalítica acrescida, uma maior semivida e/ou uma ligação e/ou afinidade acrescida para as plaquetas activadas, podem ser eficazes em menores quantidades e/ou frequências de administração inferiores em comparação com esse FVII recombinante. As doses para os polipéptidos do FVII não modificados ou de tipo selvagem podem ser utilizadas como orientação para determinar as doses para os polipéptidos do FVII modificados. Factores como o nivel de actividade e a semivida do FVII modificado, em comparação com o FVII não modificado, podem ser usados ao efectuar estas determinações. As doses e os regimes particulares podem ser determinados empiricamente.

Os niveis de dose e os regimes podem ser determinados com base em doses e regimes conhecidos e, se necessário, podem ser extrapolados com base nas alterações das propriedades dos polipéptidos modificados e/ou podem ser determinados empiricamente com base numa variedade de factores. Esses factores incluem o peso corporal do indivíduo, a saúde geral, a idade, a actividade do composto específico empregue, o sexo, a dieta, a hora de administração, a taxa de excreção, a combinação de fármacos, a gravidade e a progressão da doença, a disposição do doente para a doença e a opinião do médico assistente. 0 ingrediente activo, o polipéptido, é normalmente combinado com um veiculo farmaceuticamente eficaz. A quantidade do ingrediente activo que pode ser combinada com os materiais excipientes para produzir uma forma farmacêutica unitária ou uma preparação multidose pode variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. 0 efeito dos polipéptidos do FVII no tempo de coagulação do sangue pode ser controlado utilizando qualquer um dos testes de coagulação conhecidos na técnica que incluem, mas não exclusivamente, o tempo de protrombina do sangue total (TP) , o tempo de tromboplastina parcial activada (TTPa), o tempo de coagulação activada (TCA), o tempo de coagulação activada do sangue total recalcifiçado ou o tempo de coagulação pelo método de Lee-White.

Com a melhoria do estado de um doente, pode administrar-se uma dose de manutenção de um composto ou das composições em caso de necessidade, e a dose, a forma farmacêutica ou a frequência de administração, ou uma combinação delas, pode ser modificada. Em alguns casos, um sujeito pode necessitar de um tratamento intermitente a longo prazo perante qualquer recorrência dos sintomas da doença ou com base nas doses programadas. Noutros casos, poderão ser necessárias administrações adicionais em resposta a eventos agudos, tais como hemorragia, traumatismo ou procedimentos cirúrgicos. A descrição seguinte compreende algumas afecções exemplares para as quais o FVII (administrado como FVIIa) foi usado como um agente de tratamento, sozinho ou em combinação com outros agentes. 1. Perturbações hemorrágicas congénitas a. Hemofilia A hemofilia congénita é uma perturbação do sangue recessiva na qual há niveis reduzidos dos factores de coagulação no plasma, conduzindo a uma perturbação da cascata de coagulação e a um tempo de coagulação do sangue prolongado. A hemofilia A, que representa aproximadamente 85% de todos os casos de hemofilia, resulta de uma mutação/mutações no gene do factor VIII no cromossoma X, levando a uma deficiência ou disfunção da proteína FVIII. A hemofilia B é causada por uma deficiência ou disfunção do factor de coagulação FIX, que geralmente resulta de deleções ou mutações pontuais no gene do FIX no cromossoma X. A incidência mundial da hemofilia A é de aproximadamente 1 caso por 5.000 indivíduos do sexo masculino, enquanto a da hemofilia B é de 1 caso por 25.000 indivíduos do sexo masculino. A hemofilia A e B são adicionalmente classificadas em leves, moderadas ou graves. Um nível plasmático com 5-25% da actividade normal do factor VIII ou IX é classificado como leve, l%-5% é moderado e menos de 1% é grave. A hemofilia C, muitas vezes designada por deficiência do FXI, é uma doença relativamente ligeira e rara, que afecta cerca de 1 em 100.000 pessoas de uma forma autossómica recessiva. A hemofilia A e B manifestam-se clinicamente de muitas formas. Pequenos cortes e escoriações não resultarão em sangramento excessivo, mas os traumatismos e as cirurgias sim. O doente também terá numerosas ocorrências de sangramento nas articulações e nos músculos e fará nódoas negras com facilidade. A hemartrose ou sangramento nas articulações é uma das principais complicações na hemofilia, podendo ocorrer espontaneamente ou em resposta a um traumatismo. Os gínglimos, como o joelho, o cotovelo e o tornozelo, são as articulações afectadas com mais frequência. A anca e o ombro são afectados com muito menos frequência, pois as articulações esferóides têm mais musculatura à sua volta que as protege melhor de lesões. O sangramento pode causar dor aguda grave, restringir o movimento e conduzir a complicações secundárias, incluindo hipertrofia sinovial. Além disso, o sangramento recorrente nas articulações pode causar sinovite crónica, o que pode levar a lesões na articulação, destruindo a membrana sinovial, a cartilagem e o osso. Os sujeitos hemofílicos também sofrem de hemorragias potencialmente fatais, como seja a hemorragia intracraniana e as hemorragias no sistema nervoso central. A hemorragia intracraniana verifica-se em aproximadamente 10% dos doentes com hemofilia grave, resultando numa taxa de mortalidade de 30%. Em contrapartida, a hemofilia C é mais ligeira. Raramente se observam hemorragias espontâneas e o sangramento nas articulações, tecidos moles e músculos também é pouco comum. Em geral, as hemorragias são tratadas com transfusão de plasma fresco congelado (PFC) , terapêutica substitutiva com FXI ou, para o tratamento tópico, como o tratamento de feridas externas ou extracções de dentes, cola de fibrina. O tratamento mais comum para a hemofilia A ou B é a terapêutica substitutiva, em que o doente recebe FVIII ou FIX. As formulações estão disponíveis comercialmente como produtos derivados do plasma ou produtos recombinantes, em que as proteínas recombinantes são actualmente o tratamento de eleição em doentes previamente não tratados. Embora estas terapêuticas possam ter muito êxito, surgem complicações caso o doente desenvolva inibidores para o factor VIII ou o factor IX recentemente administrados. Os inibidores são anticorpos IgG, principalmente da subclasse IgG4, que reagem com o FVIII ou o FIX e interferem com a função pró-coagulante. Os inibidores afectam cerca de 1 em 5 doentes com hemofilia A grave. A maior parte dos sujeitos desenvolve estes inibidores pouco tempo após a administração das primeiras infusões de factor VIII, o que acontece frequentemente na primeira infância, embora alguns sujeitos desenvolvam-nos mais tarde. Os inibidores também afectam cerca de 1 em 15 pessoas com hemofilia A leve ou moderada. Estes inibidores geralmente desenvolvem-se durante a idade adulta e não só destroem o FVIII exógeno administrado, como também destroem o FVIII endógeno. Em consequência, os hemofílicos leves e moderados tornam-se graves. Clinicamente, os doentes com hemofilia A que têm inibidores são classificados em altos e baixos respondedores consoante a força da reacção anamnéstica que experimentam quando são reexpostos ao FVIII. Os inibidores afectam cerca de 1 em 100 doentes com hemofilia B. Na maior parte dos casos, os inibidores desenvolvem-se após as primeiras infusões de factor IX terapêutico e podem ser acompanhados por reacções alérgicas.

Os polipéptidos do FVII modificados aqui apresentados podem ser usados para tratar os doentes hemofílicos, em particular os doentes hemofílicos com inibidores. Um produto de FVIIa recombinante (NovoSeven, Novo Nordisk) foi aprovado e licenciado para o tratamento de episódios hemorrágicos em doentes com hemofilia A ou B que possuem inibidores para o FVIII ou o FIX e para a prevenção de hemorragias durante intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes com hemofilia A ou B que possuem inibidores para o FVIII ou o FIX. 0 tratamento com rFVIIa aumenta a produção de trombina, ao mesmo tempo que contorna a necessidade de FVIIIa e/ou FIXa. A coagulação tem início no local da lesão através da interacção do rFVIIa com o TF, resultando na activação inicial do FX, produção de trombina e activação das plaquetas. A coagulação completa produzida pelo rFVIIa pode ter lugar pelos mecanismos dependente do TF e independente do TF, em que alguma da trombina produzida pode resultar da activação directa do FX nas plaquetas activadas pelo rFVIIa sozinho, que se liga ele próprio às plaquetas activadas através de interacções de baixa afinidade com as membranas fosfolipídicas.

Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser usados em terapêuticas para a hemofilia, incluindo o tratamento de episódios hemorrágicos e a prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos. Os polipéptidos do FVII modificados deste invento proporcionam uma resistência acrescida ao inibidor do complexo TF/FVIIa, o TFPI, uma resistência acrescida à AT-III, uma actividade catalítica acrescida, uma maior semivida e/ou uma ligação e/ou afinidade acrescida para as plaquetas activadas. Deste modo, os polipéptidos do FVII podem apresentar uma actividade coagulante mais elevada de uma maneira dependente do TF (por exemplo, através da resistência acrescida ao TFPI) e/ou de uma maneira independente do TF (por exemplo, através da ligação e/ou afinidade acrescida para as plaquetas activadas). Assim, os polipéptidos do FVII modificados podem ser usados para administrar terapêuticas mais activas para a hemofilia. Os exemplos de melhorias terapêuticas obtidas com a utilização dos polipéptidos do FVII modificados incluem, por exemplo, mas não estão limitadas a, doses mais baixas, menos administrações e/ou administrações menos frequentes, efeitos secundários diminuídos e efeitos terapêuticos aumentados.

Os polipéptidos do FVII modificados são tipicamente administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). Os polipéptidos do FVII modificados podem ser testados quanto a eficácia terapêutica, por exemplo, utilizando modelos animais. Por exemplo, ratinhos com hemofilia induzida por anticorpos, ou qualquer outro modelo de hemofilia conhecido, podem ser tratados com os polipéptidos do FVII modificados. A progressão dos sintomas da doença e dos fenótipos é controlada para avaliar os efeitos dos polipéptidos do FVII modificados. Os polipéptidos do FVII modificados também podem ser administrados a sujeitos, por exemplo em ensaios clínicos, para avaliar a eficácia in vivo em comparação com controlos de placebo e/ou controlos que utilizam FVII não modificado.

b. Deficiência do FVII A deficiência do Factor VII é uma perturbação hemorrágica autossómica recessiva que afecta aproximadamente 1 em 500.000 pessoas. A deficiência do FVII pode ser clinicamente ligeira, moderada ou grave, em que a deficiência leve a moderada é caracterizada por um aumento das hemorragias após cirurgia e traumatismo. Os doentes com uma deficiência do FVII grave (menos de 1% da actividade do FVII) experimentam sintomas idênticos à hemofilia. Por exemplo, os sujeitos com deficiência do FVII são propensos a sangramentos nas articulações, hemorragias nasais espontâneas, hemorragias gastrintestinais e hemorragias no tracto urinário. A hemorragia intracerebral e os sangramentos nos músculos também foram referidos, ao passo que as mulheres podem experienciar menorragia grave (sangramento menstrual abundante). O tratamento pode ser efectuado por terapêutica substitutiva. Um produto de FVIIa recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) foi aprovado e licenciado para o tratamento de episódios hemorrágicos em doentes com deficiência congénita do FVII e para a prevenção de hemorragias durante intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes com deficiência congénita do FVII. Daqui advém que os polipéptidos do FVII modificados deste invento podem ser usados de modo idêntico. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser usados no tratamento de episódios hemorrágicos e na prevenção de hemorragias durante intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes com deficiência do FVII. Por exemplo, um doente neonatal com hemorragia intracraniana, que apresenta deficiência grave do FVII, pode receber polipéptidos do FVII modificados por bolus intravenoso para promover a coagulação e manter a hemostasia. Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). c. Outras

Outras perturbações hemorrágicas podem ser tratadas com os polipéptidos do FVII aqui disponibilizados para promover a coagulação. As deficiências congénitas dos factores V e X também se manifestam com tempos de coagulação do sangue prolongados e podem ser potencialmente tratadas com a administração de doses terapêuticas do FVII. Por exemplo, um doente com deficiência do factor X pode receber rFVIIa para controlar a hemorragia associada a uma esplenectomia (Boggio et ai. (2001) Br J Haematol 112:1074-1075) . Os episódios hemorrágicos espontâneos e associados a intervenções cirúrgicas ligados à doença de von Willebrand (DvW) também podem ser tratados utilizando os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados. A DvW é uma perturbação hemorrágica causada por um defeito ou deficiência da proteína de coagulação sanguínea factor de von Willebrand (vWF), estimando-se que ocorra em 1% a 2% da população. Os sujeitos com DvW fazem nódoas negras com facilidade, têm hemorragias nasais recorrentes, sangram após a extracção de um dente, uma amigdalectomia ou outra intervenção cirúrgica e as doentes do sexo feminino podem ter hemorragias menstruais mais abundantes. Os polipéptidos do FVII modificados podem ser usados para melhorar as hemorragias espontâneas e associadas a intervenções cirúrgicas em doentes com DvW (von Depka et ai. (2006) Blood Coagul Fibrin 17:311-316) . Outras perturbações hemorrágicas relacionadas com as plaquetas, como a trombastenia de Glanzmann e a síndrome de Hermansky-Pudlak, também estão associadas a uma actividade de coagulação endógena reduzida. As hemorragias excessivas espontâneas ou associadas a cirurgias em doentes com perturbações hemorrágicas relacionadas com as plaquetas também podem ser controladas por doses terapêuticas dos polipéptidos do FVII modificados. Por exemplo, um doente com trombastenia de

Glanzmmann submetido a uma intervenção cirúrgica pode ser tratado antes, durante e/ou após a cirurgia com os polipéptidos do FVII modificados para impedir uma perda de sangue importante (van Buuren et ai. (2002) Dig Dis Sei 47:2134-2136). Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). 2. Perturbações hemorrágicas adquiridas a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia

As perturbações hemorrágicas também podem ser adquiridas, em vez de congénitas. Por exemplo, o tratamento quimioterapêutico, por exemplo para a leucemia e outros cancros, pode resultar em trombocitopenia. Tal deve-se provavelmente a uma perda da produção de plaquetas na medula óssea dos doentes que recebem a quimioterapia e, tipicamente, verifica-se 6-10 dias após a medicação. O tratamento da trombocitopenia adquirida faz-se geralmente por transfusão de plaquetas, eritrócitos ou plasma, que serve para evitar as hemorragias espontâneas anómalas que podem resultar da deficiência de plaquetas. A hemorragia nos doentes com trombocitopenia induzida por quimioterapia, ou qualquer outra trombocitopenia adquirida ou congénita, também pode ser controlada através da administração de quantidades terapêuticas dos polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados. Por exemplo, um doente trombocitopénico com hemorragias não controladas, por exemplo no tracto gastrintestinal, pode receber uma injecção intravenosa em bolus de uma quantidade terapêutica de polipéptido do FVII para parar a hemorragia (Gerotziafas et ai. (2002) Am J Hematol 69:219-222). Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). b. Outras coagulopatias É possível tratar outras coagulopatias adquiridas utilizando os polipéptidos do FVII modificados aqui apresentados. Uma coagulopatia pode resultar de condições que incluem, mas não estão limitadas a, falência hepática fulminante (por exemplo, causada por fármacos hepatotóxicos, toxinas, doenças metabólicas, doenças infecciosas e isquemia), outra doença hepática, incluindo a cirrose e uma doença associada à doença de Wilson, deficiência de vitamina K (por exemplo, causada pelo tratamento com antibióticos ou pela dieta), síndrome hemolítico-urémica, trombocitopenia trombótica e coagulopatia intravascular disseminada (CID). 0 tratamento convencional é geralmente por transfusão de plasma, eritrócitos ou plaquetas, mas pode não ter êxito. Num exemplo, os polipéptidos do FVII modificados podem ser administrados a um doente com falência hepática fulminante submetido a procedimentos invasivos para impedir a hemorragia. 0 tratamento convencional com plasma fresco congelado (PFC) muitas vezes não tem êxito e pode exigir grandes quantidades de plasma, produzindo uma sobrecarga de volume e anasarca (uma infiltração generalizada do edema no tecido conjuntivo subcutâneo). 0 tratamento com quantidades terapêuticas dos polipéptidos do FVII modificados por bolus intravenoso durante, antes e/ou após uma cirurgia invasiva, como por exemplo uma biopsia do fígado ou um transplante de fígado, pode impedir a hemorragia e estabelecer a hemostasia em doentes com falência hepática fulminante. 0 doente pode ser controlado através do TP do sangue para determinar a eficácia do tratamento (Shami et al. (2003) Liver Transpl 9:138-143). Noutro exemplo, o FVII pode ser administrado a um doente com hemorragia grave associada a uma coagulopatia, tal como, por exemplo, hemorragia intra-abdominal pós-cesariana grave associada a disfunção hepática e CID, que não respondeu às infusões das transfusões convencionais (Moscardo et al. (2001) Br J Haematol 113:174-176). Além disso, os polipéptidos do FVII modificados podem ser usados para tratar uma coagulopatia em doentes neonatais e pediátricos. Num exemplo particular, os doentes neonatais e pediátricos não respondem ao tratamento convencional, tal como uma infusão de eritrócitos e plaquetas. Por exemplo, os neonatos com hemorragia pulmonar grave associada a TP prolongados, que não respondem à transfusão de eritrócitos e plaquetas, podem receber polipéptidos do FVII modificados para diminuir o TP e estabelecer a hemostasia (Olomu et al. (2002) J Perinatol 22:672-674). Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados apresentam uma actividade de coagulação melhorada em comparação com polipéptidos do FVII não modificados e podem, por conseguinte, ser administrados, por exemplo, em doses mais baixas, menos frequentemente e com menos reacções adversas. Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). c. Hemorragia adquirida após transplante A hemorragia grave após o transplante de medula óssea (TMO) e o transplante de células estaminais (TCE) é uma complicação relativamente comum e potencialmente fatal associada a estes procedimentos devido à redução de plaquetas. Por exemplo, a hemorragia alveolar difusa (HAD) é uma complicação pulmonar do TMO com uma incidência estimada de 1-21% na população transplantada e uma taxa de mortalidade de 60-100%. O tratamento convencional destes episódios hemorrágicos inclui o tratamento com corticosteróides e a transfusão de plasma, plaquetas e/ou eritrócitos, embora estes sejam largamente mal sucedidos com uma taxa de mortalidade global de aproximadamente 50% (Hicks et ai. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978). A administração do FVII por bolus intravenoso, com ou sem tratamento concomitante por infusão de corticosteróides e/ou plaquetas, pode ser realizada para tratar a HAD e estabelecer a hemostasia (Hicks et ai. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978) . Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados apresentam uma actividade de coagulação melhorada em comparação com polipéptidos do FVII não modificados e podem, por conseguinte, ser administrados, por exemplo, em doses mais baixas, menos frequentemente, ao longo de uma duração do tratamento mais curta e com menos reacções adversas para a mesma eficácia e actividade biológica. Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). d. Hemorragia induzida pela terapêutica anticoagulante

Os doentes submetidos a terapêuticas anticoagulantes para o tratamento de afecções como o tromboembolismo podem apresentar episódios hemorrágicos com a administração aguda de anticoagulantes, como a varfarina, a heparina e o fondaparinux, ou desenvolver perturbações hemorrágicas em consequência da utilização a longo prazo destas terapêuticas. Os tratamentos para os episódios hemorrágicos incluem tipicamente a administração de pró-coagulantes, como a vitamina K, o plasma, o FIX exógeno e protaminas para neutralizar a heparina. A administração de FVII exógeno também pode ser efectuada para neutralizar o efeito dos anticoagulantes, aumentar o TP, o TTPa e/ou outros marcadores da coagulação e estabelecer a hemostasia (Deveras et ai. (2002) Ann Inten Med 137:884-888) . Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser usados em tratamentos para controlar episódios hemorrágicos em doentes com perturbações hemorrágicas adquiridas devido aos tratamentos anticoagulantes. Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). e. Hemofilia adquirida

Os inibidores do factor VIII podem desenvolver-se espontaneamente em indivíduos de outro modo saudáveis, resultando numa afecção conhecida como "hemofilia adquirida". A hemofilia adquirida é uma afecção rara, com uma incidência anual de 0,2-1,0 por milhão de indivíduos. Os auto-anticorpos são essencialmente anticorpos IgG4 que, quando estão ligados ao FVIII, inibem a actividade do FVIII ao interferirem com a clivagem da trombina, a interacção com o factor de von Willebrand e/ou a ligação aos fosfolípidos. Isto resulta em hemorragia potencialmente fatal em cerca de 87% dos doentes afectados. Os locais comuns da hemorragia são a pele, as mucosas, os músculos e o retroperitoneu, em contraste com os doentes com hemofilia hereditária que sangram predominantemente nas articulações e músculos. A hemofilia adquirida pode ser tratada com um concentrado de complexo protrombínico activado ou com factor VII recombinante activado (NovoSeven®, Novo Nordisk) para controlar os episódios hemorrágicos. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados apresentam uma actividade de coagulação melhorada em comparação com polipéptidos do FVII não modificados e podem, por conseguinte, ser administrados, por exemplo, em doses mais baixas, menos frequentemente, ao longo de uma duração do tratamento mais curta e com menos reacções adversas para a mesma eficácia e actividade biológica.

Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). 3. Hemorragias associadas a traumatismo e cirurgia

Os polipéptidos do FVII podem ser usados como terapêutica para tratar hemorragias associadas à perda de sangue perioperatória e traumática em sujeitos com sistemas de coagulação normais. Por exemplo, os polipéptidos do FVII podem ser administrados a um doente para promover a

coagulação e reduzir a perda de sangue associada à cirurgia e, adicionalmente, reduzir a necessidade de uma transfusão sanguínea. Num exemplo, os polipéptidos do FVII podem ser administrados a sujeitos submetidos a uma prostatectomia retropúbica. A prostatectomia retropúbica está frequentemente associada a uma perda de sangue importante e à necessidade subsequente de transfusão. Os sujeitos submetidos a esta cirurgia ou outra similar podem receber uma quantidade terapêutica do FVII em bolus intravenoso na fase operatória precoce, para reduzir a perda de sangue perioperatória através do aumento da coagulação no local da cirurgia. A redução da perda de sangue resulta em eliminação da necessidade de transfusão sanguínea nestes doentes (Friederich et al. (2003) Lancet 361:201-205) . Os polipéptidos do FVII podem ser administrados a doentes com uma coagulação normal submetidos a outros tipos de cirurgia para promover uma hemostasia rápida e evitar a perda de sangue. Os exemplos não limitativos de procedimentos cirúrgicos em que o FVII, tipicamente administrado na forma activada (isto é, FVIIa), pode ser usado como terapêutica para reduzir a hemorragia perioperatória incluem, embora não estejam limitados a estes exemplos, a cirurgia de válvula cardíaca (Al Douri et al. (2000) Blood Coag Fibrinol 11:S121-

S127), a substituição da válvula aórtica (Kastrup et al. (2002) Ann Thorac Surg 74:910-912), a ressecção de hemangiopericitoma recorrente (Gerlach et al. (2002) J

Neurosurg 96:946-948), a cirurgia do cancro (Sajdak et al. (2002) Eur J Gynaecol Oncol 23:325-326) e a cirurgia em úlceras duodenais (Vlot et al. (2000) Am J Med 108:421-423). O tratamento com o FVII pode promover a hemostasia no local da cirurgia e reduzir ou evitar a perda de sangue, reduzindo ou abolindo deste modo a necessidade de transfusão. Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados foram concebidos para apresentar uma actividade de coagulação melhorada em comparação com polipéptidos do FVII não modificados e podem, por conseguinte, ser administrados, por exemplo, em doses mais baixas, menos frequentemente e com menos reacções adversas. Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa).

Os polipéptidos do factor VII também podem ser usados para promover a coagulação e prevenir a perda de sangue em doentes com lesões traumáticas. Um traumatismo é definido como uma lesão no tecido vivo causada por um agente extrínseco e é a quarta causa principal de morte nos Estados Unidos. Os traumatismos são classificados em traumatismos contundentes (resultando em compressão interna, danos nos órgãos e hemorragia interna) ou traumatismos penetrantes (uma consequência de um agente penetrar no corpo e destruir tecidos, vasos e órgãos, resultando em hemorragia externa). 0 traumatismo pode ser causado por vários eventos incluindo, embora não exclusivamente, acidentes com veículos (causando traumatismo contundente e/ou penetrante), ferimentos de arma de fogo (causando traumatismo penetrante), ferimentos de arma branca (causando traumatismo penetrante), acidentes com máquinas (causando traumatismo contundente e/ou penetrante) e quedas de alturas significativas (causando traumatismo contundente e/ou penetrante). A hemorragia descontrolada em resultado do traumatismo é responsável pela maior parte da mortalidade associada. A coagulopatia difusa é uma complicação relativamente comum associada aos doentes com traumatismo, verificando-se em cerca de 25-36% dos sujeitos. A coagulopatia pode desenvolver-se rapidamente após a lesão, resultando de uma variedade de factores tais como diluição e consumo dos factores de coagulação e plaquetas, fibrinólise, acidose e hipotermia. 0 controlo convencional envolve a terapêutica substitutiva por transfusão de plasma fresco congelado (PFC), plaquetas, eritrócitos e/ou crioprecipitado, corrigindo a acidose e tratando a hipotermia. Estes passos são frequentemente insuficientes para parar a hemorragia e evitar a morte. 0 tratamento através da administração de quantidades terapêuticas de FVII pode promover a coagulação e reduzir a perda de sangue em doentes com traumatismo. Por

exemplo, um doente com um ferimento de arma de fogo apresentando perda massiva de sangue, além da intervenção cirúrgica, pode receber FVII para controlar a hemorragia coagulopática (Kenet et al. (1999) Lancet 354:1879). A terapêutica coagulante com o FVII pode reduzir eficazmente a perda de sangue e a hemorragia em doentes com traumatismos contundentes e penetrantes (Rizoli et al. (2006) Crit Care 10:R178). Os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados foram concebidos para apresentar uma actividade de coagulação melhorada em comparação com polipéptidos do FVII não modificados e podem, por conseguinte, ser administrados, por exemplo, em doses mais baixas, menos frequentemente e com menos reacções adversas. Geralmente, os polipéptidos do FVII modificados são administrados como polipéptidos do FVII activados (FVIIa). J. Terapêuticas de combinação

Qualquer um dos polipéptidos do FVII modificados aqui descritos pode ser administrado em combinação com, antes de, de forma intermitente com, ou após outros agentes ou procedimentos terapêuticos que incluem, mas não estão limitados a, outros produtos biológicos, compostos do tipo pequenas moléculas e cirurgia. Para qualquer doença ou afecção, incluindo todas aquelas exemplificadas acima, para a qual o FVII (incluindo o FVIIa e o rFVIIa) é indicado ou foi usado e para a qual estão disponíveis outros agentes e tratamentos, o FVII pode ser usado em combinação com os mesmos. Por conseguinte, os polipéptidos do FVII modificados aqui disponibilizados podem ser usados de forma idêntica. Dependendo da doença ou afecção que se pretende tratar, as combinações exemplares incluem, embora não estejam limitadas a estes exemplos, a combinação com outros factores de coagulação purificados a partir do plasma ou recombinantes, pró-coagulantes como a vitamina K, derivados da vitamina K e inibidores da proteína C, plasma, plaquetas, eritrócitos e corticosteróides. K. Artigos de manufactura e kits

Os compostos farmacêuticos de polipéptidos do FVII modificados ou os ácidos nucleicos que codificam polipéptidos do FVII modificados, ou um seu derivado ou uma sua parte biologicamente activa, podem ser embalados como artigos de manufactura contendo um material de acondicionamento, uma composição farmacêutica que é eficaz para tratar uma doença ou perturbação hemostática e um rótulo que indica que o polipéptido do FVII modificado ou a molécula de ácidos nucleicos se destina a ser utilizado para o tratamento de uma doença ou perturbação hemostática.

Os artigos de manufactura aqui disponibilizados contêm materiais de acondicionamento. Os materiais de acondicionamento para utilizar no acondicionamento de produtos farmacêuticos são bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Ver, por exemplo, a Patente U.S. n.° 5,323,907, 5,052,558 e 5,033,352. Os exemplos de materiais de acondicionamento farmacêutico incluem, mas não estão limitados a, blisters, frascos, tubos, inaladores, bombas, bolsas, frascos de vidro, recipientes, seringas, frascos e qualquer material de acondicionamento apropriado para uma formulação seleccionada e um modo de administração e tratamento pretendidos. Uma grande variedade de formulações dos compostos e composições aqui disponibilizados, assim como uma variedade de tratamentos para qualquer doença ou perturbação hemostática encontram-se contemplados.

Os polipéptidos do FVII modificados e as moléculas de ácidos nucleicos também podem ser fornecidos como kits. Os kits podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um artigo para administração. Por exemplo, um FVII modificado pode ser fornecido com um dispositivo para administração, tal como uma seringa, um inalador, um copo de medida, um conta-gotas ou um aplicador. O kit pode incluir opcionalmente instruções de aplicação, incluindo doses, regimes posológicos e instruções para os modos de administração. Os kits também podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um artigo para diagnóstico. Por exemplo, tais kits podem incluir um artigo para medir a concentração, quantidade ou actividade do FVII ou de um sistema regulado do FVII de um sujeito.

Os exemplos seguintes são incluídos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito do invento. L. Exemplos

Exemplo 1

Geração in silico de variantes do factor VII com resistência

acrescida ao TFPI

A. Modelagem da interacção entre o factor VII e o TFPI A modelagem computacional da interacção entre o factor VII e o seu inibidor natural, o primeiro domínio de Kunitz (Kl) no inibidor da via do factor tecidual (TFPI-1) (TFPI-1 Kl), foi efectuada para determinar os resíduos de aminoácidos de contacto na interface do local de interacção. A informação publicamente disponível do banco de dados de proteínas (rcsb.org/pdb/) foi utilizada para criar o modelo de homologia. Nem a estrutura cristalina do TFPI-1 Kl sozinho nem a estrutura cristalina do complexo quaternário entre TF/FVIIa/TFPI-l/FXa foram ainda resolvidas. Em vez disso, a modelagem computacional foi efectuada utilizando a estrutura cristalina de 2,1 do complexo ternário entre o TF, o FVII e a variante 5L15 do inibidor da tripsina pancreática de bovino (BPTI5L15; código PDB: 1FAK_1) como modelo de partida para o processo, seguida da informação sobre a estrutura cristalina do complexo tripsina/TFPI-2 (Figura 6) . 0 BPTI5L15 é uma protease de serina do tipo domínio de Kunitz e apresenta homologia com o TFPI-1 e o TFPI-2. 0 primeiro domínio de Kunitz (Kl) do BPTI5L15 (SEQ ID NO: 106) apresenta uma identidade de sequência primária de 45% no primeiro domínio de Kunitz (Kl) (Figura 5) . As coordenadas para a estrutura cristalina do TFPI-2 Kl foram extraídas do ficheiro program database (pdb) 1TFX do banco de dados de proteínas, que representa a estrutura cristalina do complexo tripsina/TFPI-2. As coordenadas do TFPI-2 Kl foram alinhadas sobre as coordenadas tridimensionais do BPTI5L15 da estrutura cristalina do complexo TF/FVIIa/BPTI5L15 (ficheiro pdb 1FAK1), utilizando um programa de alinhamento de estruturas c- de corpo rígido na suite de software PyMol (pymol. sourceforge . net/) . A análise do ajuste do TFPI-2 Kl no modelo através da medição da sobreposição resultou num valor de RMSD (root-mean-square deviation) inferior a 1 Á. Este resultado indicou um alinhamento preciso entre as duas estruturas, e a geração de um modelo fiável de um complexo entre o FVII e o TFPI-2 Kl.

As cadeias laterais no TFPI-2 Kl que o modelo revelou estarem em contacto estreito com a superfície do FVII foram identificadas e mutadas in silico para corresponder às cadeias laterais presentes no TFPI-1 Kl. Os resultados desta análise revelaram uma complementaridade electrostática entre o Factor VII e o TFPI-1 Kl em vários resíduos directamente adjacentes ao sítio activo (isto é, resíduos da segunda esfera) . Os resíduos no FVII envolvidos na interacção com o TFPI-1 Kl, com base na análise de homologia descrita acima, são os resíduos D60, K60a, K60c, T99, R147 e K192 segundo a numeração da quimiotripsina, que correspondem aos resíduos D196, K197, K199, T239, R290 e K341, respectivamente, segundo a numeração do FVII maduro (Figura 7) . 0 exame da interacção modelada indicou que o resíduo de glicina na posição 97 de acordo com a numeração da quimiotripsina (G97), que corresponde a G237 de acordo com a numeração do FVII maduro, está muito próximo dos resíduos de contacto. Uma modificação nesta posição poderia resultar em impedimento estéreo, o que perturbaria a interacção do FVII com o TFPI. B. Mutação in silico do factor VII para proporcionar uma resistência acrescida ao TFPI-1 Kl

Os resíduos de aminoácidos posicionados na interface ou próximo da interface da interacção FVII/TFPI-1 Kl foram identificados da forma descrita acima. Conceberam-se variantes do FVII com modificações de aminoácidos que a) substituíram contactos electrostáticos complementares entre o FVII e o TFPI-1 por contactos carga-carga repulsivos e/ou b) anulam contactos electrostáticos positivos através da substituição dos resíduos carregados no FVII por um resíduo neutro e/ou c) causam impedimento estéreo através da substituição de um resíduo que contém uma cadeia lateral pequena por resíduos que contêm cadeias laterais maiores. As variantes ilustrativas estão indicadas na Tabela 9.

Tabela 9. Variantes do factor VII ilustrativas

Exemplo 2

Clonagem e expressão do FVII

A. Clonagem do FVII

Os nucleótidos que codificam o polipéptido precursor da isoforma do FVII humano com 466 aminoácidos (P08709; apresentado na SEQ ID N0:1) foram clonados no vector de expressão em células de mamífero pCMV Script (Stratagene; SEQ ID NO: 151), que contém um promotor de citomegalovírus (CMV). Resumidamente, os oligonucleótidos CBO-125 (SEQ ID NO:152) e CBO-126 (SEQ ID NO:153) foram utilizados como iniciadores directo e inverso, respectivamente, para amplificar a sequência do FVII por PCR, utilizando ADNc do FVII humano (Invitrogen) como molde. 0 iniciador CBO-125 continha um sítio de restrição BamH I (em negrito) e uma sequência de Kozac (duplo sublinhado) , seguidos de 18 nucleótidos com homologia para a extremidade 5' da sequência de ADNc do FVII (sublinhado), incluindo o codão de iniciação ATG. 0 iniciador CBO-126 continha um sítio de restrição EcoR I (em negrito), um codão de terminação (duplo sublinhado) e 21 nucleótidos com homologia para a extremidade 3' da sequência de ADNc do FVII (sublinhado).

Iniciador directo CBO-125 5' gcatcatgacgtgacggatccgccaccatggtctcccaggccctc 3'

Iniciador inverso CBO-126 5' gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3' A reacção de PCR e as condições de termociclagem convencionais foram utilizadas juntamente com o kit para PCR KoD HiFi (EMD Biosciences), conforme recomendado pelo fabricante. 0 produto de PCR foi digerido com as enzimas de restrição BamH I e EcoR I e ligado nos sítios de restrição BamH I e EcoR I do vector pCMV Script, utilizando técnicas moleculares padrão. 0 vector foi depois transformado em Escherechia coli. As colónias seleccionadas foram crescidas, e as células bacterianas foram recolhidas para efectuar a purificação do plasmídeo utilizando técnicas de biologia molecular de rotina.

