CN103221061A - 用于治疗止血障碍的因子ii以及纤维蛋白原 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使受损的止血正常化，包括给予一种凝血因子治疗，该凝血因子选自下组，该组由以下各项组成：（1）FII；（2）PCC；以及（3）FII、FX、以及FVIIa三因子的一个组合。该凝血因子治疗可以结合纤维蛋白原给予。这一个或多个凝血因子可以是一种或多种重组人凝血因子。

Description

用于治疗止血障碍的因子II以及纤维蛋白原

发明背景

领域

本披露涉及治疗止血障碍的方法。

相关领域说明

止血指的是阻止血液从受损的血管中流失的过程。凝结、或血凝块的形成是止血的重要部分。为了阻止从伤口中出血，受损血管壁被含有血小板和纤维蛋白的凝块覆盖。凝结障碍可以导致出血（bleeding）（出血（hemorrhage））或凝固（血栓形成）的增加的危险。

在患者中的大量出血或输血通常与受损的凝结相关联。这种受损的凝结可以由稀释性凝血紊乱引起，该稀释性凝血紊乱被定义为由于血液的稀释而增加的出血倾向。流体补偿是一种广泛失血的常规的治疗从而使血压正常化并且避免循环性休克。然而，流体补偿稀释了剩余血液中的凝血因子并且损伤了它们的功能，这可以导致增加的出血，该出血可能威胁生命。

导致凝结的体内生化途径是复杂的并且需要大量的因子和辅因子。存在由罗马数字（I-XIII，其中III、IV和VI是未使用的命名符）特指的十种因子。数字相关的因子和辅因子调整生化途径的活性。例如，在组织因子途径中，在对血管损害后，因子VII（简写为FVII，是对罗马数字命名的因子的惯例）与在组织-因子生成细胞（基质成纤维细胞以及白细胞）上表达的组织因子（TF）接触。这形成了活化的复合物（TF-FVIIa）。TF-FVIIa活化FIX和FX。FVII是通过凝血酶、FXIa、纤溶酶、FXII、以及FXa自活化。FX到活化的FXa的转化（通过TF-FVIIa）几乎立即被组织因子途径抑制剂（TFPI）抑制。FXa和它的辅因子FVa形成凝血酶原酶复合物，该复合物将凝血酶原活化为凝血酶。然后凝血酶活化凝结级联中的其他组分，包括FV和FVIII（活化FXI，FXI进而活化FIX），并且活化并从与冯·维勒布兰德因子（vWf）的结合中释放FVIII。FVIIIa是FIXa的辅因子，并且它们一起形成“酶”（“tenase”）复合物，该复合物将FX活化从而正反馈入该循环中。该途径的活化产生了活化的凝血酶的爆发。在这个循环中活化的凝血酶可以将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，该纤维蛋白是一种与血小板一起形成凝块的蛋白。

凝血酶原（FII）产生于肝中，并且在依赖维生素K的反应中被翻译后修饰，该反应将在凝血酶原上的十个谷氨酸转化为γ羧基谷氨酸。维生素K的缺乏或抗凝剂华法林（warfarin）的给予抑制了因子II谷氨酸残基转化为Gla，减慢了凝结级联的活化。凝血酶（FIIa）是通过由活化的因子X（FXa）在FII上的两个位点的酶切产生。FXa的活性通常通过结合至活化因子V（FVa）而大大增强。在成年人中，凝血酶原活性的正常血液水平已经被测量为1.1个单位/ml左右。新生儿的凝血酶原的血浆水平在出生后稳步增加至达到正常成人水平，从出生后一天0.5个单位/ml左右的水平，到生活6个月后0.9个单位/ml左右的水平。

从凝血酶原形成的凝血酶在凝结级联中具有许多作用。丝氨酸蛋白酶将可溶的纤维蛋白原转化为不可溶的纤维蛋白链，连同催化许多其他与凝结相关的反应。艾尔·迪里（Al Dieri）等人研究了在具有不同先天凝血因子缺陷症的患者中的凝血因子浓度、凝血酶生成的参数与失血量之间的关系。作者证实了失血倾向与凝血酶形成的量直接相关联，该凝血酶形成的量对于FII浓度呈线性变化。艾尔·迪里（Al Dieri）等人，《血栓形成与止血法》（Thromb Haemost）2002,88:576-82。芬格-埃里克森（Fenger-Erikson）等人还显示，在稀释性凝血紊乱的情况中，在用羟乙基淀粉溶液的32%的稀释后，除了纤维蛋白原外，包括FII、FX、以及FXIII的凝血因子也降低为所期望的的水平之下。芬格-埃里克森（Fenger-Erikson）等人，《血栓形成与止血法杂志》（J Thromb Haemost）2009,7:1099-105。

纤维蛋白原（因子I或FI）是一种可溶的血浆糖蛋白，它是由肝合成并且在血液凝结期间由凝血酶转化为纤维蛋白。凝结级联中的过程将凝血酶原转化为活化的丝氨酸蛋白酶—凝血酶，该凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。然后纤维蛋白由因子XIII交联化以形成凝块。纤维蛋白原在血浆中的正常浓度是1.5g/L-4.0g/L或约7μM。在标记的失血事件中，比任何其他的促凝血因子或血小板更多的纤维蛋白原达到了极其低的血浆浓度。希帕拉（Hiippala）等人，《麻醉与镇痛》（AnesthAnalg）1995,81:360-5；辛巴特（Singbartl）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2003,96:929-35；麦克洛克林（McLoughlin）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）1996,83:459-65。小量的胶体（小于1000ml）可以损伤纤维蛋白聚合作用并且因此削弱凝块强度。伊能霍费（Innerhofer P）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2002,95:858-65；米特迈尔（Mittermayr）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2007;105:905-17；弗里斯（Fries）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2002,94:1280-7。一些建议引用了1g/L的临界纤维蛋白原浓度，该引用是基于一个研究的结果，其中具有小于0.5g/L的纤维蛋白原浓度的四名患者中四人全被发现具有扩散的微脉管出血。施帕恩（Spahn）等人，《危重病急救》（Crit Care）2007,11:R17；斯坦斯比（Stainsby）等人，《英国血液学杂志》（Br J Haematol）2006;135:634-41；恰瓦雷拉（Ciavarella）等人，《英国血液学杂志》（Br J Haematol）1987;67:365-8。相比之下，来自门静脉周围出血、神经外科以及心脏手术的近期临床数据显示在纤维蛋白原浓度小于1.5g/L-2g/L时，已经存在一种对于围手术以及手术后出血的增加的倾向。沙尔比（Charbit）等人，《血栓形成与止血法杂志》（J Thromb Haemost）2007,5:266-73；格拉赫（Gerlach）等人，《中风》（Stroke）2002,33:1618-23；布洛姆（Blom）等人，《血栓形成与止血法杂志》（J Thromb Haemost）2005,93:1101-7；乌卡（Ucar）等人，《心脏外科论坛》（Heart Surg Forum）2007,10:E392-6。

与出血性疾病（例如稀释性凝血紊乱）相关联的凝结问题可以用止血疗法解决。止血疗法的目的在于使失血、输血需求、以及死亡率最小化。在具有相同的创伤严重度评分（ISS）的创伤患者中，死亡率事实上加倍，这只是凝血紊乱的结果。布罗希（Brohi）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2003,54:1127-30。在多重创伤的患者中大量出血或大量输血与受损的凝结相关联。因此，为了达到充分的止血，需要足够量的凝血酶以及足够的可凝结基质。在凝结中的关键因素在于在血小板表面上凝血酶的形成以及由凝血酶切割纤维蛋白原而形成纤维蛋白。布罗希（Brohi）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2003,54:1127-30。如果形成足够的凝血酶，它将纤维蛋白原转化为稳定的纤维蛋白，这决定了在因子XIII（FXIII）的存在下发展中的凝块的坚固度。科尔特（Korte）等人，Hamostaseologie2006,26:S30-5。

