ES2625153T3 - Factor II solo o en combinación con factores adicionales para el tratamiento de la hemostasia alterada asociada con una coagulopatía por dilución - Google Patents

Abstract

Un tratamiento mediante factor de coagulación que consiste en: (1) FII; o (2) una combinación de FII, FVIIa y FX; o (3) fibrinógeno y una combinación de FII, FVIIa y FX; o (4) fibrinógeno y FII; o (5) FII y FVIIa; o (6) fibrinógeno, FII y FVIIa; para su uso en la normalización de la hemostasia alterada asociada con una coagulopatía por dilución en un mamífero que lo necesita.

Description

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DESCRIPCION

Factor II solo o en combinacion con factores adicionales para el tratamiento de la hemostasia alterada asociada con una coagulopatia por dilucion

Antecedentes

Campo

La presente divulgacion se refiere al tratamiento de la hemostasia alterada asociada con una coagulopatfa por dilucion.

Descripcion de la tecnica relacionada

La hemostasia se refiere al proceso de detencion la perdida de sangre de un vaso sangumeo danado. La coagulacion, o formacion de coagulos sangumeos, es una parte importante de la hemostasia. Para detener la hemorragia de una herida, se cubre la pared danada del vaso sangumeo con un coagulo que contiene plaquetas y fibrina. Los trastornos de la coagulacion pueden conducir a un mayor riesgo de sangrado (hemorragia) o coagulacion (trombosis).

La hemorragia masiva o la transfusion en pacientes se asocia comunmente con la alteracion de la coagulacion. Dicha alteracion de la coagulacion puede estar causada por la coagulopatfa por dilucion, definida como una mayor tendencia a la hemorragia debido a la dilucion de la sangre. La compensacion de lfquidos es un tratamiento convencional de la perdida abundante de sangre para normalizar la presion sangumea y evitar el shock circulatorio. Sin embargo, la compensacion de lfquidos diluye los factores de coagulacion del resto de la sangre y afecta a su funcion, lo que puede dar lugar a un aumento de la hemorragia que podna poner en peligro la vida.

Las vfas bioqmmicas in vivo que conducen a la coagulacion son complejas y requieren un gran numero de factores y cofactores. Hay diez factores designados por numeros romanos I-XIII, siendo III, IV y VI designadores no usados. Numerosos factores y cofactores relacionados modulan la actividad de la via bioqmmica. Por ejemplo, en la via del factor tisular, tras danarse el vaso sangumeo, el factor VII (abreviado como FII por convencion para los factores denominados con numeros romanos) entra en contacto con el factor tisular (TF) expresado en las celulas portadoras de factor tisular (fibroblastos estromales y leucocitos). Esto forma un complejo activado (TF-FVIla). El TF-FVIla activa el FIX y FX. El FVII es activado por la trombina, el FXIa, la plasmina, el FXII y el FXa. La conversion de FX en FXa activado por el TF-FVIIa es inhibida casi de inmediato por el inhibidor de la via del factor tisular (TFPI). El FXa y su cofactor FVa forman el complejo protrombinasa, que activa la protrombina en trombina. La trombina activa entonces otros componentes de la cascada de coagulacion, incluyendo el FV y el FVIII (que activa el FXI que, a su vez, activa el FIX), y activa y libera el FVIII de su union con el factor de von Wiilebrand (vWf). El FVTIIa es el cofactor de FIXa, y juntos forman el complejo "tenase", que activa el FX para retroalimentarse positivamente en el ciclo. La activacion de la via produce una rafaga de trombina activada. La trombina activada en este ciclo puede convertir el fibrinogeno en fibrina, que es la protema que forma un coagulo junto con las plaquetas.