B. Geração de variantes do FVII

As variantes do FVII foram geradas utilizando o kit de mutagénese dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante, com oligonucleótidos especificamente concebidos que actuaram como iniciadores e incorporaram uma mutação particular no ADN acabado de sintetizar. 0 método QuikChange envolve a amplificação linear do molde de ADN pela ADN-polimerase de alta fidelidade Pfullltra. Os iniciadores complementares que incluem a mutação desejada foram estendidos durante a ciclagem, utilizando como molde o vector pCMV Script superenrolado de cadeia dupla e purificado contendo a sequência de ADNc do FVII clonada. A extensão dos iniciadores resultou na incorporação da mutação de interesse nas cadeias acabadas de sintetizar e deu origem a um plasmídeo mutado com nicks desencontrados. Após a amplificação, o ácido nucleico foi tratado com Dpn I, que digere as cadeias parentais com metilação dam do vector pCMV Script derivado em E. coli. Esta digestão resultou na "selecção" dos plasmídeos mutados acabados de sintetizar, que não estavam metilados. Os ADN vectoriais contendo a(s) mutação/mutações desejada(s) foram transformados em células E. coli XLIO-Gold ultracompetentes, onde a ligase bacteriana reparou os nicks e permitiu que a replicação normal tivesse lugar.

As variantes do FVII com substituições de um único aminoácido foram produzidas visando as posições D196, K197, K199, G237, T239, R290 e K341, segundo a numeração do FVII maduro (correspondendo a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 e K192 segundo a numeração da quimiotripsina). Também foram geradas variantes do FVII com mutações múltiplas nas posições D196, K197 e K199 ou mutações nas posições D196 e K197. A sequência nucleotídica de um dos oligonucleótidos de cada par de iniciadores complementares utilizado para gerar as variantes do FVII é disponibilizada na Tabela 10. A sequência de tipo selvagem correspondente também é apresentada para efeitos de comparação. As sequências de 3 pares de bases que codificam o aminoácido substituído estão indicadas em negrito. Por exemplo, para produzir uma variante do FVII contendo a substituição D196K (D60K segundo a numeração da quimiotripsina; CB554, SEQ ID NO:18), utilizou-se o oligonucleótido CBO-157 D60K e um oligonucleótido que é complementar de CBO-157 D60K com o kit de mutagénese dirigida QuickChange II XL, para substituir uma sequência "gac" de 3 pares de bases de tipo selvagem por uma sequência "aag" de 3 pares de bases. O vector mutado, que codifica um polipéptido variante do FVII contendo uma substituição D196K, foi depois transformado em células E. coli XLIO-Gold ultracompetentes

Tabela 10. Oligonucleótidos utilizados para gerar variantes do FVII

C. Expressão de polipéptidos do FVII

Para a análise inicial da expressão por ELISA e transferência de Western, os polipéptidos do FVII foram expressos em células BHK-21. Para os ensaios bioquímicos, como aqueles descritos abaixo, os polipéptidos do FVII foram expressos em células 293-F FreestyleTM (Invitrogen). 0 polipéptido do factor VII de tipo selvagem (CB553-02, SEQ ID NO: 3) e os polipéptidos variantes do FVII foram inicialmente expressos na linha de células renais de hamster bebé BHK-21 (ATCC CRL 1632). As células BHK-21 foram crescidas em meio mínimo essencial de Eagle (EMEM, Invitrogen) contendo soro fetal de vitelo (FCS) a 10%, em placas de cultura de 100 mm, a 37°C e 5% CO2. Após crescimento até uma confluência de aproximadamente 90%, as células foram transfectadas com 24 pg do ADN plasmídico FVII, utilizando o kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O meio foi substituído 6 horas após a transfecção por meio EMEM sem soro contendo 1 pg/ml de vitamina Kl (Sigma), e as células foram incubadas durante 72 horas adicionais. A expressão do FVII no meio de cultura celular foi analisada por ELISA ou transferência de Western.

Para as análises subsequentes utilizando ensaios bioquímicos, o polipéptido do factor VII de tipo selvagem (CB553-02, SEQ ID NO:3) e os polipéptidos variantes do FVII foram expressos em células 293-F Freestyle™ (Invitrogen). As células foram crescidas em meio 293 Freestyle™ (Invitrogen) a 37°C e 8% CO2, em frascos Erlenmeyer com tampas ventiladas. As células foram transfectadas utilizando o protocolo sugerido pelo fabricante. Resumidamente, após crescimento para lxlO5 células/ml, as células foram centrifugadas e o meio foi trocado. As células foram depois transfectadas com 240 pg do ADN plasmídico FVII por cada 240 ml de células, usando 293fectin (Invitrogen). Além disso, adicionaram-se 50 pl de uma solução-stock de vitamina Ki (Sigma) em etanol com uma concentração de 1 mg/ml por cada 240 ml de células. As células foram crescidas durante 5 dias e, em seguida, recolheu-se o sobrenadante de cultura. A expressão do FVII no meio de cultura celular foi analisada por ELISA.

1. ELISA

Utilizou-se um imunoensaio para quantificar a quantidade de FVII e FVIIa humanos numa amostra. Usaram-se anticorpos policlonais para o FVII humano para capturar e detectar a protease na solução. O imunoensaio pode ser usado para determinar a concentração de proteína do meio condicionado ou de um stock purificado, ou para determinar a concentração do FVII noutra amostra, por exemplo, uma amostra de plasma humano ou de ratinho. A concentração basal do FVII no sangue humano é de aproximadamente 50 nM e a concentração da forma enzimaticamente activa, FVIIa, é de aproximadamente 1 nM.

Para determinar a quantidade de proteína FVII ou FVIIa humana em amostras, efectuou-se um ensaio ELISA em sanduíche. Imunoplacas Maxisorp de fundo plano de 96 poços (Nunc) foram revestidas com 100 μΐ/poço de uma solução de avidina com uma concentração de 5 ng/μΐ (NeutrAvidin, Pierce Biotech). As microplacas foram cobertas e incubadas, com agitação, durante 1 hora à temperatura ambiente, seguida de lavagem quatro vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,01% (PBST) . As microplacas foram bloqueadas durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente com agitação, através da incubação com albumina sérica de bovino (BSA) a 1% (p/v) em PBS, adicionada a cada poço num volume de 200 μΐ/poço. As microplacas bloqueadas foram depois armazenadas a 42C até à utilização (até 2 semanas).

Antes da utilização, as microplacas foram lavadas quatro vezes com PBST para remover a BSA, adicionaram-se 100 μΐ/poço de uma solução de anticorpo anti-factor VII biotinilado (R&D Systems) com uma concentração de 1 ng/μΐ a cada poço, e a microplaca foi incubada à temperatura ambiente durante 45 minutos, com agitação, para permitir a complexação com a avidina do revestimento. O anticorpo em excesso não ligado foi removido através de lavagem da microplaca com PBST (quatro vezes).

Diluições em série de 1:2 de um padrão de FVII (American Diagnostica; diluído em PBST), com concentrações entre 50 ng/μΐ e 0,8 ng/μΐ, foram adicionadas à microplaca num volume de 100 μΐ/poço. Um poço contendo PBST sem qualquer FVII também foi incluído como um controlo apenas de tampão. Para analisar amostras purificadas (antes e após activação, ver Exemplo 3) de FVII ou FVIIa, a amostra foi primeiro diluída de 1:25 em PBST e, em seguida, ef ectuaram-se diluições em série de 1:2, de forma que se testaram diluições de 1:25, 1:50, 1:100 e 1:200. As amostras diluídas foram adicionadas aos poços, em duplicado, num volume 100 μΐ/poço. Para analisar amostras de plasma contendo FVII ou FVIIa, a amostra de plasma foi diluída de 1:100 e 1:400 em PBST e adicionada aos poços, em duplicado, num volume de 100 μΐ/poço. Uma amostra de plasma sem FVII ou FVIIa também foi incluída para determinar os níveis do fundo. Em seguida, as microplacas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente, com agitação, para permitir a complexação de qualquer FVII ou FVIIa presente na amostra com o anticorpo anti-FVII.

Após incubação com a amostra, as microplacas foram lavadas 4 vezes com PBST. Um anticorpo secundário, anticorpo equino anti-FVII humano (American Diagnostica), foi diluído de 1:5000 em PBST e adicionado a cada poço num volume de 100 μΐ. As microplacas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente, com agitação, para permitir a ligação do anticorpo adicionado ao FVII ou aos complexos do FVII presentes na microplaca. Para remover o anticorpo secundário em excesso, as microplacas foram lavadas com PBST (4 vezes). Para detectar o anticorpo secundário ligado, adicionaram-se 100 μΐ de anticorpo de cabra anti-equino conjugado com HRP, diluído de 1:5000 em PBST, a cada poço. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação, as microplacas foram lavadas quatro vezes com PBST e adicionaram-se 100 μΐ/poço de uma solução contendo uma mistura de 1:1 do substrato TMB e de solução de peróxido de hidrogénio (Pierce Biotech). As microplacas foram agitadas durante aproximadamente 1 minuto à temperatura ambiente, antes da adição de 100 μΐ/poço de H2SO4 2M para parar a reacção. A densidade óptica a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas M5 da Molecular Device, e o valor do fundo para a microplaca (medido com PBST sozinho) foi subtraído do valor medido para cada poço. Construiu-se uma curva de calibração representando a concentração dos padrões do FVII em função da absorvância. Obteve-se tipicamente uma amplitude da curva de calibração de cerca de 0,2 - 50 ng/ml nas condições do ensaio ELISA descrito acima. A concentração de cada amostra foi depois determinada utilizando a curva de calibração e multiplicando pelo factor de diluição, calculando-se uma média e um desvio-padrão. 2. Transferência de Western A expressão do FVII no meio de cultura celular também foi analisada por transferência de Western. Alíquotas contendo a amostra não diluída, ou duas diluições em série de 1:2 em PBS, do meio de cultura celular das células BHK-21 transfectadas com FVII foram identificadas como Cone. 1 (não diluída), Cone. 2 (diluição de 1:2) e Cone. 3 (diluição de 1:4) . As amostras foram aplicadas num gel de SDS-PAGE junto de 10, 25 e 50 nanogramas de rFVII purificado a partir do plasma de controlo (American Diagnostica, CB553-01). A proteína FVII produzida pelas células BHK-21 foi detectada por transferência de Western, utilizando um anticorpo policlonal equino anti-FVII como anticorpo primário (American Diagnostica; utilizado na concentração sugerida pelo fabricante) e um anticorpo secundário anti-IgG equino conjugado com HRP (uma diluição de 1:2000 da solução de 1 mg/ml de Zymed Laboratories) . A comparação dos níveis de expressão foi efectuada com o rFVII purificado a partir do plasma de controlo. Os resultados mostram que estavam presentes concentrações de FVII entre cerca de 20 ng e mais de 50 ng nas alíquotas da cultura celular.

Exemplo 3

Purificação e activação de polipéptidos do FVII

Os polipéptidos do FVII foram purificados utilizando uma coluna Q Sepharose Fast Flow (XK16), à qual os polipéptidos do FVII com domínios Gla funcionais se adsorverão, seguida de uma etapa de eluição com cálcio. Um volume de 240 ml do sobrenadante de cultura das células 293-F FreestyleTM transfectadas foi diluído de 1:2 com uma solução contendo Tris 20 mM pH 8,0 e Tween 20 a 0,01% e, em seguida, adicionaram-se 1,5 ml de EDTA 500 mM pH 8,0 à amostra diluída. As amostras foram filtradas antes de serem carregadas numa coluna Q Sepharose Fast Flow (XK16), que tinha sido pré-equilibrada, primeiro, com Tampão B (Tris 20 mM pH 8,0; NaCl 1 M, Tween 20 a 0,01%) e depois com Tampão A (Tris 20 mM pH 8,0; NaCl 0,15 M, Tween 20 a 0,01%), utilizando um caudal de 8 ml/min. Após introdução da amostra, a coluna foi lavada com Tampão A até a absorvância a 280 nm da solução que atravessou a coluna (flow-through) ter

atingido um valor basal. O Tampão A foi substituído por Tampão C (Tris 20 mM pH 8,0; NaCl 0,15 M; Tween 20 a 0,01%, CaCl2 5 mM) e efectuou-se uma lavagem da bomba para substituir totalmente o tampão nas linhas. Após conclusão da lavagem da bomba, aplicou-se o Tampão C na coluna com um caudal de 8 ml/min para eluir os polipéptidos do FVII, que foram recolhidos em fracções de 5 ml durante 60 minutos. A seguir à eluição, a coluna foi lavada com Tampão B ainda com recolha de fracções, até o pigmento rosa (do meio de cultura) ser removido da coluna. A coluna foi depois lavada com Tampão A para ficar preparada para a purificação do FVII da amostra seguinte.

As fracções eluidas foram adicionalmente purificadas utilizando uma coluna Mono Q 5/5 (contendo 1 ml de resina), que foi pré-equilibrada inicialmente com Tampão B e depois com Tampão A com um caudal de 2 ml/min. As 5a à 8a fracções de 5 ml recolhidas com Tampão C na coluna acima foram combinadas e diluídas de 1:2 em Tampão A, antes da adição de 1,6 ml de EDTA 500 mM, pH 8,0. Recolheram-se opcionalmente pequenas alíquotas (100 μΐ) para análise neste ponto, por exemplo por ELISA. A amostra combinada foi introduzida na coluna Mono Q com um caudal de 2 ml/min e, em seguida, foi lavada com Tampão A. Para eluir os polipéptidos do FVII ligados, correu-se um gradiente de Tampão B entre 0% e 30% através da coluna ao longo de 20 minutos, com um caudal de 1 ml/min, e recolheram-se fracções de 0,5 ml. A coluna foi depois lavada com Tampão B, seguido de Tampão A, em preparação para a purificação do FVII da amostra seguinte.

Os polipéptidos do FVII purificados foram activados para FVIIa utilizando o factor Xa biotinilado do kit Restriction Protease Factor Xa Cleavage and Removal (Roche). Tipicamente, 7 fracções resultantes da purificação na coluna Mono Q foram combinadas num tubo cónico de 15 ml e adicionaram-se 388 μΐ de CaCl2 500 mM, 38,9 μΐ de BSA a 10% em água destilada e 3,2 pg de factor Xa biotinilado. Após incubação durante 14-16 horas a 37°C, adicionaram-se 250 μΐ de avidina imobilizada (Pierce) e a amostra foi misturada a 42C durante 30 minutos. A solução resultante foi depois filtrada através de uma coluna Econo-pak (Bio-Rad), e o filtrado foi misturado com mais 250 μΐ de avidina imobilizada durante 30 minutos adicionais. A solução foi novamente filtrada, e o filtrado foi concentrado para aproximadamente 300-500 μΐ utilizando um filtro centrífugo Amicon Ultra-4 com limite de exclusão de lOkDa (Millipore). A concentração de FVIIa foi depois analisada por ELISA (conforme descrito no Exemplo 2.C.1) e o nível de activação do factor VII foi monitorizado por transferência de Western. A transferência de Western foi efectuada da forma essencialmente descrita no Exemplo 2.C.2, mas utilizando anticorpo de coelho anti-factor Vila humano (Haematologic Technologies, Inc.), numa diluição de 1:2000 e durante 1 hora, como anticorpo primário, seguido de anticorpo de cabra anti-IgG (H+L) de coelho conjugado com HRP (Invitrogen), numa diluição de 1:5000 durante 30 minutos.

Exemplo 4

Determinação da constante de Michaelis-Menten da actividade amidolítica do FVIIa sobre um substrato do tipo pequena molécula A actividade amidolítica das variantes do FVII foi avaliada medindo a constante cinética de Michaelis-Menten da reacção do polipéptido do FVIIa sobre o substrato de peptidilo Spectrozyme FVIIa (CfhSCh-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH). O factor tecidual humano lipidado e purificado (Innovin, Dade Behring, VWR Cat n.2 68100-390) foi incluído no ensaio para promover a actividade óptima do FVIIa. O complexo TF-FVIIa cliva o composto Spectrozyme FVIIa como um substrato cromogénico altamente específico que liberta um cromóforo para-nitroanilina (pNA), o qual pode ser monitorizado por medição da absorção a 405 nm. A actividade enzimática é determinada através da monitorização da absorvância a 405 nm do pNA livre produzido em função do tempo.

As reacções foram efectuadas a três concentrações de enzima diferentes. Para a reacção, as variantes do FVIIa foram primeiro diluídas para 40 nM em tampão de ensaio directo lx (Tris 100 mM pH 8,4; NaCl 100 mM, CaCÍ2 5 mM, BSA a 0,01%) num tubo de 1,7 ml (tubos de microcentrí fuga de baixa adesão de ISC Bioexpress). O FVIIa foi subsequentemente diluído na presença do TF (Innovin, Dade Behring), mediante diluição para 2 nM num reservatório de polipropileno de 12 poços (Axygen) da seguinte forma: 720 μΐ de tampão directo 5x (Tris 500 mM pH 8,4; NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA a 0,05%), 180 μΐ de FVIIa 40 nM e 2700 μΐ de TF 2x (solução-stock 6 nM reconstituída em 10 ml de água) . A protease diluída foi incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente. A solução-stock 2 nM do FVIIa foi adicionalmente diluída em diluições em série de 1:2 para fornecer uma solução-stock 1 nM e uma solução-stock 0,5 nM da protease, respectivamente, também na presença do TF. As reacções das diluições em série foram efectuadas da seguinte forma: primeiro, 1800 μΐ da solução-stock 2 nM de FVIIa/TF preparada acima foram diluídos em 360 μΐ de tampão directo 5x, 900 μΐ de TF 2x e 540 μΐ de água. Esta solução-stock diluída foi diluída novamente de 1:1 em 1800 μΐ de TF lx em tampão directo.

Preparou-se uma microplaca com diluições do substrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica). A solução-stock de Spectrozyme FVIIa foi preparada por reconstituição do frasco de vidro contendo 50 pmoles em água destilada para uma concentração de 10 mM e foi armazenada a 4°C. Oitenta μΐ de (Spectrozyme FVIIa 10 mM) e 60 μΐ + 20 μΐ de água (Spectrozyme FVIIa 7,5 mM) da solução de Spectrozyme FVIIa 10 mM foram adicionados a 2 poços em duas colunas adjacentes de uma microplaca de polipropileno de 96 poços (Costar). Os dois poços foram diluídos em série de 1:2, ao longo dos 8 poços da respectiva coluna, para preparar uma série de concentrações de substrato lOx, que variaram entre 10 mM e 78 μΜ ao longo dos poços da primeira coluna e entre 7,5 mM e 58,6 μΜ ao longo dos poços da segunda coluna.

Adicionaram-se cinco μΐ de cada diluição do substrato Spectrozyme FVIIa a uma microplaca transparente de 96 poços com metade da área (Costar). Quarenta e cinco μΐ de cada uma das três diluições de FVIIa/TF foram adicionados a três grupos de colunas das diluições em série do substrato. Durante este passo, procedeu-se com cuidado para evitar a introdução de bolhas nos poços do ensaio. Quando houve introdução de bolhas, elas foram furadas com uma agulha limpa e removidas antes do início de cada ensaio. As microplacas foram misturadas por agitação. Antes do início do ensaio, o comprimento do percurso dos poços de ensaio foi medido utilizando um espectrofotómetro leitor de microplacas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices), efectuando uma leitura única de todos os poços (endpoint reading) e utilizando a função Pathcheck do software SoftMax Pro (Molecular Devices) . O aumento da absorvância a 405 nm foi medido de 30 em 30 segundos durante uma hora a 372C. 0 software SoftMax Pro foi utilizado para converter a variação da absorvância (miliunidades/s) em concentração de pNa libertado (μΜ/s), utilizando o comprimento do percurso e o coeficiente de extinção do grupo sainte pNA a 405 nm, 9600 M^cirr1. A equação de conversão é a seguinte: variação da absorvância x (1/60 x 1000) x (1/9600 x comprimento do percurso) χ 100000. Os resultados para cada concentração de protease foram representados graficamente utilizando o software Graph Pad Prism, com a concentração do substrato no eixo dos X e as velocidades determinadas em μΜ/s no eixo dos Y. Recorrendo ao software Graph Pad Prism 4, determinou-se Km e Ymax através do ajuste dos resultados a uma equação de Michaelis-Menten com a seguinte forma:

onde: X é a concentração do substrato (μΜ) Y é a actividade enzimática (μΜ/s)

AcatKm é a constante de especificidade (M_1s_1)

Km é a constante de Michaelis (μΜ) E é a concentração da enzima (μΜ)

Estabeleceram-se valores iniciais de E=l, Km = X a 0,5 x Ymax e Acat-Km = 10 0 0. A actividade especifica (miliunidades/min/nM) de cada uma das variantes do FVIIa e do FVIIa de tipo selvagem (CB553-02) foi determinada com o ensaio descrito acima, utilizando uma concentração de Spectrozyme FVIIa de 420 μΜ (Tabela 11) . A actividade das variantes do FVIIa foi tipicamente superior à actividade do FVIIa de tipo selvagem (medida a 2,7 miliunidades/min/nM). A actividade das variantes do FVII foi comparada com variantes descritas na literatura (CB591-CB594) e verificou-se que a maior parte das variantes do FVII apresentava uma actividade comparável ou superior à actividade das variantes que tinham sido previamente descritas na literatura.

Tabela 11. Actividade específica das variantes do FVIIa

Exemplo 5

Determinação da actividade catalítica do FVIIa para o seu

substrato factor X A actividade catalítica das variantes do FVIIa para o seu substrato, o factor X (FX) , foi avaliada indirectamente num ensaio fluorogénico, através da determinação da actividade do FXa, gerado por activação pelo FVIIa, sobre o substrato sintético Spectrafluor FXa. Uma forma lipidada do factor tecidual purificado (TF) foi incluída no ensaio para promover a actividade óptima do FVIIa. A actividade enzimática do FXa para o substrato Spectrafluor FXa (CH3S02-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH) foi determinada por medição do aumento da absorvância do fluoróforo livre produzido, AMC (7-amino-4-metilcumarina), em função do tempo.

Resumidamente, as variantes do FVIIa foram inicialmente diluídas para 0,5 μΜ em tampão de ensaio directo lx (Tris 100 mM pH 8,4; NaCl 100 mM, CaCÍ2 5 mM e BSA a 0,01%) e depois adicionalmente diluídas para 0,1 nM em tampão de ensaio directo. O TF completo lipidado (Innovin; Dade Behring) foi reconstituído em 20 ml de água para preparar uma solução 3 nM e diluído para 0,2 nM em tampão de ensaio directo lx. Misturaram-se 400 μΐ de FVIIa 0,1 nM com 400 μΐ de TF 0,2 nM e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 minutos. A solução foi adicionalmente diluída por meio de duas diluições de 1:2 em tampão de ensaio directo lx contendo TF 0,2 nM, para obter um total de três diluições do FVIIa com concentrações de 0,05 nM; 0,025 nM ou 0,0125 nM, em que cada uma delas contém TF 0,2 nM (soluções de FVIIa/TF). O substrato factor X (FX; American Diagnostica; 80 pg) foi reconstituído em 135,6 μΐ de água destilada para fornecer uma solução-stock 10 μΜ e armazenado em alíquotas a -80°C. As alíquotas não foram congeladas e descongeladas mais de uma vez. A solução-stock de FX foi diluída para 800 nM em tampão de ensaio directo e depois foi diluída em série de 1:2, para obter soluções de FX com concentrações entre 800 nM e 50 nM. 0 composto Spectrofluor Xa (American Diagnostica; 10 pmoles) foi reconstituído em água destilada para 5 mM e armazenado a 42C. Numa microplaca preta de 96 poços com metade da área (Costar), adicionaram-se 5 μΐ de Spectrofluor Xa (American Diagnostica) a cada poço. Em seguida, adicionaram-se 25 μΐ de solução de FX a cada poço. Na última fila de poços da microplaca, incluiu-se também um controlo negativo ao qual não foi adicionado FX. Em duplicado, adicionaram-se 20 μΐ das três concentrações das soluções de TF/FVIIa aos poços das respectivas colunas da microplaca, de modo que cada diluição de TF/FVIIa foi ensaiada contra cada diluição de FX, e em que um conjunto de colunas não continha qualquer TF/FVIIa adicionado (isto é, FX sozinho). As microplacas foram misturadas por agitação. A fluorescência foi medida ao longo do tempo com um espectrofluorímetro programado para fazer leituras de 30 em 30 segundos durante 1 hora a 37°C (Ex: 380 nm, EM: 450 nm, Cut-off: 435 nm) , e o tempo foi indicado em unidades de tempo ao quadrado. Após o ensaio, gerou-se uma curva de calibração da fluorescência do AMC no mesmo leitor de microplacas, para converter as unidades de fluorescência em concentração μΜ de substrato libertado no ensaio. Uma solução 1 mM de AMC em DMSO (Invitrogen) foi diluída para 0,02 mM em tampão de ensaio directo lx. Efectuaram-se seis diluições em série de 1:2 do AMC, com concentrações entre 20 nM e 0, 625 nM, em tampão de ensaio directo lx. A fluorescência do AMC foi medida utilizando as mesmas condições de ensaio descritas acima e traçou-se um gráfico da fluorescência em função da concentração de AMC. Calculou-se o declive da recta, que serviu de factor de conversão de URF em μΜ nos cálculos subsequentes.

As constantes cinéticas para a activação do FX pelo FVIIa foram calculadas fazendo uma análise de regressão linear ao inverso da concentração do substrato em função do inverso da velocidade de clivagem do substrato (em unidades de s2) , em que Vmax,Fviia é calculado como o inverso da ordenada na origem, Km,Fviia como o declive na ordenada na origem e Vmax/Km,Fviia como o inverso do declive. O valor de kcat foi depois derivado de acordo com a equação kcat /Km ,FVIIa — Vmax / Km, FVI Ia X 1/ (0, 5 X k2 X [FVIIa 0ΓΠ μΜ ] X (factor de conversão URF/μΜ)) em que k2 = ( [S] x kcat,Fxa) / (Km,FXa + [S] ) , onde kcat,Fxa e Km,FXa são as constantes para a clivagem de SpectrofluorXa pelo FXa, que foram determinadas experimentalmente utilizando padrões de FXa como sendo iguais a kcat,FXa = 117 s~7 e Km,FXa = 164 μΜ.

Utilizando as condições de ensaio descritas acima, determinou-se que a constante cinética k2 tinha um valor de 88,1 s-1.

Os valores de Km e kcat para cada uma das variantes do FVIIa foram determinados para avaliar a actividade catalítica, kCat/Km (M_1s_1) , de cada uma delas para o seu substrato FX (Tabela 12) . A protease FVIIa de tipo selvagem (CB553-02) também foi avaliada, verificando-se que apresentava uma actividade de 1,8 x 107 M_1s_1. A activação do factor X pelo factor Vila, conforme medida por Krishnaswamy et ai. (J. Biol. Chem. (1998) 273:8 4378-86), é igual a 2,9 x 107 M_1s_1. Muitas das variantes apresentaram uma actividade comparável à da protease não modificada. Em alguns casos, as variantes do FVIIa apresentaram uma actividade catalítica melhorada em comparação com a protease não modificada. Por exemplo, CB558, CB561 e CB563 apresentaram actividades catalíticas de 5,2 x 107; 4,3 x 107 e 5, 9 x 107 M_1s_1.

ft Valor aproximado.

Exemplo 6

Determinação da concentração de protease cataliticamente viável numa solução A concentração de FVIIa cataliticamente viável numa solução-stock foi determinada através da titulação de um complexo entre o factor Vila e o factor tecidual solúvel (sTF) com um inibidor peptidico irreversível do FVIIa, Phe-

Phe-Arg-Clorometilcetona (FFR-CMK). 0 inibidor liga-se ao FVIIa, mas não ao FVII. A incubação prolongada com uma concentração elevada de FVIIa (50 nM) assegura a titulação completa da protease. A actividade residual do complexo FVIIa/TF, após incubação com FFR-CMK, foi medida para determinar a concentração de FVIIa cataliticamente viável na solução-stock original. A. Formato de microplaca de 96 poços

Uma microplaca transparente de 96 poços com metade da área (Nunc) foi pré-tratada por adição a cada poço de 150 μΐ/poço de tampão da microplaca lx (Tris 100 mM pH 8,4; NaCl 100 mM, BSA a 0,01%, Tween-20 a 0,01%) e incubação da microplaca a 37°C durante pelo menos 1 hora. O tampão foi totalmente removido por transferência para uma toalha de papel e centrifugação da microplaca voltada ao contrário para remover qualquer tampão remanescente, e a microplaca foi seca ao ar durante 1 hora e armazenada, coberta, à temperatura ambiente.

Para preparar a mistura de reacção FVIIa/sTF/FFR-CMK, uma solução-stock do FVIIa (American Diagnostica; diluída para 5 μΜ em glicerol a 50% (v/v) e armazenada em alíquotas a -20°C) ou de uma variante do FVIIa foi primeiro diluída para 500 nM em tampão de ensaio directo lx (Tris 100 mM pH 8,4; NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA a 0,01%). A mistura FVIIa/sTF foi depois preparada misturando 90 μΐ de água destilada com 36 μΐ de tampão de ensaio directo 5x, 18 μΐ de FVIIa 500 nM e 18 μΐ de sTF 5 μΜ (factor de coagulação humano recombinante III/factor tecidual solúvel; R&D Systems; a solução-stock utilizada foi de 19,6 μΜ em glicerol a 50%, que foi diluída para 5 μΜ em tampão de ensaio directo lx e armazenada durante no máximo duas semanas a 4°C) . Permitiu-se depois que os componentes complexassem durante 5 minutos à temperatura ambiente.

Uma solução-stock 10 mM de FFR-CMK (Bachem) em DMSO (armazenada a -202C) foi diluída em água para 3,5 μΜ. Utilizando uma fila de uma microplaca de polipropileno opaca para armazenamento (Costar #3363), efectuaram-se diluições em série de 1:2 do FFR-CMK em água ao longo de 11 poços de uma microplaca opaca de 96 poços, em que o último poço da fila continha apenas água como controlo. Esta é a série de soluções do inibidor FFR-CMK lOx. Em cada poço de uma fila da microplaca transparente de 96 poços com metade da área pré-tratada, adicionaram-se 10,8 μΐ da mistura FVIIa/sTF, seguidos de 1,2 μΐ da série do inibidor FFR-CMK lOx. As soluções foram bem misturadas e a microplaca foi centrifugada a <3000 rpm durante 5 minutos para remover gotas dos poços. A microplaca foi coberta e incubada durante 8 horas a 37°C.

Para determinar a actividade residual do complexo FVIIa/TF, preparou-se primeiro uma mistura do substrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica, n.2 217L; solução-stock de frasco de vidro contendo 50 pmole reconstituída em 5 ml de água destilada para uma concentração 10 mM e armazenada a 42C) com tampão directo 5x (Tris 500 mM pH 8,4; NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM e BSA a 0,05%) misturando 360 μΐ de tampão de ensaio directo 5x com 180 μΐ de uma solução 10 mM de Spectrozyme FVIIa e 1080 μΐ de água. A cada poço da microplaca, adicionaram-se 108 μΐ da solução do substrato preparada. Os poços foram misturados e a microplaca foi incubada a 37°C. O aumento da absorvância a 405 nm foi medido de 30 em 30 segundos durante uma hora a 372C, utilizando um leitor de microplacas Spectramax Gemini M5 de Molecular Devices.

Utilizando o software SoftMax Pro (Molecular Devices), mediram-se as variações da absorvância, e a actividade residual das proteases incubadas com um inibidor foi determinada dividindo a variação da absorvância medida pela variação da absorvância da protease não inibida. A actividade residual foi representada graficamente em função da concentração de FFR-CMK, e os pontos que eram >90% ou <10% da actividade não inibida foram eliminados. Traçou-se depois uma recta pelos restantes pontos para determinar a abcissa na origem, que representa a concentração de protease activa na solução. Mediram-se os valores de múltiplos ensaios, fazendo-se uma média e determinando o desvio-padrão. B. Formato de ensaio de 384 poços

De modo a aumentar a precisão e o rendimento da titulação, o ensaio anterior foi modificado para um formato baseado numa microplaca de 384 poços. A incubação foi

efectuada durante sete horas com uma concentração elevada de protease (250 nM) e uma série de concentrações de FFR-CMK abrangendo o intervalo de 400 nM a 53 nM. A actividade residual foi medida através da adição do substrato do FVIIa (Mesilo-dFPR-ACC) e medição da variação do sinal de fluorescência ao longo do tempo.

Resumidamente, uma microplaca preta de 384 poços (Nunc) foi pré-tratada como no Exemplo 6. Em seguida, preparou-se uma solução de FVIIa/sTF misturando 32,5 μΐ de FVIIa 1 μΜ + 19,5 μΐ de sTF 5 μΜ + 6,5 μΐ de tampão AST 5x (Na Hepes 100 mM, pH 7,5; NaCl 750 mM, CaCl2 25 mM, BSA a 0,5%, PEG 8000 a 0,5%) e 6,5 μΐ de dfhO. Esta reacção foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos. Metade de uma microplaca de 384 poços acomoda 5 proteases, medidas em triplicado, e uma única amostra de controlo do ensaio.

Durante a incubação de FVIIa/sTF, o inibidor FFR-CMK 20 mM foi diluído para 8 μΜ em HC1 1 mM, seguido de 9 diluições em série de 1:1,25 ao longo de uma microplaca de 96 poços. Os dois poços restantes da fila foram deixados só com HC1 1 mM. Esta fila foi depois diluída de 1:10 em tampão AST lx e misturada para produzir uma série de concentrações de FFR-CMK entre 800 nM e 107 nM. Pipetaram-se 4 μΐ da série de diluições do FFR-CMK para cada fila da microplaca de 384 poços. Em seguida, misturaram-se 4 μΐ da solução de FVIIa/sTF com a série do inibidor ao longo de onze colunas da microplaca. A coluna final foi cheia com 4 μΐ de tampão AST lx para actuar como o branco da microplaca. A microplaca foi centrifugada, vedada e incubada à temperatura ambiente durante sete horas com agitação. O ensaio foi iniciado com 72 μΐ de Mesilo-dFPR-ACC 110 μΜ diluído em tampão AST lx. O aumento da fluorescência foi monitorizado a Ex:380 nm e Em: 460 nm durante 20 minutos, com leituras de 45 em 45 segundos a 37°C. Os resultados foram analisados da mesma forma que no Exemplo 6 com os refinamentos que se seguem. Primeiro, a actividade residual foi limitada às actividades entre 20% e 80% da actividade da protease sozinha. Segundo, a ordenada na origem da regressão linear foi forçada a estar entre 0,9 e 1,1. Terceiro, a abcissa na origem foi restringida aquelas entre 125 nM e 375 nM. Calculou-se a média da abcissa na origem para as três réplicas de cada protease e obteve-se o desvio-padrão.