在具有钝性以及多重创伤的患者中，侵略性的补液在大量失血的情况中对于维持正常血容量是决定性的。斯佩里（Sperry JL）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2008;64:9-14。然而，通过给予大量的类晶体或胶体溶液实现的血液动力学的稳定化引起稀释性凝血紊乱。先前在若干出版物中研究了由等容血液稀释（normovolemic haemodilution）引起的受损血浆凝块的临床作用。伊能霍费（Innerhofer P）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2002;95:858-65；辛巴特（Singbartl）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2003;96:929-35。米特迈尔（Mittermayr）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2007;105:905-17。

稀释性凝血紊乱通常是用新鲜冷冻的血浆（FFP）以及用冷冻沉淀（如果可获得的话）来处理。斯坦斯比（Stainsby）等人，《英国麻醉学杂志》（Br JHaematol）2000,85:487-91；施帕恩（Spahn）等人，《危重病急救》（Crit Care）2007,11:R17。但是，严重减少的凝块因子浓度很难能通过给予FFP来纠正，因为凝血因子的低浓度以及它的膨胀效应，抵消了任何感兴趣蛋白的浓度的预期增加。米特迈尔（Mittermayer）2007,同上；斯卡莱亚（Scalea）等人，《外科学年鉴》（AnnSurg），2008,248:578-84；乔杜里（Chowdhury）等人，《英国血液学杂志》（BrJ Haematol）2004,125:69-73；斯坦沃茨（Stanworth）等人，《英国血液学杂志》（Br J Haematol）2004,126:139-52；阿卜杜勒-瓦哈布（Abdel-Wahab）等人，《输血》（Transfusion）2006,46:1279-85。此外，FFP的给予与若干并发症（例如肺损伤的发作、多器官功能衰竭、以及感染）相关联。沃森（Watson GA）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2009,67:221-7；萨拉尼（Sarani）等人，《危重病急救医学》（Crit Care Med）2008,36:1114-8；达拉（Dara）等人，《危重病急救医学》（CritCare Med.）2005,33:2667-71。此外，必需的解冻过程延迟了即时治疗，即时治疗在急性和严重出血的情况中特别重要。

在若干动物模型连同在临床实践中，先前在体外检验了纤维蛋白原浓缩物的给予对稀释性凝血紊乱的作用弗里斯（Fries）等人，《英国麻醉学杂志》（BrJ Anaesth）2005,95:172-7；弗里斯（Fries）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2006,102:347-51；韦利克-萨尔切纳（Velik-Salchner）等人，《血栓形成与止血法杂志》（J Thromb Haemost）2007,5:1019-25；史丁格（Stinger）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2008,64:S79-85。纤维蛋白原浓缩物的单独给予使得凝块强度正常化，但没有使凝结的启动正常化，这是由于该启动是一个凝血酶依赖反应。弗里斯（Fries）等人，《英国麻醉学杂志》（Br J Anaesth）2005,95:172-7；弗里斯（Fries）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2006,102:347-51；芬格-埃里克森（Fenger-Erikson）等人，《血栓形成与止血法杂志》（J Thromb Haemost）2009,7:795-802。因此，先前已经研究了纤维蛋白原与凝块因子复合物（例如凝血酶原复合物浓缩物PCC）的组合。_<0}

具体地，弗里斯（Fries）等人研究了在体外模型中纤维蛋白原替代对稀释性凝血紊乱的反转的作用。《英国麻醉学杂志》（British Journal of Anaesthesia），2006,97(4):460-467。将来自5个健康男性志愿者的血液稀释60%，该稀释是使用乳酸化林格氏溶液、4%的改性明胶溶液、或6%的羟乙基淀粉（HES）130/0.4连同乳酸化林格氏溶液与2种胶体溶液任一种的组合来进行。弗里斯（Fries）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）；2006,102:347–51。此后，将稀释的血样的等分部分用3种不同浓度的的纤维蛋白原（0.75g/L、1.5g/L、以及3.0g/L）孵育。通过改进型血栓弹力描记术（

彭塔法姆公司（Pentapharm），慕尼黑，德国）来进行测量。在60%的稀释后，凝血时间增加，然而凝块坚固度以及纤维蛋白聚合反应显著减少。在给予纤维蛋白原后，凝血时间减少。当添加纤维蛋白原时，在所有经稀释的血样中凝块坚固度连同纤维蛋白聚合反应增加。体外纤维蛋白原替代对

变量的作用取决于纤维蛋白原剂量以及用来稀释血样的溶液类型。

在另一研究中，弗里斯（Fries）等人研究了在猪模型中，在血液稀释以及不受控的出血的情况下，纤维蛋白原与凝血酶原复合物浓缩物（PCC）的作用。弗里斯（Fries）等人，《英国麻醉学杂志》（British Journal of Anaesthesia），2006,97(4):460-467。在所估算的总血容量的65%的大失血后，用HES（2500ml）进行的体积补液导致稀释性凝血紊乱，如通过常规凝血试验和

分析测量的。在仅接受补救性的红血细胞浓缩物的动物中以及在安慰剂组中，在

参数中存在统计学上有意义的小的改进。然而，在治疗组中，纤维蛋白原以及PCC的额外替代导致凝结参数的正常化。在标准化的的肝损伤后，与安慰剂组相比，在用纤维蛋白原与PCC治疗的动物中失血和死亡率显著降低。

在临床实践中，PCC通常给予重危患者中延长的凝血时间的情况中、连同大量出血的情况中。沙霍希尔（Schochl）等人，《麻醉学》（Anaesthesia）2009。PCC对应于因子II、VII、IX和X连同蛋白C以及小量的肝素，并且已经被多年来用于治疗遗传性凝结缺陷症以及用于在给予维生素K拮抗剂后的抗凝的反转。关于在由于大量失血和HES的给予而呈现出获得性凝血因子缺乏症的猪中，使用现代PCC制剂的方面仅可获得有限的动物数据。迪克奈特（Dickneite）等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2008,106:1070-7；迪克奈特（Dickneite）等人，《英国麻醉学杂志》（Br J Anaesth）2009,102:345-54；迪克奈特（Dickneite）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2009。

施陶丁格（Staudinger）等人研究了在重危患者中PCC对血浆凝结的作用，并且指出PCC的2,000个因子IX单位的剂量（平均30IU/kg体重）通过提高具有中度降低的凝结活性的患者中凝血因子II、VII、IX和X的血浆水平而使得凝血酶原时间（PT）正常化。施陶丁格（Staudinger）等人，《重症监护医学》（Intensive CareMed）1999,25:1105-10。然而，关于凝血酶形成，与rhFVIIa相比PCC似乎远更有活性。迪克奈特（Dickneite）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2009。PCC可能与血栓栓塞并发症的增加的风险有关联，尤其是在患有获得性凝血缺陷症的患者中。巴戈特（Bagot）等人，《血栓形成与止血法杂志》（Thromb Haemost）2007,98:1141-2；沃伦（Warren）等人，《急诊医学年鉴》（Ann Emerg Med）2009,53:758-61；科勒（Kohler）等人，《血栓形成与止血法杂志》（Thromb Haemost）1998,80:399-402。

不同治疗出血和失血的额外方法也已经被提出，包括增补凝血因子。参见，例如，美国专利公开2003/0129183、2004/0198647、2004/0237970、2005/0282771、2006/0025336、2006/0211621、2007/0232788、2008/0014251、2008/0188400、2008/0267940、2010/0093607、2009/0098103、2009/0148502、2009/0175931、2009/0232877、以及2010/0086529。

尽管有对于恢复止血的不同组合物和方法的提议和研究，但是本领域仍存在对于治疗止血障碍（例如稀释性凝血紊乱）的改进的方法的需求。

为了在患有出血性疾病或失血的患者中达到止血，需要足够量的凝血酶以及足够的可凝结基质（纤维蛋白原）。在凝结中的关键方面在于在血小板表面上凝血酶的形成以及由凝血酶切割纤维蛋白原而形成纤维蛋白。如果形成足够的凝血酶，若存在足够的纤维蛋白原，凝血酶将纤维蛋白原转化为稳定的纤维蛋白，这决定了在因子XIII（FXIII）的存在下发展中的凝块的坚固度。