La protrombina (FII) se produce en el hfgado y se modifica tras la traduccion en una reaccion dependiente de la vitamina K que convierte diez acidos glutamicos de la protrombina en acido gamma carboxi glutamico. La deficiencia de vitamina K o la administracion del anticoagulante warfarina inhibe la conversion de los restos de acido glutamico del Factor II en Gla, lo que ralentiza la activacion de la cascada de la coagulacion. La trombina (Flla) se produce por escision enzimatica de dos sitios de VII por el Factor X activado (FXa). La actividad de FXa se mejora en gran medida mediante la union al Factor V activado (FVa). En adultos humanos, el nivel sangumeo normal de actividad de protrombina se ha medido en torno a 1,1 unidades/ml. Los niveles plasmaticos de protrombina en los recien nacidos aumentan de manera constante tras el nacimiento para alcanzar niveles normales de adultos, desde un nivel de aproximadamente 0,5 unidades/ml un dfa despues del nacimiento a un nivel de aproximadamente 0,9 unidades/ml tras 6 meses de vida.

La trombina, que se forma a partir de la protrombina, tiene muchos efectos en la cascada de la coagulacion. Es una serina proteasa que convierte el fibrinogeno soluble en cadenas insolubles de fibrina, asf como cataliza muchas otras reacciones relacionadas con la coagulacion. Al Dieri et al., investigaron la relacion entre las concentraciones del factor de coagulacion, los parametros de generacion de trombina y la cantidad de perdida de sangre en pacientes con diversas deficiencias congenitas de factor de coagulacion. Los autores demostraron que la tendencia a la hemorragia se asocio directamente con la cantidad de generacion de trombina, que vario de manera lineal a las concentraciones de FII. Al Dieri et al., Thromb Haemost 2002, 88: 576- 82. Fenger-Erikson et al., tambien mostraron, en el caso de la coagulopatfa por dilucion, que aparte del fibrinogeno, los factores de coagulacion incluyendo el FII, FX y FXIII tambien se redujeron por debajo del nivel esperado tras una dilucion al 32 % con solucion de almidon hidroxietilico. Fenger-Eriksen et al., J Thromb Haemost 2009, 7: 1099-105.

El fibrinogeno (factor I o FI) es una glicoprotema plasmatica soluble que es sintetizada por el tugado y convertida por la trombina en fibrina durante la coagulacion de la sangre. Los procesos de la cascada de coagulacion convierten la

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protrombina en la serina proteasa activada trombina, que convierte el fibrinogeno en fibrina. La fibrina es entonces reticulada por el factor XIII para formar un coagulo. La concentracion normal de fibrinogeno en el plasma sangumeo es de 1,5-4,0 g/l o de aproximadamente 7 pM. En el caso de una perdida de sangre marcada, el fibrinogeno mas que cualquier otro factor procoagulante o plaqueta alcanza concentraciones en plasma cnticamente bajas. Hiippala et al., Anesth Analog 1995, 81:360-5; Singbartl et al., Anesth Analog 2003, 96:929-35; McLoughlin et al., Anesth Analg 1996, 83:459-65. Pequenas cantidades de coloides (inferiores a 1.000 ml) pueden afectar a la polimerizacion de la fibrina y, por lo tanto, la fuerza del coagulo. Lunerhofer P et al., Anesth Analog 2002, 95:858-65; Mittermayr et al., Anesth Analg 2007; 105:905-17; Fries et al., Anesth Analg 2002,94:1280-7. Algunas recomendaciones citan un umbral de concentracion de fibrinogeno de 1 g/l basado en los resultados de un estudio en el que se observo que cuatro de cada cuatro pacientes con una concentracion de fibrinogeno inferior a 0,5 g/l teman hemorragia microvascular difusa. Spahn et al., CritCare 2007, 11:R17; Stainsby et al., Br J Haematol 2006; 135:634-41; Ciavarella et al., Br J Haematol 1987; 67:365-8. Por el contrario, los datos clmicos recientes de la hemorragia periparto, la neurocirugfa y la cirugfa cardfaca muestran que a una concentracion de fibrinogeno inferior a 1,5-2 g/l, ya hay una tendencia creciente de hemorragia peri y postoperatoria. Charbit et al., J Thromb Haernost 2007, 5:26673; Gerlach et al., Stroke 2002, 33:1618-23; Blome et al., J Thromb Haemost 2005, 93:1101-7; Ucar et al., Heart Surg Forum 2007, 10:E332-6.