Exemplo 7

Determinação da CI50 para a inibição de FVIIa/TF pelo TFPI A potência da interacção entre o TFPI e o complexo FVIIa/TF foi avaliada medindo o nivel de inibição causado por várias concentrações do TFPI sobre a actividade catalítica de um complexo FVIIa/TF em relação a um substrato, Spectrazyme Vila. A concentração de TFPI que foi necessária para causar uma inibição de 50% (CI50) foi calculada para cada variante do FVII e para um padrão do FVIIa.

Uma microplaca transparente de 96 poços com metade da área (Nunc) foi pré-tratada por adição a cada poço de 150 μΐ/poço de tampão da microplaca lx (Tris 100 mM pH 8,4; NaCl 100 mM, BSA a 0,01%, Tween-20 a 0,01%) e incubação da microplaca a 37°C durante pelo menos 1 hora. O tampão foi totalmente removido por agitação, transferência para um papel absorvente e centrifugação da microplaca voltada ao contrário para remover o tampão remanescente. A microplaca foi seca ao ar durante 1 hora e armazenada à temperatura ambiente.

Num tubo de microcentrí fuga de 1,7 ml (tubo de microcentrífuga de baixa adesão de ISC Bioexpress), preparou-se uma mistura de FVIIa/TF, num volume total de 450 μΐ, misturando 9 μΐ de FVIIa 250 nM (American Diagnostica, CB553-02 ou uma variante respectiva que se pretende testar) com 337,5 μΐ de TF 2x (Innovin, Dade Behring, produto liofilizado ressuspenso em 10 ml de água destilada para produzir TF 2x, que equivale a uma concentração de TF lipidado aproximadamente 7 nM), 90 μΐ de tampão de ensaio 5x (Tris 500 mM pH 8,4; NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0,05%) e 13,5 μΐ de água, que resultou numa solução contendo FVIIa 5 nM e TF 5,2 nM. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir a complexação dos componentes. A cada poço de 2 colunas da microplaca transparente de 96 poços com metade da área pré-tratada, adicionaram-se 25 μΐ da mistura FVIIa/sTF respectiva e a placa foi coberta para impedir a evaporação. 0 TFPI humano recombinante (R&D Systems) foi inicialmente dissolvido em 33 μΐ de glicerol a 50% (v/v) para preparar uma solução-stock 10 μΜ que foi armazenada a -202C. A solução-stock de TFPI foi adicionalmente diluída para 1,5 μΜ em tampão directo lx final (Tris 100 mM pH 8,4; NaCl 100 mM, CaCÍ2 5 mM, BSA a 0,01%), numa microplaca de polipropileno para armazenamento, da seguinte forma: para cada protease testada, prepararam-se 87,5 μΐ de uma solução 1,5 μΜ de TFPI misturando 13,1 μΐ de TFPI 10 μΜ com 17,5 μΐ de tampão de ensaio 5x e 56,9 μΐ de água destilada. Efectuaram-se diluições em série de 1:3 da solução de TFPI em tampão de ensaio lx, misturando 27,5 μΐ de TFPI em 55 μΐ de tampão de ensaio lx, de forma a produzir soluções contendo TFPI nas concentrações de 750 nM, 250 nM, 83,3 nM; 27,8 nM; 9,26 nM; 3,1 nM e 1,03 nM. O poço final da série continha apenas tampão directo lx como controlo.

Adicionaram-se 25 μΐ de cada diluição do TFPI a 2 poços (isto é, em duplicado) de 2 colunas da microplaca transparente de 96 poços contendo a mistura de FVIIa/TF, de modo que a mistura da protease foi testada em duplicado com cada uma das diluições do TFPI. Uma solução de tampão de ensaio lx sem TFPI também foi adicionada a 2 poços contendo a mistura de FVIIa/TF como controlo negativo. A microplaca foi brevemente agitada e depois foi centrifugada a 3000 rpm durante 5 minutos, antes da incubação a 372C durante 1,5 horas.

Uma solução-stock de Spectrazyme Vila (American Diagnostica) foi preparada por reconstituição de 50 pmoles em 5 ml de água destilada para 10 mM e armazenamento a 4°C até à utilização. Imediatamente antes da utilização, a solução foi diluída para 600 μΜ em água destilada. Após a incubação da microplaca referida acima, adicionaram-se 10 μΐ da solução diluída de Spectrazyme Vila a cada poço da microplaca de ensaio. As reacções foram misturadas e a placa foi incubada a 372C. O aumento da absorvância a 405 nm foi medido de 30 em 30 segundos durante uma hora a 372C, e a variação da absorvância foi calculada utilizando o software SoftMax Pro (Molecular Devices).

Para determinar o grau de inibição pelo TFPI, as variações da absorvância das reacções das proteases contendo o TFPI foram primeiro divididas pela variação da absorvância das reacções que não continham TFPI (a amostra de controlo) para obter a actividade residual, e determinou-se o logio de cada concentração de TFPI. Utilizando o software GraphPad Prism, representou-se graficamente o logio [TFPI] em função da actividade residual para cada protease e gerou-se uma curva dose-resposta, com um ajuste que assumiu os valores fixos de 1 e 0 para o máximo e o mínimo dos resultados da actividade, respectivamente. 0 software foi usado para determinar a inibição pelo TFPI como o valor log CI50 (pCIso) e também como o valor absoluto CI50 (inibição pelo TFPI em nM) para cada protease, determinando-se a sua média e desvio-padrão . 0 nível de inibição do TFPI sobre cada uma das variantes do FVIIa complexada com o sTF foi determinado e expresso como CI50 ou pCIso (Tabela 13) . A extensão em que o TFPI inibiu a actividade do FVIIa não modificado (CB553-02) complexado com o sTF também foi determinada, tendo-se obtido um valor de CI50 de 88 nM. Nove das variantes do FVIIa que foram produzidas apresentaram uma diminuição da potência da interacção com o TFPI, tal como reflectido pelos valores superiores de CI50.

Exemplo 8

Avaliação in vivo da actividade pró-coagulante do FVIIa de tipo selvagem

Um modelo de ratinho de hemofilia A foi estabelecido para avaliar a actividade pró-coagulante de polipéptidos do FVIIa. A hemofilia A foi induzida em ratinhos CD-I através da administração de anticorpos anti-FVIII, seguida de remoção cirúrgica das pontas das caudas para dar inicio à hemorragia. Os ratinhos foram depois tratados com polipéptido do FVIIa e o tempo que decorreu até pararem de sangrar, e a quantidade de sangue perdido durante este tempo, foi medido para determinar a actividade pró-coagulante dos polipéptidos do FVIIa.

Ratinhos CD-I machos foram anestesiados por administração intraperitoneal de Tiobarbital sódico a 100 mg/kg e cetamina a 100 mg/kg. Administrou-se lidocaina por injecção subcutânea na parte ventral do pescoço para reduzir a sensibilidade. A traqueia e a artéria carótida foram canuladas através de uma pequena incisão cutânea no pescoço, para facilitar a respiração sem restrições e a administração do anticorpo anti-factor VIII, do factor Vila humano recombinante (rhFVIIa) e/ou dos polipéptidos do FVII modificados.

Os ratinhos canulados receberam 3,76 mg de anticorpo de ovelha anti-FVIII humano (Affinity Biologicals, lote IG129R4, 612 UB/ml ratinho) em 40 μΐ. Esta dose foi determinada efectuando uma experiência inicial de dose-resposta com o anticorpo, usando 0,376; 0,94; 1,88 e 3,76 mg de anticorpo anti-FVIII humano, e avaliando a perda de sangue e o tempo de sangramento. Após 20 minutos, as caudas dos ratinhos foram colocadas em tubos de 15 ml contendo soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) a 39°C, durante um período de 10 minutos. Aos 30 minutos, as caudas foram brevemente retiradas da solução de PBS e os últimos 5 mm das mesmas foram cortados para dar início ao sangramento. Anotou-se o momento em que o sangramento teve início. As caudas foram devolvidas ao tubo contendo PBS a 39°C e permitiu-se que sangrassem durante 5 minutos (pré-sangramento) para garantir que os ratinhos tinham respondido ao anticorpo anti-FVIII. Após o pré-sangramento, os ratinhos receberam os polipéptidos do FVIIa ou o veículo no qual as proteínas FVIIa foram preparadas e administradas. Os polipéptidos do FVIIa foram diluídos em PBS ou num tampão constituído por cloreto de sódio 52 mM, cloreto de cálcio di-hidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polissorbato 80 a 0,01% e manitol 165 mM. As preparações do FVIIa foram administradas em doses de 1, 3 ou 10 mg/kg, num volume equivalente a 3 ml/kg, via a cânula da carótida, e as caudas foram colocadas em tubos novos contendo PBS a 39°C. O sangramento foi monitorizado durante um período de 20 minutos, e os tempos a que a hemorragia parou foram anotados. 0 tempo total de sangramento foi calculado como a soma da duração da hemorragia durante o pré-sangramento com a duração da hemorragia após a administração dos polipéptidos do FVIIa ou de PBS ou do tampão.

Para determinar a quantidade de sangue perdido durante os episódios hemorrágicos, o conteúdo dos tubos de 15 ml foi analisado relativamente ao teor de hemoglobina. Diluiu-se Triton X-100 de 1:4 em água estéril e adicionaram-se 100 μΐ a 1 ml das amostras para causar hemólise. A absorvância das amostras foi depois medida a um comprimento de onda de 54 6 nm. Para calcular a quantidade de sangue perdido, a absorvância foi lida contra uma curva de calibração construída por medição da absorvância a 546 nm de volumes conhecidos de sangue murino, diluído em PBS e submetido a hemólise com Triton X-100 como acima.

Foi efectuada uma experiência de comparação entre o rhFVIIa (CB533) produzido da forma descrita acima e o FVIIa humano recombinante disponível comercialmente (NovoSeven®, Novo Nordisk) , e a perda de sangue foi avaliada após a administração de uma dose de 3 mg/kg de cada proteína. A perda de sangue no grupo do veículo (tampão, n = 15) foi de 671,9 ± 57,89 μΐ ao longo do período de 20 minutos. Este valor foi reduzido pelo rhFVIIa produzido pela Catalyst Biosciences para 264,1 ± 56,59 μΐ e pelo NovoSeven® para 273,7 ± 53, 93 μΐ (n = 14) . Esta experiência demonstrou a equivalência entre as duas proteínas.

Exemplo 9

Análise farmacocinética de polipéptidos do FVIIa

As propriedades farmacocinéticas dos polipéptidos do FVIIa foram avaliadas através da medição da quantidade de factor Vila humano no plasma de ratinhos. Foram utilizados dois ensaios para quantificar o FVIIa no plasma. Um ensaio ELISA foi utilizado para quantificar a proteína FVIIa total no plasma de ratinhos e um ensaio de coagulação dependente do FVIIa (FVII:C) foi utilizado para quantificar a actividade coagulante dos polipéptidos do FVIIa no plasma. A. Administração dos polipéptidos do FVIIa a ratinhos

Os polipéptidos do FVIIa modificados e a proteína FVIIa humana recombinante não modificada (rhFVIIa) (NovoSeven®, Novo Nordisk) foram avaliados em estudos farmacocinéticos. Para cada estudo, 18 ratinhos CD-I machos foram injectados com uma dose em bolus intravenoso (0,1-3,0 mg/kg, dependendo do estudo) de rFVIIa. Aos 5, 15, 30, 60, 120 e 240 minutos após a injecção, três ratinhos de cada protocolo de injecção foram eutanasiados mediante asfixia com CO2 e foi recolhido cerca de 1,0 ml de sangue para uma seringa de 1,0 ml por meio de uma punção cardíaca percutânea. Cada seringa estava pré-carregada com uma quantidade suficiente de citrato de sódio para fornecer uma concentração final de 3,2% em 1 ml de sangue. As amostras de sangue foram depois centrifugadas a 9000 rpm durante 8 minutos, a 42C. O plasma foi retirado para tubos individuais de 1,5 ml (Eppendorf) rotulados, congelado instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80°C. Adicionalmente, um ratinho por experiência foi injectado apenas com veículo (controlo não activo - sham) e o plasma deste ratinho foi utilizado para a determinação da actividade do FVIIa do fundo.

B. Ensaio ELISA

Um kit disponível comercialmente, IMUBIND® Factor VII ELISA (American Diagnostica), foi utilizado para detectar a proteína FVII no soro por ELISA. Este kit utiliza uma microplaca pré-revestida com um anticorpo anti-FVII/FVIIa para capturar a proteína e um anticorpo anti-FVII biotinilado para efectuar a detecção através de uma peroxidase de rábano marcada com estreptavidina. O kit foi utilizado de acordo com as instruções dos fabricantes com as seguintes excepções: a curva de calibração foi encurtada para garantir uma zona de linearidade ao longo de todo o intervalo de concentrações e abrange as concentrações de 0,88 ng/ml a 10 ng/ml; segundo, a própria variante do FVIIa purificada foi utilizada para a curva de calibração, em vez do padrão de FVII fornecido com o kit, devido a diferenças na afinidade para o anticorpo. Experiências indicaram que o complexo do FVIIa com a antitrombina III (ATUI), um potencial inibidor plasmático do FVIIa, é detectado a 75% do nivel da protease livre, garantindo que o ensaio consegue detectar o FVIIa total na amostra de plasma em ambas as formas activa e inactiva.

Resumidamente, as amostras de plasma foram descongeladas à temperatura ambiente e diluídas de 1:10 em tampão de amostra (PBS + Triton X-100 a 0,1% + BSA a 1,0%) e, em seguida, diluídas em série de 1:5,5 para quatro diluições. As quatro amostras diluídas foram diluídas de 1:2 na microplaca de ELISA para diluições finais da amostra de 1:20, 1:110, 1:605 e 1:3327,5. Estas quatro diluições do plasma de ratinho abrangeram um intervalo de concentrações de protease de 33.000 ng/ml a 20 ng/ml. Cada amostra foi medida em duas microplacas de ensaio separadas, e aquelas medições dentro do intervalo da curva de calibração foram utilizadas para calcular a concentração da variante do FVIIa na amostra de plasma. C. Ensaio de coagulação

Um kit disponível comercialmente (STACLOT FVIIa-rTF, Diagnostica Stago, Parsippany, Nova Jérsia) foi utilizado como ensaio de coagulação. Para determinar a actividade coagulante dos polipéptidos do FVIIa activos, as amostras de plasma foram analisadas utilizando um ensaio de coagulação dependente do FVIIa (FVII:C). O ensaio foi efectuado utilizando os reagentes e instruções fornecidos num kit comercial, e o tempo de coagulação foi medido usando um instrumento de detecção electromecânica de coágulos (STArt4, Diagnostica Stago, Parsippany, Nova Jérsia). O kit foi utilizado de acordo com as instruções dos fabricantes com as seguintes excepções: primeiro, a própria variante do FVIIa purificada foi utilizada para a curva de calibração, em vez do padrão de rhFVIIa fornecido com o kit; segundo, os seguintes reagentes comerciais foram usados para estudos de rastreio farmacocinético de rotina e forneceram resultados comparáveis aos reagentes do kit: factor tecidual solúvel (CalBioChem, La Jolla, Califórnia) e mistura fosfolipídica sintética (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) , tampão TBSA (Tris-NaCl, pH 7,5 com BSA a 1%, DiaPharma, West Chester, Ohio) e solução de cloreto de cálcio 25 μΜ (Diagnostica Stago, Parsippany, Nova Jérsia). 0 ensaio de coagulação foi realizado da forma que se segue. As amostras de plasma congeladas foram descongeladas à temperatura ambiente durante aproximadamente 45 minutos e depois foram diluídas de 1:5000 em tampão. Cinquenta μΐ do plasma diluído foram combinados com 50 μΐ de plasma humano deficitário em factor VII e 50 μΐ de factor tecidual relipidado e pré-incubados durante 180 segundos. Após a pré-incubação, foram adicionados 50 μΐ de solução de cloreto de cálcio (25 μΜ) para iniciar a coagulação. O tempo de coagulação foi determinado utilizando a detecção electromecânica de coágulos. Cada amostra de plasma foi analisada em duplicado. O sistema foi calibrado por construção de uma curva de calibração, utilizando o tempo de coagulação de diluições em série de tampão contendo uma quantidade conhecida da variante do FVIIa específica que está a ser analisada. As concentrações de FVIIa nas amostras de plasma de ratinho foram calculadas a partir da porção linear da curva de calibração log FVIIa versus Log tempo de coagulação. A capacidade das amostras de plasma para induzir a coagulação em plasma deficitário em factor VII foi apresentada como ng FVIIa/ml de plasma de ratinho, após subtracção do fundo correspondente ao FVIIa de tipo selvagem endógeno no plasma dos ratinhos sham. A semivida de cada proteína FVII foi determinada de forma rotineira, fazendo um ajuste convencional do logaritmo natural da actividade para uma linha recta e medindo o tempo necessário para que a actividade das proteínas FVIIa seja reduzida para metade. No caso das proteínas FVII com um decaimento multiexponencial, a semivida foi determinada a partir da porção terminal do perfil log plasma versus tempo. Os parâmetros farmacocinéticos adicionais foram calculados usando software disponível comercialmente (WinNonLin v5.1, Pharsight Corporation, Mountain View, Califórnia). D. Propriedades farmacocinéticas de CB728, CB735 e CB945

Utilizando o protocolo descrito acima, foram avaliadas as propriedades farmacocinéticas do FVIIa de tipo selvagem e de duas variantes do FVIIa: CB728, CB735 e CB945. Os resultados estão apresentados na Tabela 14. As variantes CB735 e CB945 apresentaram parâmetros farmacocinéticos melhorados em comparação com o FVIIa de tipo selvagem

Tabela 14. Parâmetros farmacocinéticos de variantes do FVIIa em ratinho

E. Propriedades farmacocinéticas de CB558 A semivida de um polipéptido do FVIIa modificado que exibiu uma resistência acrescida ao TFPI (CB-558; contendo uma mutação K197E) foi medida e comparada com a semivida de uma proteína FVIIa humana recombinante não modificada (rhFVIIa) (NovoSeven®, Novo Nordisk), num estudo farmacocinético idêntico ao descrito acima com algumas modificações. Quinze ratinhos CD-I machos foram injectados com uma dose de 0,5 mg/kg em bolus intravenoso de CB-558 e 15 ratinhos foram injectados com uma dose de 0,5 mg/kg em bolus intravenoso de rhFVIIa. Aos 5, 15, 30, 60 e 120 minutos após a injecção, três ratinhos de cada protocolo de injecção foram eutanasiados mediante asfixia com CO2 e foi recolhido cerca de 1,0 ml de sangue para uma seringa de 1,0 ml por meio de uma punção cardíaca percutânea. Cada seringa estava pré-carregada com uma quantidade suficiente de citrato de sódio para fornecer uma concentração final de 3,2% em 1 ml de sangue. As amostras de sangue foram depois centrifugadas a 9000 rpm durante 8 minutos, a 42C. O plasma foi retirado para tubos individuais de 1,5 ml (Eppendorf) rotulados, congelado instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80°C.

Para determinar a actividade coagulante e a semivida dos polipéptidos do FVIIa activos, as amostras de plasma foram analisadas na Machaon Diagnostics, Inc. (Oakland, California), utilizando um ensaio de coagulação dependente do FVIIa (FVII:C) e um coagulómetro automático (AMAX 190plus, Trinity Biotech). Resumidamente, as amostras de plasma congeladas foram descongeladas num banho de água a 31-C, durante 5 minutos, e depois foram diluídas de 1:40 em tampão Veronal. Seis μΐ do plasma diluído foram adicionados a 54 μΐ de tampão Veronal numa cuvete e misturados com uma esfera metálica. Uma quantidade igual (60 μΐ) de plasma humano deficitário em factor VII (Precision Biologic) foi depois adicionada à cuvete, que foi incubada a 372C durante 60 segundos com mistura constante.

Para dar início ao começo da cronometragem da reacção, foram adicionados 120 μΐ de tromboplastina (proveniente de cérebro de coelho; Thromboplastin-DS; Pacific Hemostasis) à cuvete, mantendo-se a mistura constante da mesma. A reacção de coagulação foi monitorizada de forma foto-óptica a 405 nm para detectar a formação de fibrina. O sistema foi calibrado analisando o tempo de coagulação de diluições em série de plasma de referência com níveis de FVII publicados (Precision Biologic), e analisando depois o tempo de coagulação de plasma de controlo normal (Precision Biologic) e de plasma de controlo anómalo (Precision Biologic). A capacidade das amostras de plasma para induzir a coagulação em plasma deficitário em factor VII foi indicada como uma percentagem do tempo de coagulação observado no plasma humano normal. A actividade coagulante do plasma de ambos os grupos de ratinhos tratados com FVIIa (NovoSeven®) e com CB-558 diminuiu com o tempo. A semivida de cada proteína FVII foi determinada fazendo um ajuste convencional do logaritmo natural da actividade para uma linha recta e medindo o tempo necessário para que a actividade das proteínas FVIIa seja reduzida para metade. Observou-se que a semivida do CB-558 foi aproximadamente o dobro da semivida do FVIIa (NovoSeven®): 156 minutos em comparação com 67 minutos.

Exemplo 10

Produção de variantes do FVII adicionais

Foram produzidos vários mutantes adicionais do FVII para alterar uma ou mais propriedades e/ou actividades do FVII. Além das modificações para aumentar a resistência ao TFPI, foram concebidas modificações para aumentar a resistência à AT-III, aumentar a actividade catalítica, aumentar a semivida e/ou aumentar a afinidade e/ou a ligação aos fosfolípidos, como aqueles nas plaquetas activadas. As modificações incluem a substituição, inserção e deleção de aminoácidos. Também foram geradas variantes do FVII contendo duas ou mais modificações. A Tabela 23 apresenta as variantes do FVII que foram geradas e expressas em células 293-F Freestyle™. As substituições de aminoácidos foram incorporadas nos polipéptidos do FVII utilizando os métodos descritos no Exemplo 2.B, acima, com um oligonucleótido apropriado. A Tabela 15 abaixo apresenta as variantes adicionais do FVII que foram geradas. Foram produzidas variantes de troca do domínio Gla do FVII, em que os resíduos de aminoácidos AI a Y44 (segundo a numeração do FVII maduro) na extremidade N-terminal da proteína FVII de tipo selvagem foram substituídos pelos resíduos de aminoácidos correspondentes ao domínio Gla do FIX, do FX, da proteína C, da proteína S ou da trombina. A variante do FVII "Gla Swap FIX" (isto é, um polipéptido do FVII em que o domínio Gla endógeno foi substituído pelo domínio Gla do FIX) contém os resíduos de aminoácidos A2 a Y45 da SEQ ID NO: 110 na extremidade N-terminal; a variante do FVII "Gla Swap FX" contém os resíduos de aminoácidos AI a Y44 da SEQ ID NO: 111 na extremidade N-terminal; a variante do FVII "Gla Swap Protein C" contém os resíduos de aminoácidos Al a H44 da SEQ ID NO: 113 na extremidade N-terminal; a variante do FVII "Gla Swap Protein S" contém os resíduos de aminoácidos Al a Y44 da SEQ ID NO: 114 na extremidade N-terminal; e a variante do FVII "Gla Swap thrombin" contém os resíduos de aminoácidos Al a Y44 da SEQ ID NO: 115 na extremidade N-terminal.

Tabela 15. Variantes do factor VII exemplares

Exemplo 11

Análise da actividade catalítica de variantes do FVIIa para o

substrato factor X A actividade catalítica das variantes do FVIIa para o substrato factor X (FX) foi avaliada indirectamente em dois tipos de ensaios cromogénicos, através da determinação da actividade do FXa, gerado por activação pelo FVIIa, sobre o substrato sintético Spectrafluor FXa. Os dois ensaios foram efectuados quer na presença quer na ausência de factor tecidual lipidado, para avaliar tanto a actividade dependente do TF como independente do TF. As variantes do FVII foram expressas, purificadas e activadas para FVIIa da forma descrita acima nos Exemplos 2 e 3. Embora a maioria das variantes do FVII tenham sido expressas apenas em células 293-F Freestyle™, algumas também foram expressas em células BHK-21.

Ensaio indirecto com factor tecidual lipidado A actividade catalítica das variantes do FVIIa na presença de factor tecidual foi avaliada utilizando o ensaio descrito no Exemplo 5 acima, com pequenas modificações. Uma dessas modificações foi a utilização de uma protease substrato factor X que tinha sido tratada com ERG-CMK e FFR-CMK para reduzir a actividade do fundo (Molecular

Innovations). Foram efectuados dois tipos de análises de dados utilizando dois ensaios separados: um ensaio de análise na zona de linearidade e um ensaio de análise na zona hiperbólica. 0 ensaio de análise na zona de linearidade utilizou uma gama de concentrações de factor X entre 0 e 150 nM para garantir uma medição correcta das constantes cinéticas na zona linear da curva de dose. Em contraste, o ensaio de análise na zona hiperbólica utilizou uma gama de concentrações de factor X entre 0 e 1,44 μΜ para garantir uma medição correcta das constantes cinéticas com uma curva de dose com saturação (hiperbólica). O ensaio indirecto na presença de factor tecidual lipidado com análise de dados na zona de linearidade foi efectuado essencialmente da forma descrita no Exemplo 5

acima, com as seguintes modificações. As soluções de variante do FVIIa/TF foram preparadas como soluções de FVIIa 0,1 nM/TF 0,4 nM e incubadas durante 30 minutos, antes de serem diluídas de 1:2 em TF 0,4 nM até à obtenção de uma solução contendo FVIIa 1,5625 pM/TF 0,4 nM. Vinte e cinco μΐ da solução de FVIIa/TF foram misturados com 25 μΐ de uma solução de substrato que continha Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) e uma das concentrações 300 nM, 200 mM, 133,3 nM; 88,9 nM; 59,3; 39,5 nM; 36,3 nM ou 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Assim, as concentrações finais para o ensaio foram FVIIa 0,8 pM; TF 0,2 nM; Spectrofluor FXa 0,5 mM e 150 nM, 100 mM, 66,7 nM; 44,4 nM; 29,6 nM; 19,8 nM; 13,2 nM ou 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) em 50 μΐ/poço. A curva de calibração do AMC, que serviu de factor de conversão de URF em μΜ nos cálculos subsequentes, foi expandida para incluir um intervalo de dose abrangendo concentrações de AMC de 0 μΜ a 100 μΜ. O ensaio indirecto na presença de factor tecidual lipidado com análise de dados na zona hiperbólica foi efectuado essencialmente da forma descrita no Exemplo 5 acima, com as seguintes modificações. As soluções de variante do FVIIa/TF foram preparadas como soluções de FVIIa 0,1 nM/TF 0,4 nM e incubadas durante 30 minutos, antes de serem diluídas de 1:2 em TF 0,4 nM até à obtenção de uma solução contendo FVIIa 1,5625 pM (ou 0,78 pM para as proteases com actividade elevada expectável)/TF 0,4 nM. Vinte e cinco μΐ da solução de FVIIa/TF foram misturados com 25 μΐ de uma solução de substrato que continha Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) e uma das concentrações 1440 nM, 720 mM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM ou 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Assim, as concentrações finais para o ensaio foram FVIIa 0,8 (ou 0,39) pM; TF 0,2 nM; Spectrofluor FXa 0,5 mM e 7 nM, 72 0 mM, 3 60 nM, 180 nM, 9 0 nM, 4 5 nM, 22,5 nM; 11,25 nM ou 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) em 50 μΐ/poço. Os parâmetros kcat e Km são calculados utilizando a equação hiperbólica de Michaelis-Menton com a forma (Vmax/ (1+ (Kmx) ) ) · A curva de calibração do AMC, que serviu de factor de conversão de URF em μΜ nos cálculos subsequentes, foi expandida para incluir um intervalo de dose abrangendo concentrações de AMC de 0 μΜ a 100 μΜ.

Para determinar as constantes cinéticas para a activação do FX pelo FVIIa ou uma variante do FVIIa, os dados em bruto recolhidos com a aplicação SoftMax Pro (Molecular Devices) foram exportados como ficheiros .XML. Foram efectuadas análises lineares e não lineares subsequentes dos dados com XLfit4, um pacote de software para ajuste automático das curvas e análise estatística dentro do ambiente de folha de cálculo do Microsoft Excel (IDBS Software).

Para os dados recolhidos utilizando o ensaio na zona de linearidade, as constantes cinéticas kcat/Km (M_1 s_1) são calculadas directamente a partir do declive das análises de regressão linear da concentração do FX em função da velocidade da clivagem do substrato fluorogénico (em μΜ/s2), em que kcat/Km = declive/[FVIIa] x 0,5 x k2. Utilizando o método descrito no Exemplo 5, o factor de correcção k2 foi calculado como sendo igual a 45; os valores das constantes cinéticas para a clivagem de Spectrofluor FXa pelo FXa, determinadas experimentalmente com FX activado (FXa) que foi previamente titulado ao nivel do seu sitio activo com ΑΤΙ I I /heparina, foram de kcat,Fxa = 56 s~2 e Km,Fxa = 126 nM. A exclusão dos valores que resultaram em valores de R2 inferiores a 0,98 garantiu a linearidade dos conjuntos de dados utilizados na rotina de ajuste.

As análises dos dados recolhidos utilizando o ensaio na zona hiperbólica foram calculadas a partir de análises de regressão não-linear da concentração do FX em função da velocidade da clivagem do substrato fluorogénico (em μΜ/s2) . Os parâmetros kcat e Km individuais são calculados como parâmetros de ajuste utilizando a equação hiperbólica de Michaelis-Menton com a forma (Vmax/ (l+(Km/x))), em que kcat = Vmax/ [FVIIa] x 0,5 x k2. A constante cinética kcat/KM foi calculada a partir dos parâmetros ajustados kcat e Km individuais.

Ensaio indirecto independente do factor tecidual A actividade catalítica das variantes do FVIIa na presença de factor tecidual foi avaliada num ensaio indirecto idêntico ao ensaio descrito acima, à excepção de o factor tecidual não ter sido incluído no ensaio. Assim, o ensaio para avaliar a actividade independente do TF foi efectuado essencialmente da forma descrita acima, com as seguintes modificações. As soluções das variantes do FVIIa foram diluídas para 50 nM. Vinte e cinco μΐ de cada solução de FVIIa foram misturados com 25 μΐ de uma solução de substrato que continha Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) e uma das concentrações 1050 nM, 700 mM, 466,7 nM; 311,1 nM; 207,4 nM; 138,3 nM; 92,2 nM ou 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Assim, as concentrações finais para o ensaio foram FVIIa 25 nM, Spectrofluor FXa 0,5 mM e 525 mM, 350 nM, 2 33,3 nM; 155,6 nM; 103,7 nM; 69,1 nM; 46,1 nM ou 0 nM de Factor X (Molecular Innovations) em 50 μΐ/poço. As análises dos dados foram efectuadas da forma descrita acima para o ensaio na zona de linearidade, sem modificações.

As Tabelas 16-18 apresentam os resultados dos ensaios que foram efectuados para medir a actividade catalítica das variantes do FVIIa. As Tabelas 15 e 16 fornecem a actividade catalítica medida num ensaio indirecto dependente do TF, utilizando polipéptidos do FVIIa expressos em células 293-F e em células BHK-21, respectivamente. A Tabela 17 fornece a actividade catalítica medida num ensaio indirecto independente do TF, utilizando polipéptidos do FVIIa expressos em células 293-F e/ou células BHK-21. Os resultados são apresentados como a constante cinética para a actividade catalítica, kCat/Km (M_1s_1) , e também são expressos como uma percentagem da actividade do FVIIa de tipo selvagem, em que a actividade é a actividade catalítica kCat/Km (M_1s_1) de cada variante do FVIIa para o seu substrato FX. A utilização da análise de dados na zona linear ou na zona hiperbólica também está indicada para os valores apresentados nas tabelas. Nem todas as variantes do FVIIa foram analisadas em cada um dos ensaios. Algumas das variantes do FVII analisadas no Exemplo 5, acima, apresentaram uma actividade catalítica para o FX ligeiramente diminuída ou acrescida neste conjunto de ensaios em comparação com o ensaio descrito no Exemplo 5. A diferença nas actividades em relação às observadas no Exemplo 5 deve-se provavelmente à actividade variável do fundo do FXa residual presente no substrato FX obtido de American Diagnostica. Várias variantes do FVIIa apresentaram uma actividade catalítica acrescida em comparação com a molécula FVIIa de tipo selvagem. Por exemplo, CB760, que contém a mutação Q366V, possui uma actividade catalítica entre 1,5 e 5 vezes superior à actividade do FVIIa de tipo selvagem.

Exemplo 12

Determinação da inibição de FVIIa/TF ou FVIIa por AT-III/heparina A potência da interacção entre o complexo AT-III/heparina e o FVIIa, na presença ou na ausência de factor tecidual solúvel (sTF) , isto é, dependente do TF ou independente do TF, foi avaliada medindo o nivel de inibição causado por várias concentrações de AT-III sobre a actividade catalítica do complexo FVIIa/sTF em relação a um substrato, Mesilo-FPR-ACC. 0 valor K0.5 foi determinado para cada variante do FVIIa testada, que corresponde à concentração molar de AT-III que foi necessária para causar uma inibição de 50% (CI50) da variante do FVIIa, num ensaio de 30 minutos à temperatura ambiente ( 25°).

Foram preparados dois ensaios em separado, um com TF e outro sem TF. Uma solução 2 μΜ de AT-111/heparina (heparina final 5 mM) foi preparada misturando 26,4 μΐ de AT-III 151,7 μΜ (AT-III humana purificada a partir do plasma; Molecular Innovations) com 50 μΐ de heparina (baixo peso molecular) 0,2 mM (CalBiochem), 400 μΐ de tampão de ensaio 5x (Hepes 100 mM, NaCl 750 mM, CaCl2 25 mM, BSA a 0,05%; PEG 8000 a 0,5%; pH 7.4) e 1,523 ml de água de qualidade reagente. Esta solução foi utilizada como a concentração mais elevada no ensaio dependente do TF. Uma solução contendo AT-III 4 μΜ/heparina (heparina final 5 mM) foi preparada para ser utilizada no ensaio independente do TF por mistura de 52,8 μΐ de AT-III 151,7 μΜ (Molecular Innovations) com 50 μΐ de heparina (baixo peso molecular) 0,2 mM (CalBiochem), 400 μΐ de tampão de ensaio 5x e 1, 497 ml de água de qualidade reagente. As soluções de AT-III/heparina foram incubadas durante 5-10 minutos à temperatura ambiente e depois foram diluídas de 1:2, numa microplaca de polipropileno de 96 poços profundos, com um volume final de 1 ml contendo heparina 5 μΜ, resultando em diluições de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5;

31,25 e 0 nM ou 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 0 nM. As variantes do FVIIa e o FVIIa de tipo selvagem foram diluídos para 250 nM em tampão de ensaio lx (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA a 0,01%; PEG 8000 a 0,1%; pH

7.4) . Para o ensaio dependente do TF, foram formados complexos FVIIa 5 nM/sTF 50 nM por mistura de 20 μΐ de FVIIa com 10 μΐ de sTF 5 μΜ (R&D Systems; factor de coagulação humano III: 2339-PA), 200 μΐ de tampão de ensaio 5x e 770 μΐ de água de qualidade reagente e incubação das soluções durante 10-15 minutos à temperatura ambiente. Para o ensaio independente do TF, 100 μΐ de FVIIa foram misturados com 200 μΐ de tampão de ensaio 5x e 70 0 μΐ de água de qualidade reagente para produzir soluções 25 nM de FVIIa. Para iniciar o ensaio, 25 μΐ das soluções do complexo FVIIa/TF ou do FVIIa sozinho foram misturados, em separado, com 25 μΐ de cada diluição de AT-III/heparina, em poços de uma microplaca preta de 96 poços com metade da área (Nunc). As condições finais de ensaio para o ensaio dependente do TF foram: FVIIa 2,5 nM/sTF 25 nM e concentrações de AT-IIl/heparina entre 1000 nM e 0 nM. Para o ensaio independente do TF, as concentrações de FVIIa foram 12,5 nM e as concentrações de AT-III/heparina variaram entre 2000 nM e 0 nM. As placas foram incubadas durante 30 minutos com agitação à temperatura ambiente ( 25 °C) .