本发明提供了使用一种或多种重组止血剂（包括单独的重组人因子II（rhFII）或三种重组人凝血因子（rhII、rhFX和rhVIIa）（3F）的组合）来治疗或最小化不受控的出血，其中这些止血剂与或不与纤维蛋白原一起使用。具体地，本发明证实了这些重组止血剂在治疗稀释性凝血紊乱中的疗效。令人惊讶的是单独地或与纤维蛋白原组合地给予rhFII足以恢复正常止血。单独地或与纤维蛋白原组合地给予rhFII，可以潜在地避免血栓栓塞事件的严重并发症，该并发症可以伴随当前被提供来控制出血性疾病或失血的其他标准形式的治疗。

应指出的是，在此对于任何公开出版物的引用不应被理解为这种公开出版物是对于在此下文中所披露发明的先前技术的承认。

发明概述

止血障碍的治疗或止血的正常化可以包括给予一种选自下组的凝血因子治疗，该组由以下各项组成：（1）单独的FII；（2）PCC；以及（3）FII、FX、以及VIIa的三因子组合。该凝血因子治疗（一种或多种止血剂）可以任选地与纤维蛋白原组合给予。这一个或多个止血剂可以是重组人因子，例如rhFII、rhFX以及rhVIIa（重组人因子的这个三因子组合可以简写为3F）、或单独的rhFII。在一些实施例中，止血障碍的有效治疗或止血的正常化可以包括纤维蛋白原与rhFII的共同给予。该治疗可以在没有任何其他凝血因子的实质性增补的情况下进行。因此，在一些实施例中，止血障碍的有效治疗可以包括：给予一种选自下组的凝血因子治疗，该组由以下各项组成：（1）单独的FII（例如rhFII）；（2）3F；（3）纤维蛋白原，以及FII、FVIIa、和FX的一个组合；（4）或纤维蛋白原以及FII。

附图简要说明

图1：在肝脏切割并且给予盐水对照、纤维蛋白原浓缩物（fib）、纤维蛋白原浓缩物(concentration)结合PCC（PCC+fib）、纤维蛋白原浓缩物结合三因子组合（ThreeF+fib）或纤维蛋白原浓缩物结合重组人FII（FII+fib）后，每kg体重的失血量（以mL计），显示为平均数+/-SD。

图2（A-B）：在基线处（BL），在抽血后（BW），在血液稀释后（HD），在给予研究药物后（TH），以及在观察终点处（END）的

分析。研究药物对应于纤维蛋白原浓缩物（纤维蛋白原），纤维蛋白原浓缩物结合PCC（PCC），纤维蛋白原浓缩物结合重组人FII（FII），纤维蛋白原浓缩物结合三因子组合（3F），或盐水对照。显示了凝血时间（CT，以秒计）（图2A）以及最大凝块坚固度（MCF，以mm计）（图2B）。显示了与盐水组和纤维蛋白原组相比的统计学上的显著差异（P<.001）。

图3：在给予（1）盐水对照；（2）重组人FII（rhFII）（8mg/kg）；（3）对应于rhFII+rhFX+rhFVIIa（分别为4.0mg/kg、0.32mg/kg以及0.006mg/kg）（低剂量）的三因子组合；（4）对应于rhFII+rhFX+rhFVIIa（分别为8.0mg/kg、0.64mg/kg以及0.012mg/kg）（高剂量）的三因子组合；（5）FEIBA

（活化的复合物浓缩物（APCC），百特公司（Baxter））（40U/kg）；（6）

（凝血因子VIIa，诺和诺德公司（Novo Nordisk））（第一次剂量为200μg/kg，之后一小时后第二次剂量为100μg/kg）；或者

HS（纤维蛋白原浓缩物，杰特贝林公司（CSL-Behring））之后，每kg体重的失血量（以ml计），显示为单独的值以及中位数（横条）。

图4（A-B）：在给予凝血因子或其组合（如上对于图3所述）后的ROTEM结果显示：分别在基线处、稀释后、给药后以及实验终点绘制的a)凝血时间（CT），b)来自ex-TEM（组织因子）活化的全血样的最大凝块坚固度（MCF），显示为平均数±SEM。

图5（A-D）：在给予凝血因子、或其组合（如上对于图3所述）后，凝血酶生成结果（校准自动化凝血酶图（Calibrated Automated Thrombogram）），显示了在基线处、稀释后、给药后以及在实验终点处获得的血浆样品的A)滞后时间，(B)达峰时间，(C)峰值以及(D)内源凝血酶生成潜力，显示为平均数±SEM。

图6：在给予凝血因子、或其组合（如上对于图3所述）后，在基线处、稀释后、给药后以及在实验终点处所绘制的在血浆样品中凝血酶-抗凝血酶复合物的浓度，显示为中位数。

详细说明

本发明提供了通过给予凝血因子治疗、或一种或多种凝血因子的组合来治疗不受控的出血或使止血正常化。具体地，本发明提供了通过给予FII或三因子组合（FII、FX、以及VIIa）来治疗不受控的出血或使止血正常化。在某些实施例中，止血剂或凝血因子是重组人凝血因子。在另外的实施例中，凝血因子与或不与纤维蛋白原一起给予。在某些其他实施例中，凝血因子治疗是PCC（FII、FVII、FIX以及FX，任选地与小量的肝素一起）。

稀释性凝血紊乱的发作以及治疗效果可以通过常规凝血试验（例如旋转式血栓弹力计

）以及凝血酶生成来测量，凝血酶生成由校准自动化凝血酶图（Calibrated Automated Thrombogram，CAT）来测量，自动化凝血酶图使用1pM TF活化剂来进行。

研究在凝固和随后的纤维蛋白溶解期间，凝血因子、它们的抑制剂、抗凝剂药物、血细胞（特别是血小板）的相互作用。流变学的条件模仿血管中血液的缓慢流动。短暂地，使用电子吸量管将血液放置在一个一次性槽中。将一个一次性的针附接至与一个细弹簧相连的一个杆上，并且该针缓慢地前后摆动。悬浮在血样中的针的信号经由一个光学检测器系统传输。该仪器测量并图解地展示在发展中以及分解中的凝块的所有阶段中弹性的变化。典型的测试温度是37°C，但是可以选择不同温度。主要结果是一个反应曲线，该曲线显示了当凝块形成或溶解时，随时间变化的弹性。

四个参数描述了常规使用的凝血曲线。凝血时间（CT）是从将起始试剂添加到血液中直到凝块开始形成的等待时间。CT的延长可以是凝结缺陷症（主要是凝结因子）、或肝素的结果（取决于所使用的测试）。CT的缩短指示高凝性。α角是切线到曲线的角，而凝块形成时间（CFT）是从CT直到已经达到20mm点的凝块坚固度的时间。这些参数指示固体凝块形成的速度，并且主要受血小板功能的影响，但是纤维蛋白原和凝血因子也有贡献。延长的CFT（或更低的α角）通常是由差的血小板功能、低血小板计数、纤维蛋白聚合失调或纤维蛋白原缺乏引起的。CFT的缩短（或高的α角）指示高凝性。最大凝块坚固度（MCF）是轨迹的最大垂直幅度。它反映纤维蛋白和血小板凝块的绝对强度。低MCF指示降低的血小板数目或功能、降低的纤维蛋白原水平或纤维蛋白聚合失调、或因子XIII的低活性。机械地弱凝块表示严重的失血风险。

的变化可以用于强调不同的参数和作用。例如，EXTEM是一种用于（外源性）止血系统的筛选试验。EXTEM试剂使用组织因子而温和地活化止血。然后结果受到外源性凝血因子、血小板以及纤维蛋白原的影响。

亨姆克（Hemker）等人（《病理生理止血与凝血》（Pathophysiol HaemostThromb），2002,32:249-253）描述了校准自动化凝血酶图（CAT）。通过使用“缓慢的”荧光凝血酶底物以及与同时运行的校准器的连续比较，可以自动监测凝血酶生成。生成的“凝血酶图”测量在血小板差的血浆中的低凝性以及高凝性。