Los problemas de coagulacion asociados con trastornos hemorragicos tales como la coagulopatfa por dilucion se pueden abordar con terapia hemostatica. El objetivo de la terapia hemostatica es reducir al mmimo la perdida de sangre, las necesidades de transfusion y la mortalidad. En pacientes con traumatismos con puntuaciones de gravedad de lesiones (ISS) identicas, la mortalidad practicamente se duplica simplemente como resultado de la coagulopatfa. Brohi et al., J Trauma 2003, 54: 1127-30. La hemorragia masiva o la transfusion masiva en pacientes con politraumatismo se asocia con una coagulacion alterada. Por lo tanto, para lograr una hemostasia adecuada, se requiere una cantidad suficiente de trombina y suficiente sustrato coagulable. Los elementos clave en la coagulacion son la formacion de trombina en la superficie de las plaquetas y la escision del fibrinogeno por la trombina para formar fibrina. Brohi et al., J Trauma 2003, 54:1127-30. Si se forma suficiente trombina, convierte el fibrinogeno en fibrina estable, lo que determina la firmeza del coagulo en desarrollo en presencia del factor XIII (FXIII). Korte et al., Hamostaseologie 2006, 26: S30-5.

Un reemplazo agresivo del lfquido es crucial en el caso de la perdida de sangre masiva, en pacientes con traumatismo por un objeto romo y politraumatismo, para mantener la normovolemia. Sperry J. L., et al., J Trauma 2008; 64: 9-14. Sin embargo, la estabilizacion hemodinamica mediante la administracion de grandes cantidades de soluciones cristaloides o coloides provoca LA coagulopatfa por dilucion. Los efectos clmicos de la alteracion de la coagulacion plasmatica causada por hemodilucion normovolemica se investigaron previamente en varias publicaciones. Innerhofer P., et al., Anesth Analg 2002; 95:858-65, Singbartl et al., Anesth Analog 2003; 96:929-35. Mittermayr et al., Anesth Analg 2007; 105:905-17.

La coagulopatfa por dilucion suele tratarse con plasma recien congelado (FFP) y, si esta disponible, con crioprecipitado. Stainsby et al., Br J Anaesth 2000, 85:487-91; Spahn et al., Crit Care 2007, 11:R17. Sin embargo, las concentraciones de factor de coagulacion reducidas drasticamente apenas se pueden corregir administrando FFP debido a sus bajas concentraciones de factores de coagulacion y sus efectos de expansion del volumen, que contrarrestan el aumento previsto de la concentracion de cualquier protema de interes. Mittermayer 2007, supra; Scalea et al., Ann Surg, 2008, 248:578-84; Chowdhury et al., Br J Haematol 2004, 125:69-73; Stanworth et al., Br J Haematol 2004, 126:139-52; Abdel-Wahab et al., Transfusion 2006, 46:1279-85. Ademas, la administracion de FFP se asocia con varias complicaciones tales como la aparicion de lesion pulmonar, insuficiencia multiorganica e infeccion. Watson G. A., et al., J Trauma 2009, 67:221-7; Sarani et al., Crit Care Med 2008, 36:1114-8; Dara et al., Crit Care Med. 2005, 33:2667-71. Ademas, el proceso de descongelacion necesario retrasa el tratamiento inmediato, que es de especial importancia en el caso de hemorragia aguda y grave.