Uma solução-stock do substrato do FVIIa (Mesilo-FPR-ACC) foi preparada por dissolução do substrato em DMSO para 20 mM, seguida da preparação de uma solução de trabalho 0,5 mM em tampão de ensaio lx. Após a incubação da microplaca de ensaio referida acima, foram adicionados 50 μΐ do substrato do FVIIa a cada poço da microplaca. As reacções foram misturadas, e a actividade residual do FVIIa foi avaliada seguindo as velocidades iniciais de clivagem do substrato durante 15 minutos, num leitor de fluorescência regulado para 30°C.

Para determinar o grau de inibição por AT-III/heparina para o FVIIa ou as variantes do FVIIa, os dados em bruto recolhidos com a aplicação SoftMax Pro (Molecular Devices) foram exportados como ficheiros .XML. Foram efectuadas análises não lineares subsequentes dos dados com XLfit4, um pacote de software para ajuste automático das curvas e análise estatística dentro do ambiente de folha de cálculo do Microsoft Excel (IDBS Software). O modelo da folha de cálculo foi utilizado para calcular a série de diluições da AT-III, a razão da AT-III para o FVIIa e as razões Vi/Vo para cada amostra replicada do FVIIa a cada concentração experimental da AT-III. As análises de regressão não linear da actividade residual do FVIIa (expressa como Vi/Vo) em função da concentração de AT-III foram processadas utilizando o XLfit4 e uma equação de inibição hiperbólica com a forma ( (C+(Amp* (1-(X/(K0.5+X) ) ) ) ) , onde C = offset (fixo no valor 0 para permitir a extrapolação dos conjuntos de dados que não atingem 100% de inibição no decurso do ensaio), Amp = amplitude do ajuste e K0.5, que corresponde à concentração de AT-III necessária para causar metade da inibição máxima nas condições do ensaio. Para várias variantes do FVIIa, a AT-III inibiu menos de 20-25% da actividade total da protease à concentração mais elevada de AT-III testada, que representa um limite superior de detecção para o ensaio. Às variantes com menos de 20-25% da inibição máxima foi, por conseguinte, atribuído um limite inferior do valor K0.5 (5 μΜ para dependente do TF e 10 μΜ para independente do TF) e, na maioria dos casos, é esperado que tenham resistências à ATUI superiores ao valor indicado.

As Tabelas 19 e 20 fornecem os resultados dos ensaios que foram efectuados utilizando variantes do FVIIa expressas em células 293-F FreestyleTM e/ou em células BHK-21, na presença e na ausência de TF, respectivamente. Os resultados são apresentados como o parâmetro K0.5 ajustado e como uma representação da extensão da resistência à AT-III para cada variante em comparação com o FVIIa de tipo selvagem, expressa como uma razão dos seus valores K0.5 ajustados (K0.5 variante/ K0.5 tipo selvagem). Várias variantes do FVIIa apresentaram uma resistência acrescida à AT-III em comparação com o FVIIa de tipo selvagem.

Tabela 19. Inibição de variantes do FVIIa por AT-III/heparina

na presença de TF

Tabela 20. Inibição de variantes do FVIIa por AT-IIl/heparina

na ausência de TF

Exemplo 13

Determinação da resistência de variantes do FVIIa ao TFPI A resistência de várias variantes do FVIIa ao TFPI avaliada utilizando o ensaio descrito no Exemplo 7 acima. A Tabela 21 apresenta os resultados dos ensaios. Os resultados são expressos como a resistência em vezes de cada variante do FVIIa ao TFPI em comparação com o FVIIa de tipo selvagem.

Exemplo 14

Avaliação in vivo da actividade pró-coagulante de polipéptidos do FVIIa

Foi estabelecido um modelo de ratinho de hemofilia A para avaliar a actividade pró-coagulante dos polipéptidos do FVIIa. A hemofilia A foi induzida em ratinhos CD-I através da administração de anticorpos anti-FVIII, seguida de remoção cirúrgica das pontas das caudas para dar inicio à hemorragia (idêntico ao procedimento descrito acima no Exemplo 8) . Também foram usados ratinhos deficitários em FVIII (ratinhos FVI1I-/-) , mas não foram tratados com os anticorpos anti-FVIII. Os ratinhos foram depois tratados com polipéptido do FVIIa, e a quantidade de sangue perdido em 20 minutos foi medida para determinar a actividade pró-coagulante dos polipéptidos do FVIIa. A. Análise da actividade coagulante do FVIIa em ratinhos CD-I com hemofilia A induzida

Foram efectuadas experiências iniciais para determinar a dose necessária, o tempo e a duração do efeito de anticorpos anti-FVIII humano quando são administrados pela via intraperitoneal para induzir hemofilia em ratinhos CD-I. Para o primeiro lote de anticorpo anti-FVIII (lote 1; Affinity Biologicals, lote IG129R4), isto baseou-se inicialmente na dose usada para as experiências de canulação descritas acima no Exemplo 8. A dose que causou um estado hemofílico (hemorragia descontrolada durante um período de 20 minutos do ensaio) foi de 7,54 mg/ratinho (80 μΐ de uma solução-stock 94,25 mg/ml). Este lote tinha uma actividade neutralizante de 612 UB/ml ratinho. Para o segundo lote de anticorpo anti-FVIII humano (lote 2; Affinity Biologicals, lote IG1577R2, actividade neutralizante de 474 UB/ml ratinho), a dose utilizada foi de 11,98 mg/ratinho (120 μΐ de uma solução-stock 99,8 mg/ml) e foi administrada 6 horas antes do corte da cauda.

Para induzir hemofilia, os ratinhos CD-I machos (25-35 g) receberam por via intraperitoneal o lote 1 ou o lote 2 de anticorpo anti-FVIII antes da experiência. Os ratinhos CD-I machos e os ratinhos FVIII_/_ foram anestesiados por administração intraperitoneal de um cocktail de cetamina/xilazina (solução 100 mg/ml) e colocados numa plataforma aquecida (39°C) para garantir que não ocorria abaixamento da temperatura corporal. A sala do procedimento foi mantida a uma temperatura de 27,8 2C (82°F). Dez minutos antes do corte da cauda, esta foi mergulhada em 10 ml de PBS pré-aquecido (tubo de centrífuga de 15 ml, 392C). Oito a dez ratinhos foram injectados com FVIIa humano recombinante (Novoseven®, Novo Nordisk) ou com polipéptidos do FVII modificados diluídos num tampão constituído por cloreto de sódio 52 mM, cloreto de cálcio di-hidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polissorbato 80 a 0,01% e manitol 165 mM, via a veia da cauda numa injecção única. Também foi injectado apenas veículo num grupo de ratinhos como controlo. Quando a injecção falhou, o animal foi excluído do estudo. A injecção com o agente de teste ou com o veículo foi efectuada 5 minutos antes do corte da cauda. O corte da cauda foi feito utilizando uma lâmina de barbear a 5 mm do final da cauda, e o sangue foi recolhido em PBS durante um período de 20 minutos. No final do período de recolha, a perda total de sangue foi avaliada. Os tubos de recolha foram misturados e foi recolhida uma alíquota de 1 ml de cada amostra, que foi analisada quanto ao teor de hemoglobina. Diluiu-se Triton X-100 de 1:4 em água estéril e adicionaram-se 100 μΐ às amostras de 1 ml para causar hemólise. A absorvância das amostras foi depois medida a um comprimento de onda de 54 6 nm. Para calcular a quantidade de sangue perdido, a absorvância foi lida contra uma curva de calibração construída por medição da absorvância a 546 nm de volumes conhecidos de sangue murino, diluído em PBS e submetido a hemólise com Triton X-100 como acima.

Foi também efectuado um estudo dose-resposta no qual foram avaliadas doses de 0,3; 1 ou 3 mg/kg de CB553 (FVIIa tipo selvagem). Os ratinhos que receberam o veículo perderam 1002,3 ± 60,71 μΐ no ensaio de 20 minutos. Este valor foi reduzido de forma significativa em ratinhos que receberam 3 mg/kg de CB553, para 415,5 ± 90,85 μΐ (p < 0,05 utilizando o teste de Kruskal-Wallis, seguido de pós-teste de Dunn). A redução da dose para 1 mg/kg resultou numa perda de sangue de 679,57 ± 83,95 μΐ e uma dose mais baixa de 0,3 mg/kg resultou numa perda de sangue de 852,42 ± 94,46 μΐ.

Num estudo separado, o CB735 (K341D) e o CB945 (M298Q/K341D) foram avaliados numa dose de 3 mg/kg. A injecção apenas com veículo foi utilizada como controlo. Os grupos de ratinhos que receberam apenas o veículo perderam entre 803 ± 92,18 μΐ e 813,1 ± 82,66 μΐ de sangue no ensaio de 20 minutos. Isto foi idêntico ao tratamento com CB735 ou CB945, que resultou numa perda de sangue de 746 ± 110,5 μΐ e 870,9 ± 78,38 μΐ, respectivamente. B. Análise da actividade coagulante do FVIIa em ratinhos FViii-/-

Um modelo de ratinho de hemofilia A utilizando ratinhos deficitários em FVIII (ratinhos FVIII-/-) também foi usado para avaliar a actividade coagulante de polipéptidos do FVIIa, usando os mesmos protocolos descritos acima à excepção de os ratinhos não terem sido tratados com os anticorpos anti-FVIII. 1. Estudo dose-resposta avaliando a actividade coagulante do FVIIa de tipo selvagem

Foram efectuados estudos dose-resposta para avaliar a actividade coagulante de NovoSeven® e CB553 em ratinhos FVIII-/- nas doses de 0,3; 1, 3 e 6 mg/kg. Na experiência com NovoSeven®, a perda de sangue no grupo do veículo foi de 912,79 ± 38,32 pL, que foi reduzida de forma significativa pelo tratamento com NovoSeven® nas doses de 6 e 3 mg/kg (para 361,74 ± 55,28 μΐ e 586,98 ± 60,56 μΐ; p < 0,05 utilizando o teste de Kruskal-Wallis, seguido de pós-teste de Dunn). A redução da dose para 1 mg/kg resultou numa perda de sangue de 674,84 ± 46,88 μΐ e à dose mais baixa testada, o valor foi de 801, 08 ± 41,39 μΐ. Na experiência com CB553, o grupo de controlo com veículo produziu uma perda de sangue de 904,08 ± 15,38 μΐ. Este valor foi reduzido de forma significativa (p < 0,05 utilizando o teste de Kruskal-Wallis, seguido de pós-teste de Dunn) pelo CB553 na dose de 6 mg/kg, para 451,04 ± 74,17 μΐ. A redução da dose para 3 mg/kg produziu um valor de perda de sangue de 695,75 ± 60,50 μΐ, ao passo que a redução adicional da dose para 1 e 0,3 mg/kg resultou em valores de perda de sangue próximos e equivalentes aos níveis do controlo com veículo (846,08 ± 34,17 μΐ e 936,43 ±31,39 μΐ, respectivamente).

Exemplo 15

Determinação da ligação do factor Vila ao factor tecidual solúvel A capacidade das variantes do FVIIa, expressas em células HEK 293 ou BHK, para ligarem o factor tecidual solúvel (sTF) foi avaliada utilizando ressonância de plasma de superfície Biacore. As variantes do FVIIa são avaliadas através de medição do perfil de ligação a três concentrações de protease, em duas experiências duplicadas, utilizando duas quantidades diferentes de sTF imobilizado num chip CM5 Biacore.

Um chip sensor CM5 Series S novo (GE Healthcare Cat n.2 BR1006-68) foi acoplado com albumina sérica de bovino e factor tecidual solúvel, utilizando um instrumento Biacore T100. O acoplamento foi realizado utilizando tampão de acoplamento Biacore (Na Hepes 30 mM pH 7,4; NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 a 0,01%) com um kit de acoplamento de aminas (GE Healthcare Cat n.2 BR-1000-50) e o assistente de protocolo no software Biacore T100. Para a imobilização, utilizaram-se as quatro células do chip. As células 1 e 3 foram acopladas com 500 unidades de resposta (UR) da proteína de referência albumina sérica de bovino diluída em tampão acetato, pH 4,0; e as células 2 e 4 foram acopladas com 500 e 250 UR de sTF (R&D Systems) diluído em tampão acetato, pH 4,5.

Cada variante do FVIIa, e a protease FVIIa de tipo selvagem, foi testada a três concentrações diferentes e em duplicado. As proteases foram diluídas para 60 nM, 30 nM e 15 nM em 100 μΐ de tampão de ensaio Biacore (Na Hepes 200 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 a 0,1%, BSA a 0,1%, Tween-20 a 0,01%), numa microplaca de 96 poços. Cada amostra foi analisada no instrumento Biacore T100 utilizando 120 segundos de tempo de contacto, seguido de 180 segundos de tempo de dissociação com um caudal de 10 μΐ/min. Também foi analisado um branco de tampão. O chip foi regenerado com EDTA 50 mM, pH 7,0 durante 60 segundos e depois 30 segundos. O ensaio para medir a ligação do FVIIa de tipo selvagem ao sTF deverá originar três conjuntos de curvas que fornecem uma Kd de aproximadamente 8 nM. O software de avaliação Biacore T100 foi utilizado para analisar os dados. Especificamente, foi usada a análise de cinética/afinidade 1:1 ligação, que ajusta os dados à isotérmica de Langmuir, e os dados foram ajustados individualmente para duas réplicas de cada variante a acoplamentos com duas unidades de resposta. Foi calculada a média dos quatro valores Kd ajustados, que é apresentada na Tabela 22. Os polipéptidos do FVIIa contendo a mutação M156Q tiveram tendência para resultados mais baixos de Kd e, por conseguinte, ligam-se mais fortemente ao sTF.

Exemplo 16

Rastreio de variantes do FVIIa quanto a resistência ao TFPI por ressonância de plasma de superficie (SPR) A resistência relativa de várias variantes do FVIIa à inibição pelo TFPI solúvel humano recombinante foi avaliada utilizando um ensaio por ressonância de plasma de superficie (SPR) de alto rendimento, com o instrumento Biacore T100. A resistência relativa das variantes do FVIIa à inibição pelo TFPI foi avaliada por medição da quantidade relativa de variante do FVIIa ligada ao TFPI solúvel, imobilizado num chip sensor CM5 Biacore, em comparação com a quantidade de FVIIa de tipo selvagem ligado, após uma concentração de protease e um tempo de injecção padronizados.

Para cada experiência, o TFPI solúvel (R&D Systems) foi imobilizado num chip sensor CM5 Biacore Series S de 4 células novo (GE Healthcare), utilizando o protocolo de acoplamento de aminas disponível no software de controlo Biacore T-100 (GE Healthcare) e os reagentes fornecidos com o kit de acoplamento de aminas (GE Healthcare). Utilizou-se a totalidade das quatro células de fluxo disponíveis para a imobilização de duas densidades diferentes de TFPI e albumina sérica de bovino (BSA), que serviu de agente de bloqueio nas células de referência. A BSA foi diluída para 5 pg/ml em acetato de sódio (pH 4,0) e imobilizada nas células de fluxo 1 e 3 a 1000 e 2000 unidades de resposta (UR), respectivamente. Para a imobilização do TFPI, o TFPI solúvel liofilizado (10 pg) foi ressuspenso em 100 μΐ de tampão de acoplamento lx (Hepes 30 mM, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 a 0,01%, pH 7,4) para uma concentração de 0,1 mg/ml. Um total de 20 μΐ de TFPI 0,1 mg/ml foram diluídos para 10 pg/ml em acetato de sódio, pH 4,0; para imobilização nas células de fluxo 2 e 4 a 1000 e 2000 UR, respect ivamente. O tampão de acoplamento foi utilizado como tampão de corrida durante os passos de imobilização.

Cada amostra de FVIIa foi preparada numa concentração final de 320 nM em tampão de corrida lx (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 a 0,1%, BSA a 0,1%, Tween-20 a 0,01%, pH 7,4) contendo sTF 620 nM (factor de coagulação humano III, R&D Systems) . Em geral, cada variante do FVIIa foi diluída de 1:10 em tampão de corrida lx antes da diluição final de 320 nM. Os complexos FVIIa/sTF foram preparados num volume final de 120 μΐ, em duplicado, permitindo que um máximo de 48 variantes do FVIIa distintas fossem carregadas numa microplaca para armazenamento de 96 poços e avaliadas com injecções em duplicado, num único ciclo. O complexo FVIIa/sTF foi incubado à temperatura ambiente durante 10-15 minutos antes de ter início a primeira injecção da amostra.

Foi criado um método de análise da ligação padronizado dentro do software de controlo Biacore (GE Healthcare), no qual todas as réplicas do FVIIa são injectadas durante 180 segundos de tempo de associação, seguido de uns curtos 60 segundos de dissociação, com um caudal de 10 μΐ/min. A regeneração do chip sensor sucedeu à fase de dissociação durante 30 segundos, com glicina 10 mM, NaCl 500 mM, pH 3,0, e depois teve lugar um período de estabilização de 60 segundos com tampão de corrida lx, com o mesmo caudal de 10 μΐ/min. Foram registados dois pontos de referência do ensaio para cada ciclo e subsequente análise dos dados: um 5 segundos antes da conclusão da fase de associação (ligação) e um segundo 5 segundos antes da conclusão da fase de dissociação (dissociação). Antes de iniciar um ensaio completo, o chip sensor foi testado com uma injecção única de FVIIa de tipo selvagem 320 nM/sTF durante 180 segundos, que deverá dar uma resposta de aproximadamente 400-450 UR e 750-850 UR para a ligação às células de fluxo 2 (1000 UR) e 4 (200 UR), respectivamente. A análise dos resultados foi efectuada primeiro com o software de avaliação Biacore T100 (GE Healthcare) para inspeccionar os parâmetros de validação do ensaio, que incluem verificar que a liqação à célula de referência é mínima, o desvio da linha de base e a ligação das injecções do branco de controlo (tampão de corrida). Foram geradas tabelas de dados dentro desta aplicação que indicaram a quantidade de variante do FVIIa ligada (em UR) tanto no ponto de referência da ligação como no ponto de referência da dissociação. As tabelas de dados foram subsequentemente exportadas para análise adicional no ambiente de folha de cálculo do Microsoft Excel. Os valores medidos em bruto (ligados a UR) foram corrigidos em relação à ligação do controlo ao chip sensor e, em seguida, retirou-se uma razão da quantidade de FVIIa de tipo selvagem ligado (em UR) para a quantidade de variante do FVIIa ligada (em UR) para cada parâmetro, que foi indicada como Ligação (wt/variante) e Dissociação (wt/variante). A resistência à inibição pelo TFPI é reflectida como um aumento da razão para um ou para ambos os parâmetros avaliados. Por exemplo, um valor de Ligação (wt/variante) ou de Dissociação (wt/variante) igual a 20 para uma variante do FVIIa particular indica que essa variante é 20 vezes mais resistente à inibição pelo TFPI do que o FVIIa de tipo selvagem. Várias variantes apresentaram uma resistência acrescida à inibição pelo TFPI. Por exemplo, CB609, CB637, CB691, CB856 e CB857 estão entre o grupo que apresentou uma resistência de 20 a 60 vezes. As variantes contendo a mutação K341D de acordo com a numeração do FVII maduro (correspondendo a segundo a numeração da quimiotripsina), como CB735, possuem razões que indicam uma resistência significativa ao TFPI (mais de 50-150 vezes) e uma variante contendo a mutação K192D (9CB945) possui uma razão que indica uma resistência significativa ao TFPI (mais de 40-150 vezes). Em alguns casos, a velocidade de dissociação foi mais afectada do que a velocidade de associação. Alguns exemplos de variantes que apresentaram este perfil são CB735, CB854, CB855, CB856 e CB857.

Tabela 23. Resistência das variantes do FVIIa à inibição pelo TFPI

Exemplo 17

Determinação da concentração de protease cataliticamente activa utilizando o titulante de sitios activos p'-guanidinobenzoato de 4-metilumbeliferilo (MUGB) A concentração de FVIIa cataliticamente activo numa solução-stock foi determinada por titulação de um complexo de FVIIa e factor tecidual solúvel (sTF) com p'- guanidinobenzoato de 4-metilumbeliferilo (MUGB), um substrato éster fluorogénico desenvolvido como um titulante de sítios activos para as proteases de serina de tipo tripsina. 0 ensaio foi efectuado essencialmente da forma descrita por Payne et al. (Biochemistry (1996) 35:7100-7106) com algumas pequenas modificações. O MUGB reage prontamente com o FVIIa, mas não com o FVII ou protease inactiva, para formar um intermediário acil-enzima efectivamente estável em condições em que a concentração de MUGB é saturante e a desacilação é especialmente lenta e limitante da velocidade para a catálise. Nestas condições, a protease FVIIa sofre um único turnover catalítico para libertar o fluoróforo 4-metilumbeliferona (4-MU). Quando o pico inicial de fluorescência é calibrado numa curva de calibração externa da fluorescência de 4-MU, a concentração de sítios activos pode ser calculada.

Os ensaios foram efectuados com um volume de reacção de 2 ml, numa cuvete de quartzo 1 cm x 1 cm, com agitação contínua. Cada reacção continha sTF 0,5 μΜ (R&D Systems Human) num tampão de ensaio contendo Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM e PEG 8000 a 0,1%, pH 7,6. A solução padrão de 4-MU foi preparada de novo com uma concentração de 0,5 M em DMSO (solução-stock) e a concentração foi confirmada por espectroscopia de absorvância a 360 nm, utilizando um coeficiente de extinção de 19.000 M_1 cm-1 em tampão Tris 50 mM, pH 9,0. A solução-stock de MUGB foi preparada com uma concentração de 0,04 M em DMSO com base no peso seco. Os ensaios foram iniciados pela adição de 4 μΐ de MUGB 4 mM (concentração final 8 μΜ) a uma solução de sTF 0,5 μΜ (20,2 μΐ de sTF 49,4 μΜ) em tampão de ensaio lx e medindo primeiro a hidrólise do fundo do MUGB durante -150-200, antes da adição do FVIIa ou variante do FVIIa para uma concentração final de -100-200 nm com base no ensaio ELISA inicial (Exemplo 2C.1) ou na titulação de sítios activos com FFR-CMK (Exemplo 6). A libertação da fluorescência de 4-MU na fase de irrupção da reacção foi seguida durante 1000-1200 segundos adicionais. Preparou-se uma curva de calibração de 4-MU livre por titulação do 4-MU calibrado por absorvância em tampão de ensaio lx contendo sTF 0,5 μΜ, em degraus de 20 nM para uma concentração final de 250 nM.

Para análise dos resultados, os traçados da reacção foram importados para o pacote de software Graphpad Prism, e a contribuição da hidrólise do fundo foi subtraída da curva por extrapolação da velocidade inicial da hidrólise espontânea do MUGB medida, que foi tipicamente inferior a 5% do pico de fluorescência total. A curva corrigida foi ajustada a uma equação exponencial simples com uma componente linear (para considerar a velocidade de desacilação lenta) da forma Fluorescência = Amp (1=¾)+Bt, onde Amp = amplitude da fase de irrupção nas condições de ensaio saturantes descritas acima, k é a constante de velocidade de primeira ordem observada para a formação da acil-enzima e B é uma constante de velocidade associada ao turnover completo de MUGB. A concentração da protease FVIIa activa é calculada por comparação do parâmetro de ajuste para a amplitude com a curva de calibração do fluoróforo 4-MU. Foram medidos os valores de múltiplos ensaios, tendo-se calculado a sua média e determinado o desvio-padrão.

Uma vez que serão evidentes modificações para os peritos na especialidade, é pretendido que este invento seja limitado apenas pelo âmbito das reivindicações anexas. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Catalyst Biosciences, Inc.

Edwin Madison Christopher Thanos Sandra Waugh Ruggles Shaun Coughlin

<12 0> POLIPÉTIDOS DO FACTOR VII MODIFICADOS E SUAS UTILIZAÇÕES

<130> 119357-00067/4913PC <140> Ainda não atribuído <141> Incluso <150> 60/923,512 <151> 2004-04-13 <160> 250 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor do factor VII - isoforma a <4 Ο 0> 1

Met Val Ser Gin Ale Lew Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 . 25 r 30 .

Arg Asp Met Pro Tip Lys Pro Gly Pro Hifl Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO SS 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp GLn Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

LyS Asp Asp Gin Leu Tie Cya Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cya Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ber Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 160 1S5 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 2D5

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu Tie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Aen Leu-He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 2 B0 2B5 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Agp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu lieu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 3 B0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cye Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 4 55 460

Phe Pro 465

<210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor do factor VII - isoforma b <400> 2

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 15 40 4$

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu

50 55 SO

Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu phe Trp lie 65 7 0 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly 85 90 95

Gly Sex Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie 115 120 125

Cys val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr'Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie 165 170 175

Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val 180 185 190

Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu 195 200 205

Leu val Aan Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie 21b 215 220

Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240

Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 245 250 255

Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr 260 265 270

Val Pro Gly Thr Thr Asn His Aep He Ala Leu Leu Arg Leu Hia Gin 275 280 285

Pro Val Val Leu Thr Asp His Val val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300

Thr Phe Ser Glu Axg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320

Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335

Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 340 345 350

Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365

Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly

370 375 3 BO

Pro Hie Ala Thr Hie Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val 385 390 395 400

Ser Trp Gly Glh Gly Cys Ala Thr Val Gly Hie Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415

Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu 420 425 430

Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 435 440

<210> 3 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Factor Vila <400> 3

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lye Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Aap Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp *0 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

55 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Tie Pro Tie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val Cy3 pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 130

His Cys Phe Asp Lye He Lys Asn Trp Arg Asn Leu tie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He He Pro £er Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Aap Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lye Asp Ser Cys Lys Gly Aap Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 3SC 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser. Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 4 <211> 447 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0>

<223> Precursor do factor VII <4Ο0> 4

Met Leu ser Gin Ala Trp Ala Leu Ala Leu Leu Cye Phe Leu Leu Ser IS 10 15

Leu Trp Gly Ser Leu Pro Ala Val Phe Leu Pro Gin Glu Gin Ala Leu 20 25 30

Ser He Leu His Arg Pro Arg Arg Ala Asn Gly Phe Leu Glu Glu Leu 35 40 45

Leu Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Arg Glu Glu Leu Cys Ser Phe 50 55 60

Glu Glu Ala Mis Glu Zle Phe Arg Asn Glu Glu Arg Thr Arg Gin Phe

65 70 75 BO

Trp Val Ser Tyr Asn Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin 95 SO 35

Asn Gly Gly Ser Cys Glu Asp Gin Leu Arg Ser Tyr lie Cys Phe Cys 100 105 110

Pro Asp Gly Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Tbr Asp Lys Gin Ser Gin 115 120 125

Leu lie Cya Ala Asn Asp Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cya Gly Ala 130 135 140

Asp Pro Gly Ala Gly Arg Phe Cys Trp Cye HÍ3 Glu Gly Tyr Ala Leu 145 150 155 160

Gin Ala Asp Gly Val Ser Cys Ala Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly 165 170 175

Lys He Pro Val Leu Glu Lys Arg Asn Gly Ser Lys Pro Gin Gly Arg 180 185 130

He Val Gly Cly His Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala 195 200 205

Met Leu Lys Leu Asn Gly Ala Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu Val Gly 210 215 220

Pro Ala Trp val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Glu Arg Leu Arg Ser 225 230 235 240

Arg Gly Asn Leu Thr Ala Val Leu Gly Glu Mis Asp Leu Ser Arg Val 245 250 255

Glu Gly Pro Glu Gin Glu Arg Arg Val Ala Gin lie lie Val pro Lys 260 265 270

Gin Tyr Val Pro Gly Gin Thr Asp His Asp Val Ala Leu Leu Gin Leu 275 280 2B5

Ala Gin Pro Val Ala Leu Gly Asp His Val Ala Pro Leu Cys Leu Pro 230 295 300

Asp Pro Asp Phe Ala Asp Gin Thr Leu Ala phe Val Arg Phe Ser Ala 305 310 315 330

Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Glu Arg Gly Val Thr Ala Arg Lys 325 330 335

Leu Met Val Val Leu Val Pro Arg Leu Leu Thr Gin Asp Cys Leu Gin 340 345 350

Gin Ser Arg Gin Arg Pro Gly Gly Pro Val Val Thr Asp Asn Met Phe 355 3SO 36S

Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser 370 375 380

Gly Gly Pro His Ala Thr Arg Phe Arg Gly Thr Trp Phe Leu Thr Gly 365 390 395 400

Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Ala Gly Hia Phe Gly lie 405 410 415

Tyr Thr Arg Val Ser Arg Tyr Thr Ala Trp Leu Arg Gin Leu Met Gly 420 425 430

His Pro Pro Ser Arg Gin Gly Phe Phe Gin Val Pro Leu Leu Pro 435 440 445

<210> 5 <211> 446 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0>

<223> Precursor do factor VII <4Ο0> 5

Met. Val Pro Gin Ala His Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Leu Leu Gin 15 10 15

Leu Gin Gly Pro Leu Gly Thr Ala Val Phe lie Thr Gin Glu Glu Ala 20 25 30

His Gly Val Leu His Arg Gin Arg Arg Ala Asn ser r.eu Leu Glu Glu 35 40 45

Leu Trp Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Asn Glu Glu Gin Cys ser SO 55 €0

Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Ser Pro Glu Arg Thr Lys Gin 65 70 75 80

Phe Trp lie Val Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys 85 90 95

Gin Asn Gly Gly Thr Cys Gin Asp His Leu Lys Ser Tyr Val Cys Phe 100 105 110

Cys Leu Leu Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Lys Ser Lys Asn Glu 115 120 125

Gin Leu lie Cys Ala Asn Glu Asn Gly Asp Cys Asp Gin Tyr Cys Arg U0 135 140

Asp His val Gly Thr Lys Arg Thr Cys Ser Cys His Glu Asp Tyr Thr 145 150 155 160

Leu Gin Pro Asp Glu Val Ser Cys Lye Pro Lys Val Glu Tyr Pro Cys 165 170 175

Gly Arg He Pro Val Val Glu Lys Arg Asn ser ser Ser Arg Gin Gly 180 105 190

Arg lie Val Gly Gly Asn Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin 195 200 205

Ala Val Leu Lys lie Asn Gly Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Leu 210 215 220 aBp Ala Arg Trp lie val Thr Ala Ala His Cys Phe Asp Asn He Arg 225 230 235 240

Tyr Trp Gly Asn lie Thr Val Val Met Gly Glu His Asp Phe Ser Glu 245 250 255

Lys Asp Gly Asp Glu Gin Val Arg Arg Val Thr Gin Val He Met Pro 260 265 270

Asp Lys Tyr lie Arg Gly Lys lie Asn Hi a Asp He Ala Leu Leu Arg 275 * 280 285

Leu His Arg Pro Val Thr Phe Thr Asp Tyr Val Val Pro Leu Cys Leu 230 295 300

Pro Glu Lys Ser Phe Ser Glu Asn Thr Leu Ala Arg lie Arg Phe Ser 305 310 315 320

Arg Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu 325 330 335

Glu Leu Met Ser lie Glu Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu 340 345 350

Glu His Ala Lye His Ser Ser Asn Thr Pro Lys lie Thr Glu Aan Met 355 360 365

Phe Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Thr Lya Asp Ala Cys Lys Gly Aap 370 375 380

Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr 385 390 395 400

Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala He Gly Hie lie Gly 405 410 415

Val Tyr Thr Arg Val Set Gin Tyr lie Asp Trp Leu Val Arg His Met 420 425 430

Asp Ser Lys Leu Gin Val Gly Val Phe Arg Leu Pro Leu Leu 435 440 445

<210> 6 <211> 466 <212> PRT <213> Pan paniscus <22 0>

<223> Precursor do factor VII <22 0> <221> INCERTO <222> (0) ... (0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <400> 6

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Glu Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hia Arg Val Phe lie Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 aO

Gin Cys Ser Fhe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Leu Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser- Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 no ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr US 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys GLu Thr Tyr 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 100 155 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Asn Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 2C5

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Fro Trp Gin Xaa Leu Leu Xaa Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Ala Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr He Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pró 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Ala Phe Ser Glu Arg Thr Lev Ala Phe val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Fro Asn He Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Fhe Cya Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 3 90. 395 4 00

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Ser Val Gly 420 425 430

His'Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <213> Pan troglodytes <22 0>

<210> 7 <211> 466 <212> PRT <223> Precursor do factor VII <22 0> <221> INCERTO <222> (0) ... (0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <400> 7

Met Val Ser (3In Ala Leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 lb

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Glu Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Xaa Xaa Trp Lys Pro Gly Pro Kis Arg Val Phe lie Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO 55 SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cya Lys Glu Glu 65 70 75 00

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Leu Glu Arg 05 90 95

Thr Lya Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Αθρ Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Aen Cya Glu Thr Tyr 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu Tie Cys Val Asn Glu Aen Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala A Bp Gly Val Ser Cya Thr Pro ,Thr Val Glu 100 ' 1B5 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Aan Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 2S0 255

Lys lie Lys Aen Trp Arg Asn Leu He Ala val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu Hie Asp Gly Asp Glu Gin ser Arg Arg Val Ala Gin val 275 280 285 lie lie Pro ser Thr Tyr lie Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg L*u Hia Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Ala Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe aer Leu val ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 39S 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Mis Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Ser Val Gly 430 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu pro Arg pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 8 <211> 444 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <22 0> <223> Precursor do factor VII <400> 8

Met Ala Pro Gin Ala Arg Gly Leu Gly Leu Cya Ser Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15

Gin Ala Ser Leu Ala Ala Val Phe lie Thr Gin Glu Glu Ala His Ser 20 25 30

Val Leu Arg Arg Gin Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg 35 40 45

Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Leu Cys Ser Phe Glu 50 55 60

Glu Ala Arg Glu Val Phe Gin Ser Thr Glu Arg Thr Lys Gin Phe Trp 65 70 75 B0 lie Thr Tyr Asn Asp Gly Asp Gin Cys Ala ser Asn Pro Cys Gin Asn 85 90 95

Gly Gly Ser Cys Glu Asp Gin lie Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu 100 105 110

Ala Asp Phe Glu Gly Arg Αβη Cys Glu Lys Asn Lys Asn Asp Gin Leu 115 120 125 lie Cys Met Tyr Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His 130 135 140

Val Gly Ser Gin Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Thr Leu Leu 145 150 155 160

Pro Asn Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Asp Tyr pro Cys Gly Lys 165 170 175

Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Gly Ala Ser Asn Pro Gin Gly Arg lie 1B0 185 190

Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Ala 195 200 205

Leu Met Asn Gly 5er Thr Leu Leu Cya Gly Gly Ser Leu Leu Asp Thr 210 21S 220

His Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Leu Ser Sec Leu 225 230 235 240