止血障碍的治疗或止血的正常化可以包括给予一种凝血因子治疗，例如，FII、以及任选地FX和FVIIa、或纤维蛋白原与FII的一个组合，任选地进一步结合FX和FVIIa。这些止血剂可以是重组人因子，例如rhFII、rhFX以及rhVIIa，或单独的rhFII。在一些实施例中，止血障碍的有效治疗可以包括：给予FII或共同给予FII、FX以及FVIIa，或共同给予纤维蛋白原与FII，以及任选地进一步共同给予FX和FVIIa，其中FII、FX和/或FVIIa可以是重组生产的人因子。

该治疗或正常化或止血可以在没有任何其他凝血因子的实质性增补的情况下进行。在一些实施例中，止血障碍的治疗可以包括FII或纤维蛋白原与FII的共同给予，其中FII可以是重组人FII（rhFII）。

术语“实质性增补”指的是其他组分（例如除了本发明中所述的那些）以一个量的添加，由此当增补这类额外的凝血因子时，一种或多种止血剂的效果与在不增补的情况下给予一种或多种止血剂的效果非常不同。

如在此使用的“重组的”蛋白包括那些通过重组技术制成的蛋白。这类蛋白包括类似于天然蛋白的那些连同被修饰以增强活性、蛋白半衰期、蛋白稳定性、蛋白定位、以及效力的那些。参见美国专利公开号US2005/0164367，通过引用将其结合在此。

如在此使用的“治疗”是一种用于获得有益的或希望的临床结果的方法。有益的或希望的临床结果包括但不局限于症状的减轻、出血减少、个体的稳定化、以及预防出血。

短语“主要由…组成”不是指意味着其他共存的常规患者治疗需要避开，而是治疗主要由…组成，例如FII的给予、或有效量的纤维蛋白原与FII的共同给予并不是立即先于、伴随、或立即跟随其他凝血因子（特别是蛋白凝血因子，例如由罗马数字V-XIII指代的那些）的大量增补来进行。在一些实施例中，一个主要由FII的单独给予、或有效量的纤维蛋白原与FII的共同给予组成的治疗可以与单独的步骤（例如输血，冷冻血小板、恢复的血细胞、包含类晶体和/或胶体的流体的给予，以及其他常规治疗（这些常规治疗不包括凝血因子的活性增补，除了这些凝血因子，在输送的血液、冷冻血小板制品、或类似物中可以是内源性的））同时进行。在其他实施例中，所需要或希望的是：当进行一种主要由有效量的FII、3F、纤维蛋白原与FII或者纤维蛋白原与3F的给予组成的治疗时，同时进行包括单独给予一种组合物（该组合物包括大量的凝血因子（例如因子V-XIII））的任何程序。

在一些实施例中，治疗在对其有需要的哺乳动物中的创伤出血性疾病的方法可以包括给予选自下组的凝血因子治疗，该组由以下各项组成：(a)PCC（FII、FX、FIX、FVII、以及蛋白C）；(b)rhFII、rhFVIIa以及rhFX；以及(c)单独的rhFII，其中(a)、(b)或(c)任选地结合纤维蛋白原被提供。同样，在哺乳动物中使与创伤出血性疾病相关联的受损的止血正常化的方法可以包括给予选自下组的凝血因子治疗，该组由以下各项组成：(a)PCC（FII、FX、FIX、FVII、以及蛋白C）；(b)rhFII、rhFVIIa以及rhFX；以及(c)单独的rhFII，其中(a)、(b)或(c)任选地结合纤维蛋白原被提供。此外，减少由于创伤出血性疾病引起的死亡率的方法可以包括给予选自下组的凝血因子治疗，该组由以下各项组成：(a)PCC（FII、FX、FIX、FVII、以及蛋白C）；(b)rhFII、rhFVIIa以及rhFX；以及(c)单独的rhFII，其中(a)、(b)或(c)任选地结合纤维蛋白原被提供。

治疗一种止血障碍或使止血正常化的方法可以包括：在哺乳动物中的与创伤出血性疾病相关联的出血或大量失血之后，通过给予包括或主要由一种或多种止血剂（包括FII以及任选的纤维蛋白原）组成的组合疗法，增加最大凝块坚固度（MCF）、减少凝血时间（CT）、和/或改进凝血酶生成。

在任何这些方法中，凝血因子治疗可以选自下组，该组由以下各项组成：(a)PCC（FII、FX、FIX、FVII、以及蛋白C）；(b)rhFII、rhFVIIa以及rhFX；以及(c)rhFII。在一个实施例中，凝血因子治疗是FII、FVIIa、以及FX的组合。在另一实施例中，凝血因子治疗是单独的FII或rhFII。在其他实施例中，凝血因子治疗可以是rhFII、rhFVIIa、以及rhFX的组合亦或是单独的rhFII，基本上不用增补任何其他的止血因子，特别是其他的罗马数字命名的凝血因子。那就是说，在一些实施例中，这些方法可以包括给予rhFII以及任选的纤维蛋白原，而基本上不用增补任何其他的止血因子，特别是因子V-XIII。

在替代实施例中，治疗在对其有需要的哺乳动物中的创伤出血性疾病的方法可以由如上所述的给予凝血因子治疗组成。同样，使哺乳动物中的与创伤出血性疾病相关联的受损止血正常化的方法可以由如上所述的给予凝血因子治疗组成。并且，减少由创伤出血性疾病引起的死亡率的方法可以由如上所述的给予凝血因子治疗组成。

治疗一种止血障碍或使止血正常化的方法可以包括：在哺乳动物中的与创伤出血性疾病相关联的出血或大量失血之后，通过一种可以由凝血因子治疗的给予组成的方法，增加最大凝块坚固度（MCF）、减少凝血时间（CT）、和/或改进凝血酶的形成。在某些实施例中，最大凝块坚固度增加至：约10mm至约40mm、约10mm至约30mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm或约30mm。在其他实施例中，凝血时间减少了：约35秒至约75秒、或约35秒、约40秒、约45秒、约50秒、约55秒、约60秒、约65秒、约70秒、或约75秒。如上，凝血因子治疗可以选自下组，该组由以下各项组成：(a)PCC（FII、FX、FIX、FVII、以及蛋白C）；(b)rhFII、rhFVIIa以及rhFX；以及(c)单独的rhFII，其中(a)、(b)或(c)任选地结合纤维蛋白原被提供。在一些优选实施例中，凝血因子治疗是（1）FII、FVIIa以及FX的组合；亦或是（2）单独的FII。凝血因子治疗可以包括重组人因子，即（1）rhFII、rhFVIIa以及rhFX的组合；亦或（2）单独的rhFII。在一些实施例中，这些方法可以由共同给予rhFII，以及任选地共同给予纤维蛋白原组成。

“共同给予”或“共同治疗”是指给予多种组分的混合物，或在邻近的时间分开给予共同治疗的组分，例如在暂时重叠的时期期间给予共同给予的（co-administered）组分，或者在给予一种共同给予的组分的开始或终止时的约一小时内或半小时内、或一刻钟内开始给予一种组分。

按在此所披露的方法来给予的组分是使用本领域中完全确立的技术来配制并给予。例如，使用一种药学上可接受的载体或赋形剂，可以将纤维蛋白原以及FII、rhFII、或3F通过静脉注射或输注来给予。适合活化剂的配制的载体和赋形剂包括任何药学药剂，该药剂不诱导对接受该组合物的个体而言有害的免疫应答、并且可以被给予而没有过分毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不局限于液体，例如水、盐水、甘油、糖以及乙醇。还可以包括药学上可接受的盐。此类盐包括无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、以及类似物；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、以及类似物。另外，辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲液物质、以及类似物可以存在于此类运载体（vehicle）中。药学上可接受的赋形剂的充分讨论在《雷明顿药物科学》（Remington'sPharmaceutical Sciences）（Mack出版公司，第18版，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1990）中可获得。