El efecto de la administracion de concentrado de fibrinogeno en la coagulopatfa por dilucion se examino previamente in vitro, en varios modelos animales, asf como en la practica clmica. Fries et al., Br J Anaesth 2005, 95:172-7; Fries et al., Anesth Analg 2006, 102:347-51; Velik-Salchner et al., J Thromb Haemost 2007, 5:1019-25; Stinger et al., J Trauma 2008, 64:S79-85. La administracion de solo concentrado de fibrinogeno normaliza la resistencia del coagulo, pero no el inicio de la coagulacion, ya que se trata de una reaccion dependiente de la trombina. Fries et al., Br J Anaesth 2005, 95:172-7; Fries et al., Anesth Analg 2006, 102:347-51; Fenger-Eriksen et al., J. Thromb Haemost 2009, 7:795-802. De este modo, se han estudiado anteriormente combinaciones de fibrinogeno y complejos de factor de coagulacion tales como concentrado de complejo de protrombina (PCC).

En particular, Fries et al., estudiaron el efecto de la sustitucion del fibrinogeno en la reversion de la coagulopatfa por dilucion en un modelo in vitro. British Journal of Anesthesia, 2006, 97(4):460-467. Se diluyo sangre de 5 voluntarios varones sanos en un 60 % usando solucion de Ringer con lactato, solucion de gelatina modificada al 4 % o almidon de hidroxietilo al 6% (HES) 130/0,4, asf como la combinacion de la solucion de Ringer con lactato bien con cualquiera de 2 soluciones coloidales. Fries et al., Anesth Analg; 2006, 102:347-51. Tras ello, se incubaron almuotas de muestras de sangre diluidas con 3 concentraciones diferentes de fibrinogeno (0,75, 1,5 y 3,0 g/l). Las mediciones se realizaron mediante tromboesograma modificado (ROTEM®, Pentapharm, Munich, Alemania). Despues de una dilucion al 60 %, los tiempos de coagulacion aumentaron, mientras que la firmeza del coagulo y la polimerizacion de

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la fibrina se redujeron significativamente. Tras la administracion de fibrinogeno, los tiempos de coagulacion se redujeron. La firmeza del coagulo, as^ como la polimerizacion de la fibrina, aumentaron en todas las muestras de sangre diluidas cuando se anadio fibrinogeno. El efecto de la sustitucion in vitro de fibrinogeno sobre las variables de ROTEM® dependfa de la dosis de fibrinogeno y del tipo de solucion usada para diluir las muestras de sangre.

En otro estudio, Fries et al., investigaron el efecto del concentrado de complejo de fibrinogeno y protrombina (PCC) en condiciones de hemodilucion y hemorragia no controlada en un modelo porcino. Fries et al., British Journal of Anesthesia, 2006, 97(4): 460-467. Despues de una importante perdida de sangre del 65 % del volumen sangumeo total estimado, el reemplazo del volumen de lfquido con HES (2.500 ml) dio lugar a la coagulopatfa por dilucion medida mediante pruebas convencionales de coagulacion y analisis de ROTEM®. En los animales que solo recibieron concentrado de globulos rojos recuperados y en el grupo de placebo, hubo una pequena mejona estadfsticamente significativa en los parametros de ROTEM®. Sin embargo, en el grupo de tratamiento, la sustitucion adicional de fibrinogeno y PCC produjo la normalizacion de los parametros de coagulacion. La perdida de sangre y la mortalidad tras una lesion hepatica estandarizada se redujeron significativamente en animales tratados con fibrinogeno y PCC en comparacion con el placebo.

El PCC se suele administrar en la practica clmica en el caso de un tiempo de coagulacion prolongado en pacientes en estado cntico, asf como en situaciones de hemorragia masiva. Schochl et al., Anaesthesia 2009, 58(10): 10101026. El PCC corresponde a los factores 11, VII, IX y X, asf como a la protema C y pequenas cantidades de heparina, y se ha usado durante anos para tratar las deficiencias hereditarias de la coagulacion y para la reversion de la anticoagulacion tras la administracion de antagonistas de la vitamina K. Solo se dispone de datos limitados en animales sobre el uso de preparados de PCC modernos en cerdos que presentan deficiencias adquiridas del factor de coagulacion causadas por la perdida masiva de sangre y la administracion de HES. Dickneite et al., Anesth Analg 2008, 106:1070-7; Dickneite et al., Br J Anaesth 2009, 102:345-54; Dickneite et al J Trauma 2009.