Arg Asn Leu Thr lie Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Mis Glu 245 250 255

Gly Asp Glu Gin Val Arg His Val Ala Gin Leu lie Met Pro Asp Lys 1 -260 265 270

Tyr Val Pro Gly Lye Thr Asp His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu Leu 275 280 285

Gin Pro Ala Ala Leu Thr Asn Asn. Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu 290 29S 300

Arg Asn Phe Ser Glu Ser Thr Leu Ala Thr lie Arg Phe Ser Arg val 305 310 315 320

Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Tyr Arg Gly Ala Leu Ala Arg Glu Leu 325 330 335

Met Ala He Asp Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Val Glu Gin 340 345 350

Ser Glu His Lys Pro Gly Ser Pro Glu Val Thr Gly Asn Met Phe Cys 355 360 365

Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly 370 375 380

Gly Pro His Ala Thr Ser Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Val 385 390 395 400

Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Val Gly His Val Gly Val Tyr 4Q5 410 415

Thr Arg Val Ser Arg Tyr Thr Glu Trp Leu Ser Arg Leu Met Arg Ser 420 425 430

Lys Leu His His Gly He Gin Arg His pro Phe Pro 435 440

<210> 9 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <22 0> <223> Precursor do factor VII <400> 9

Met Val Pro Gin Thr His Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Phe Leu Leu Sin 15 10 IS

Leu Gin Gly Pro Leu Gly Ala Val Val Phe He Thr Gin Glu Glu Ala 20 25 30

His Gly Val Leu His Arg Gin Arg Arg Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu 35 40 45

Leu Trp Ser Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Asn Glu Glu Arg Cys Ser 50 55 6Q

Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Ser Pro Glu Arg Thr Lys Gin 65 70 75 B0

Phe Trp Thr lie Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Sçr Asn Pro Cys 85 90 99

Gin Asn Gly Gly Thr Cys Gin Asp Hits Leu Lys Ser Tyr Val Cys Phe 100 105 no cys Pro Leu Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Lys Asn Lys Asn Glu 115 120 125

Gin Leu lie Cys Ala Asn Glu Aen Gly Asp Cys Asp Gin Tyr Cys Arg 130 13 S 140

Asp His Val Gly Thr Lys Arg Thr Cys Ser Cys His Glu Asp Tyr Val 145 150 155 160

Leu Gin Pro Asp Glu Val Ser Cys Lys Pro Lys Val Glu Tyr Pro Cys 165 170 175

Gly Arg lie Pro Val Val Glu Lys Arg Asn Phe Ser Arg Pro Gin Gly 180 105 190

Arg lie Val Gly Gly Tyr Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin 195 200 205

Ala Val Leu Lys Phe Asn Glu Ala Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Leu 210 215 220

Asp Thr Arg Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Phe Gly 225 230 215 240

Lys Leu Val Asn Tie Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Phe Ser Glu 245 250 255

Lys Glu Gly Thr Glu Gin Val Arg Leu Val Glu Gin Val lie Met Pro 260 265 270

Asn Lys Tyr Thr Arg Gly Arg Thr Asp His Asp lie Ala Leu Val Arg 27S 2B0 23S

Leu His Arg pro Val Thr Phe Thr Asp Tyr Val val Pro Leu Cys Leu 290 295 300

Pro Glu Arg Ala Phe Ser Glu Asn Thr Leu Ala Ser lie Arg Phe Ser 305 310 315 320

Arg Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu 325 330 335

Glu Leu Met Val lie Glu Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu 340 34S 350

Glu His Ala Lye His Ser Ala Aen Thr Pro Arg lie Thr Glu Asn Met 355 360 365

Phe Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Thr Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp 370 375 350

Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr 365 390 395 400

Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala lie Gly Tie Gly 405 410 415

Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Asp Trp Leu Val Lys Tyr Met 420 425 430

Asp Ser Lys Leu Arg Val Gly lie Ser Arg Val Ser Leu Leu 435 440 445

<210> 10 <211> 469 <212> PRT <213> Macaca mulatta <22 0>

<223> Precursor do factor VII <4 Ο 0> 10

Met Val Ser Arg Ala Leu Gly Leu Leu cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly cys Leu Ala Ala Ala Thr Phe Leu Pro Gin Ala Gly Ser Leu Arg 20 25 30

Pro Gin Glu Glu Lys Thr Gin Asp Leu Leu Tip Lys Pro Gly Pro His 35 40 45

Arg Val Phe val Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Gin 50 55 60

Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu 65 70 75 80

Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He 85 90 95

Phe Lys Asp Leu Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp 1Ú0 105 110

Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gin Aan Gly Gly Ser Cys Lys 115 120 125

Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ser Phe Glu Gly 130 135 140

Arg Asn Tyr Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly 145 ISO 155 160

Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Ala Gly Ala Lys Arg Ser Cys Trp 165 170 175

Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Met Pro 180 185 190

Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn 195 200 205

Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Arg Val Cys Pro Lys 210 215 220

Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu 225 230 235 240 cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His 245 250 , 255

Cya Phe A3p Lys lie Lys Ser Trp Arg Asn Leu Thr Ala Val Leu Gly 260 265 270

Glu His Asp Leu Ser Glu Hie Glu Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val 275 280 285

Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr val Leu Gly Ala Thr Asn Hig 290 295 300

Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Gin Gin Prg Val Val Leu Thr Asp His 305 310 315 320

Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Met Phe Ser Glu Arg Thr Leu 325 330 335

Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp 340 345 350

Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Ala Leu Asn Val Pro Arg Leu 355 360 365

Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Gin Lys Ala Glu Ala sex Pro 370 375 380

Asn He Thr Glu Tyr Met Phe cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly ser Arg 385 390 395 400

Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Arg Tyr Arg 405 410 415

Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala 420 425 430

Ala Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu 435 440 445

Trp Leu Gin Lys Leu Met His Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu 450 455 " 460

Arg Ala Pro Phe Pro 465 <210> 11 <211> 445 <212> PRT <213> Sus scrofa <223> Precursor do factor VII (isoforma b) <22 0> <4 0 0> 11

Met Ala Ser Leu Arg Pro Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Cys Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Ser Leu Ala Ala Val Phe Val Gly His Glu Glu Ala His Ser Leu 20 25 10

Leu His Arg Phe Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Trp Pro 35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Arg Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60

Ala Arg Glu lie Phe Lys Ser Glu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Trp Val 65 70 75 60

Ser Tyr Asn Aap Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly

as 90 9S

Gly Ser Cys Glu Asp Gin Leu Gin Ala Tyr lie Cys Phe Cys Pro Glu 100 105 110

Gly Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr ash Lys Lys Ser Gin Leu lie 115 120 125

Cye Met Aan Asp Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Ala 110 135 140

Glu Ala Gly Arg ser cys Trp Cys His Glu Gly Tyr Ala Leu Gin Glu 145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Glu Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie 165 170 175

Pro Val Leu Glu Lys Arg Aan Asp Ser Asn Pro Gin Gly Arg lie Val 180 165 190

Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cye Pro Trp Gin Ala Met Leu 195 200 205

Lys Leu Lys Gly Ala Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu- Leu Asn Thr Ser 210 215 220

Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Aap Arg lie Arg Ser Trp Lys 325 230 235 240

Asp Leu Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Leu ser Lys Asp Glu Gly 245 250 255

Asp Glu Gin Glu Arg Pro Val Ala Gin Val Phe Val Pro Asp Lys Tyr 260 265 270 val Pro Gly Lys Thr Aap His Asp Leu Ala Leu val Arg Leu Ala Arg 275 280 285

Pro Val Ala Leu Thr Asp His val val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300

Ser Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe He Arg phe Ser Ala Val Ser 305 310 315 320

Gly Trp Gly Arg Leu Leu Asp Arg Gly Ala Lys Ala Arg Val Leu Met 325 330 335

Ala lie Gin Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Glu Gin Ala 340 345 350

Arg Arg Arg Pro Gly Ser Pro Ser lie Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala 355 360 365

Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380

Pro His Ala Thr Arg Phe Arg Gly Thr Trp Phe Leu Thr Gly Val Val 365 390 395 400

Ser Trp Gly Glu Gly Cye Ala Ala Thr Gly Arg phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415

Arg Val Ser Arg Tyr Thr Ala Trp Leu Leu Gly Leu Met Ser Ala Pro 420 425 430

Pro Pro Pro Ser Glu Gly Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro 435 440 445

<210> 12 <211> 446 <212> PRT <213> Canis familiaris

<223> Precursor do factor VII <4 0 0> 12 <22 0>

Met Val Ala Trp Ala Gly Glu Leu Ala Leu Leu eye Phe Leu Leu Gly 1 .-5 10 15

Leu Gin Gly Ser Leu Ala Ala Val Phe Leu Thr Gin Glu Glu Ala Gin 20 25 30

Gly Val Leu His Arg Gin Arg Arg Ala Asti Ser Phe Leu Glu Glu Leu 35 40 45

Arg Ala Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Arg Glu Glu Gin Cys Ser Phe 50 55 60

Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Gin Asp Val Asp Arg Thr Arg Gin Phe

65 10 75 BO

Trp Tie Ser Tyr Lys Asp Gly Aap Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gin B5 50 95

Aan Gly Gly Ser Cys Glu Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys 100 105 110

Pro Asp Asp Phe Gin Gly Arg Asn Cys Glu Thr Asp Lys Lys Asp Gin 115 120 12 5

Leu lie Cys Met Asn Glu Aen Gly Gly Cys Gin Gin Tyr Cys Ser .Asp 130 135 140

His Ala Glu Ala Arg Arg Ser Cys Trp Cya Hia Glu Gly Tyr Thr Leu 145 150 155 160

Gin Asp Asp Gly Val Ser Cys Met Pro lie Val Glu Tyr Pro.Cys Gly 16S 170 175

Lys He Pro Val Leu Glu Lys Arg lie Gly Ser Asn Pro Gin Gly Arg 180 105 190 lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala 195 200 205

Ala Val Lye Val Asp Gly Lys Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu tie Aap 210 215 22ft

Ala Ala Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Glu Arg He Lys Asn 225 230 235 240

Trp Lys Asn Leu Thr val Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Asp 245 250 2S5

Asp Gly Asp Glu Gin Glu Arg His Val Ala Arg Val lie Val Pro Asp 260 265 270

Lys Tyr lie Pro Leu Lys Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Hi a Leu 275 2B0 2Θ5

Arg Thr Pro Val Ala Tyr Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 290 295 300

Glu Lys Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe tie Arg phe Ser Thr 305 310 315 320

Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Gin. 325 330 335

Leu Met Ala lie Asp Val Pro Arg Val Met Thr Gin Asp Cys Gin Glu 340 345 350

Gin Ser Arg Arg Arg Ser Gly Ser Pro Ala lie Thr Glu Asn Met Phe 355 360 365

Cys Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser 370 375 380

Gly Gly Pro His Ala Thr Lys Phe Gin Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 385 390 395 400

Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Glu Gly His Phe Gly Val 405 410 415

Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Arg Gin Leu Met val 420 425 430

Ser Ser His Thr Leu Arg Gly Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro 435 440 445

<210> 13 <211> 433 <212> PRT <213> Brachydanio rerio

<223> Precursor do factor VII <4 0 0> 13 <22 0>

Met Ser Leu Leu Leu Val Phe Ser val Leu Trp Ser Leu His Tyr Cys

IS 10 IS

His Ser Ala Ala Val Phe Val His Arg Asp Glu Ala His Glu Val Leu 20 25 30 lie Arg Ser Lys Arg Ala Asn Ser Gly Trp Phe Glu Glu Leu Lys Thr 35 40 45

Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Leu Glu Glu Lys Cye Ser Tyr Glu Gly SO 55 60

Ala Arg Glu Val Phe Glu His Thr Glu Ala Thr Asn Glu phe Trp Lys 65 70 75 80 lie Tyr Asp Val Lya Asp His Cys Ala Ser Ser Pro Cys Glu Hia Asp 65 90 95

Gly Leu Cys Thr Thr Gin Asn Ala Asp Ser Tyr Met Cys Leu Cys Ala 100 105 110

Pro Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Glu Gin Ser lie Gly Asp Val Pro 115 120 125

Asp Ser Cys Leu His Asp Asn Gly Gly Cye Glu His Phe Cys Thr Glu 130 US 14 0

Gin Asp Gly Arg Arg Aon Cys Ser Cys Ala Aap Gly Tyr Tyr Leu Asp 145 150 1S5 160

Asn Gly Gly Gin Lys Cys Arg Ser His Glu Val Phe Pro Cys Gly Lys 165 17 D 175

Val Pro Leu Leu Gin Ala Gly Lys Ala Ala Asp Hia Gift Val Asp Leu 180 185 190

Arg Ser Arg lie Val Gly Gly Ser Glu Cys Pro Lys Gly His Cys Pro 195 200 205

Trp Gin Val Leu Leu Lya Tyr Gly Glu Lys Gly Phe Cys Gly Gly Val 210 215 220 lie Tyr Lys pro Thr Trp lie Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lyg 225 230 235 240

Leu Lys Val Lys Phe Leu Arg lie Val Ala Gly Glu His Asp Leu Glu 245 250 255

Val Asp Glu Gly Thr Glu Gin Leu He Gin val Asp Gin Met Phe Thr 260 265 270

His Pro Ala Tyr Val Ser Glu Thr Ala Asp Ser Asp lie Ala Leu Leu 275 2 BO 285

Arg Leu Arg Thr Pro lie Val Tyr Ser Val Tyr Ala Val Pro Val Cys 290 295 300

Leu Pro Leu Arg Glu Met Ala Glu Arg Glu Leu Trp Ala Val Ser Lys 305 310 315 320

His Thr Val Ser Gly Trp Gly Lye Arg Ser Glu Asp Gly Pro Thr Ser 325 330 335

Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Val Pro Arg lie Arg Thr Gin Glu Cys 340 345 350

Val Gin Val Ser Αβη Leu Thr Leu Thr ser Asn Met Phe cys Ala Gly 355 360 365

Tyr lie Glu Gly Arg Gin Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro 370 375 380

Leu val Thr Arg Tyr Arg Asp Thr Ala Phe Leu Leu Gly lie val ser 385 390 395 400

Trp Gly Lya Gly Cys Ala Arg Pro Gly Ser Tyr Gly lie Tyr Thr Arg 405 410 415

Val Ser Asn Tyr Leu Gin Trp Tie Arg Gin Thr Thr Asn Thr Thr lie 420 42$ 430

Hia

<210> 14 <211> 441 <212> PRT <213> Fugu rubripes

<223> Precursor do factor VII <4 0 0> 14 <22 0>

Met Arg Leu Arg Val Phe Phe Thx Leu Val Phe Thx Phe Thr Hi3 Cys 1 S 10 15

Arg Ala Ala Ser val phe Leu Asp Ala Asp Lys Ala His Asp val Leu 20 25 30

Val Arg Thr Arg Arg Tyr Asn Ser Gly Trp Leu Glu Glu Leu Gin Lys 15 40 45

Gly Asp Leu Lys Arg Glu Cya Leu Glu Glu lie Cys Ser Tyr Glu Glu 50 55 60

Ala Arg Glu Val Phe Glu His Thr Lys Thr Thr Asp Glu Phe Trp Lys

63 70 75 BO

He Tyr Asn Arg pro Asn ser Cys Lys Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly 85 30 95

Gly Ser Cys Ser Ala Glu Gly Ser ser Tyr Thr Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110

Glu Phe Ser Gly Val Asp Cys Glu Leu Glu Tyr Gin Thr Val Pro Asp 115 120 125

Thr Cys Leu Leu Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Phe Cys His Glu Asn 130 135 140

Ser Ala Gly Gin Arg Gly Asn Cys Ser Cys Ala Aep Gly Tyr Asp Leu

145 150 155 1EO

Asp Val Asp Gly Leu Ser Cys Lys Ala Lys Glu Ser Val Ala Cys Gly

165 170 17S

Met Val Leu Ser Ala Gin Phe Glu His Asn Gin Leu Asn Pro Arg Ala 180 185 190

Arg lie Val Gly Gly Aen Glu Cya Pro Ly3 Gly Glu Cys Pro Trp Gin 195 200 205

Val Leu Leu Val Tyr Lys Gly Lys Gly Phe Cys Gly Gly Val lie Tyr 210 215 220

Lys Pro Thr Trp He Leu Thr Ala Ser His Cys Met Ala Asp lie Asp 225 230 235 240

Val Gin Phe Leu Lye val Val Ala Gly Glu His Asn Thr Glu Val- Asp 245 250 255

Glu Gly Thr Glu Gin lie lie Gin val Ser Glu He lie Met His Glu 260 265 270

Lys Tyr Val Pro Arg Thr Ala Asp Asn Asp He Ala Leu Leu His Leu 275 2Θ0 285

Ala val Pro lie Thr Tyr Thr Thr Tyr Ala He Pro Val Cys Leu Pro 290 295 300

Thr Arg Pro Leu Ala Glu Arg Glu Leu Trp Ala Val Ser Leu Hie Thr 305 310 315 320

Val Ser Gly Trp Gly Arg Arg Ser Glu Asn Gly Pro Thr Ser His Leu 325 330 335

Leu Arg Gin Leu Lya Val Pro Arg lie Arg Thr Gin Gin Cys He Glu 340 345 350

Glu Ser Gly Val val Leu Thr Gin Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Met

355 360 36S

Glu Gly Arg Gin Aep Ser CyB Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 370 375 380

Thr Lys Tyr Lys Lys Thr Val Phe Leu Leu Gly lie Val Ser Trp Gly 385 390 395 400

Lys Gly Cys Ala Arg Pro Gly Asn Tyr Gly lie Tyr Thr Arg Val Ala

405 410 41S

Asn Tyr Leu Glu Trp lie His Asn Arg Thr Ala Thr Val Asn Gin Pro 420 425 430

Thr Asn Asn Thr Glu Asn Phe Thr Thr 435 440

<210> 15 <211> 425 <212> PRT <213> Gallus gallus

<223> Precursor do factor VII <4 0 0> 15 <22 0>

Met Val Ser Arg Gin Cys Val Ala Leu Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu 15 10 15

Val Pro Pro Ser Leu Glu Ala VaL Phe Leu Lys Gin Glu Glu Ala Asn 20 25 30

Ser lie Phe Gin Arg His Arg Arg Ala Asn Ser Phe Phe Glu Glu lie 35 40 45

Lye Leu Gly Pro Leu Glu Arg Glu Cys lie Glu Glu Lys Cys Ser Phe 50 55 60

Glu Glu Ala Arg Glu lie Tyr Arg Asp Asp Glu Arg Thr Lys Glu Phe 65 70 75 00

Trp His lie Tyr Ser Asp Pro Asn Gin Cya Asp Ser Ser Pro Cys Gin SS 90 95

Aan Gly Gly Ser Cys Asp Asp Gin Phe Gin Asp Tyr Val Cya Arg Cys 100 105 110

Pro Pro Glu Tyr Glu Gly Lys Ser Cys Glu Thr Ala Val ALa Glu Asn 115 120 125

Leu Lys Cya lie Tyr Asp Asn Gly Gly Cya Glu Gin Tyr Cys Ala Asp 130 13S 140

Glu Gin Ser Glu Lys Arg Val Cys Phe Cya Ala Glu Gly Tyr Ala Leu 145 150 155 160

Ala Ser Asp Gly Val Ser Cys lie Pro Gin Val Lys Tyr Pro Cys Gly 165 170 175

Thr He Pro val Leu Ala Arg Lys Asn Thr Thr Ala Gin Gly Arg lie 160 165 190

Val Gly Gly Val Thr Cys Pro Pro Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu 195 200 205 lie He Gin Asp Gin Lys Gly Lys Cys Gly Gly Ser Leu Leu ser Pro 210 215 220

Glu Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys Leu Asp Tyr Ala His Ser Lys 22S 230 235 240

Gin Leu Arg Val Arg Leu Gly Glu Tyr Ser Val Lys Val Ala Glu Lys 245 250 255

Thr Glu Gin Glu Ser Gly Val Ser Lys lie lie Arg His Glu Glu Tyr 260 265 270

Thr He Gly Gin Val Asn. His Asp lie Ala Leu Leu Lys Leu Glu Thr 275 260 2 B5

Fro Val Asn Leu Thr Asp Phe Val Val Pro lie Cys Leu Pro Glu Lys 290 295 300

Arg phe Ala val Tyr Glu Leu Ser Ser lie Lyg Phe Ser Met Val Ser 305 310 315 320

Gly Trp Gly Arg Leu Leu Asp Gly Gly Ala Thr Ser Thr Phe Leu Met 325 330 335

Arg Val His Leu Pro Arg Val Lys Thr Gin Glu Cys Glu Lys Gin Ala 340 345 350

Asn Leu Asn lie Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Asp Leu Thr Gly 3 55 360 365

Lys Lys Asp Ser Cya Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Lys

370 375 3 BO

Tyr Lys Asn Thr Trp Phe Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Ly3 Gly 365 390 395 400

Cys Ala Val Glu Gly Ser Tyr Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Arg Tyr 405 410 ‘ 415

He Asn Trp Leu Lys Arg His Met Glu 420 425

<210> 16 <211> 444 <212> PRT <213> Pongo pygmaeus <22 0> <223> Factor VII (fragmento) <4 0 0> 16

Gly Val Ala Glu Ala Ser Gly Gly Glu Thr Arg Asp Met Gin Trp Lya 15 10 15

Leu Gly Pro His Arg Val Phe lie Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 4Ξ

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lye Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60

Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Leu Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie 65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Fro Cys Gin Asn Gly 65 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110

Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Met Tyr Lys Asp Asp Gin Leu He 115 ‘ 120 125

Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Met 130' 135 140

Gly Ala Lys Arg Ser Cys Trp Cys His Glu Sly Tyr Ser Leu Léo Ala 145 ISO 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He 165 170 175

Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lya Pro Gin Gly Arg lie Val 180 185 190

Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu cys Pro Trp Gin Val Leu Leu 195 200 205

Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cya Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie 210 215 220

Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lya lie Lya Asn Trp Arg 225 230 235 240

Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Arg Asp Gly 245 250 255

Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr 260 265 270

Val Pro Gly Thr Thr A3jn His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu Hia Gin 275 200 285

Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300

Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320

Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335

Ala Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 340 345 350

Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365

Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lya Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380

Pro His Ala Thr Arg Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He val 305 390 395 400

Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Ala Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 4is

Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Cys Ser Glu 420 425 430

Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala pro Phe Pro 435 440

<210> 17 <211> 221 <212> PRT <213> Gorilla gorilla <22 0> <223> Factor VII (fragmento) <22 0> <221> INCERTO <222> (0) ... (0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <4 0 0> 17

lie Trp Val Val Her Ala Ala His Cya Phe Asp Lya lie Lys Asn ΤΓΡ 1 5 10 IS

Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu Hie Asp Leu Ser Glu Hi a Asp 20 25 30 *Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Met 35 40 45

Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His SO 55 60

Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu 65 20 75 80

Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val 85 90 95 ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu 100 10E 110

Met val Leu Aan Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin 115 120 125

Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met"Phe Cys 130 135 140

Ala Gly Tyr Ser- Αερ Gly Ser Lys Asp Ser cys Lys Gly Asp Ser Gly 145 ISO 1S5 160

Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Xaa Leu Thr Gly He 165 170 17$ xaa Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr val Gly His Phe Gly Val Tyr 180 185 190

Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp.Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser 195 200 205

Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 210 215 220

<210> 18 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60K <4 Ο 0> 18

Ala. As π Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cya Ala Ser Ser Fro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60 '

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 60

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly

85 90 9S

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cya Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cya Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cyg Gly Ly§ He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val- Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala 1BO 1SS 190

His Cys Phe Lys Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val rie lie Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn 2 2S 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cya Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Lev Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Wet Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 30S 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Wet Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 19 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60R <4 Ο 0> 19

Ala Asn Ala phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Aap Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Irp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 . 50

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 90 cys Glu Thr Hie Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly OS 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lya lie pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Ly3 Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly ly3 Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Fro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin

165 170 ITS

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 160 185 190

His Cys Phe Arg Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu tie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys LSU Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Sar Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Fro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 360

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 20 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60A <4Ο0> 20

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lya Glu Glu Gin Cys Eer Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp IS 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cya Glu Thr His Ly3 Aap Asp Gin Leu lie Cys Val Aen Qlu Asn Gly 85 90 95

Gly Cya Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 10S 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cye Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Ala Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Kis Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 3b0

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 39S 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 21 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aY <4Ο0> 21

Ala Asn Ala Phe lieu Glu Glu Leu Arg pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lye 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Agp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala SerSer Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin

50 55 GO

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly. Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aep Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lya lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Aan Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 1SS 190

His Cys Phe Asp Tyr lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Aan 225 230 235 240

His Aap lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe 5er Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 27S 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lya Aap Ser Cys Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3SS 360 365

Ala Thr Val Gly Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3B5 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 22 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aA <4Ο0> 22

Ala Asn Ala phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lya Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 $0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg A3n

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 35 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 . 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 14 5 150 155 160

Lya Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lle Trp Val Val Ser Ala Ala 130 135 190

His Cys Phe Asp Ala lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Hie Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr ASp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe ser Leu val ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 230 235

Agp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lya Asp Ser cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 390

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 395 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 23 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aE <4Ο0> 23

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Afg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 10

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Pile Trp lie ser Tyr ser Asp Gly Asp IS 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 $0 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Hie Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 ' 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Ly3 Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu L6u Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu

195 200 20S

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu

275 280 28S

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lya Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

325 330 33S

Lys Asp ser Cye LyB Gly Asp ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hia Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lya Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro phe Pro

4ÚS

<210> 24 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aD <4Ο0> 24

Αία Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 05 90 95

Gly cys Glu Gin Tyr Cys ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lye He Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lya Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 160 185 190

His Cys Phe Asp Asp lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 20S

Gly Glu Hia Aap Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 24S 250 255

His Val Val Pro Leu cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285 ASp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn. Val Pro Arg 290 295 300'

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 3S0

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lya Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 OS

<210> 25 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aL <4Ο0> 25

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Set Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 2S 30

Asp Ala. Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cya Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Aan Glu Asn Gly 85 50 95

Gly Cye Glu Gin Tyr cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys iço ips no

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Ttir Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin

165 170 ITS

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Aert Thr He Trp val Val Ser Ala Ala 1Θ0 185 190

Hie Cyo Phe Asp Leu Xle Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Lou Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Aep 245 250 255

His Val Val Pro Leu cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 370

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp. Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 26 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aM <4Ο0> 26

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cye Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 2S 10

Asp Ala Glu Arg Tbr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 *0 45

Gin Cys Ala Ser ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly B 5 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Giy Val Ser Cya Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lyo lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Sin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala 130 185 ISO

His Cys Phe Asp Met lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 20S

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu fhr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly A3p Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lye Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro . 405

<210> 27 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60cA <4Ο0> 27

Ala Asn Ala Phe leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS

Cya Lys Glu Glu Gift Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 4 0 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin ASA Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin ser Tyr lie eye Phe Cys Leu pro Ala phe Glu Gly ArgAan 65 70 75 80 .

Cy3 Glu Thr Hia Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly

85 90 9S

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser.Cys 100 105 no

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 I 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin

165 170 17S

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Ala Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin val lie He Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

Kis Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 ' 4ÚÔ Lâu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 28 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60cD <4Ο0> 28

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 6D

Leu Gin Ser Tyr He cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 TO 75 ao cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Hia Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 215 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140’

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Asp Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr. 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp cys Leu Gin Gin Ser Árg Lys val Gly Asp Ser 30S 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Mis Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3SS 360 365

Ala Thr Val Gly Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 29 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60cE <4Ο0> 29

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Aap Ala Glu Arg The Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cya Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser cys Lys Asp Gin 50 55 SO

Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn £5 70 75 00

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn GlU Asn Gly 8S 00 95

Gly Cya Glu Gin Tyr Cya Ser Asp His Thr Gly Thr Lya Arg Ser Cya 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala A3p Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lya lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lya Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Glu Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser.Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Aan 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro val val Leu Thr Asp 24$ 250 255

Hia Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Ash Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Αβρ Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lya Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Aan He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lya Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Kis Ala Thr His Tyr 340 34S 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cya 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hia Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr He 370 375 360

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 30 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante T99A <4Ο0> 30

Ala Asn Ala Phe Leu Qlu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15-

Cys Lys Glu Glu Gin Cye Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 2S 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lye Leu Phe Trp lie Ser Tyr ser Asp Gly Asp IS 4Q 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin ser Tyr lie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

6S 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cya val Asn Glu Asn Gly es SO 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg .130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys val Cya Pro

145 150 155 ISO

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Aan Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu GJn £er Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Ala Asn 2 25 230 235 24 0

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 . 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 27S 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg 290 295 300

Leu .Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 5er 305 310 315 320

Pro Aen lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 395 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 31 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante R147A <4Ο0> 31

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS LD 15

Cys Lys Glu Glu Gin cya Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Tie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cya Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg A3n 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lye Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cya Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He val Gly Gly Lys Val Çys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 " 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp vei Val ser Ala Ala LBO 185 190

His Cys. Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Ala Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu wee Val Leu Agn y«l Pro Arg 290 295 300

Leu Mec Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr MeC Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cya Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 37S 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Alá Pro Phe Pro 405

<210> 32 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante R147E <4Ο0> 32

Ala Aan Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 S 10 15

CyB Lya Glu Glu Gin Cys Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 2S 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 BO eye Glu Thr His Lya Aap Asp Gin L4u lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cya Glu Gin τγ* Cya Ser Aap His Thr Gly Thr Lys Arg Ssr Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cya Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val cys Pro 145 150 155 . 160

Lys Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Açn 225 230 235 240

Hie Asp lie Ala Leu Leu Arg Léu Hia Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Glu Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cye Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 32S 330 335

Lys Asp Ser Cya Lys Gly Asp ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 33 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante R147D <4Ο0> 33

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lye 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Sec Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn EE 70 75 80

Cys Glu Thr His Lye A3p Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 05 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Aan Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp val Val Ser Ala Ala 1B0 IBS 190

His Cys phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 19S 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Kls Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Asp Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 230 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 37S 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3SS 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 34 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K192E <4Ο0> 34

Ala Asn Ala phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Pile Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Xle Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser ser Pro cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 SO

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 30 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 lio

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr US 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly,Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cya Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 - 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 Z6S 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 265

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lya Asp Ser Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 ' 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 35 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K192R <4Ο0> 35

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin cys ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 3S 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly.Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 €0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr Hia Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lye Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lya He Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lye Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys val Cye Pro

145 150 155 ISO

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 no 115

Leu Cye Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His A3p lie Ala Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 2SS

His val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 2S0 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met val Leu Asn Val pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hia Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 36 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60R/R147E <4Ο0> 36

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Lieu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu

IS 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg rhr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cye Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 BO

Cys Glu Thr Hie Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 65 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lye Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 1S5 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 17S '

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Arg Lye lie Lya Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val Leu 195 200 205

Sly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

Hi a Val Val pro Leu Cys Leu Pro Glu ATS Thr Phe Ser, Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin. Leu Leu 275 280 285

Aap Glu Gly Ala Thr Ala Leu Glu Ley Met Val Leu Asn Val pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Aan lie Thr Glu Tyr Met Phe eye Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin,Gly Cya 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 3B0

Glu Trp Leu Gin Lya Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 3 95 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 37 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60K/R147E <4Ο0> 37

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lye 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 S5 €0

Leu Gin ser Tyr tie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly B5 90 95

Gly Cys Glu Sin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly'val Ser Cys Thr 11S 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin

165 170 17S

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp v*l Val Ser Ala Ala ISO 195 190

His cys Phe Lys Lys tie Lys Asn Trp Arg A?n Ley tie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu.His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin val He lie Pro ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe 5er Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Glu Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Net Val Leu Asn val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ber Cys Lys Gly Aap Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 34 S 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3SS 360 365

Ala Thr val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro phe Pro 405

<210> 38 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60R/R147D <4Ο0> 38

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asti Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 _ 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Arg Lys rle Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin.Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val pro Leu Cy3 Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Asp Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 366 3Ó5

Ala Thr val Gly Hie Phe Cly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 39 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60R/K60aE/K60cE <4Ο0> 39

Ala Asn Ala Pile Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Olu 1 5 10 15

Cye Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg rhr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Aan Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 05 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly val ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys 11« Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Aan Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 105 190

His Cys Phe Arg Glu lie Glu Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 155 200 205

Gly Glu His Asp L6u Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He He Prô Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 ' 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 30Ξ 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lya Asp Ser Cya Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Kis Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 40 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60K/K60aE/K60cE <4Ο0> 40

Ma Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu is 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 SO

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe eye Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 30 95

Gly Cyp Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cya Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cya Pro rrp Gin Val Leu Leu Leu Val ash Gly Ala Gin 165 170 175

Leu cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp val val ser Ala Ala 180 185 190

His Cya phe Lys Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Λβπ 225 230 235 240

His Asp lie Ma Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 27S 260 265

Agp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 32S 330 335

Lya Asp Ser cya Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly his Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr lie 370 375 360

Glu Trp Leu Gin Lya Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 395 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 41 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60R/K60aE/K60cE/R147E <4Ο0> 41

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 S 10 15

Cya Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Xle Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Aap Gly Asp 35 40 4 5

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cy3 Gin Asn Gly Gly Ser Cya Lya A3p Gin 50 SS S0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys G1U Thr His Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 1LO

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly vai Ser Cys Thr 11S 120 125

Pro Thr Vai Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 13 S 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Qly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro 145 ISO 1S5 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Arg Glu Ile Glu Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Vai Ala Gin Vai lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu Hi3 Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp 245 250 255

His Vai Vai Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Vai Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 200 285

Asp Glu Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser 305 310 315 32Ò

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lya Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Vai Gly Hia Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr Ile 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 40S

<210> 42 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60R/K60aM/K60cE <4Ο0> 42

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS cys LyS Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Tip lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cya Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 €0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 TO 75· ao

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly 85 SO 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 10S 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lyô lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Arg Met He Glu Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Z10 215 220

Val Ala Gin val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 25S

His Val Val Pro Leu Cya Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala phe val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Aon Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3SS 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 43 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60R/K60aM/K60cE/R147E <4Ο0> 43

Ala Asti Ala Phe Leu Glu Clu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Ly3 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin ASM Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly S5 »0 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly LyS lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin .165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Léu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 185 190

Hia Cys Phe Arg Met lie Glu Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn • 225 230 235 240

Hia Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val. Leu Thr Asp

245 250 2SS

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 290 2Θ5

Asp Glu Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lye Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3 S 5 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 390

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3B5 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 44 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> FVII - variante L13P <4Ο0> 44

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Pro Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 10

Arg Asp Met: Pro Trp Lys Fro Gly 'Pro His Arg Val Phe val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hie Gly Val Leu Hie Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 5 D 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 90

Sin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg S5 50 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser ABp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125

He CyS Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly CyS Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 1B5 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin. Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu Hi3 Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 3SO 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 90S 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie val Sex Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 4SS 460

Phe Pro 465

<210> 45 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor F64L) <400> 45

Met Val Ser Gin Ala leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hie Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Leu 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly ser.Leu Glu Arg Glu cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 50 95

Thr Lyfi Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cy3 Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys Hi3 Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 20S

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Aen Trp Arg Ash Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 'Val Ala Gin Val 27S 280 285 lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met' Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 3Θ0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cya 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 44S

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 45S 460

Phe Pro 4 65'. <210> 46 <211> 466

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor L73Q) <400> 46

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cye Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lya Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hi a Gly Val Leu Hie Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe so 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Gin Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 05 70 15 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Glti Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Ann Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 2 OS

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 . 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn He Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <213> Homo sapiens <22 0>

<210> 47 <211> 466 <212> PRT <223> Variante de FVII (precursor E79Q) <400> 47

Met Val Set Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Set Gly Gly Glu Thr 20 25 10

Arg Asp Met Pro Ttp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hie Sly Val Leu Hie Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO S5 €0

Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Gin Glu 65 70 -75 80

Gin Cys Set Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys LeU Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cya Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys aln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Αβρ Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg CyS His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr val Glu 180 165 190

Tyr Pro cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Txp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320 Léu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe val 325 330 315

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Aap Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Tie Thr 370 375 380 fllu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Kis Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly CyS Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 400

Phe Pro 485

<210> 48 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor S120P) <400> 48

Met Val ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 . 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu Efis Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Scr Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 6S 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lyg Asp Ala Glu Arg as 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 .105 lio

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Pro Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cy3 Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp Hie Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 21S 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn The lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys ASn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 27(3

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 2B 0 2Θ5

He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 215 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Ann Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp CyO Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser Lys Asp ser Cys 3£5 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr rle Glu Trp Leu Gin 43S 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 4S5 460

Phe Pro 465

<210> 49 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor C121F) <400> 49

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu Hie Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu tie Phe. Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 10S 110 ser Pro cys Ολη Asn Qly Gly Ser Phe Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie cys Phe Cye Leu Pro Ala. Phe Glu Cly Arg Asn Cye Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cye Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 150

Tyr Cye Ser Asp Hia Thr Gly Thr Lya Arg Ser Cys Arg Cys Hia Glu 1G5 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu

180 185 ISO

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys

195 200 20S

Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lya Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys Zle Lys A3n Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu Gly Glu Hia Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 280 285

He lie Pro ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn Hie A3p Ile Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu Hia Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His Vai Vai Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Vai 325 330 335

Arg Phe Ser Leu vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 ' 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Vai Leu Aen Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin ser Arg Lys vai Gly Aep ser Pro Asn xle Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lya Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly Ile vai Ser Trp Gly Gin Gly çys Ala .Thr Vai Gly 420 425 430

His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai ser Gin Tyr Ile Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 55

<210> 50 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor L125P) <4Ο0> 50

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin

IS 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly val Ala Lyg Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cye Lys Glu Glu 65 70 - 75 00

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp. Ala Glu Arg OS 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Aep Gin Pro Gin Ser Tyr 11S 120 125 lie Cys Phe Cya Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cya His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr val Glu 160 1&S 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val Leu Gly Glu Hie Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 2S0 235 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp His val val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 3SS 360 365

Aap Cya Leu Gin Gin Ser Arg Ly3 Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 360

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly ser Lys Asp Ser Cys 365 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hia Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 4 2S 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lya Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 51 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor Y128C) <400> 51

Met Val Set (Jin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 S 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 2S 30

Arg Asp Met Pro Trp Lye Pro Gly Pro HÍ3 Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lya Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 SO $5

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Cys 115 120 12S

He Cys Phe cys Leu Pro Ala phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160 tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lya He Pro lie Leu Glu Lys Arg Aen Ala Ser Lya 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys Val Cys Pro Ly3 Gly Glu Cys 210 21S 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Aen Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe A3p 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu Hie Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Glit Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu Kis Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 3S0

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn He Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Her Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 52 <211> 466

<212> PRT <223> Variante de FVII (precursor R139K) <213> Homo sapiens <22 0> <400> 52

Met val ser Gin Ala Levi Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lya Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Fro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 5S SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu cys Lys Glu Glu 65 TO 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Pile Lys Asp Ala Glu Arg

85 90 9S

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Aap Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Ly3 Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Aap Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin

145 150 155 ISO

Tyr Cys Ser ASp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 135 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Trp val val Ser Ala Ala Hie Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala val Leu Gly Glu His Aap 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser. Arg Arg val Ala Gin Val 275 280 285 lie Tie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Aap His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 3 80

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 3H5 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyx Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R139Q)

<210> 53 <211> 466 <212> PRT <400> 53

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cya L*u Ala. Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin IS 40 45

Glu Glu Ala Hie Gly Val Leu Hie Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 10S 110

Ser Pro Cys Gin Asti Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Gin Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie cys val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser ABp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro' lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lye ASn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro 9er Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Híb Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cye Ala Thr val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Lev Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 54 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R139W) <400> 54

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly GLy Val Ala Lye Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr GLn 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lya Glu Glu

65 70 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lya Asp Ala Glu Arg 65- 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro CyS Gin Asn Gly Gly Ser Cya Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 11S 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Trp Asn Cys Glu Thr His 120 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin

14 S 150 1S5 ISO

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Ly3 Arg Ser Cys Arg Cys His Glu

1G5 170 17S

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lya Val Cys Pro Cys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu Zle Ala Val Leu Gly Glu His Asp 280 265 270

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val v«l Leu Thr Asp Hiis Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val

325 330 33S

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 373 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Set Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie val ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 45S 460

Phe Pro 465

<210> 55 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor C151S) <400> 55

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin IS 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys'Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Ser Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 185 190

Tyr Pro cys Gly Lye lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lye 195 200 20S

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Aap 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 295 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Aep Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lye Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 56 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor E154K) <400> 56

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Cys Leu. Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO 55 60

Leu Glu Gill Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 BO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cya Ala Ser 100 105 ' no

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Aan Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val ASK Lys Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 1B5 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 260 2BS lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 360

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 57 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor G157C) <4Ο0> 57

Met val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cy® Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Ly® Ala Ser Gly Gly Glu Thr ZD 25 30

Arg Aap Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Aon Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 30

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Aap Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 no

Ser Pro Cy® Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 1Z0 125 lie Cys Phe Cye Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lya Asp Asp Gin Léu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Cys Cys Glu Gin

145 150 155 ISO

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu

165 170 17S

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cy® Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Aen Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 . 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 33.0 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 . 330 335

Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lye Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 3Θ5 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met. Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 58 <211> 466 <223> Variante de FVII (precursor G157S)

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <400> 58

Met Val Set Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 S 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Sly Gly Glu Thr 20 25 10

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Mis Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala ash Ala Phe 50 55 50

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 00

Gin Cys Sèr Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg as 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin. Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr

115 120 12S lie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Ser Cys Glu Gin ' 145 150 155 1€0

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lya Arg Ser Cya Arg Cya His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cya Thr Pro Thr Val Glu 1B0 105 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro 11« Lew Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lya Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Bln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phé Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 . 200 235 lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Léu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn He Thr 370 375 300

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 3 05 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 59 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor G157V) <400> 59

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 IS

Gly Cya Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lya Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala ASn Ala Phe 50 55 50

Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cya Lya Glu Glu 65 70 75 SO

Gin Cys Sec Phe Glu Glu Ale Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lyfi Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Girt Cys Ala Sec 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125

He Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Val Cys Glu Gin

145 150 155 ISO

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 Π0 17 5

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 'Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Lèu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu-Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 60 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor Q160R) <4Ο0> 60

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly val Ala Lye Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 10

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 4S

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr IIS 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Hie 130 135 14 0

Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Arg 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lye Arg Ser Cys Arg Cys His Glu

165 170 17S

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Ly3 Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 3 05 310 31S 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp

405 410 41S

Tyr Leu Thr Gly lie Val See Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 4S5 4έ0

Phe Pro 465

<210> 61 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor P194T) <400> 61

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Lèu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ale Ala Gly Gly val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu Hie Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr CyS Set Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys Arg Cys Hie Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 100 185 190

Tyr Thr Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220 '

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Aen Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu Ele Aen Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 24S 250 255

Lya lie Lye Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 260 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr.Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phé Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 37S 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cya Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 62 <211> 466

<212> PRT <223> Variante de FVII (precursor C195R) <213> Homo sapiens <22 0> <400> 62

Met val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 s 10 is

Gly CyB Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg val phe val Thr Gin . 35 40 45

Glu Glu Ala Hia Gly val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 5Ξ 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg

B5 , 90 SS

Thr Lya Leu Phe Trp lie Ser Tyr Scr A3p Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 10S lid

Ser Pro Cys Gin. Asti Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly CyB Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr Cys Ser Asp Hi3 Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr pro Arg Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Glu Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Aep Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 5er Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65 <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor K197E)

<210> 63 <211> 466 <212> PRT <400> 63

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin IS 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO SS ¢0

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 65 90 35

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 1L0

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg 5er Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 185 190

Tyr Pro Cys Gly Glu lie Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val Cys Pro Lya Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 230 235 lie lie Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn Hia Asp lie Ala 290 295 100

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro val val Leu Thr ASP His val val Pro 305 310 315 320 lieu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly A3p Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hia Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cya Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 64 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R212Q) <400> 64

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO 5S 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe LyS Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Gy a Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Aap His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 166 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cya Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro Tie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Gin lie Val Gly Gly Lys val Cya Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys phe Aap 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr A3n His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Lau Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Pfj«* Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Fro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

Hi a Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lya Leu Met Arg Ser Slu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 46C

Phe Pro 465

<210> 65 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor G216D) <400> 65

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu. Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Aep Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hia Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125

He Cya Phe Cya Leu Fro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cya Glu Thr Kis 130 135 140

Lys Aap Asp Gin Leu lie Cya Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr Cys ser λβρ His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys Hia Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro CyS Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gift Gly Arg lie Val Gly Asp Lye Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 250 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val. Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala , 280 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Zle Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 .440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 45Q 455 460

Phe Pro 465

<210> 66 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor C238Y) <400> 6 6

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 50

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Sex Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cya Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 12S lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr ser Leu Leu Ala Asp Gly val ser Cys Thr pro Thr val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lye 11« Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lye 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lya Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Tyr Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val val ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 260 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 294 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu CyS Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Ash lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Glh Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 67 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor T241N) <4Ο0> 67

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly pro Hia Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 4 Ξ

Glu Glu Ala His Gly val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu ¢5 70 75 8o

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg Θ5 90 95

Thr Lys Leu Phe rrp rie Ser Tyr Ser Aap Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr CyS Ser Asp His Thr Gly Thr Lye Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Lçu Val Asn Gly Ala Gin Lev Cys Gly Gly 225 230 235 240

Asn Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu Kis Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin ser Arg Arg val Ala Gltt Val 275 260 285

He He Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn His Aap lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly ser Lye Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 4S0 4SS 460

Phe Pro 465

<210> 68 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor C254Y) <400> 68

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 ID 15

Gly Cya Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lya Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hie Arg val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 eo

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg B5 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asti Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lya Aap Asp Gin Leu lie Cys Val Αβη Glu Αβπ Gly Gly Cya Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys $çr Asp Hiç Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cya Thr Pro Thr Val Glu 100 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205 pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Tyr Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lye Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Alá Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 3BS 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 69 <211> 466 <223> Variante de FVII (precursor A266T)

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <400> 6 9

Met val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 ID 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 ID

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg. Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly val Leu his Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 20 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Xle Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 11D

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 , 150 155 160

Tyr cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala Hie Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Thr Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Glr. Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp His Val Val Pro 30S 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hie Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr Tie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65 <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R283W)

<210> 70 <211> 466 <212> PRT <400> 70

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lye Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg B5 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Aen Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin

145 150 155 ISO

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 1SS 190

Tyr Pro Cys Gly Lya lie Pro lie Leu Glu Lya Arg Asn Ala Ser Lya 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lye Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys He Lya Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Trp Arg Val Ala Gin val 275 280 285

He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Aap Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Lou Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Aap Ser Cys 365 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410' 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Mat Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly val Leu Leu Arg Ala Pro 450 4S5 460

Phe Pro 465

<210> 71 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor V295D) <400> 71

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 ‘ 30

Arg Aap Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Giu 65 70 75 B0

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Fhe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cye Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cye Thr Pro Thr Val Glu 160 1ΒΞ 190

Tyr Pro Cye Gly Lys He Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin Leu cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 255 lie He Pro Ser Thr Tyr Asp Pro Gly Thr Thr ash His Asp He Ala 290 295 3Õ0

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 110 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 3SS 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly pro His Ala Thr His iyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 72 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor D302H) <400> 72

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Léu Gly Leu Gin 15 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin CyS Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Tie Phe Lya Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Sex Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser ICO 105 110

Ser Pr* Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cya Glu Thr His 110 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp Hie Thr Gly Thr Lye Arg Ser Cys Arg Cys Hia Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr pro Thr Val Glu ISO 185 190

Tyr Pro Cya Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp val Val ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His His He Ala 290 295 300

Leu lieu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser CyB 385 390 395 400

Lys Gly Abp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Alá Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 73 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor D302N) <4Ο0> 73

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin IS 10 IS

Sly Cys Leu Ala Ala Gly Sly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

6S 70 75 BO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg AS 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cya Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cye Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ash Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cye Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly val Ser Cys Thr Pro Thr val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lye Arg Asn Alá Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Sly Arg Ele Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 325 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu Hia Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 ZB0 295

He He Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn His Asn lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp Hie Val Val Pro 305 Π0 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cye Leu Gin Gin ser Arg Lys val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 395 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Fro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 74 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor A304T) <400> 74

Met Val Ser Gin Ala Lett Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Tip Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 10 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lye Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu' Gin Ser Tyr 115 120 125 . lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lya lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg tie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Léu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala Hie Cys Phe Asp 245 250 255

Lya lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Thr 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn He Thr 370 37 S 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 75 <211> 466 <223> Variante de FVII (precursor A304V)

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <400> 75

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 20

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hia Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Ann Ala Phe 50 55 50

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu ¢5 70 75 80

Gin Cys Eer Pbe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 50 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Aep Gin Leu Gin Ser Tyr US 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cya Glu Thr His 130 135 ' 140

Lys ASp Asp Girt Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu

165 170 17S

Gly Tyr ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 100 165 150

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 19S 200 205-

Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 235 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Val 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 3B0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 305 3 SO 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hie Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 40S 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cya Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Fro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 76 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R307C) <4Ο0> 76

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1.5 10 IS

Gly cys Leu Ala Ala Gly Gly val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp' Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 3 5 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cye Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg es so 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Hia 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser cys Thr Pro Thr val Glu 180 18S 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lye Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asπ Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 2BO 385 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn Hia Asp lie Ala 290 295 . 300

Leu Leu Cys Leu Hie Gin Pro val val Leu Thr Asp His Val val Pro 305 310 315 320

Leu Cys leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Léu Met Thr Gin 355 360 36S

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 330 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 4E0

Phe Pro 4 65

<210> 77 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R307H) <400> 77

Met 'Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu aly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Sly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala asti Ala Phe 50 55 6.0

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cy3 Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 05 SO 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Aon Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin lieu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr See Leu Leu Ala Asp Gly val Ser Cys Thr Pro Thr val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu.Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 260 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp I2e Ala 290 285 300

Leu Leu His Leu His Gin pro Val val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 46 5 <210> 78 <211> 466

<212> PRT <223> Variante de FVII (precursor V312M) <213> Homo sapiens <22 0> <400> 78

Met Val Ser Gin Ala lieu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 1C? 15

Sly Cya Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Ly3 Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala HIa Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SO 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cya Lys Glu Glu 65 70 75 60

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie ser Tyr Ser Asp Gly Aep Gin Cys Ala ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu,Ala Asp Gly.val ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cya Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val ASn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu Tie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cya Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie pro Sér Thr Tyr Val Prô Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala i 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Met Val .Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu leu Asp Arg Gly Ala 340 345- 3S0

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser Pro Ash lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor E325K)

<210> 79 <211> 466 <212> PRT <400> 79

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala ,Asn Ala Phe SO S5 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 50 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lya Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Trp val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 26S 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285

He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Fro 305 310 315 320

Leu Cys Leu pro Lys Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly rle Val ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr val Gly 420 425 430

His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Lev Lew Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 80 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor T332M) <400> 80

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lye Glu Glu 65 70 75 00

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg as 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 10O 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr IIS 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160 . Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 190 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lye Val Cye Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn GLy Ala Gin Leu Cys Gly Gly 22S 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 20S lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Fro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Met Leu Ala Pbe Val 335 330 335

Arg Fbe ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Aap Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 300

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Set Asp Gly Ser'Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Set Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 81 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor V341F) <400> 81

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Aan Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu £5 70 75 Θ0

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg as 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Aap Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Aon Gly Gly Ser Cye Lye Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125

Tie Cys phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cya Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 14S 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 1?0

Tyr Pro Cys Gly Lye lie pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys IPS 200 205

Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 210 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg val Ala Gin Val 275 280 285 lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Phe Ser Gly Trp Gly Gin Lêu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Ash Val Pro Arg Leu Net Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lye Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 42 S 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 82 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor A352T) <400> 82

Met val ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cye Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His .Gly Vai Leu Kis Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu GlU Glu Léu Arg Pr* Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Glu Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 05 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pr* Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala- Asp Gly Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu ISO 185 190

Tyr Pr* Cys Gly Lys lie Pr* Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lye Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 280 285 lie lie Pr* Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu Híb Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His vai Vai Pro 30S 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala phe Vai 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Thr 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Ket Vai Leu Asn vai pro Arg Leu Met. Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Aap Ser Pro Asn Ile Thr 370 375 3Θ0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Vai Gly 420 425 430

His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr Ile Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 83 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor A354V) <4Ο0> 83

Met Vai ser Gin Ãla Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cya Leu Ala Ala Gly Gly Vai Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Vai Fhe Vai Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Vai Leu Hia Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 10 15 BO

Gin Cys ser pbe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 80 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cye Phe Cys Leu Pro Ale Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 13S 140 . Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cya Glu Gin

145 150 15S ISO

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cya Arg Cys His Glu 165 110 115

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser cys Thr Pro Thr Vai Glu ibO íes 190

Tyr Pro Cya Gly Lya lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 2DD 205

Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu Ile Asn Thr lie Trp vai vai Ser Ala Ala His cya Phe Asp 245 250 25$

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu Tie Ala Vai Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 2B0 2B5 lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn His Asp ile Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro vai Vai Leu Thr Asp His Vai Vai Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Clu Arg Thr Leu Ala Phe Vai 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Vai Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Vai Gly 420 425 . 430

His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr Ile Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro 450 4SS 460

Phe Pro 465

<210> 84 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor M358I) <400> 84

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lya Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lya Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu Hie Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly ser Leu Glu Arg Glu Cys Lye Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lye Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe rrp lie £er Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Aan Gly Gly Cys Glu Gin 145 ISO IBS 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 17S

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val 5er Cya Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Aan Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lya Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu eye Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lya lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 265 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn Hia Asp lie Ala 290 235 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu lie Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Aap Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lya Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser Lye Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cya Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 85 <211> 466 <223> Variante de FVII (precursor M358V)

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <400> 85

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser çly çly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Aen Ala Phe 50 55 GO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Gly Glu

65 70 75 * SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 05 90 . 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr.Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu L6S 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 18S 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Aep 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Glu Val 275 280 285 lie lie Pro ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro val Val Leu Thr Asp His val val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Val Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 5er Pro Asn Tie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 4C5 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Het Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor P363R)

<210> 86 <211> 466 <212> PRT <400> 86

Net Val Ser Gin Ala Leu. Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 00

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 05 90 95

Thr Lys Leu phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cye His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala ser Lys 195 200 305

Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly 'Lys val Cys Pro Lye Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Sly Glu Hie Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 27S 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Aep His val Val Pro 305 , 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Net Val Leu Asn Val Arg Arg Leu Met Thr Gin 3SS 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lya Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Tfir 3*70 375 3a0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala ¢1/ Tyr Ser Asp Gly ser Lya Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lya Gly Asp Ser Gly Gly pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lya Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 4 50 455 460

Phe Pro 465

<210> 87 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R364Q) <400> 87

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Cly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 55

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 10Q 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Kis 130 133 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie CyB Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys ser Asp His Thr Sly Thr Lyá Arg Ser Cys Arg Cys His Glu

165 170 17S

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO IBS 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lye Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Girt Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp . 260 . 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 2Θ5 lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp IU Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 33Q 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Gin Leu Met Thr Gin 355 360 36S

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser pro ash lie Thr 370 375 3Θ0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410’ 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Lèu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 4S5 460

Phe Pro 465

<210> 88 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor T367S) <400> 88

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lya Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu Hia Arg Arg Arg Arg Ala Aen Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 9α 95

Thr Lys Leu Phe Tip lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cya Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His

130 135 14D

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asri Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu

165 170 ITS

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 190 185 190

Tyr Pro Cya Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val CyS Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 2E5 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Abo His Asp He Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu Hia Gin Pro Val Val-Leu Thr Asp His val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cya Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala ' 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Ser Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser A3p Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4S5

<210> 89 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor C370F) <4Ο0> 89

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 10

Arg Asp Met pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu. Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Glh Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cya Ser Asp His Thr Gly Thr Lye Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Sèr Leu Leu Ala Asp Gly val ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lye Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu Hie Aep 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 235 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cy3 Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg GLy Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Phe Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser pró Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 43S 440 445

Lye Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 6S

<210> 90 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor C389G) <400> 90

Met Val Set Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cya Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 IS

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lye Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe SOBS €0

Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lye Glu Glu

65 70 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 30 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110 ser Pro cys Gin Asn Gly Gly Ser cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr Cys Ser Asp Hie Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 1Θ5 190

Tyr Pro Cys Gly Lye lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lye 195 200 205

Pro Gin Gly Arg He val Gly gly Lys val cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 290 28S lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Aen Hie Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Vhl 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Gly Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 3B5 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 91 <211> 466

<212> PRT <223> Variante de FVII (precursor G391S) <213> Homo sapiens <22 0> <400> 91

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lye Ala Ser Gly Gly Glu Thr SO 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Aen Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 .285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 2 95 300

Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His val val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 3 B0

Glu Tyr net Phe Cys Ala Scr Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lye Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phè Pro 465 <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor G402E)

<210> 92 <211> 466 <212> PRT <400> 92

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala ser Gly Gly Glu Thr 20 25 3D

Arg A3p Het Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hia Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 BO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg B5 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Lys Asp Asp Gin Leu lie CyS Val Asn Glu Asn Gly Gly CyS Glu Gin 145 150 155 150

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 1B0 IBS 190

Tyr Pro CyS Gly Lye He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cye Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val val Ser Ala Ala His Cys Phe Aap 245 250 355

Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu Tie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 2B0 285 lie rie Pro Sec Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Het Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn He Thr 370 375 380

Glu Tyr Het Phe Cys Ala Gly. Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Glu Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Pile Sly val iyr Thr Arg val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Fro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 93 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor G402R) <400> 93

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40. 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asπ Gly Gly ser CyS Lye Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 12(7 125 * lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 110 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175.

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu ISO 165 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu tie Asn Thr tie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 24 5 250 ' 255

Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 265 lie lie Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp Hia Val Val Pro 305 310 315 -320

Leu Cya Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 305

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 360

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Arg Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr,Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 94 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor D403H) <400> 94

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu eye lieu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly val Ala Lya Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hi8 Arg Val Phe val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hia Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cya ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Aap Gin CyS Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Hie 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Aan Gly Gly Cys Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu A3p Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met; Thr Gin 3 55 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Aap Gly Ser Lys Asp Ser Cya 385 390 395 400

Lys Gly His Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Sly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly Xle Val Ser Trp Gly Gin Gly Cya Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 95 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R413Q) <4Ο0> 95

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin IS 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lye Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala Hie Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asη Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 BO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Fro cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Aan Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 1B5 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cya 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cy3 Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 2BS lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp He Ala 290 295 300 Lçu Leu Arg Leu Hia Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His val Val Pro ' 305 310 315 320

Leu Cye Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cy3 Leu Gin Bln Ser Arg Lys val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cye 385 390 395 400

Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr Gin Gly Thr Trp 405 410 dl5

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Aia Pro 4SO 455 460

Phe Pro 465

<210> 96 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor T419M) <400> 9 6

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cy3 Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly GLy Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 S5 SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lye Glu Glu

65 70 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Pha Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly A3p Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cya Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys Hie Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Fro Thr Val Glu 180 165 190

Tyr Pro Cys Gly Lya lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cya Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val val ser Ala Ala His Cys Phe Aap 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Ser Glu Hia Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 260 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 31S 32Ç

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 34S 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp cys Leu Gin Gin ser Arg Lys val Gly Asp ser Pro A3h lie Thr 370 375 3B0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 3 85 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Met Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg val Sec Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Sex Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 4b5 460

Phe Pro 465 <210> 97 <211> 466 <223> Variante de FVII (precursor G435E)

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <400> 97

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15 '

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lye Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin as 40 45

Glu Glu Ala His Gly val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe so ss 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg SS »0 35

Thr Lya Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Aep Gly A3p Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Αβρ Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140

Lya Asp Αβρ Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 14S 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu Gly Glu Hie Asp 260 265 270

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val val Pro 105 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg Leu Met Thr Gin 3S5 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Aap Ser Pro Asn lie Thr 370 375 3 B0

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Set Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly A3p Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Glu Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465

<210> 98 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor E445K) <400> 98

Met Val Sex' Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1 5 10 15

Gly Cys Leu Ale Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hie Arg Val Phe Val Thr Gin 25 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asti Ala Phe 50 55 €0

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lye Glu Glu 65 70 75 80

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lye Asp Ala Glu Arg SS 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cye Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cye Gin Asn Gly Gly Ser Cye Lye Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cye Phe Cys Leu Pro Ala Fhe Glu Gly Arg Asn Cye Glu Thr His 130 135 140

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 150

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lye Arg Ser Cye Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 IBS 19 D

Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cye Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr lie Trp val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val aer Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 ' 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr lie Lys Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 99 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R375W) <4Ο0> 99

Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro Hia Arg- Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 SO

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 6S 70 75 80

Gin Cys Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg

85 90 PS

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin eye Ala Ser 100 IDS 110

Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr pro Thr Val Glu 180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys IPS 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220

Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240

Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu Hie Asp 260 26S 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300.

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 3SS 360 365

Asp Cys Leu Glh Gin Ser Trp Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr'Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 4 65

<210> 100 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Variante de FVII (precursor R375K) <4 0 0> 100

Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 1.5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Sly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 SO

Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Ar.g Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110

Ser Pro Cys Gin Aen Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Hia 130 135 140.

Lys Asp Asp Gin Leu He Cya val Asn Glu Asn Gly Gly Cya Glu Gin 145 ISO 155 160

Tyr cys ser Asp Hie Thr Gly Thr Lys Arg ser Cye Arg cys Hie Glu 165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cya Thr Pro Thr Val Glu 160 165 190

Tyr Pro cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lya 195 200 205

Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cya 210 215 220

Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 22S 230 235 240

Thr Leu Tie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala Hia Cys Phe Asp 245 250 2S5

Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270

Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His val Val Pro 305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335

Arg Phe Ber Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 140 345 350

Thr Ala Leu Glu leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365

Asp Cys Leu Gin Gin Ser Lys Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 37S 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 365 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415

Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He Glu Trp Leu Gin 435 440 445

Lys Leu Met Axg-Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460

Phe Pro 465 <210> 101 <211> 304

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor do TFPI - isoforma a <4 0 0> 101

Met He Tyr Thr Met Lys Lys val Hi3 Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys 15 10 15

Leu Leu Leu Asn Leu Ala Fro Ala Fro Leu Asn Ala Asp Sex Glu Glu 20 25 30

Asp Glu Glu Hie Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45

Leu Met His Ser phe Cys Ala phe Lys Ala Asp Asp Cly Pro Cys Lys 50 55 60

Ala lie Met Lys Arg Fhe Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gin Cya Glu SS 70 75 80

Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Giy Asn Gin Aen Arg Phe Glu Ser 85 SO 95

Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg lie 100 105 no lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Fro Asp Phe Cys Fhe Leu Glu 115 120 125

Glu Asp Pro Gly lie Cys Arg Gly Tyr He Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140

Asn Gin Thr Lya Gin Cys Glu Arg Phe Lya Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160

Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lie Cys Glu 165 170 175

Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gin Leu Asn 180 185 190

Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205

Phe Glu Phe His Gly Fro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly 210 215 220

Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val lie Gly 225 230 235 24 0

Lys Cys Arg Pro Phe Lye Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn 245 250 255

Phe Thr Ser Lys Gin Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lya Lys Gly Phe lie 260 265 270

Gin Arg He Ser Lys Gly Gly Leu lie Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys 275 280 2B5

Lys Gin Arg Val Lys lie Ala Tyr Glu Glu He Phe Val Lys Asn Met 290 295 300

<210> 102 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> TFPI maduro - isoforma a <4 Ο 0> 102

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu 15 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30

Gly Pro Cys Lya Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn lie Phe Thr 35 40 45

Arg Gin. Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn 50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 *70 75 8 D

Ala Asn Arg lie lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Aap Phe 85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Aap Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110

Tyr Phe Tyr Aan Asn Gin Thr Lya Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140

Asn lie Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Vai Asp Asn Tyr Gly 145 150 1SS 160

Thr Gin Leu Asn Ala Vai Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys 165 170 175

Vai Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn 195 200 205 3er Vai lie Gly Lya Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly 210 215 220

Asn Glu Aan Asn phe Thr Ser Lys Gin Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys 225 230 235 240

Lya Gly Phe He Gin Arg lie Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys 245 250 255

Arg Lys Arg Lys Lys Gin Arg Vai Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe 260 265 270

Vai Lys Asn Met 275

<210> 103 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor do TFPI - isoforma b <4 Ο 0> 103

Met lie Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser val Cys 15 10 IS

Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Fto Leu hsn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30

Asp Glu Glu Hi a Thr He lie Thr Asp Thr Glu Leu pro Pro Leu Lys 35 40 45

Leu Met His Ser Phe Cys Ala Fhe Lye Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60

Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gin Cys Glu

65 10 75 BO

Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95

Leu Glu Glu Cys Lye Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg lle 100 105 110 lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Fra Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125

Glu Asp Pro Gly lie Cys Arg Gly Tyr He Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140

Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160

Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lie Cys Glu 165 170 175

Asp Gly Pro Asn. Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gin Leu Asn 180 185 190

Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205

Phe Val Thr Lys Glu Gly Thr Asn Asp Gly Trp Lys Asn Ala Ala His 210 215 220 lie Tyr Gin Val Phe Leu Asn Ala Fhe Cys rle His Ala Ser Met Phe 225 230 235 240

Phe Leu Gly Leu Asp Ser lie Ser Cys Leu Cys 24E 250

<210> 104 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> TFPI maduro - isoforma b <4 Ο 0> 104

Ser Glu Glu A3p Glu Glu Hie Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu Pro 1 5 10 15

Pro Léu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly 20 25 30

Pro Cys Lys Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Àsn lie Phe Thr Arg 35 40 45

Gin Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Aan Arg 50 55 60

Phe Glu Ser Leu Glu Glu cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala 65 70 75 80

Asn Arg He lie Lya Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe Cys 85 90 95

Phe Leu Glu Glu Aap Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr 100 105 110

Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lya Gin Cya Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly 115 120 125

Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Ly3 Asn 130 135 140 lie Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Vai Asp Aan Tyr Gly Thr 145 150 1S5 160

Gin Leu Asn Ala Vai Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys Vai 165 170 175

Pro Ser Leu Phe Va.l Thr Lys Glu Gly Thr Asn Asp Gly Trp Lys Asn 180 185 190

Ala Ala His Ile Tyr Gin Vai Phe Leu Asn Ala Phe Cys Ile His Ala 195 200 205

Ser Met Phe Phe Leu Gly Leu Asp Ser Ile Ser Cys Leu Cys 210 215 220

<210> 105 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> TFPI-2 maduro <4 Ο 0> 105

Asp Ala Ala Gin Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu lie Cys Leu Leu 1 5 10 15

Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr 20 25 30

Asp Arg Tyr Thr Gin Ser Cys Arg Gin Pbe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu 35 40 45

Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys 50 $5 ¢0

Trp Arg He Glu Lys Val Pro Lys Val Cya Arg Leu Gin Val Ser Val 65 70 75 80

Asp Asp Gin Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys Tyr Phe Phe Asn Leu Ser 85 90 55

Ser Met Thr Cys Glu Lye Phe Phe ser Gly Gly Cys His Arg Asn Arg 100 105 110 lie Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr Cys Met Gly Phe Cys Ala 115 120 125

Fro Lys Lys lie Pro Ser Phe Cys Tyr Ser Pro Lys Asp Glu Gly Leu 130 135 140

Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe Aon Pro Arg Tyr Arg Thr 145 150 155 160

Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cya Gly Gly Asn Asp Asn Asn Phe 1ÊS 170 175

Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys Ala Lys Ala Leu Lys Lys 180 185 190

Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala Ser Arg lie Arg Lys He 195 200 205

Arg Lys Lys Gin Phe 210 <210> 106 <211> 55 <212> PRT <213> Bos taurus <22 0> <223> BPTI 5L15 K-l <4 0 0> 106

Ala Pro Asp Phe Cye Leu Glu Pro Pro Tyr Asp Gly Pro Cys Arg Ala 1.5 10 15

Leu His Leu Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr 20 25 30

Phe Tyr Tyr Gly Gly Cys Leu Ala Lys Arg Asn Asn Phe Glu Ser Ala 35 40 45

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cye 50 55

<210> 107 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Quimotripsinogénio B maduro <4 Ο 0> 107

Cys Gly Val Pro Ala lie His Pro Val Leu Ser Gly Leu Ser Arg. He 1 5 10 15

Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Gly Ser Trp Pro Trp Gin Val Ser 20 25 30

Leu Gin Asp Lya Thr Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Leu lie Ser 35 40 45

Glu Asp Trp val val Thr Ala Ala His Cys Gly Val Arg Thr Ser Asp 50 55 60

Val Val Val Ala Gly Glu Phe Asp Gin Gly Ser Asp Glu Glu Asπ lie 65 70 75 80

Gin Val Leu Lya lie Ala Lys Val Phe Lys Asn Pro Lys Phe Ser He 65 90 95

Leu Thr Val Asn Asn Asp lie Thr Leu Leu Lys Leu Ala Thr Pro Ala 100 105 110

Arg Phe Ser Gin Thr Val Ser Ala Val Cys Leu Pro Ser Ala Asp Asp 115 120 125

Asp Phe Pro Ala Gly Thr Leu Cye Ala Thr Thr Gly Trp Gly Lys Thr 130 135 140

Lys Tyr Asn Ala Asn Lys Thr Pro Asp Lys Leu Gin Gin Ala Ala Leu 145 150 155 160

Pro Leu Leu Ser Asn Ala Glu Cys Lys Lys Ser Trp Gly Axg Arg lie 165 170 175

Thr Asp Val Met lie Cys Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ser Cys Met 180 185 190

Gly Asp Ser Gly Gly Pro lieu Val Cya Gin Lye Asp Gly Ala Trp Thr 195 200 205

Leu Val Gly lie Val Ser Trp Gly Ser Asp Thr Cys Ser Thr ser Ser 210 215 220

Pro Gly val Tyr Ala Arg Val Thr Lys Leu lie Pro Trp Val Gin Lys 225 230 235 240 lie Leu Ala Ala Asn 245