止血障碍可以与任何凝血紊乱（例如稀释性凝血紊乱）、创伤性出血、围手术出血、术后出血、产后出血、等相关联。止血障碍可以与小于约2g/L至约1.5g/L、小于约1g/L、或小于约0.5g/L的血液纤维蛋白原浓度水平相关联。止血障碍可以与约30%至约85%（例如，大于哺乳动物中估算的总血容量的约30%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约70%、约80%或约85%）的失血相关联。在一些实施例中，稀释性凝血失调起因于正常血容量的重建或血液动力学的稳定化。因此，在此披露的需要治疗的哺乳动物可以是一种符合这些标准的一个或多个的哺乳动物。

止血障碍还可以包括血友病A和B、具有抑制性抗体的血友病A和B患者、凝血因子（例如纤维蛋白原、FII、FV、FVII、FIX、FVIII、FX、FXI、FXII、以及FXIII、冯维勒布兰德因子）缺乏、组合的FV/FVII缺乏、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏、γ羧化酶缺乏；与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少、中风、凝血紊乱、弥散性血管内凝血（DIC）相关联的出血；与肝素、低分子量肝素、戊糖、华法林、小分子抗凝血酶（即FXa抑制剂）相关联的过强抗凝；以及血小板病（plateletdisorder），例如巨血小板综合征（Bernard-Soulier综合征）、血小板无力症（Glanzmanthromblastemia）、以及储存池缺损。

止血障碍还可以包括涉及血栓病（例如深静脉血栓形成、与心血管疾病状态或恶性肿瘤相关联的血栓形成、起因于内在的导管或其他侵入性外科手术的血栓形成、以及与自身免疫性疾病（例如狼疮）相关联的血栓形成）的出血。

在此所述的方法可以包括或基本上由以下组成：以足以将血液纤维蛋白原浓度提高到约0.5g/L、约1g/L、约1.5g/L或约2g/L以上的量来共同给予纤维蛋白原。在一些实施例中，纤维蛋白原按12.5-200mg/kg的剂量（例如在如约12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg或200mg/kg的剂量）给予。在一些实施例中，rhFII是按1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、或10mg/kg的剂量给予。在一些实施例中，纤维蛋白原与一种或多种止血剂的共同给予导致在给予后维持近似正常化的凝结持续至少两小时。

在一些实施例中，用于治疗的活化剂可以组装成一个药盒。该药盒可以包含纤维蛋白原以及FII、rhFII、和/或3F连同任何适当的赋形剂，例如但不局限于盐水和蔗糖溶液，以及任何额外的用于组合物组分的稳定性或有效性的辅因子（例如但不局限于糖、抗氧化剂、以及白蛋白）。此外，该药盒可以包括涉及活化剂递送的其他元件，这些元件包括用于注射活性剂的装置（例如注射器）、止血带、以及清洁注射部位的酒精棉签。其他的元件还可以包括入药盒中，包括涉及伤口闭合的元件，例如缝合材料、针以及镊子。

尽管在此披露的方法已经引用其实施例而进行了详细说明，但是本领域中的一个普通技术人员应清楚的是，可以做出不同变化，并且采用等价物而不偏离本披露的范围。同样，提出以下实例作为披露的方法的说明，但不应理解为限制所披露的方法。

除了一种或多种增强最终凝块强度的止血剂之外，还可以给予纤维蛋白原或纤维蛋白原浓缩物。在某些实施例中，纤维蛋白原与PCC、rhFII或3F的组合缩短了凝血时间并且改进了凝血酶生成。PCC或rhFII与纤维蛋白原的组合给予可以用来降低不受控出血的治疗中的死亡率。PCC与纤维蛋白原的组合给予可以用于在给予后加强凝结高达0.5小时、一小时或两小时。因此，rhFII的使用，特别是结合纤维蛋白原可以是PCC的替代方案，具有可比较的疗效但对于血栓栓塞并发症而言具有更小风险。

在严重失血至少高达约60%的血液稀释而具有更小并发症风险后，包括纤维蛋白原与rhFII的共同给予而没有任何其他止血剂增补的治疗可以在受损止血的正常化中是有效的。包含3F的纤维蛋白原与rhFII的共同给予也是有效的。此外，有效的治疗可以基本上由给予rhFII或3F伴随或不伴随纤维蛋白原的增补组成。

实例

实例1

方法

手术准备与测量：使用五十只健康的猪来进行本研究。动物的前驱给药是在研究开始一小时之前，用阿扎哌隆（4mg kg^-1IM，安定剂，赐静宁（Stresnil）^TM，杨森公司（Janssen），维也纳，奥地利）以及阿托品（0.1mg kg^-1IM）来进行。用丙泊酚（1mg kg^-1-2mg kg^-1IV）来诱导并维持麻醉。为了进行麻醉的诱导，注射哌腈米特（30mg，具有～4小时至8小时半衰期的阿片样物质，Dipidolor^TM，杨森公司，维也纳，奥地利）。为了肌肉松弛，在气管内麻醉后注射0.2mg kg^-1h^-1泮库溴铵。在插管后，将7.5French导管插入股动脉内用于收集血样以及持续的血压测量。将两个7.5French导管插入两边的股静脉用于抽血、胶体和类晶体的给予以及研究药物的给予。将Swan-Ganz导管穿过右侧颈静脉。

实验方案：在试验的整个过程期间，使用类晶体（林格氏乳酸溶液）来满足补液（4ml·kg^-1）的基本需求。为了诱导一种标准化的稀释性凝血紊乱，用6%HES130/0.4（万汶费森尤斯公司（Fresenius Co.），巴登洪堡，德国）来进行等容的血液稀释：将血液从动物中经由大的导管来抽出并且以1:1的比例用类晶体来替换。在完成血液稀释之后，将抽出的血液在细胞保存系统（CellSaver System）（

费森尤斯公司，维也纳，奥地利)中进行加工，进行浓缩并且重新输入，以预防血液动力学相关的贫血。通过和EXTEM试剂的使用而确定所生成的凝血紊乱达到临界水平（凝血时间（CT）>100秒以及最大凝块坚固度（MCF）<40mm）时，等容血液稀释完成。动物被随机地指定为200mg·kg^-1纤维蛋白原浓缩物（Haemocomplettan杰特贝林（CSL-Behring）公司）（纤维蛋白原组），200mg·kg^-1纤维蛋白原浓缩物以及35IU kg^-1PCC（

杰特贝林公司，马尔堡，德国）（PCC组），200mg kg^-1纤维蛋白原浓缩物以及4mgkg^-1rhFII浓缩物（阿斯利康研发（AstraZeneca R&D），默恩达尔，瑞典）（FII组），200mg kg^-1纤维蛋白原浓缩物以及三因子组合浓缩物（包括4mg kg^-1rhFII、0.32mgkg^-1rhFX以及0.006mg kg^-1rhFVIIa）（阿斯利康研发（AstraZeneca R&D），默恩达尔，瑞典）（3F组），亦或为等量生理盐水（盐水组）。纤维蛋白原浓缩物与PCC的剂量是基于先前发表的来自动物实验的数据。斯佩里（Sperry）等人，《外伤杂志》（J Trauma）2008,64:9-14；Innerhofer（因纳霍芬）P等人，《麻醉与镇痛》（Anesth Analg）2002,95:858-65。

在给予以上所述的凝血因子或凝血因子组合之后，使用一种模板诱导了标准化的肝损伤（12cm长并且3cm深）。将该切口制成在肝右叶上。本研究中不知情的是进行组织检验、凝血试验、血液动力学的记录、肝切口的工作人员、或参与在收集并测量发生的失血中的那些人。

在肝切口后，评定随后的失血以及直到动物死于出血性休克的时间长度。除了血栓弹力测量之外，还进行标准的凝血试验（PT、aPTT、纤维蛋白原、血小板计数），测量活化凝结的参数（D-二聚体以及TAT）、以及用于估算形成凝血酶的潜力的凝血酶形成试验（校准自动化凝血酶图（CAT））。