Staudinger et al., investigaron el efecto del PCC en la coagulacion plasmatica en pacientes en estado cntico, e indicaron que una dosis de 2.000 unidades de Factor IX de PCC (media de 30 Ul/kg de peso corporal) normalizo el tiempo de protrombina (PT) elevando el nivel plasmatico de factores de coagulacion II, VII, IX y X en pacientes con actividad de coagulacion moderadamente reducida. Staudinger et al., Intensive Care Med 1999, 25:1105-10. Sin embargo, con respecto a la generacion de trombina, el PCC parece ser mucho mas activo que el rhFVIIa. Dickneite et al., J Trauma 2009. El PCC puede estar asociado con un mayor riesgo de complicaciones tromboembolicas, especialmente, en pacientes con defectos de coagulacion adquiridos. Bagot et al., Thromb Haemost 2007, 98:11412; Warren et al., Ann Emerg Med 2009, 53:758-61; Kohler et al., Thromb Haemost 1998, 80:399-402.

Tambien se han propuesto diversos metodos adicionales para el tratamiento de la hemorragia y la perdida de sangre, incluyendo la suplementacion de factores de coagulacion. Veanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes de EE.UU. 2003/0129183, 2004/0198647, 2004/0237970, 2005/0282771, 2006/0025336, 2006/0211621, 2007/0232788, 2008/0014251, 2008/0188400, 2008/0267940, 2010/0093607, 2009/0098103, 2009/0148502, 2009/0175931, 2009/0232877 y 2010/0086529.

A pesar de la propuesta y del estudio de diversas composiciones y metodos para restaurar la hemostasia, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de mejorar los metodos de tratamiento de trastornos hemostaticos tales como la coagulopatfa por dilucion.

Para lograr la hemostasia en pacientes con trastornos hemorragicos o perdida de sangre, se requiere una cantidad suficiente de trombina y suficiente sustrato coagulable (fibrinogeno). Los aspectos clave en la coagulacion son la formacion de trombina en la superficie de las plaquetas y la escision del fibrinogeno por trombina para formar fibrina. Si se forma suficiente trombina, convierte el fibrinogeno en fibrina estable, siempre que haya fibrinogeno, lo que determina la firmeza del coagulo en desarrollo en presencia del factor XIII (FXIII).

La presente invencion proporciona el tratamiento o la reduccion al mmimo de la hemorragia incontrolada usando uno o varios agentes hemostaticos recombinantes, incluyendo el factor II humano recombinante (rhFII) solo o una combinacion de tres factores de coagulacion humanos recombinantes, rhFll, rhFX y rhFVIIa (3F), donde se usan agentes hemostaticos con o sin fibrinogeno. En particular, la presente invencion demuestra la eficacia de dichos agentes hemostaticos recombinantes en el tratamiento de la coagulopatfa por dilucion. Sorprendentemente, la administracion de rhFll solo o en combinacion con fibrinogeno basta para restablecer la hemostasia normal. La administracion de rhFII solo, o en combinacion con fibrinogeno, puede evitar las complicaciones potencialmente graves de los episodios tromboembolicos que pueden acompanar a otras formas convencionales de tratamiento proporcionadas en la actualidad para controlar los trastornos hemorragicos o la perdida de sangre.

Cabe senalar que la referencia a cualquiera de las publicaciones en el presente documento no debe interpretarse como una admision de que dicha publicacion sea una tecnica anterior a las invenciones desveladas a continuacion en el presente documento.