<210> 108 <211> 3141 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Transcrito de FVII - variante 1 <4 0 0> 108 agtcecatgg ggaatgteaa caggcagggg cagcactgca gagatttcat catggtctcc 60 caggccctca ggctcetctg ccttctgctt gggcttcagg getgcctggc cgcaggcggg 120 gtcgctaagg cctcaggagg agaaacacgg gacatgccgt ggaagccggg gcctcacaga 190 gtcttcgtaa cccaggagga agcccacggc gtcetgcacc ggcgccggcg cgccaacgcg 240 ttcctggagg agctgcggcC gggctccetg gagagggagt gcaaggagga geagtgctee 300 ttcgaggagg cccgggagat cttcaaggac goggagagga cgaagctgtt ctggatttct 360 tacagtgatg gggaceagtg tgeetcaagt ccatgooaga atgggggoto otgcaaggac 420 cagetccagt cctatatctg cttctgcctc cctgccttcg agggccggaa ctgtgagacg 480 cacaaggatg accagctgat ctgtgtgaac gagaaeggeg getgegagea gtactgcagt 540 gaccacacgg gcaecaagcg ctcctgtegg tgccacgagg ggtactctct gctggcagac 600 ggggtgtccC gcacaeccac agttgaatat ceatgtggaa aaatacctat tctagaaaaa 660 agaaatgcca gcaaacccca aggccgaact gtggggggca aggtgtgccc caaaggggag 720 tgtccatggc aggtcetgtt gttggtgaat ggagctcagt tgtgtggggg gaccctgatc 790 aacaccatct gggtggtctc cgcggcccac tgtttcgaca aaatcaaga* ctggaggaac 94 0 ccgatcgcgg tgctgggcga gcacgacctc agegageaeg acggggatga geagageegg 900 cgggtggcgc aggtcafccat eeccagcacg taegteeegg gcaccaccaa ccacgacatc 960 gcgctgctcc gccfcgcacca gcccgtggte etcactgacc atgtggtgcc cctetgcctg 1020 cccgaacgga cgtfcctctga gaggaegetg gccttcgtgc gcttctcatt ggteagegge 1030 tggggccagc tgctggaccg tggegecaeg gccctggagc tcatggteet caacgtgccc 1140 cggetgatga cccaggactg cctgcagcag teaeggaagg tgggagaetc cccaaatatc 1200 acggagtaca tgttctgtgc cggctactcg gatggeagea aggactcctg caagggggac 1260 agtggaggcc cacatgccac ccactaccgg ggcacgtggt acctgacggg catcgteagc 1320 tggggccagg gctgcgcaac egtgggccac tttggggtgt acaccagggt cfccccagtac 13ÔO atcgagtggc tgcaaaagct catgcgctca gagecacgee caggagtcct cctgcgagcc 1440 ccatttccct agcccagcag cectggcctg tggagagaaa gccaaggctg cgtcgaactg 1500 tcctggcacc aaatcccata tattettetg cagttaatgg ggtagaggag ggcatgggag 1560 ggagggagag gtggggaggg agacagagac agaaacagag agagacagag acagagagag 1620 actgagggag agactccgag gacatggaga gagactcaaa gagactccaa gattcaaaga 1680 gactaataga gacacagaga eggaatagaa aagatgagag gcagaggcag acaggcgctg 1740 gacagagggg caggggagtg ecaaggttgt cctggaggca gacagcccag ctgagcctce 1900 ttacctccct tcagccaagc ccacctgcac gtgatctgct ggcctcaggc tgctgctctg I860 ccttcattgc tggagacagt agaggeatga acacacatgg atgeacacaC acacacgcca 1920 atgcaeacac acagagatat gcacacacac ggatgeaeae acagatggtc acacagagat 1990 acgcaaacac accgatgcae acgcacatag agatatgeae acaeagatgc acacacagat 2040 atacacatgg atgcacgcac atgccaatgc aegcacaeat eagtgcacac ggatgcacag 2100 agatatgeae acaccgatgt gcgcacacac agatatgeae acacatggat gagcacacac 2160 acaccaatgc gcacacacac cgatgtacac acaeagatgc acacacagat gcacacacac 2220 egatgetgae tecatgtgtg ctgtcctctg aaggcggttg tttagctctc acttttctgg 2290 ctettatcca ttatcatctt eaetteagac aattcagaag catcaccatg cafcggeggeg 2340 aatgccccca aactctcecc caaatgtatt tetecetteg ctgggtgccg ggccgcacag 24oo actattcccc acctgcttcc cagcttcaca ataaaegget gcgtctcctc cgcacaectg 2460 tggtgectgc cacccactgg gttgcecatg attcattttt ggagcccccg gtgcteatcc 2520 tctgagatgc tcttttcttt cacaattttc aacatcactg aaatgaaccc tcacatggaa 2580 gctatttttt aaaaacaaaa gctgtttgat agatgtttga ggctgtagct cccaggatcc 2640 tgtggaattg gatgttctct ccctgccaca gcccttgtca atgatatttc acagagaccc 2700 tgggagcacc tgctcaagag tcagggaeac acgcatcact aaatgcaagt ccccaggccc 2760 tggctgcagt gggaggaect ggcaagctgc actcttgctg agtccccagg gtggtggaag 2820 aagaaegaga aacacatgaa cagagaaatg gggaggtgac aaacagtgcc cccactcaga 2B80 cteeggcaag cacggcfecag agagtggact egatgccatc cctgcagggc cgtcctgggc 2940 accaetggca cteacagcag caaggtgggc accattggca ctcacagcag caaggeagge 3000 aecagcaacc cacctcgggg gcactcaggc atcatctact teagageaga cagjgtctat 3060 gaactacagc cgtgggctgc ttccaaggca ccctgctctt gtaaataaag ttttatggga 3120 acacaaaaaa aaaaaaaaaa a 3141

<210> 109 <211> 3075 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> Transcrito de FVII - variante 2 <4 Ο 0> 109 agtcecatgg ggaatgtcaa caggcagggg cagcacbgca gagatttcat cabggtçbcc ¢0 caggCcctCi ggctcctctg ccttctgctt gggcttcagg gctgcctggc tgcagtcttc 120 gtaacccagg aggaagceca cggcgCcctg caccggcgee ggcgcgccaa cgcgttcctg 180 gaggagctgc ggccgggctc cctggagagg gagtgcaagg aggagcagtg ctccttcgag 240 gaggcccggg agatccccaa ggacgcggag aggacgaagc tgttctggab ttcttacagt 300 gatggggacc agtgtgcctc aagtccatgc cagaatgggg gctcctgcaa ggaccagetc 360 cagtoctata tetgcttctg cebceetgcc ttcgagggcc ggaactgtga gacgcacaag 420 gatgaccagc tgatetgtgt gaacgagaac ggcggctgtg agcagtectg cagtgaccac 480 acgggcaeca agcgctcctg tcggtgccac gaggggtact ctctgctgge agacggggtg 540 tcctgcaeac ccacagtcga atatccatgt ggaaaaatac ctattctaga aaaaagaaat 600 gccagcaaac cccaaggccg aattgtgggg ggcaaggtgt gccccaaagg ggagbgtcca 660 tggcaggtcc tgttgttggt gaatggagct cagbtgtgtg gggggaccct gatcaacace 720 atctgggbgg cctccgcggc ccactgcttc gacaaaatca agaactggag gaaectgatc 780 gcggtgctgg gcgagcacga ectcagcgag cacgacgggg atgagcagag ccggcgggtg 840 gcgcaggtca tcatccccag cacgtacgtc ccgggcacca ccaaccacga caCcgcgctg 900 ctccgcctgc accagcccgt ggtcctcact gaccatgtgg tgcccctctg cctgcccgaa 960 eggacgtbct ctgagaggac gctggccttc gcgcgcttct cattggtcag cggctggggc 1020 cagctgctgg eccgtggcgc cacggccctg gagctcatgg tcctcaacgt gccccggetg 1080 atgacccagg actgcctgca gcagtcacgg aaggtgggag actccccaaa tatcacggag 1140 tacabgttct gtgccggcta cbcggatggc agcaaggact cctgcaaggg ggacagtgga 1200 ggeecacatg ccacccacta ccggggeacg tggtacctga cgggcatcgt cagctggggc 1260 cagggctgcg caaecgbggg eeactttggg gtgtacacca gggtctccca gtacatcgag 1320 tggctgcaaa agctcatgcg ctcagagcca cgcccaggag toctcctgcg agccccattt 13Θ0 ccctagccca gcagccctgg cetgtggaga gaaagccaag gccgcgtcga aetgtcctgg 1440 caccaaabcc catatattct tctgcagtta atggggtaga ggagggcatg ggagggaggg 1500 agaggtgggg agggagacag agacagaaac agagagagac agagacagag agagactgag 1560 ggagagactc tgaggacatg gagagagact caaagagact ccaagattca aagagactaa 1620 cagagacaca gagatggaat agaaaagatg agaggcagag gcagacagge gcfcggacaga 16bo ggggcagggg agtgccaagg ttgtcccgga ggcagacagc ccagctgagc ctccttacct 1740 ccctteagcc aagcccacct gcacgtgatc tgctggcctc aggcbgctgc tctgccttca IB00 ttgctggaga cagtagagge atgaacacac abggacgcac acacacaeac gccaabgcae 1860 acacacagag atatgcacac acacggatgc acacacagat ggtcacacag agatacgcaa 1920 acacaccgat gcacacgcac atagagabat gcacacacag atgcacacac agabatacac 19B0 atggatgcac gcacatgcca atgcacgcac acatcagtgc acacggatgc acagagatat 2040 gcacacaccg atgtgcgcac acacagatat gcacacacat ggatgagcac acacacacca 2100 atgcgcaeae acaccgatgt acacacacag atgcacacac agatgcacac acaccgatgc 2160 tgactccatg tgtgctgbcc tctgaaggcg gttgtttagc tctcactttt ctggttctta 2220 tccattaeca tcttcacttc sgacaattca gaagcatcae catgcatggt ggcgaatgcc 2280 cccaaactcb cccccaaatg tatttctccc btcgcbgggt gccgggcbgc acagactatt 2340 ccccacctgc ttcccagctt cacaataaac ggccgcgtcb cctccgcaca cctgbggbgc 2400 etgecaccca ctgggttgcc catgattcat ttbtggagcc cccggbgctc accctctgag 2460 atgctcbttt ctttcacaat cttcaacatc actgaaatga accctcacat ggaagctatt 2520 btttaaaaac aaaagctgtt tgatagatgC ttgaggctgt agctcccagg accctgtgga 2580 abtggatgtt ctcbccctgc cacagccctt gtcaatgata tctcacagag accctgggag 2640 cacctgctca agagtcaggg acacacgcae cactaaatgc aagtteecag gce-ctggctg 2700 cagbgggagg acctggcaag ctgcactctt gctgagtccc cagggtggtg gaagaagaat 2760 gagaaacaca tgaacagaga aatggggagg bgacaaacag Cgcccccact cagactccgg 2820 caagcacggc tcagagagtg gactcgatgc catccctgca gggccgtcet gggcaccact 2980 ggcactcaca gcagcaaggt gggcaccatt ggcactcaca gcagcaaggc aggcaccagc 2940 aaeccacctc gggggcactc aggcatcate tacttcagag cagacagggt ctabgaacta 3000 cagccgtggg ctgcttccaa ggcaccccgc tcttgtaaat aaagttttat gggaacacaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaa 3075

<210> 110 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Domínio Gla do factor IX <4 Ο 0> 110

Tyr Asn Ser Gly Lye Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asti Leu Glu Arg 1 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Val 35 40 45

<210> 111 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Domínio Gla do factor X <400> 111

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu 1 5 10 ' 15

Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30

Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys 35 40 45

<210> 112 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Domínio Gla da protrombina/trombina <4 0 0> 112

Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu 1 S - 10 15

Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu 20 25 30

Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala 35 40 45

<210> 113 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Domínio Gla da proteína C <4 Ο 0> 113

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg Hís Ser Ser Leu GlU Arg Glu 1 5 10 IS

Cys lie Glu Glu lie Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu lie Phe Gin 20 25 30

Asn Vai Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys Hi,s Vai Asp 35 40 45

<210> 114 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Domínio Gla da proteína S <4 0 0> 114

Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu Thr Lys Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu 1 .5 10 15

Cys He Glu Glu Leu Cys Asn Lys Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe Glu 20 25 30

Asn Asp Pro Glu Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Vai 35 40 45

<210> 115 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Domínio Gla da osteocalcina (proteína Gla óssea) <4 0 0> 115

Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Vai Pro Tyr Pro Asp Pro Leu 15 10 15

Glu Pro Arg Arg Glu Vai Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cya Asp Glu Leu 20 25 30

Ala Asp his He Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly 35 40 45

<210> 116 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Domínio Gla da proteína Gla da matriz <4 Ο 0> 116

Arg Ala Lys Val Gin Glu Arg He Arg Glu Arg Ser Lys Pro Val Hia 1 5 10 IS

Glu Leu Asn Arg Glu Ala Cys Asp Asp Tyr Arg Leu Cys Glu Arg Tyr 20 2S 30

Ala Met Val Tyr Gly Tyr Asn Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe Arg 3S 40 45

<210> 117 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Domínio Gla da proteína 6 específica da paragem do crescimento <4 0 0> 117

Phe Glu Glu Ala Lye Gin Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu IS 10 IS

Leu Cys Ser Arg Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Asp Pro. Glu 20 2 5 30

Thr Aap Tyr Phe Tyr Pro Arg Tyr Leu Asp 35 40

<210> 118 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Domínio Gla da proteína Z <4 0 0> 118

Ala Gly Ser Tyr Leu Leu Glu Glu Leu Phe Glu Gly Asn Leu Glu Lys IS 10 IS

Glu Cys Tyr Glu Glu He Cya Val Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30

Glu Asn Glu Val Val Thr Aap Glu Phe Trp Arg Arg Tyr Lys 35 40 4 5

<210> 119 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Dominio Gla do factor VII <4 Ο 0> 119

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He ser Tyr Ser 35 40 45

<210> 120 <211> 40 <212> PRT <213> Notechis scutatus scutatus <22 0> <223> Protease do veneno semelhante ao factor de coagulação Xa - domínio Gla <22 0> <221> INCERTO <222> (0) ... (0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <4 0 0> 120

Ser Asn Ser Leu Phe Glu Glu Tie Arg Pro Gly Asn Ile Glu Arg Glu 1 Ξ 10 15

Cys Tie Glu Glu Lys Cys Ser Lys Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe Glu 20 25 30

Asp Asn Glu Lys Thr Xaa Xaa Phe 35 40

<210> 121 <211> 46 <212> PRT <213> Tropidechis carinatus <22 0> <223> Protease do veneno semelhante ao factor de coagulação Xa - domínio Gla <4 0 0> 121

Ser Asn Ser Leu Phe Glu Glu lie Arg Pro Gly A3n lie Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Ile Glu Glu Lys Cya Ser Lys Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe Glu 20 25 30

Asp Asn Glu Lys Thr Glu Thr Phe Trp Asn Vai Tyr Vai Asp 35 40 45 <210> 122 <211> 464

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Precursor da antitrombina III <4 0 0> 122

Met Tyr Ser Asn Val lie Gly Thr Val Thr Sec Gly Lys Arg Lys Val 1 S 10 15

Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Leu lie Gly Phe Trp Aap Cys Val Thr Cys 2Ò 25 30

His Gly ser Pro val Asp He Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp lie Pro 35 40 45

Met Asn Pro Met Cys He Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 50 55 60

Asp Glu Gly Ser Glu Gin Lys lie Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 65 70 75 80

Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gin 85 90 95

His Leu Ala Asp Ser Lyo Asn Asp Asn Asp Asn lie Phe Leu Ser Pro 100 105 110

Leu Ser lie Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 115 120 125

Aap Thr Leu Gin Gin Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr lie Ser . 130 135 140

Glu Lys Thr Ser Asp Gin lie His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 145 150 155 160

Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 165 170 175

Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gin Asp ISO 1B5 190 lie Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gin Pro Leu Asp Phe Lys 19S 200 205

Glu Asn Ala Glu Gin Ser Arg Ala Ala lie Asn Lys Trp Val Ser Asn 210 215 220

Lys Thr Glu Gly Arg lie Thr Asp. Val lie Pro Ser Glu Ala lie Asn 225 230 235 240

Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr He Tyr Phe Lys Gly Leu 245 250 255

Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 260 265 270

Lya Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala ser Met Met Tyr Gin Glu Gly 275 280 285

Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gin Val Leu Glu Leu 290 295 300

Pro Phe Lys Gly Asp Asp He Thr Met Val Leu lie Leu Pro Lys Pro 305 310 315 320

Glu Lys Ser Leu Ala Lye Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 325 330 335

Gin Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val val His Met 340 345 350

Pro Arg Phe Arg lie Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gin Leu Gin 355 360 365 ASp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 370 375 380

Gly lie Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 385 390 395 400

His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 405 410 415

Ser Thr Ala Val Val lie Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 420 425 430

Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro phe Leu Val Phe He Arg Glu val Pro 435 440 445

Leu Asn Thr lie lie Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys . 450 455 460 <213> Homo sapiens <22 0>

<210> 123 <211> 432 <212> PRT <223> Antitrombina III madura <4 0 0> 123

His Gly Ser Pro VaX Asp lie cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp lie pro 15 10 15

Met Asn Pro Met Cyg lie Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 20 25 30

Asp Glu Gly Ser Glu Gin Lye He Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 35 40 45

Trp Glu Leu Ser Lya Ala Aen Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gin 50 55 60

His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn lie Phe Leu Ser Pro 65 70 75 B0

Leu Ser lie Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lya Leu Gly Ala Cys Asn B5 90 95

Asp Thr Leu Gin Gin Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr He Ser 100 105 110

Glu Lys Thr Ser Asp Gin lie His Phe Phe Phe Ala Lya Leu Asn Cys

115 120 12S

Arg Leu Tyr Arg Lya Ala Aen Lya Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 130 135 140

Arg Leu Phe Gly Asp Lya Ser Leu Thr Phe Aan Glu Thr Tyr Gin Asp 145 150 155 1G0 lie Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gin Pro Leu Asp Phe Lys 165 170 175

Glu Asn Ala Glu Gin Ser Arg Ala Ala rle Asn Lys Trp val ser Asn 1B0 105 . 190

Lys Thr Glu Gly Arg He Thr Aop Val He Pro Ser Glu Ala lie Aan 195 200 205

Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr He Tyr phe Lya Gly Leu 210 215 220

Trp Lyfl Ser Lys Phe Ser Pro Glu Aan Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 225 230 235 240

Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys ser Ala ser Met Met Tyr Gin Glu Gly 245 250 255

Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gin Val Leu Glu Leu 260 265 270

Pro Phe Lys Gly Asp Asp lie Thr Mat Val Leu He Leu Pro Lys Pro 275 280 285

Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lya Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 290 295 300

Gin Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 305 310 315 320

Pro Arg Phe Arg lie Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gin Leu Gin 325 330 335

Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 340 345 350

Gly He val Ala Glu Gly Arg Aep ASp Leu Tyr Val ser Asp Ala Phe 35S 360 365

His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 370 375 3 B0

Ser Thr Ala Val Val Tie Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 395 390 395 400

Thr Phe Lys Ala Asπ Arg Pro Phe Leu Val Phe He Arg Glu Val Pro 405 410 415

Leu Asn Thr He He Phs Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 420 425 430 <213> Homo sapiens <22 0>

<210> 124 <211> 263 <212> PRT <221> THIOLEST <222> (0) ... (0) <223> Factor tecidual maduro <4 0 0> 124

Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 1 5 10 15

Thr Asn phe Lys Thr lie Leu Glu Trp Glu Pro Lye Pro Val Asn Gin 20 25 30

Val Tyr Thr Val Gin lie Ser Thr Ly3 Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45

Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu lie Val 50 55 60

Lys Asp Val Lys Gin Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 βο

Gly Aan Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 05 90 95

Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gin pro Thr 100 10S 110 lie Gin Ser phe Glu Gin Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125 ASp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140

Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu lie Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser 145 ISO 155 160

Ser ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu 165 170 175

He Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gin Ala Val 180 105 190 lie Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu 195 200 205

Cyg Met Gly Gin Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu tie Phe Tyr lie lie 210 215 220

Gly Ala Val Val Phe Val Val lie He Leu Val He lie Leu Ala lie 22S 230 235 240

Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gin Ser Trp Lys Glu 245 250 255

Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser 260

<210> 125 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60Y <4 Ο 0> 125

Ala Asti Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Zle Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Sar Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 6S 70 75 BQ

Cys Glu Thr His Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cye Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cye Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Aan Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 1Θ5 190

His Cys Phe Tyr Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu L«u Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

Hia Val Val Pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hie Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3S5 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lye Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 126 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60F <4 Ο 0> 126

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lya Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 €0

Leu Gin Ser Tyr lie cys Ptie Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn SS 70 75 00

Cya Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly SS 90 55

Gly Cys Glu Gin Tyr Cya Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 13S 140

Aen Ala Ser Lya Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro i; 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ΙβΟ 185 190

His Cys Phe Phe Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 155 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 230 255

His Val Val Pro Leu Cya Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 . 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 250 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly.Asp ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 127 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60W <4 Ο 0> 127

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Aap 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Aap Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lye Aap Aap Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Aan Gly 8S 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Trp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 26E 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met val Leu Asn val pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Αβη lie Thr Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lya Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hie Ala Thr His Tyr 340 34S 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 3B0

Glu Trp Leu Gin. Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 4Q0

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 128 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60L <4 Ο 0> 128

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Sly Ser Leu Glu Arg Glu is 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Clu He phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Pbe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr' lie Cys Fhe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Abp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 95 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Hie Thr Gly Thr Lys Arg Sftr Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin

165 170 17S

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cy3 Phe Leu Lya lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His ASp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met val Leu Asn Val pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 3B0

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 129 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60I <4 Ο 0> 129

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lya Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val ser Ala Ala 180 18S 190

His Cys Phe lie Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 2IS 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Αβη 225 230 235 240

Hia Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

Hia Val Val Pro Leu Cya Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 34S 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hia Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu pro Arg Pro Gly Val Leu 3B5 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 130 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Factor Vila - variante K60ai <4 Ο 0> 130

Ala Αξπ Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Aen Glu Asn Gly 05 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lye Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lya Arg 130 135 140

Aen Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys val cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Asp lie He Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 22S 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu ilia Gin Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 25S

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Aen Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser ATg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 305 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 131 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aV <4 Ο 0> 131

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu. Leu Arg Pro GLy Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 10

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 15 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cye Lye Asp Gin 5 0 55 60 '

Leu Gin Ser Tyr lie Cy9 Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

£5 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cye Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cya Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cya Phe Asp Val He Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 2S0 255

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Aan Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 305 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 132 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aF <4 Ο 0> 132

Ala Asn Ala Ptie Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly 5er Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 SB €0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lye Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly B5 $0 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys HÍ3 Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cya Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lye Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala 180 IBS iso

His Cya Phe Aap Phe lie Lya Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu KÍ3 Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 2S0 265

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp CyS Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu 365 390 395 400

Leu Arg Ala Fro Phe Fro 405

<210> 133 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K60aW <4 Ο 0> 133

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Qlu 1 S 10 IS

Cys Lys Glu; Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu rle Phe Lys 20 25 30

Aap Ala Glu Arg Thr Lya Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 15 40 45

Gin Cys Ala ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 TO 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Aap His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lye Gly Glu cys Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Trp lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg.Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 134 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante G97W <4 Ο 0> 134

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lye Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Aap Gly Aap 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lya Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala iso 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 2L5 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Trp Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Hia Gin Pro Val val Leu Thr Aap 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Aap Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser ' 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr val Gly His Phe Gly val iyr Thr Arg val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu 385 ISO 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 135 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante G97T <4 Ο 0> 135

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys slu Glu Gin Cye Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin ser Tyr lie Cy3 Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cya Ser Asp Hie Thr Gly Thr tys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 ' 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lye Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cye Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 100 185 190

His cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Thr Thr Thr Asn 22S 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

Hie Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 260 265

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu

385 390 395 40G

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 136 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante G97I <4 Ο 0> 136

Ala. Asπ Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu

15 10 IS

Cys Lye Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 €0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin 165 17 D 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala 1B0 1Θ5 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu Tie Ala Val Leu 195 200 205

Sly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie 11« Pro Ser Thr Tyr Val Pro He Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys A3p Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 140 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin. Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala pro Phe Pro 405

<210> 137 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante G97V <4 Ο 0> 137

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 35 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu Tie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Hia Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp 245 250 255

His val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 2Θ5

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 3 D5 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Çly Ser 325 330 335

Lys Asp ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 360

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3ΘΞ 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 138 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante K192Q <4 Ο 0> 138

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lye 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr LyaLeu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 S5 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr Hie Lys Asp Asp Gin Leu He Cya val Asn Glu Asn Gly B5 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lye Arg 130 115 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 1^0 155 160

Lys Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin

165 170 17S

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala ISO. 185 190

His Cye phe Aep Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 . 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 23s 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 200 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin ASp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn 31e Thr Glu Tyr Met Ph« Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr val Gly Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr He_ 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu '3B5 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 139 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60K/K60aL <4 Ο 0> 139

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu phe Trp lie Sex Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly B 5 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr ser Leu Leu Ala A3p Gly val Ser cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lye Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 160 185 190

His Cys Phe Lys Leu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 20S

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin val lie lie Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val val Pro Leu cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 140 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60F/K60aL <4 Ο 0> 140

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cye lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lya 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lya Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala ser Ser Pro Cya Gin ash Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 ¢0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Sin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Aap His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys his Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

11S 120 L2S

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cya Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 13S 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lya Val Cys Pro 145 150 1SS 160

Lya Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phè Phe Leu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

Hi8 Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro val val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 200 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 230 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr aly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 141 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60L/K60aL <4 Ο 0> 141

Ala Asn Ala. Pile Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Fhe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys hya Asp Gin 50 55 6 0

Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 6S 70 75 80

Cys Glu Thr His Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lye Pro Gin Gly Arg rle Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 16S 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 IBS 190

Hie Cys Phe Leu Leu He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 22S 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Agp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu val ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu . 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp ser cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3 5S 360 365

Ala Thr Vãl Giy His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Fro Phe Pro 405

<210> 142 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60M/K60aL <4 Ο 0> 142

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu leu Arg Pro Gly Ser Leu Girt Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 2D 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Aap Gly Asp 3S 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin ser Tyr lie Cys Phe cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly S5 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys- Thr LIS 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Met Leu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Aap Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Aap Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Fro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 40S

<210> 143 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60W/K60aL <4 Ο 0> 143

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu ATg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cye Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser cys Lys Aap Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 7 0 75 ΒΠ

Cys Glu Thr Kis Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly CTys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cye 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lye Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 1B5 190

His Cys Phe Trp Leu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin 5er Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

Hie Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cye Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Kis Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 144 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60F/K60aE <4 Ο 0> 144

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin. 50 55 60

Leu Gin ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 6S 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He,Cys vai Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys Hi3 Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr vai Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lye Val Cye Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu cys Pro Trp Gin val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cye Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp val val ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Phe Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu Hie Asp Leu Ser Glu His ASp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin Val lie lie Pro ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Sin Pro Val val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser. Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 265

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cya Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cye 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr Tie 370 375 360

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Fro Arg Pro Gly Val Leu 36S 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 145 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60W/K60aE <4 Ο 0> 145

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie phe Lys 20 25 30 "

Asp Ala Glu Arg Thr Lye Lou Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 S5 eo

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

¢5 70 75 SO

Cys Glu Thr Hia Lys Asp Asp Gin Leu lie Cy3 val Asn Glu Asn Gly 85 SO 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys. 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Agp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cya Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lyfl Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cya Phe Trp Glu lie Lys Aen Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 '

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 2BO 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Lieu Gin Gin Sér Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn Tie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lye Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 146 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante D60V/K60aE <4 Ο 0> 146

Ala Asn Ala Pile Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu

IS 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser ser pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cye Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cye Glu Thr His Lya Asp Aap Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys LOO 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Αβπ Oly Ala Gin

165 170 17S

Leu Cya Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 135 190

His Cy3 Phe Val Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Slu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp Tie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Aap Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Men Val Leu Asn val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Aap Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Aap Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

325 330 33S

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 37S 3 B0

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3B5 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 147 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante L163V/S170bE/K188A/F225Y <4 Ο 0> 147

Ala Aan Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu 11a Phe Lya 20 2S 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 3S 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 SO

Leu Gin Ser Tyr tie.Cys Phe Cys Leu pro Ala Phe Glu Gly Arg Αβπ fiS 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly cya Glu Gin Tyr Cys Ser Aap His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 11S 120 125

Pro Thr val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cya Pro 145 150 155 1G0

Lys Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 185 190

His Cy3 Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 19S 200 2D5

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Fro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 26S 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 27S 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu net Val Leu Aen Val Fro Arg 290 295 300

Val Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Glu Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Ala Asp Ser Cys Lye Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3S5 360 365

Ala Thr Val Gly His Tyr Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala pro Phe Pro 405

<210> 148 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante M156Q <4 Ο 0> 148

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 10

Asp Ala Glu Arg Thr Lye Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 S£ ¢0

Leu Gin Set Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 60

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lye He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 13S 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lye Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu ILe Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn. Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He lie Pro ser Thr Tyr Val pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin val Leu Asn val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lye Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala-Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Net Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu

385 390 395 4 DO

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 149 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante V21D/E154V/M156Q <4 Ο 0> 149

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Sex Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

6 5 70 7 5 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly SS 90 95

Gly cys Glu Gin Tyr Cya Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys LOO 105 110

Arg Cys Hia Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 , 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 24 S 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu val Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 150 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Factor Vila - variante V21D/E154V/M156Q/K188A <4 Ο 0> 150

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 13

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu ile Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Àrg Thr Lys Leu Phe Trp Xle Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 S5 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly as 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 10S 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly vai Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Vai Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Lev Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr ile Trp vai vai Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Aen Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Vai Ala Gin Vai IJe lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

Hia Aap lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp 245 250 255

His Vai vai Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Vai Arg Phe Ser Leu vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Vai Leu Gin Vai Leu Asn Vai Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Ala Aap Ser Cys Lya Gly Aap Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly ile vai Ser Trp Gly Gin Gly cys 3S5 360 365

Ala Thr Vai Gly His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr He 370 375 330

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 151 <211> 4278 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Vector pCMV-Script <4 Ο 0> 151 atgcattagt tattaatagt aatcaaccac ggggteatta gttcatagcc catatatgga 60 gteccgcgee acataactta cggtaaaCgg CCcgcoeggc tgaccgccca acgacccccg 120 cccategacg tcaataatga cgtatgtccc catagtaacg ccaataggga ctCtccattg 180 aegteaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240 tatgccaagt acgcccccLa ttgacgteaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300 ccagtacatg aecttatggg actttoctac ttggcagtac atctacgtat tagtcafccgc 360 tattaccatg gtgatgcggt tttggcagCa catcaatggg cgtggatagc ggtctgactc 420 acggggattt ccaagtetcc accçcafctga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 4B0 tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540 gcgtgeacgg tgggaggccc atataagcag agctggttta gtgaaccgCc agatccgcta 600 gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccacc 660 gcggtggcgg ccgctctagc ccgggcggat cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc 720 ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ecggtaecag gtaagtgtac ccaattcgcc 7BQ ctatagtgag tegtattaca attcaetcga tcgeecttcc caacagctgc gcagcctgaa 840 tggcgaatgg agatcceatfc tttaagtgca Caatgtgtta aactactgat tctaattgtt goo tgtgtatttt agattcacag tcccaaggct catttcaggc ccctcagtcc tcacagtctg 960 ttcatgatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc 1020 ccacacctcc ccecgaacet gaaacataaa abgaacgcaa ttgttgttgt taacttgttt 1080 attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagça 1140 ttttttecac tgcattcfcag ttgeggtteg tccaaactca tçaatgtacc ttaaegcgta 1200 aattgtaagc gttaatattt tgtfcaaaatt cgcgttaaat tfcttgttaaa tcagctcatt 1260 ttttaaccaa taggccgaaa teggeaaaat cccccataaa tcaaaagaat agaccgagat 1320 agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa 1380 cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta 1440 atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc 1500 ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc 1560 gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc aegctgegcg taaccaccac 1620 acccgccgcg cttaatgcgc cgetaeaggg cgcgtcaggt ggcaçfcttte ggggaaatgt 16B0 gcgcggaacc cctatctgtt tattcttcta aacacattca aatatgtatc cgctcatgag 1740 acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagaaccctg aggcggaaag 1800 aaccagctgc ggaatgtgcg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc,cccagcaggc 1860 agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagoaacca ggtgtggaaa gteeccaggc 1820 tccccagcag gcagaagtat gcaaagcacg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 1980 cccctaaetc cgcccatccc gcccctaact cegcccagtt ccgcccattc tccgccccat 2040 ggetgactaa ttttttctat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 2100 cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaagaccg atcaagagac 2160

aggacgagga tcgtttegca cgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggcegc 2220 ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag açaatqggct gebetgatgc 2280 cgfiOgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttett tttgtcaaga ccgacctgtc 2340 cggtgccctg aatgaactge aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 2400 ogctccttgc gcagctgtgc tcgacgttgn cactgaagcg ggaagggacc ggctgctatt 2460 gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc ateteacctt gctcctgccg agaaagtatc 2520 catcatggct gatgcaatgo ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 2580 ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 2640 tcaggatgat ctggacgaag aacatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 2700 caaggcgage atgccegaeg gegaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 2760 gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 2820 ggcggaocgc tatcaggaca tagcgttggc taccegtgat attgctgaag aactcggcgg 2880 cgaatgggct gaccgcttec tcgtgcttta cggeatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 2940 cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc 3000 gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatfctcgatt coaccgccgc ettetatgaa 3060 aggttgggct tcggaabcgt tttcegggaç gccggctgga tgatcctcca g-egcggggat 3120 cfccatgctgg agttcttcgc ccaccctagg gggaggccaa ctgaaacacg gaaggagaca 3180 ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca ataaaaagác agaataaaac gcacggtgtt 3240 gggtcgtttg ttcataaacg cggggtCcgg tcccagggcC ggcactctgt cgatacccca 3300 ecgagaccec atcggggcca atacgcccgc gtttctCcct tttccccacc ccacccccca 3360 agttegggtg aaggcccagg gcccgcagcc aacgtcgggg cggcaggccc tgecatagcc 3420 tcaggttaee catatatact ttagattgat ttaaaactte atttttaatt caaaaggatc 3480 taggtgaaga tcdtttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgctq 3540 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagacc aaaggaectfc cetgagatcc tttttttctg 3600 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgcttgccg 3660 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 3720 aatactgccc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccace tcaagaactc tgtagcaccg 3780 cctacatace tcgctctgct aatcctgtta ocagtggctg ctgecagtgg cgataagtcg 3840 tgtcttaccg ggttggactc aagaegatag tbaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 3900 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaecga actgagaCac 3960 cLacagcgtg agctatgaga aagcgccacg ettcccgaag ggagaaagge ggaeaggtat 4020 ccggtaagcg gcagggtegg aacaggag&g egeaegaggg agcttccagg gggaaacgcc 4080 tggtatcttc atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagegteg atttttgtga 4140 tgctcgtcag gggggeggag ectatggaaa aacgccagca aegeggeett tttacggttc 4200 ctggcccctt getggeettt tgetcaeatg ttetttcctg cgttatcgec tgattctgtg 4260 gacaaccgca tcacegcc 427B

<210> 152 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR directo para o factor VII CBO-125 <4 0 0> 152 gcatcatgac gtgaeggate cgccaccatg gtctcccagg ccctc 45

<210> 153 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador de PCR inverso para o factor VII CBO-126 <4 0 0> 153 gategtaega taegtgaatt cctagggaaa tggggctcgc aggag 45

<210> 154 <211> 1398 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <223> ADNc de FVII (molde para PCR) <4 0 0> 154 atggtcteee aggceeteag gcteetctgc cttetgcttg ggcttcaggg ctgcctggct βο gcaggcgggg tcgctaaggc ctcaggagga gaaacacggg acatgccgtg gaagccgggg 120 cctcacagag tcttcgtaac ccaggaggaa geccacggcg tccfcgcaccg gcgccggcgc ISO gccaacgcgt tcctggagga gctgcggccg ggctccctgg agagggagtg caaggaggag 240 cagtgctcct Ccgaggagge ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagetgttc 300 tggatttctt acagegatgg ggaecagtgt gcctcaagte catgccagaa tgggggetcc 360 tgcaagga.cc agctccagtc efcstatctgc ttctgcctcc ctgccttcga gggccggaac 4 20 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgageag 480 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 540 ctggeagaeg gggtgtcetg eacacccaca gttgaatate catgtggaaa aatacctatt eoo ctagaaaaaa gaaatgccag caaaeeecaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 660 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 72 0 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggcecact gtttcgacaa aatcaagaac 780 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 840 eagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 900 cacgaeatcg cgctgctecg ectgcaccag cccgtggtcc tcactgaeea tgtggtgccc 960 ctctgcctgc ccgaacggae gttcfcccgag aggacgctgg ccttcgtgcg cttctcattg 1020 gtcagcggct ggggccagct gctggaccgt ggcgccacgg ccctggagct catggtcctc 1080 aacgtgcccc ggctgatgae ccaggactgc ctgçagcagt cacggaaggt gggagactce 1140 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctgc 1200 aagggggaca. gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggc 1260 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1320 tcceageaea fccgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1380 ctgcgagccc catttccc 1398