在肝创伤两小时后，将存活的动物用钾注射处死。将心、肺、部分肠以及肾移除并且对于微脉管的血栓形成的出现进行评估。

血液取样以及分析方法：在基线处（BL），在抽血（BW）、血液稀释（HD）、用研究药物治疗（TH）后，以及在肝切口后120min或刚在预期死亡前（END），进行动脉血的取样。所有的血样是从股动脉抽取，在此弃掉最初的5ml的血液。将用于

和凝血分析的血样收集在含有0.3mL（0.106mol/L）缓冲（pH5.5）柠檬酸钠的3mL试管中（扎尔施泰特（Sarstedt），纽姆布莱希特，德国）。将用于血细胞计数的血样收集在含有1.6mg EDTA/mL的2.7mL试管中（扎尔施泰特（Sarstedt），纽姆布莱希特，德国）。通过标准的实验室方法，使用适当的测试（来自德灵公司（Dade Behring），马尔堡，德国）以及阿梅隆血凝仪（AmelungCoagulometer，百特公司，英国）来确定凝血酶原时间（PT）、部分凝血激酶时间（PTT-LA1）、纤维蛋白原浓度、抗凝血酶（AT）以及凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）。对于D-二聚体测量，使用分析型D-二聚体

（仪器实验室公司（Instrumentation Laboratory Company），列克星顿，美国）。血细胞计数是使用Sysmex计数仪（希斯美康（Sysmex），Lake Zurich（苏黎世湖），伊利诺伊州，美国）来进行。使用血栓弹力计（

彭塔法姆公司（Pentapharm），慕尼黑，德国）进行凝结系统的功能性评定。为了加速和更好的标准化，使用了EXTEM试剂。勒丁顿（Luddington），《临床实验血液病学》（Clin Lab Haematol）2005,27:81-90。

校准自动化凝血酶图（CAT）试验是在圆底96孔板（Greiner microlon公司，U-形，高结合，美国）中进行。将柠檬酸化的血浆样品（80μl）以及含有1pMTF的启动溶液（20μl）（PPP试剂低质Cat#TS31.00，Thrombinoscope公司，马斯特里赫特，荷兰）混合在样品孔中。与上平行，通过将20μl校准器和80μl收集的柠檬酸化的正常猪血浆混合在与样品孔偶联的孔中来分析校准器（Cat#TS20.00，Thrombinoscope公司）。然后将板移至荧光计（Ascent阅读器，ThermolabsystemsOY公司，赫尔辛基，芬兰）并且将20μl的含有荧光底物和CaCl₂的FluCa溶液（Cat#TS50.00，Thrombinoscope）通过该仪器来分配。在60min期间，在λex390nm、λem460nm处测量荧光信号。在添加试剂期间，将96孔板保持在37°C加热块上。将凝血酶活性的开始（滞后时间）、凝血酶活性达峰时间（tt峰）、凝血酶活性峰值（峰值）、以及总凝血酶活性（即内源凝血酶生成潜力（ETP））使用来自ThrombinoscopeBV公司（马斯特里赫特，荷兰）的软件Thrombinoscope（版本3.0.0.29）来进行计算。

统计分析：所有统计分析是使用SPSS15.0统计包（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州）来进行的。使用Shapiro-Wilk检验来检验正态性。将没有呈正态分布的那些变量对数转换为使能够进行参数分析。施用分级程序（hierarchical procedure），进行一种方差分析（ANOVA），从而检测全组以及时间效应（P<.05被认为是显著的）。在具有显著性差异的情况中，进行方差分析（ANOVA）来检测组间差异。使用Bonferroni-Holm程序用于多重比较的修正。P<.005被认为是显著的。在具有显著性差异的情况中，进行组内的配对T检验以及组间的独立T检验。P<.001被认为是显著的。将组间的生存率使用Kaplan-Meier方法、用治疗组的累积生存率的对数秩（Mantel Cox）比较来进行分析。

结果

对具有平均重量为36.98kg（±4.23）以及年龄在四和五个月间的50只猪进行检验。在基线处，在组间，关于血液动力学或凝结参数、血小板或红血细胞计数，没有检测到统计学上显著的差异。所有的凝血试验结果在正常范围之内。韦利克-萨尔切纳（Velik-Salchner）等人，《凝血酶研究》（Thromb Res）2006,117:597-602。

存活时间：在伴随不受控的出血的肝损伤后，与在对照组中的那些相比，用纤维蛋白原结合rhFII（P=.029）或结合PCC（P=.017）治疗的动物存活显著更长。与对照组相比，用至少一种血液因子来治疗的所有组动物，已经增加了存活时间；同时在肝损伤后，与对照组相比，单独的纤维蛋白原以及纤维蛋白原与3F的组合显示对于存活率的类似影响。一只动物死于在刚给予PCC后的血栓栓塞并发症。

失血：如图1所示，在具有不受控的出血的肝损伤后，与盐水组相比，所有组中的失血量显著减少。

与用盐水或单独的纤维蛋白原治疗相比，在给予纤维蛋白原结合PCC或结合3F后，凝血时间（CT）显著减少。如图2a所示，在观察期的终点（END），与盐水或单独的纤维蛋白原相比时，在用纤维蛋白原与3F的组合治疗的动物中，CT仍显著缩短。与盐水相比，纤维蛋白原与PCC的组合显著缩短了CT。

如图2b所示，与单独用盐水相比，最大凝块坚固度（MCF）在给予纤维蛋白原结合3F或rhFII时显著增加。在稀释后，所有组中，MCF以相同量显著减小。与用盐水治疗的对照动物相比，在纤维蛋白原的给予后，MCF显著增加。在观察期的终点，与盐水组相比，在接受纤维蛋白原与3F浓缩物的组合（3F组）或纤维蛋白原与rhFII的组合的猪中，MCF仍显著增加。

凝血酶生成（CAT）：在组内滞后时间以及达峰时间没有不同。与用单独的纤维蛋白原治疗的动物中相比，纤维蛋白原结合PCC、rhFII或结合3F的给予导致显著更高的峰值。与对照组相比，在给予纤维蛋白原与rhFII连同纤维蛋白原与3F之后，峰值也显著增加。在肝损伤的两小时后，与所有其他组相比，在用纤维蛋白原与PCC的组合治疗的动物中峰值显著增加。与仅用纤维蛋白原（#）治疗的动物相比，用纤维蛋白原与rhFII连同纤维蛋白原与3F的组合治疗的动物具有显著更高的ETP，而与对照组相比，纤维蛋白原与rhFII的组合也导致显著更高的ETP。在观察期的终点，与所有其他组相比，纤维蛋白原与PCC的组合具有显著更高的ETP。

结论

如上所证实，在等容血液稀释和肝损伤后，与盐水或单独的纤维蛋白原相比，PCC或rhFII结合纤维蛋白原的给予导致失血的显著减小。在肝损伤后，PCC或rhFII结合纤维蛋白原的给予还导致动物存活显著更长。与对照相比，给予rFII结合纤维蛋白原的凝血时间显著缩短，并且在rhFII结合纤维蛋白原的治疗中，最大凝块坚固度也显著增加。这些结果证实rhFII的给予（在本例中，结合纤维蛋白原）是一种有效的治疗，该治疗足以恢复正常化的止血、预防失血并且降低死亡率。因此在出血性疾病和失血的治疗中，rhFII的使用是有效的，并且可以避免血栓栓塞事件的潜在严重的并发症，该并发症会伴随多重凝血因子的组合的给予。