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Resumen

El tratamiento de un trastorno hemostatico o la normalizacion de la hemostasia asociada con una coagulopatfa por dilucion pueden comprender administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion seleccionado del grupo que consiste en (1) Fll solo; (2) FII y FVIIa; y (3) una combinacion de tres factores de FII, FX y FVIla. El tratamiento mediante factor de coagulacion (agente/s hemostatico/s) se puede administrar opcionalmente en combinacion con fibrinogeno. El/los agente/s hemostatico/s puede/n ser factores humanos recombinantes, por ejemplo, rhFII, rhFX y rhVIIa (esta combinacion de tres factores de factores humanos recombinantes se puede abreviar como 3F) o rhFII solo. En algunas realizaciones, un tratamiento eficaz de un trastorno hemostatico o de la normalizacion de la hemostasia asociada con una coagulopatia por dilucion puede comprender la administracion conjunta de fibrinogeno y rhFII. El tratamiento puede realizarse sin suplementacion sustancial de ningun otro factor de coagulacion. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un tratamiento eficaz de un trastorno hemostatico asociado con la coagulopatfa por dilucion puede comprender administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion seleccionado del grupo que consiste en (1) Fll solo, por ejemplo, rhFII; (2) 3F; y (3) FII y FVIIa; (4) fibrinogeno y una combinacion de Fll, FVIIa y FX; (5) fibrinogeno, FII y FVIIa; (6) o fibrinogeno y FII

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Perdida de sangre por kg de peso corporal en ml tras una incision hepatica y la administracion de control de solucion salina, concentrado de fibrinogeno (fib), concentracion de fibrinogeno en combinacion con PCC (PCC + fib), concentrado de fibrinogeno en combinacion con combinacion de tres factores (3F+fib)) o concentrado de fibrinogeno en combinacion con FII humano recombinante (FII + fib), que se muestra como la media ± DT.

Figura 2 (A-B): Analisis de ROTEM® en la lmea basal (LB), tras la extraccion de sangre (ES), tras la hemodilucion (TH), tras la administracion del farmaco de estudio (FE), y en el punto final de la observacion (FIN). Los farmacos del estudio corresponden a concentrado de fibrinogeno (fibrinogeno), concentracion de fibrinogeno en combinacion con pCc (PCC), concentrado de fibrinogeno en combinacion con FII humano recombinante (FII), concentrado de fibrinogeno en combinacion con combinacion de tres factores (3F) o control de solucion salina. Se muestran el tiempo de coagulacion (TC, en segundos) (Figura 2A) y la maxima firmeza del coagulo (FMC, en mm) (Figura 2B). Se muestran diferencias estadfsticamente significativas (p <0,001) en comparacion con el grupo de solucion salina y el grupo de fibrinogeno.

Figura 3: Perdida de sangre por kg de peso corporal en ml tras la administracion de (1) control de solucion salina; (2) FII humano recombinante (rhFII) a 8 mg/kg; (3) combinacion de tres factores correspondiente a rhFII + rhFX + rhFVIIa a 4,0, 0,32 y 0,006 mg/kg, respectivamente (dosis baja); (4) combinacion de tres factores correspondiente a rhFII + rhFX + rhFVIIa a 8,0, 0,64 y 0,012 mg/kg, respectivamente (dosis alta); (5) FEIBA VH® (concentrado de complejo activado (APCC), Baxter) a 40 U/kg; (6) NovoSeven® (factor de coagulacion VIla; Novo Nordisk) a una primera dosis de 200 pg/kg seguida de una segunda dosis de 100 pg/kg una hora despues; O Haemocomplettan® HS (concentrado de fibrinogeno, CSL-Behring), como valores individuales y mediana (barra horizontal).

Figura 4 (A-B): Resultados de ROTEM tras la administracion de factores de coagulacion, o combinaciones de los mismos, como se describe en la Figura 3 anterior, que muestra a) tiempo de coagulacion (TC); b) firmeza maxima del coagulo (FMC) de muestras de sangre entera activadas por ex-TEM (factor tisular) extrafdas al inicio, tras la dilucion, tras la administracion del farmaco y al final del experimento, respectivamente, mostradas como media ± DT.

Figura 5 (A-D): Resultados de generacion de trombina (trombograffa calibrada automatizada) tras la administracion de factores de coagulacion, o combinaciones de los mismos, segun lo descrito en la Figura 3 anterior, que muestra (A) tiempo de retardo; (B) tiempo hasta el maximo; (C) maximo; y (D) potencial de trombina endogena para las muestras de plasma obtenidas al inicio, tras la dilucion, tras la administracion del farmaco y al final del experimento, mostradas como media ± ETM.