<210> 155 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador D60 tipo selvagem <4 0 0> 155 gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac tgg 33

<210> 156 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Iniciador CBO-157 D60K <4 Ο 0> 156 gcggcccact gtttcaagaa aatcaagaac tgg 33

<210> 157 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-158 D60R <4 0 0> 157 gcggcccact gtttcaggaa aatcaagaac tgg 33

<210> 158 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-159 D60A <4 0 0> 158 gcggcccact gtttcgcgaa aatcaagaac tgg 33

<210> 159 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador K60a tipo selvagem <4 0 0> 159 gcccactgtt tcgacaaaat caagaactgg agg 33

<210> 160 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Iniciador CBO-160 K60aD <4 Ο 0> 160 gcccactgtt tcgacgacat caagaactgg agg 33

<210> 161 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-161 K60aE <4 0 0> 161 gcccactgtt tcgacgagat caagaactgg agg 33

<210> 162 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> alelo <222> (0) ... (0) <22 0> <223> Iniciador CBO-162 K60aA <4 0 0> 162 gcccactgtt tcgacgcgat caagaactgg agg 33

<210> 163 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-163 K60aL <4 0 0> 163 gcccactgtt tcgacctcat caagaactgg agg 33

<210> 164 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-164 K60aY <4 0 0> 164 gcccactgtt tcgactatat caagaactgg agg 33

<210> 165 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador K60c tipo selvagem <4 0 0> 165 tgtttcgaca aaatcaagaa ctggaggaac ctg 33

<210> 166 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-165 K60cD <4 0 0> 166 tgtttcgaca aaatcgacaa ctggaggaac ctg 33

<210> 167 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-166 K60cE <4 0 0> 167 tgtttcgaca aaatcgagaa ctggaggaac ctg 33

<210> 168 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-167 K60cA <4 0 0> 168 tgtttcgaca aaatcgcgaa ctggaggaac ctg 33

<210> 169 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador T99 tipo selvagem <4 0 0> 169 tacgtcccgg gcaccaccaa ccacgacatc gcg 33

<210> 170 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-168 T99A <4 0 0> 170 tacgtcccgg gcaccgcgaa ccacgacatc gcg 33

<210> 171 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador R147 tipo selvagem <4 0 0> 171 ggccagctgc tggaccgtgg cgccacggcc ctg 33

<210> 172 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-169 R147D <4 0 0> 172 ggccagctgc tggacgacgg cgccacggcc ctg 33

<210> 173 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-170 R147E <4 0 0> 173 ggccagctgc tggacgaggg cgccacggcc ctg 33

<210> 174 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-171 R147A <4 0 0> 174 ggccagctgc tggacgcggg cgccacggcc ctg 33

<210> 175 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador K192 tipo selvagem <4 0 0> 175 agcaaggact cctgcaaggg ggacagtgga ggc 33

<210> 176 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-172 K192R <4 0 0> 176 agcaaggact cctgccgcgg ggacagtgga ggc 33

<210> 177 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador para mutantes múltiplos tipo selvagem <4 0 0> 177 gtggtctccg cggcccactg tttcgacaaa atcaagaact ggaggaacct gatcgcggtg 60

<210> 178 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-177 D60R/K60aE/K60cE <4 0 0> 178 gtggtctccg cggcccactg tttcagggag atcgaaaact ggaggaacct gatcgcggtg 60

<210> 179 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-178 D60K/K60aE/K60cE <4 0 0> 179 gtggtctccg cggcccactg tttcaaggag atcgaaaact ggaggaacct gatcgcggtg 60 <210> 180 <211> 60

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBO-179 D60R/K60aM/K60cE <404> 180 gtggtctccg cggcccactg tttcaggatg atcgaaaact ggaggaacct gatcgcggtg 60

<210> 181 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-54 K60al <4 0 0> 181 gcccactgtt tcgacatcat caagaactgg agg 33

<210> 182 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-55 K60aV <4 0 0> 182 gcccactgtt tcgacgtcat caagaactgg agg 33

<210> 183 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-56 K60aF <4 0 0> 183 gcccactgtt tcgacttcat caagaactgg agg 33

<210> 184 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-57 K60aW <4 0 0> 184 gcccactgtt tcgactggat caagaactgg agg 33

<210> 185 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-58 K60aM <4 0 0> 185 gcccactgtt tcgacatgat caagaactgg agg 33

<210> 186 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-59 D60F <4 0 0> 186 gcggcccact gtttctttaa aatcaagaac tgg 33

<210> 187 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-60 D60Y <4 0 0> 187 gcggcccact gtttcataaa aatcaagaac tgg 33

<210> 188 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-61 D60W <4 0 0> 188 gcggcccact gtttctggaa aatcaagaac tgg 33

<210> 189 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-62 D60L <4 0 0> 189 gcggcccact gtttcgagaa aatcaagaac tgg 33

<210> 190 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-63 D60I <4 0 0> 190 gcggcccact gtttcatcaa aatcaagaac tgg 33

<210> 191 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador G97 tipo selvagem <4 0 0> 191 agcacgtacg tcccgggcac caccaaccac gac 33

<210> 192 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-64 G97W <4 0 0> 192 agcacgtacg tcccgtggac caccaaccac gac 33

<210> 193 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-65 G97T <4 0 0> 193 agcacgtacg tcccgacgac caccaaccac gac 33

<210> 194 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-66 G97I <4 0 0> 194 agcacgtacg tcccgatcac caccaaccac gac 33

<210> 195 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-67 G97V <4 0 0> 195 agcacgtacg tcccggtcac caccaaccac gac 33

<210> 196 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-68 K192Q <4 0 0> 196 agcaaggact cctgccaggg ggacagtgga ggc 33

<210> 197 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador K60aL/D60 tipo selvagem <4 0 0> 197 gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac tgg 33

<210> 198 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-69 K60aL/D60K <4 0 0> 198 gcggcccact gtttcaagct catcaagaac tgg 33

<210> 199 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-70 K60aL/D60L <4 0 0> 199 gcggcccact gtttcctcct catcaagaac tgg 33

<210> 200 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-71 K60aL/D60F <400> 200 gcggcccact gtttctttct catcaagaac tgg 33

<210> 201 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-72 K60aL/D60M <400> 201 gcggcccact gtttcatgct catcaagaac tgg 33

<210> 202 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-73 K60aL/D60W <400> 202 gcggcccact gtttctggct catcaagaac tgg 33

<210> 203 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-74 D60F <400> 203 gcggcccact gtttctttga gatcaagaac tgg 33

<210> 204 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-75 D60W <400> 204 gcggcccact gtttctggga gatcaagaac tgg 33

<210> 205 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador CBOLH-76 D60V <400> 205 gcggcccact gtttcgtcga gatcaagaac tgg 33

<210> 206 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> R290N <4Ο0> 206

Ala As π Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg GLu 15 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Aap Ala Glu Arg Thr Lya Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Aap Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Aap Gin 50 SS 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cya Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Aan Glu Asn Gly 05 90 95

Gly cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 IDS 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr Tie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin tro Val Val Leu Thr Aap 245 250 255

Hia Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe' Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Aap Asn Gly Ala Thr Ala Lsu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg '290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Aap Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Cly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 207 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> R290Q <4Ο0> 207

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Sly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Gy a Lys Glu Glu Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin AsnGly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly BS 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 LOS 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lye Arg

130 135 HO ASn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cya Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu 5er Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Hia Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 25Ξ

His val Val pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Gin Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu.Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 3 7S 350

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 208 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> R290K <4Ο0> 208

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly 3er Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cya Lye Glu Glu Gin Cys Set Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 2S 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 3 S 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 ¢0

Leu Gin Ser Tyr Tie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Agn 65 70 75 BO

Cys Glu Thr Mis Lys Asp Asp Gin Léu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 SO 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Kis Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 no

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Fro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lye Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn. Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 IB5 ISO

Hie Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ale Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 21S 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Αθπ 225 23D 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 2B0 285

Asp Lys Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Aep Ser Cya Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr val Gly His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr lie 370 37S 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 209 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> R290M <4Ο0> 209

Ala Asn Ala Phe Uu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lya 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 -JO 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly SS 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cye Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys LOO 105 . 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro rhr Val Glu Tyr Pro Cya Gly Lys lie Pro 11« Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He val Gly Gly Lya val Cys Pro 145 150 1SS 160

Lys Gly Glu Cys Fro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 173

Leu cys Gly Gly Thr Leu 11« Asn Thr He Trp Val val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu S«r Glu His Asp Gly Asp Glu Gin ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Met Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cya Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

325 330 33S

Lye Aep ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp G2y Gin Gly Cys 255 350 355

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 365 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 210 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> R290V <4Ο0> 210

AlA Asn Ala Phe Leu Qlu Glu Leu Arg Pro Sly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 IS

Cye Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Aep Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cye Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr Jle Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 2SS

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp val Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 'Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cya Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cya 355 360 36S

Ala Thr Val Gly Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 211 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K341N <4Ο0> 211

Ala Αξπ Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Sox' Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Sex' Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro Ala phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 Θ0

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn. Glu Asn Gly 05 50 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 10S 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lye lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie LyS Asn Trp Arg Asn Leu rle Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val Zle He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp ser Cys Asn Gly Asp ser Gly Gly pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 212 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K341M <4Ο0> 212

Ala Asn Ala Fhe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IB 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

S5 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp A3p Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Aan Gly 05 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg tie Val Gly Gly Lys Val Cys Fro 14S ISO 155 150

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 163 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 100 1ΒΞ 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr vai Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Agn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Met Cly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Çys 355 360 365

Ala Thr val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 300

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3B5 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 213 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K341D <4Ο0> 213

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Clu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lye 2D 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin CyS Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 ¢0

Leu Gin ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 90

Cys Glu Thr Kis Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Aen Gly 85 90 55

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser A3p His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lya lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cya Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu ser Glu Kis Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 23S 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Lau

275 ΞΒ0 28S

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Scr 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Asp Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Cly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 300

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Lau 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 214 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237T238insA <4Ο0> 214

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp, -3 5 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cye Lye Asp Gin 50 55 60

Leu Gin. Ser Tyr lie Cys Phe cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

55 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cye Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 14 o

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 150

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cye Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 300 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Ala Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Hie Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe .Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 2 B0 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn He Thr Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Zle Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380

He Glu Txp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 215 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237T238insS <4Ο0> 215

Ala hen Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Clu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lye 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Aap 35 40 45

Gin Cye Ala Sec Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

S5 70 75 BO

Cys Glu Thr Hia Lys Aap Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cye 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

115 120 12S

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cye Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lye Arg 130 135 140

Aan Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro L4S 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val ASIi Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala

180 185 19Q

His cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin. Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro ser Thr Tyr Val Pro Gly Ser Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cye Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350 -

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg val ser Gin Tyr 370 375 380

He Glu Trp Leu Gin Lya Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro. 405

<210> 216 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237T238insV <4Ο0> 216

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Fro Sly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cye Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 no 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Val Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His val val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Cln Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly

325 330 33S

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr val Gly Hi9 Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 217 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237T238insAS <4Ο0> 217

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 31/ Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie phe Lys 20 2S 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin cys Ala Ser Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser cys Lye Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr cys ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lya Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Α3Π Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 IBS 190

His Cys Phe Aep Lye lie Lys Asn Trp Arg Aan Leu lie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Ala Ser Thr 225 230 235 240

Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin pro Val Val Leu 245 250 255

Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr phe Ser Glu 260 265 270

Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin 275 280 285

Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val 290 295 300 pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly 305 310 315 320

Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp 325 330 335

Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr 340 345 350

His Tyr Arg gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val $er Trp Gly Gin 355 360 365

Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin 370 375 380

Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly 385 390 395 400

Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 218 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237T238insSA <4Ο0> 218

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lye Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Aap Gin 50 55 ¢0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn ,65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Hla Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys lOO 105 110

Arg cys Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aep Gly Val ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lye Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 1S5 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175 i«u Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

Hie Cya Phe Asp Lys lie Lya Aan Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Ser Ala Thr 225 230 235 240

Thr Asn His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu 245 250 255

Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu 260 265 270

Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin 275 280 285

Leu Lau Aap Arg Qly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val 290 295 300

Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly 305 310 315 320

Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp 32S 330 335

Gly ser Lys Asp Ser Cys Lye Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr 340 345 350

His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He val Ser Trp Gly Gin 355 360 365

Gly Cys Ala Thr val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin

370 375 3 BO

Tyr lie Olu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly 385 390 395 400

Val LèU Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 219 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> D196K197insK <4Ο0> 219

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lye 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Tiir Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Aep Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ásn 65 70 75 80 cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asπ Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 1L0

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr val Glu Tyr Pro cys Gly Lys He Pro Tie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lye Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Fro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Lçu lie Asn Thr lie Trp Val val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys Lys lie Lya Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin ser Arg 210 . 215 220

Arg Val Ala Gin Val He He pro Ser Thr Tyr Val pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro val Val Leu Thr 245 250 255

Aap Hia Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 2B0 295

Leu Aep Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Aap 30Ξ 310 315 320

Ser Fro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Sly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly ASp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 3S0 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 390 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 350 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 220 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> D196K197insR <4Ο0> 220

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cya Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lya Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin set Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 8S 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Çys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lye Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lye Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 173

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 185 190

His Cys Phe Asp Arg Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Gig Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 2B5

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 29S 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380

He Glu Trp Leu Gin. Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Fro Gly Val 335 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 221 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> D196K197insY <4Ο0> 221

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lye Glu Glu Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lye leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro CyB Gin Asn Gly Gly Ser Cya Lya Asp Gin 50 55 50

Leu Gin Ser Tyr lie Cya Phe Cya Leu pro Ala Pile Glu Gly Arg Asn 6S 70 75 80

Cys Glu Thr Hia Lys Aap Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 »5

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lya He Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 ISO 155 150

Lys Gly Glu cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 165 190

His Cys Phe Asp Tyr Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp Hie val val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe ser Glu Arg 260 265’ 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 2B5

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hie Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lya Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 222 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> D196K197insW <4Ο0> 222

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Fro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Lyfi Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 35 30

Asp Ala Qlu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr rle Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 05 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 10S 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cye Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 1P0

His Cys Phe Asp Trp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 230 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu ,Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380

He Glu Trp Leu Gin Lys Leu net Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 223 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> D196K197insA <4Ο0> 223

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Glu Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lyg Leu Pile Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys LyS Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Fhe Cys Leu Pro Ala phe Glu Gly Arg Asn 65 TO 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lye Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Asp Ala Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Per Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr phe ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 250 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cyo Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His . 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 224 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Dl96K197insM <4Ο0> 224

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ale Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 50

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 55 70 75 80

Cys Glu Thr His Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly BE 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Hia Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lye lie Pro Tie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lye Pro Gin Gly Arg Tie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Aap Met Lys He Lys Asn Trp Arg Aeri Leu lie Ala Val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Kis Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn Hia Aap He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 210 315 320

Ser Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365 çys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 3B0

Zle Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly val 3B5 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 225 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197I198insE <4Ο0> 225

Ala Asn Ala Pile Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lye 20 25 10

Aap Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Tip lie Ser Tyr Ser Asp Gly Aap 35 40 45

Gin Cya Ala Ser ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr Tie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn £5 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly as so as

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cyg Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Lau Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 21S 220

Arg Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr

245 250 25S

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 26S 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Aen He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335 ser Lys Asp ser cys Lys Gly Aap ser Gly Gly Pro His Ala Thr Hie 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cya Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 3Θ5 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 226 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197I198insY <4Ο0> 226

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lyg Glu Glu Gin Cya ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Aan Gly Giy Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 «0

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 60

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cye Val Asn Glu Asp Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser - Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro Xle Leu Glu Lys Arg 130. 135 140

Asn Ala Ser Lya Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr Xle Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Asp Lys Tyr lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Kis Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin val lie rle Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Fro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe ser Leu Vel Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Hat Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Fro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cye Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 376 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 227 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K1971198insA <4Ο0> 227

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IB

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Pbe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Tie Ser Tyr Ser A3p Gly Aep 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 50

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ann 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn. Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Hia Thr Gly Tbr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 . 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lya Val Cys Pro

145 150 155 ISO

Lye Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Aan Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys Ala lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 235

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn Hie Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cye Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala phe val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Net Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Set Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Aep Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380

He Clu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 228 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197I198insS <4Ο0> 228

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 S 10 15

Cy^ Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Tie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp, 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 SO

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie CyS Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 12S

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Ly3 Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro

145 150 155 ISO

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp val Val Ser Ala Ala 180 185 190

Hia Cys phe Asp Lye Ser lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205

Leu Sly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Glri Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Tip Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380

He Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 229 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/K341Q <4Ο0> 229

Ala A3n Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 S 10 15

Cya Lya Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cya Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Aan

65 70 7S BO

Cys Glu Thr Hia Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 16S 170 175

Leu Cya Gly Gly Thr Leu lie Asn. Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 230 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197L/K341Q <4Ο0> 230

Ala Asn Ala Phe Leu Slu Glu Leu Arg Pro Qly Set Leu Glu Arg Glu IS 10 15

Cys Lys Glu Glu Glh Cys Set Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Sfer Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu I.le Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr val Glu Tyr Pro Cya Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 13S 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Asp Leu lie Lys Asn Trp Arg Aan Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 2 B0 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He val Ser Trp Gly Gin Gly Cya 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hia Phe Gly Val Tyr Thr Arg val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 231 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237V/K341Q <4Ο0> 231

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lye Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 sc

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

55 70 75 BO

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr LyS Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cye Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Iveu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 160 185 190

His Cys Phe Asp LyS lie Lys Asn Trp Arg Aan Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin val -He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Aep He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cye Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu^Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 260 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin ser Arg Lys val Gly Asp Ser 30S 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hie Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg pro Gly Val Leu 365 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 232 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/K199E <4Ο0> 232

Ala Asti Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 SS 60

Leu Gin ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 60

Cys Glu Thr Mis Lys Asp Asp Girt Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr IIS 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn. Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

Hie Cys Phe Asp Glu He Glu Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu Mis Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin val lie He Pro ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Aen 225 230 235 240

Mis Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Mis Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

Mis Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Lau Mat Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu ryr Met phe CyH Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lya Gly Aap Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 34S 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala pro Phe Pro 4 05

<210> 233 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/G237V <4Ο0> 233

Ala Ran Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60 • Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 SO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly &5 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cya 100 105 110

Atg Cys Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr val Glu Tyr Pro cys Gly Lye lie pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Qly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 190 195 190

His Cys Phe Asp Glu lie Lys Asn Trp Arg ASn Leu lie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Qlu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Aan 22S 230 235 240

His Asp tie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin. Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 2S0 295

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 3 65

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 3 75 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Fro 405

<210> 234 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K199E/K341Q <4Ο0> 234

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cya Ala Ser Ser Pro Cys Gin Aan Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 5D 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ale Phe Glu Gly Arg Asti 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cya Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cya Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cya Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cya Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lys He Glu Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu Kis Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin val He 31e Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 .315 320

Pro Asn 31e Thr Glu Tyr Met Phe cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly A3p Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 t 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 235 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/G237V/K341Q <4Ο0> 235

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cys Lya Glu Glu Gin Cys Set Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp

35 40 4S

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Asp Gin SO 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro CyS Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lya Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lya Val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Lew Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Glu lie Lya Asn Trp Arg Asn Leu He Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He lie Pro ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu

275 280 28 S

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr val Gly His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Tip Leu Gin Lys Leu Met Arg ser Glu Pro Arg Pro Gly val Leu 385 390 39S 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 236 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Gla swap FIX <4Ο0> 236

Tyr Asn ser Gly Lys Leu Glu Glu Fhe vai Gin Gly Asn Leu Glu Arg 15 LO 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe 20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Ser Asp Gly 35 40 45

Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp S0 55 60

Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg es 70 75 80

Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn 65 90 95

Gly Gly Cya Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser 100 105 110

Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys 115 12 D 125

Thr Pro Thr Vai Glu Tyr Pro Cys Gly Lye lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140

Arg Asn Ala Ser Lys Fro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys 145 150 155 160

Pro Lys Gly Glu Cya Pro Trp Gin vai Leu Leu Leu vai Asn Gly Ala 165 170 175

Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala 190 185 190

Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai 195 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Hi9 Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Vai Ala Gin Vai lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr 245 250 255

Asp His Vai Vai Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Fhe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Vai Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 260 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Fhe Cys Ala Gly ryr Ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyx Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Xle Vai 5er Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Cys Ala Thr Vai Gly His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai 385 390 395 400

Leu Leu Arg Ala Pro Fhe Pro 4 05

<210> 237 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Gla swap FX <4Ο0> 237

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu 1 5 10 IS

Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30

Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lya Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He CyS Val Asn Glu Asn Gly 95 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 185 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 " 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val yal Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 26S 270 Léu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 200 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lye Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 305 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 238 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Gla Swap Prot C <4Ο0> 238

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Sejr Ser Leu Glu Arg GLu IS 10 IS

Cys lie Glu Glu lie Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu lie Phe Gin 20 25 30

Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lye His Ser Asp Gly Asp 3S 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys A3p Gin 50 55 60

Leu Gin Sér Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys val Cys Pro 145 . ISO 155 160

Lys Gly Glu cya Pro Trp Gin val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lye lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Agn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lya Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3B5 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

<210> 239 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Gla Swap Prot S <4Ο0> 239

Ala As η Sex Leu Leu Glu Glu Thr Lys Gin Qly Aan Leu Glu Arg Glu 1 S 10 15

Cys lie Glu Glu Leu Cys Asn Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30

Aan Asp Pro Glu Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 SO

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phé Glu Gly Arg Asn 6s 70 75 80

Cys Glu Thr His Lya Asp Asp Gin Leu lie Cya Val Aan Glu Aan Gly B5 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys Hia Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr . 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Her Lya Pro Gin Gly Arg Tie Val Gly Gly Lys Val Cya Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin

165 170 ITS

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 105 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie Tie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr hap 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lya Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Aan lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 3SO 365

Ala Thr Val Gly Hia Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 170 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 305 390 ' 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 240 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Gla swap Thrombin <4Ο0> 240

Ala Asn Thr Phe Leu alu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu 20 25 30

Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lyg Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin

so 55 GO

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 ?5 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp Hia Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Lya lie Lys Asn Trp Arg Aan Leu lie Ala Val Leu 195 200 205 □ly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 2 BO 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 205 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 175 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 241 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> V158D/G237V/E296V/M298Q <4Ο0> 241

Ala Aan Ala Phe Levi Glu Glu Leu AT3 Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 IQ 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 «0 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 50

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Aen es 70 75 so

Cys Glu Thr His Lys Asp abp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly B5 50 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Aan Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 105 190

His Cys Phe Asp Lys lie Lys Ash Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220 val Ala Gin val lie lie Pro Ser rhr Tyr val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 290 295

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Val Leu Gin val Leu Asn Val Pro Arg 290 29S 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Aen He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 34S 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 ' 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 242 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/G237V/M298Q <4Ο0> 242

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu IS 10 IS

Cys Lye Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Aap Ala Glu Arg Tiir Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 3S 40 4S

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Glii Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro- Ala Phe Glu Gly Arg Aan

65 70 75 BO

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys val Asn Glu Aan Gly

85 90 9S

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser CyB 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Aan Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Ash Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He. Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 290 2Θ5

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Hia Ala Thr His Tyr 340 34$ 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 330

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 335 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 243 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Kl97E/G237V/M298Q/K341Q <4Ο0> 243

Ala Asn Ala Phe Leu Slu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu i 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin cys Ala Ser ser Pro Cys Gin ASn Gly Gly Ser cys Lys Asp Gin 50 55 eo

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 10 15 . 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Lôu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly S5 80 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 .

Pro Thr val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Aep Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr A3p 245 250 255

His Val val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 250 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Aep Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 3S5 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr He 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 244 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q <4Ο0> 244

Ala Asn Ala Phe Leu GLu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys LyS Glu Glu Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 10

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Aap 15 40 45

Gin Cys Ala ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lye Asp Gin SO 55 60

Leu Gin ser Tyr He Cys Phe Cya Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cy3 Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cya Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lya He pro He Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 16S 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu Lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 190 185 190

His Cys Phe Asp Glu Zle GLu Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val pro Val Thr Thr A®n 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 200 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Sly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Hie Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 37S 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 3 85 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 245 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237V/M298Q <4Ο0> 245

Ala Ann Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 IS

Cys Lys Glu Glu Gin Cys ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lyg 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cya Ala Ser Ser Pro Cya Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 SS 60

Leu Gin Ser Tyr He Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 7S 00

Cy3 Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gift Tyr Cya Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys Hie Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 ' 140

Asn Ala ser Lye Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Ly3 Val Cya Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cye Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cya Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala ÍS0 185 190

His cya Phe Asp Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu rie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 2B5

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Aan He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cya 355 350 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu pro Arg pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 246 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> G237V/M298Q/K341Q <4Ο0> 246

Ala Asn Ala Phe Leu 61u Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg olu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Sax Pro Cys· Gin Α3Π Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Aan Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 , 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 1B0 185 190

His Cys Phe Asp Lys He Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240

Hie Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 2S0 255 his Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 265

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin 5er Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 3XS 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 3 B0

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 39S 4 0 0

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 247 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> M298Q/Gla Swap FIX <4Ο0> 247

Tyr Aen Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ale Arg Glu val Phe 20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Ser Asp Gly 35 40 4S

Asp Gin Cys Ala ser Ser Pro Cye Gin Aen Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60

Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg 65 70 75 80

Asn Cye Glu Thr Hie Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn BS 90 95

Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser 100 105 110

Cys Arg cys His Glu Gly Tyr ser Leu Leu Ala Asp Gly val ser Cys 115 120 125

Thr Pro Thr val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140

Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys Val Cya 145 150 155 160

Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 165 170 175

Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Aen Thr He Trp Val Val ser Ala ISO 185 190

Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 “ 200 205

Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220

Arg Val Ala Gin Val He lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val val Leu Thr 245 250 255

Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270

Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285

Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro 290 295 300

Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320

Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr ser Asp Gly 325 330 335

Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365

Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 248 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/M298Q <4Ο0> 248

Ala ASH Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15

Cya Lys Glu Glii Gin Cys Ser phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr Hia Lys Asp Asp Gin Leu lie Cya Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cya Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 10S 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie val Gly Gly Lys val Cys Pro 145 ISO 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val A9n Gly Ala Gin 165 170 175

Leu cys Gly Gly Thr Leu ile Asn Thr He Trp Val Val ser Ala Ala 180 1B5 190

His Cys Phe Asp Glu lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 27Q

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 205

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Fro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 249 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> M298Q/K341D <4Ο0> 249

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Slu is 10 15

Cys Lya Glu Glu Gin Cya Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lya 20 25 20

Aap Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 4S

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cye Gin Asti Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lye Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 35 90 95

Gly Cya Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lya Arg Ser Cys 100 105 110

Arg Cya His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Aap Gly Val Ser Cys Thr IIS 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lye lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cye Pro 145 150 . 155 160

Lya Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Αβη Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala ISO 135 190

Hi a Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val pro Leu Cys Leu pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 2B5

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 - 330 335

Lya Asp Ser cys Asp Gly Aap Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

<210> 250 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> K197E/K199E/K341Q <4Ο0> 250

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Sin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys 20 25 30

Aep Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Aap Gly Asp 35 40 45

Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cye Gin Asn Gly Gly Ser Cya Lys Asp Gin 50 55 60

Leu Gin Ser Tyr lie Cys phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80

Cye Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95

Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg ser Cys 100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro He Leu Glu Lys Arg 130 13S 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 150

Lye Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Aen Gly Ala Gin 165 170 175

Leu Cye Gly Gly Thr Leu He Asn Thr lie Trp Val val ser Ala Ala 180 185 190

His Cys Phe Asp Glu lie Glu Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala val Leu 195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220

Val Ala Gin Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240

Hie Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Fro Arg 290 295 300

Leu Met Thr Gin Asp Cya Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320

Pro Asn He Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335

Lys Asp Ser Cys Gin Gly Aap Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly He Val ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365

Ala Thr Val Gly Kis Phe Gly val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380

Glu. Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro 4 05

Lisboa, 2015-06-12

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido do factor VII (FVII) modificado, compreendendo: um domínio Gla heterólogo, ou uma porção suficiente deste para efectuar uma ligação aos fosfolípidos, por meio do qual o polipéptido do FVII modificado apresenta uma afinidade acrescida para os fosfolípidos ou uma ligação acrescida aos fosfolípidos em comparação com um polipéptido do FVII não modificado que não contém o domínio Gla heterólogo, em que: a porção suficiente contém 30 ou mais aminoácidos contíguos do domínio Gla heterólogo e o domínio Gla heterólogo é seleccionado entre um domínio Gla presente no factor IX (FIX) , no factor X (FX) , na protrombina, na proteína C, na proteína S, na osteocalcina, na proteína 6 específica da paragem do crescimento (Gas6) e na proteína Z; e uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais que aumentam a resistência à antitrombina III (AT-III), aumentam a afinidade para o factor tecidual (TF) , aumentam a actividade intrínseca, aumentam a actividade coagulante ou catalítica dependente do TF, aumentam a actividade coagulante, modificam a conformação do polipéptido para alterar o carácter zimogénico, aumentam a actividade catalítica ou coagulante desviando o equilíbrio entre as conformações do FVIIa fortemente activas e menos activas no sentido das conformações fortemente activas, aumentam a resistência às proteases, diminuem a glicosilação, aumentam a glicosilação, reduzem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade e/ou facilitam a ligação de grupos químicos.
2. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio Gla heterólogo possui uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-115, 117 e 118, ou a porção suficiente desta.
3. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a totalidade do domínio Gla nativo do FVII é removida e é substituída pelo domínio Gla heterólogo.
4. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o domínio Gla heterólogo é seleccionado entre um domínio Gla presente no factor IX (FIX), no factor X (FX), na protrombina, na proteína C e na proteína S.
5. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a(s) modificação(ões) adicional(ais) aumenta (m) a resistência ao inibidor da via do factor tecidual (TFPI) em comparação com um polipéptido do FVII não modificado.
6. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 5, em que a(s) modificação(ões) adicional(ais) consiste(m) em uma ou mais modificações de aminoácidos em posições seleccionadas entre D196, K197, K199, G237, T239, R290 e K341 num polipéptido do FVII possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 ou ao nível de resíduos correspondentes num polipéptido do FVII, em que a(s) modificação (ões) adicional(ais) confere(m) uma resistência acrescida ao TFPI.
7. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 6, em que as uma ou mais modificações de aminoácidos são seleccionadas entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, Dl 96K197insK, Dl 9 6K197insR, D196K197insY, Dl96K197insW, Dl 96K197insA, Dl 96K197insM, Kl 971198insE, Kl 971198insY, K197I198insA e Kl 971198insS.
8. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 7, em que as uma ou mais modificações de aminoácidos são seleccionadas entre D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, Dl 96R/K197E/K199E, Dl 96K/K197E/Kl 99E, D196R/K197E/K199E/R290E, Dl 96R/K197M/K199E e D196R/K197M/K199E/R290E.
9. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais nas posições Q176, M298 ou E296 num polipéptido do FVII possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 ou ao nivel de resíduos correspondentes num polipéptido do FVII.
10. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 9, em que as modificações de aminoácidos são seleccionadas entre Q176A, M298Q, E296V e E296A.
11. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 9 ou a reivindicação 10, compreendendo M298Q/ AlY44delinsYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY.
12. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais seleccionadas entre S279/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, a inserção de uma tirosina na posição 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P1 ON, Q21N, R28F, R28E, I30C, 130D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T, T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397NN399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T.
13. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, compreendendo a substituição das posições 300-322, 305-322, 300-312 ou 305-312 pelos aminoácidos correspondentes da tripsina, da trombina ou do FX ou a substituição das posições 310-329, 311-322 ou 233-329 pelos aminoácidos correspondentes da tripsina.
14. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o polipéptido do FVII não modificado possui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3.
15. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 14, possuindo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:247.
16. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, que é um polipéptido activo ou maduro.
17. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que apenas a sequência primária é modificada.
18. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, compreendendo ainda uma modificação química ou uma modificação pós-traducional.
19. Polipéptido do FVII modificado de acordo com a reivindicação 18, em que o polipéptido do FVII é glicosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado ou conjugado com um grupo funcional de polietilenoglicol (PEG) .
20. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, que é um polipéptido de cadeia única ou é um polipéptido com duas cadeias.
21. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, que é activo ou activado.
22. Polipéptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a actividade de coagulação é acrescida.
23. Molécula de ácidos nucleicos, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 .
24. Vector, compreendendo a molécula de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 23.
25. Vector de acordo com a reivindicação 24, em que o vector é um vector procariótico, um vector virai ou um vector eucariótico.
26. Vector de acordo com a reivindicação 24 ou a reivindicação 25, em que o vector é um vector de mamífero.
27. Vector de acordo com a reivindicação 25, em que o vector é um vector virai seleccionado entre um adenovirus, um vírus adeno-associado, um retrovirus, um vírus do herpes, um lentivírus, um vírus pox e um citomeqalovírus.
28. Célula, compreendendo o vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27.
29. Célula de acordo com a reivindicação 28, que é uma célula eucariótica.
30. Célula de acordo com a reivindicação 29, em que a célula eucariótica é uma célula de mamífero.
31. Célula de acordo com a reivindicação 30, em que a célula de mamífero é seleccionada entre as células renais de hamster bebé (BHK-21) ou as células 293 ou as células CHO.
32. Célula de acordo com a reivindicação 28, que é uma célula de levedura.
33. Célula de acordo com a reivindicação 32, que é uma célula de Pichia sp.
34. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 33, em que a célula expressa o polipéptido do FVII modificado.
35. Polipéptido do FVII modificado que é produzido pela célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34.
36. Composição farmacêutica, compreendendo uma concentração ou quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e 35, ou de uma molécula de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 23, ou de um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27 ou de uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, num veiculo farmaceuticamente aceitável.
37. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 36, que é formulada para uma administração local, sistémica ou tópica.
38. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 36 ou a reivindicação 37, que é formulada para uma administração por via oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutânea, intraduodenal, entérica, parentérica, intravenosa ou intramuscular.
39. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, que é formulada para uma libertação controlada.
40. Polipéptido do FVII modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e 35, para uma utilização no tratamento de uma doença ou de uma afecção que é tratada através da administração de FVII ou de um pró-coagulante.
41. Utilização de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 39, na preparação de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença ou de uma afecção que é tratada através da administração de FVII ou de um pró-coagulante.
42. Polipéptido do FVII modificado para uma utilização de acordo com a reivindicação 40, ou a utilização de acordo com a reivindicação 41, em que a doença ou a afecção é tratada através da administração de um zimogénio ou de uma forma activa do FVII.
43. Polipéptido do FVII modificado para uma utilização de acordo com a reivindicação 40 ou a reivindicação 42, ou a utilização de acordo com a reivindicação 41 ou a reivindicação 42, em que a doença ou a afecção a tratar é seleccionada entre perturbações da coagulação sanguínea, perturbações hematológicas, perturbações hemorrágicas, hemofilias, uma deficiência do factor VII, perturbações hemostáticas, um sangramento cirúrgico e um sangramento resultante de um traumatismo ou devido a uma complicação hemorrágica devido a uma intervenção cirúrgica ou a um traumatismo.
44. Polipéptido do FVII modificado para uma utilização de acordo com a reivindicação 43, ou a utilização de acordo com a reivindicação 43, em que a hemofilia é a hemofilia A ou a hemofilia B ou a hemofilia C ou é adquirida. Lisboa, 2015-06-12