实例2

方法

麻醉和维持稳态：将猪用肌肉内多美康（Dormicum）（2mg/kg）以及克他命（Ketaminol）（10mg/kg）进行术前用药。在约20min之后，将聚乙烯导管（Venflon1.0mmx32mm，Becton Dickinson公司，赫尔辛堡，瑞典）插入耳静脉中以用于麻醉剂和林格氏溶液的给予。将猪起初用戊巴比妥钠（Apoteksbolaget公司，于默奥，瑞典）来麻醉，经内静脉以单次剂量（15mg/kg）给予以使得插管法变得可能。在实验期间，用后续的戊巴比妥（10mg/kg/h-15mg/kg/h）的输注（在制备期间用1.8%异氟烷（vet，先灵葆雅公司（Schering-Plough），丹麦）补充）来维持麻醉。将猪用供应有10%O₂的房间空气来进行通风（Servo通风机900C，Siemens Elema公司，索尔纳，瑞典）。将呼吸频率保持恒定在15个循环/min并且通过调节潮气量将终末潮气CO₂保持在大约5.5kPa。不断地以1.5mL/kg/h给予林格氏溶液（费森尤斯卡比公司（Fresenius Kabi AS），哈尔登，挪威）以替换失液量。通过覆盖动物并且通过外部加温，将整个实验中的体温维持在36°C至39°C。在实验的终点，动物使用一个致死剂量的戊巴比妥（>150mg/kg）。

手术制备：将聚乙烯导管（Intramedic PE-200Clay Adams，派西派尼，新泽西州，美国）插入右侧股动脉，用于持续的动脉压力测量并且用于血样的收集。使聚乙烯导管（Intramedic PE-200Clay Adams，派西派尼，新泽西州，美国）向前进入两侧股静脉用于抽血并且用于加工好的红细胞（PRC）、羟乙基淀粉（HES）以及研究药物/运载体的给予。将用于监测中心静脉压（CVP）的第四聚乙烯导管（Intramedic PE-200Clay Adams，派西派尼，新泽西州，美国）放置在右侧颈静脉中。通过直肠探头来测量体温。最终，进行中线剖腹术（约35cm）以揭开肝。直到制成肝切口，将伤口用止血镊子闭合并且通过浸泡盐水的棉签来保护免于干燥。

实验方案：在基线血样（BS0）之后，动物经历了它们的总血容量（70mL/kg）的大约60%的、使用HES60mg/mL（

费森尤斯卡比公司（FreseniusKabi AB），乌普萨拉，瑞典）的等容的和等体温的交换。将尽可能多的血液用50mL注射器进行抽取，用5mL0.109M柠檬酸钠进行制备，直到平均动脉压（MAP）达到30mmHg至35mmHg的临界水平。然后将动物静置直到MAP增加至稳定水平（约10min）。

然后继续进行抽血直到MAP降低至最小值30mmHg，并且借助压力带立即静脉内（1mL HES:1mL血液）给予HES。正常地，在第一轮血液-HES交换期间，难以取出需要建立凝血紊乱的、所计算的血液体积。如果凝血紊乱的水平（用ROTEM分析来检查）太低，则抽取更多血液出并且用HES替换（1:1，尽管在第一轮交换之后血液被稀释）。在第二轮以及随后所有轮期间，平均动脉压将降低在60mmHg以下并且不存在对于任何恢复性间断的需要。为了使在第一轮交换中抽血体积最大化（即使MAP正在降低），可以静脉内给予盐酸苯福林（Apoteket AB公司，默恩达尔，瑞典）从而将血液从周围血管中挤出。在10min恢复性间断后，当MAP已经降低至约40mmHg时，给予盐酸苯福林（0.1mg/mL，约2mL）。在MAP短暂的并且立刻的增加期间，可以将一些额外的注射器充满血液。

使用在细胞保存装置（CATS，

费森尤斯卡比公司（Fresenius Kabi AB），乌普萨拉，瑞典）上的质量洗涤程序来加工流出的血液，并且在用HES进行体积恢复后，动物接受适当体积的经加工的红细胞，从而保持血红蛋白体积在50g/L以上并且由此避免来自严重贫血的早期死亡。在血液稀释之后进行ROTEM分析，以确定凝血紊乱的程度。凝血紊乱的标准如下：CT_Ex-TEM≥100s并且MCF≤40mm。在建立凝血紊乱后，收集血样（BS2）。然后给予研究药物。研究药物对应如下：（1）盐水对照；（2）重组人FII（rhFII）（8mg/kg）；（3）对应于rhFII+rhFX+rhFVIIa（分别为4.0mg/kg、0.32mg/kg以及0.006mg/kg）（低剂量）的三因子组合；（4）对应于rhFII+rhFX+rhFVIIa（分别为8.0mg/kg、0.64mg/kg以及0.012mg/kg）（高剂量）的三因子组合；（5）FEIBA（抗抑制剂-凝结剂复合物（AICC）；百特公司（Baxter））（40U/kg）；（6）

（凝血因子VIIa，诺和诺德公司（Novo Nordisk））（200μg/kg+100μg/kg）；或者HS（纤维蛋白原浓缩物，杰特贝林公司（CSL-Behring））。在完成输注十（10）分钟后，收集另一血样（BS3）。通过将国产模板放置在右肝叶上并且将手术刀（11号）牵拉穿过模板中的狭缝（长8cm，深3cm）来制成标准化切口，从而诱导不受控的出血。在肝切口后的最大观察时间是120min。就在死亡前收集最后的血样（BS4）。将血液抽吸出腹部外并且确定总失血量连同存活时间。死亡被定义为无脉搏的电学活性，MAP在15mmHg以下或者终末潮气二氧化碳在1.5kPa以下。

血液取样：将动脉血收集在柠檬酸化的试管（

9NC/2.9mL，扎尔施泰特（Sarstedt），纽姆布莱希特，德国）中用于ROTEM测量，并且将血浆保存用于凝血酶生成以及凝血酶-抗凝血酶复合物分析。将用于确定重组人因子II（rhFII）、重组人因子X（rhFX）、FVIIa、人纤维蛋白原的血浆浓度以及细胞计数的血液收集在钾EDTA试管（

2.6mL K3E，扎尔施泰特（Sarstedt），纽姆布莱希特，德国）中。

全血分析

ROTEM：贯穿实验，系列的血样被获得，以在旋转式血栓弹力计（

彭塔法姆股份有限公司（Pentapharm GmbH），慕尼黑，德国）中使用标准的凝血试验（EXTEM，

彭塔法姆股份有限公司（PentapharmGmbH），慕尼黑，德国）来评定有关凝块弹性发展的止血系统的能力。除了自制的、具有与可商购溶液类似浓度的氯化钙溶液外，使用可商购的试剂。遵从制造商的程序说明书。在该研究中，对凝血时间（CT）、凝块形成时间（CFT）以及最大凝块坚固度（MCF）进行了评估。

血液气体以及电解质：实验期间，将动脉血气体、酸-碱参数以及电解质进行了分析（ABL700，Radiometer Medical ApS公司，

丹麦）。根据制造商的说明书进行分析。贯穿实验，所有的动物表现出了良好的血液气体状态。

细胞计数：为了监测血细胞浓度中的可能的变化，在所有的血液取样时刻，将动脉血样在自动细胞计数仪（KX-21N，希斯美康（Sysmex），神户，日本）中进行分析。根据制造商的说明书进行分析。

血浆分析

凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）：使用三明治酶免疫分析（

TAT micro，德灵股份有限公司（Dade Behring GmbH），马尔堡，德国）来测量TAT的血浆水平。遵从制造商的说明书。如果获得浓度>90μg/mL，则将样品在稀释缓冲液中稀释10倍并且再进行分析。如果在血浆样品中观察到凝块，则它们不用于TAT分析。

CAT：如在实例1中所述，进行CAT分析。

结果

数据分析：使用自制软件（PharmLab V6.0，阿斯利康研发（AstraZenecaR&D），默恩达尔）来收集平均动脉压、中心静脉压、以及心率数据。结果呈现为：具有平均值±平均值的标准误差（SEM）的描述统计，将全血凝血时间以及TAT浓度结果除外。这些结果呈现为中值，这是因为在这些数据中离群值以一种误导的方式影响平均值。在对于大多数动物而言，发生在不同实验时间点的死亡之前，将在每个实验中的最后的血样（称为“实验终点”）取出。