Figura 6. Concentracion del complejo de trombina-antitrombina en muestras de plasma tras la administracion de factores de coagulacion, o combinaciones de los mismos, segun lo descrito para la Figura 3 anterior, representada al inicio, tras la dilucion, tras la administracion del farmaco y al final del experimento mostrada como la mediana.

Descripcion detallada

La presente invencion proporciona el tratamiento de la hemorragia incontrolada o la normalizacion de la hemostasia asociada con una coagulopatfa por dilucion mediante la administracion de un tratamiento mediante factor de coagulacion o una combinacion de uno o mas factores de coagulacion. En particular, la invencion proporciona el tratamiento de la hemorragia incontrolada o la normalizacion de la hemostasia asociada con una coagulopatfa por dilucion mediante la administracion de FII, o VII y FVIla, o una combinacion de tres factores (FII, FX y FVIla). En ciertas realizaciones, los agentes hemostaticos o factores de coagulacion son factores de coagulacion humanos recombinantes. En realizaciones adicionales, los factores de coagulacion se administran con o sin fibrinogeno. Tambien se desvela a efectos meramente ilustrativos el PCC (FII, FVII, FIX y FX, opcionalmente con pequenas cantidades de heparina) como tratamiento mediante factor de coagulacion.

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El inicio de la coagulopatfa por dilucion y el efecto del tratamiento se pueden medir mediante pruebas de coagulacion convencionales, tales como la trombelastometna rotacional (ROTEM®) y generacion de trombina medida mediante la trombograffa calibrada automatizada (CAT) realizado usando activador de TF 1 pM.

ROTEM® investiga la interaccion de factores de coagulacion, sus inhibidores, farmacos anticoagulantes, celulas sangumeas, en concreto, plaquetas, durante la coagulacion y posterior fibrinolisis. Las condiciones reologicas imitan el flujo lento de la sangre por las venas. En resumen, se dispone la sangre en una cubeta desechable usando una pipeta electronica. Se coloca un pasador desechable a un eje que esta conectado con un resorte delgado y que oscila lentamente hacia adelante y hacia atras. La senal del pasador suspendido en la muestra de sangre se transmite a traves de un sistema detector optico. El instrumento mide y muestra graficamente los cambios en la elasticidad en todas las etapas del coagulo en desarrollo y resolucion. La temperatura de ensayo tfpica es de 37 °C, pero se pueden seleccionar diferentes temperaturas. El resultado principal es una curva de reaccion que muestra la elasticidad a lo largo del tiempo cuando el coagulo se forma o se disuelve.

Cuatro parametros describen la curva de coagulacion en el uso rutinario. El tiempo de coagulacion (TC) es el tiempo de retardo desde la adicion del reactivo de partida a la sangre hasta que el coagulo comienza a formarse. La prolongacion del TC puede deberse a deficiencias de coagulacion, principalmente factores de coagulacion, o heparina (dependiendo de la prueba usada). Un acortamiento del TC indica hipercoagulabilidad. El angulo alfa es el angulo de una tangente a la curva, mientras que el tiempo de formacion de coagulos (TFC) es el tiempo desde el TC hasta que se alcanza una firmeza del coagulo de 20 mm. Estos parametros indican la velocidad a la que se forma un coagulo solido, y estan influidos principalmente por la funcion plaquetaria, pero tambien contribuyen factores de fibrinogeno y coagulacion. Un TFC prolongado (o un angulo alfa inferior) suele deberse a una mala funcion plaquetaria, bajo recuento de plaquetas, trastornos de polimerizacion de fibrina o deficiencia de fibrinogeno. Un acortamiento del TFC (o un alto angulo alfa) indican hipercoagulabilidad. La maxima firmeza del coagulo (FMC) es la mayor amplitud vertical del trazado. Refleja la resistencia absoluta de la fibrina y del coagulo plaquetario. Un FMC bajo es indicativo de una reduccion del numero o de la funcion de las plaquetas, una reduccion del nivel de fibrinogeno o trastornos de polimerizacion de la fibrina, o una baja actividad del factor XIII. Un coagulo mecanicamente debil representa un grave riesgo de hemorragia.