失血：图3显示在运载体、测试和对照物质的给予以及肝切口后，每kg体重的失血（以ml计）。数据显示为单个的值，其中中位数由横条表示。

存活时间：图4显示对于不同的治疗组的存活曲线。在运载体组中，贯穿整个实验，25%的动物存活。在治疗组中，持续观察时间的2h的存活率是：对应地，对于三因子组合的更低剂量为67%，更高剂量三因子组合

以及

为80%，rhFII和

为100%。

ROTEM：来自全血样的EXTEM活化（即经TF的活化）的、在基线处、稀释后、给药后以及在实验终点处绘制的结果显示于图5a和图4b中。在基线处，对于所有的治疗组而言，CT和MCF是类似的。在稀释后，CT增加为基线水平的两倍，而MCF降低至约基线水平的一半。在稀释后，与基线相比，两个变量显示出组间的更大的可变性。在给予治疗后，对于所有被包含的治疗的CT类似地朝着基线值转移而不具有完全的正态化。不同的治疗对MCF的作用是小的，但除了

（纤维蛋白原）之外，它显示了在给药后几乎呈正态化的MCF。

CAT：来自对血浆样品的校准自动化凝血酶图分析的、在基线处、稀释后、给药后以及在实验终点处绘制的结果显示于图6（a-d）中。

在稀释后，与基线值相比，滞后时间（LT）以及达峰时间（tt峰）减小而峰值以及内源凝血酶生成潜力（ETP）增加。在物质已经被给予之后，对于rhFII的LT增加约50%，并且对于

注意到略微增加，而其他物质导致LT略微减小。并且，tt峰显示与LT相同的模式。与稀释后的值相比，峰值对于rhFII增加了100%，对于三因子组合（低剂量）增加了30%，对于三因子组合（高剂量）增加了150%，并且对于

增加了150%。与稀释后的即刻的值相比，运载体

以及没有改变峰值。与稀释步骤后的值相比，最终ETP值对于rhFII、三因子组合（高剂量）以及增加了几乎200%。与稀释后相比，对于低剂量三因子组合，ETP增加了约30%。

在实验终点处，，LT对应于与在剂量给予后的情况中相同的时段，但除了rhFII已经降低至与稀释步骤后相同的水平的情况之外。tt峰值如对于LT所述。峰值的情形显示所有的物质组（除了

）已经回到在最终的稀释后所发现的水平。

仍然显示与在物质给予之后立刻发现的水平可比较的峰值。在实验终点处的ETP值全部类似于峰值模式。

TAT：如在图7中所示，在稀释步骤后所有的治疗组中TAT的水平是类似的。当已经给药，会看到对于所有的包含凝血酶原（即三因子组合，rhFII以及

）的治疗而言，在2-3倍之间的TAT水平的增加。在实验的终点处，在给药后获得的模式仍然一致，对于含有凝血酶原的治疗（除了单独的rhFII）伴随TAT水平甚至更多的增加，与给予后相比，终点处显示减小的TAT水平。与稀释后和用2至3的因子给予后这二者相比，在实验的终点处，

以及

还具有增加的TAT水平。

结论

如上所证实，在等容血液稀释和肝损伤后，与盐水或其他治疗相比，单独给予rhFII导致失血的显著减小。凝血酶图分析揭示了：对于单独的rhFII增加了约50%的滞后时间，并且对于单独的rhFII增加了100%的峰值并且对于单独的rhFII增加了几乎200%的ETP值。这些结果进一步证实单独给予rhFII是一种有效的治疗，足以恢复正常化的止血、预防失血并且增加存活时间。

由于稀释性凝血紊乱，先前没有在具有不受控出血的复合动物模型中对单独的rhFII的使用或者三因子组合的使用进行测试。因而，本发明第一次提供了对于出血性疾病以及失血治疗，单独的rhFII的疗效、或3F的疗效。如以上实例2中所述，对于所有样品，在实验终点处的TAT水平和凝血酶生成数据减小至给予前的水平。对于凝血因子（例如单独的rhFII）的给予，这可以是有利的，因为在严重出血事件进程或失血时期期间，它使治疗方案能够更好地调整。更的持续时间可能不允许治疗方案中的必要调整。因此，如上所讨论，单独的rhFII的给予可以避免治疗期间潜在严重的血栓栓塞事件的并发症，该并发症有时伴随多重凝血因子的组合给予。

Claims (24)

1.使对其有需要的一个哺乳动物中受损的止血正常化的一种方法，该方法包括给予一种凝血因子治疗，该凝血因子治疗选自下组，该组由以下各项组成：（1）FII，（2）FII、FVIIa、以及FX的一个组合，（3）纤维蛋白原以及FII、FVIIa、和FX的一个组合，以及（4）纤维蛋白原和FII。

2.在一个具有受损的止血的哺乳动物中增加最大凝块坚固度（MCF）的一种方法，包括给予一种凝血因子治疗，该凝血因子治疗选自下组，该组由以下各项组成：（1）FII，（2）FII、FVIIa、以及FX的一个组合，（3）纤维蛋白原以及FII、FVIIa、和FX的一个组合，以及（4）纤维蛋白原和FII。

3.在一个具有受损的止血的哺乳动物中减少凝血时间（CT）的一种方法，该方法包括给予一种凝血因子治疗，该凝血因子治疗选自下组，该组由以下各项组成：（1）FII，（2）FII、FVIIa、以及FX的一个组合，（3）纤维蛋白原以及FII、FVIIa、和FX的一个组合，以及（4）纤维蛋白原和FII。

4.在一个具有受损的止血的哺乳动物中改进凝血酶生成的一种方法，包括给予一种凝血因子治疗，该凝血因子治疗选自下组，该组由以下各项组成：（1）FII，（2）FII、FVIIa、以及FX的一个组合，（3）纤维蛋白原以及FII、FVIIa、和FX的一个组合，以及（4）纤维蛋白原和FII。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述受损的止血与一种出血性疾病、出血、大量失血或一种外伤性出血事件相关联。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述大量失血与凝血紊乱相关联。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述出血性疾病是血友病。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述出血或外伤性出血事件与围手术出血、术后出血或产后出血相关联。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述FII是重组人FII（rhFlI）。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述FVIIa是重组人FVIIa（rhVIIa）。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述FX是重组人FX（rhFX）。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中需要治疗的该哺乳动物具有一个小于约2g/L、小于约1g/L、或小于约0.5g/L的血液纤维蛋白原浓度水平。

13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中需要治疗的该哺乳动物具有一个小于约200mg/L、小于约150mg/L、小于约100mg/L、或小于约50mg/dL g/L的血液纤维蛋白原浓度水平。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述受损的止血与占所估算的一个哺乳动物的总血容量大于约30%、大于约40%、大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%或大于约85%的一种失血相关联。

15.如权利要求6所述的方法，其中所述凝血紊乱是稀释性凝血紊乱，它起因于正常血容量的重建或血液动力学的稳定化。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中纤维蛋白原是以一个足以使血液纤维蛋白原浓度提高到约0.5g/L以上、约1g/L以上、约1.5g/L以上、或约2mg/L以上的量给予。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中纤维蛋白原是以12.5mg/kg至200mg/kg的一个剂量给予。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该FII是rhFII并且以1mg/kg至10mg/kg的一个剂量给予。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该凝血因子治疗是以使凝血时间减少约40秒至约60秒的一个剂量给予。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中该凝血因子治疗是以使最大凝块坚固度增加至约10mm至约30mm的一个剂量给予。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述凝血因子治疗的给予导致在给予后正常化的凝结维持至少两小时。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述凝血因子治疗是（1）FII，或（2）纤维蛋白原以及FII；并且其中所述凝血因子治疗是与FVIIa一起共同给予。

23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述凝血因子治疗是（1）FII、FVIIa、以及FX的组合，或（2）FII、FVIIa、以及FX与纤维蛋白原的组合；并且其中FII和FVIIa是以一个至少1:90的比率给予。

24.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述凝血因子治疗是（1）FII，或（2）纤维蛋白原以及FII；并且其中所述凝血因子治疗的给予是在没有来自凝血因子FV-FXIII中的任何其他凝血因子的共同给予的情况下进行的。

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