Se pueden usar variaciones de ROTEM® para enfatizar diferentes parametros y efectos. Por ejemplo, EXTEM es un ensayo de deteccion para el sistema de hemostasia (extrmseco). El reactivo EXTEM activa suavemente la hemostasia usando el factor tisular. El resultado se ve influido luego por factores de coagulacion extrmsecos, plaquetas y fibrinogeno.

La trombograffa calibrada automatizada (CAT) ha sido descrita por Hemker et al., (Pathophysiol Haemost Thromb, 2002, 32:249-253). Usando un sustrato de trombina fluorogenico "lento" y una comparacion continua con un calibrador de ejecucion simultanea, se puede controlar automaticamente la generacion de trombina. La "trombograffa" resultante mide la hipocoagulabilidad y la hipercoagulabilidad en plasma pobre en plaquetas.

El tratamiento de un trastorno hemostatico o la normalizacion de la hemostasia asociada con una coagulopatfa por dilucion pueden comprender la administracion de un tratamiento mediante factor de coagulacion, por ejemplo, FII y, opcionalmente, FX y FVIla, o una combinacion de fibrinogeno y FII, opcionalmente ademas en combinacion con FX y FVIIa. El/los agente/s hemostatico/s puede/n ser factores humanos recombinantes, por ejemplo, rhFII, rhFX y rhFVIla o rhFII solo. En algunas realizaciones, un tratamiento eficaz de un trastorno hemostatico puede consistir en administrar VII o administrar conjuntamente FII, FX y FVIIa, o administrar conjuntamente fibrinogeno con FII y opcionalmente, administrar conjuntamente ademas FX y FVIIa, pudiendo ser FII, FX y/o FVIIa factores humanos producidos de forma recombinante.

El tratamiento o la normalizacion o la hemostasia asociada con una coagulopatfa por dilucion se pueden realizar sin la suplementacion sustancial de ningun otro factor de coagulacion. En algunas realizaciones, el tratamiento de un trastorno hemostatico puede consistir en VII o la administracion conjunta de fibrinogeno y FII, donde el VII puede ser FII humano recombinante (rhFII).

La expresion "suplementacion sustancial" se refiere a la adicion de otros componentes tales como factores de coagulacion ademas de los descritos en la presente invencion, en una cantidad en la que el efecto de uno o mas agentes hemostaticos cuando se suplementan con dichos factores de coagulacion adicionales es considerablemente diferente del efecto de la administracion del uno o mas agentes hemostaticos sin suplementacion.

Como se usan en el presente documento, las protemas "recombinantes" incluyen aquellas protemas producidas mediante tecnicas recombinantes. Dichas protemas incluyen aquellas que se asemejan a la protema natural, asf como las modificadas para potenciar la actividad, la semivida de la protema, la estabilidad de la protema, la localizacion de la protema y la eficacia. Vease la publicacion de la solicitud de patente de EE.Uu. n.° US 2005/0164367.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" es un metodo de obtencion de resultados clmicos beneficiosos o deseados. Los resultados clmicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitacion, el alivio de

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los smtomas, la reduccion de la hemorragia, la estabilizacion del individuo y la prevencion de la hemorragia.

La expresion "que consiste esencialmente en” no implica la abstencion de otros tratamientos de pacientes convencionales simultaneos, sino que un tratamiento que consiste esencialmente en, por ejemplo, la administracion de FII o la administracion conjunta de una cantidad eficaz de fibrinogeno y FII, no esta precedido de inmediato, acompanado ni seguido de inmediato por una suplementacion significativa de otros factores de coagulacion, en particular, factores de coagulacion de protemas tales como los designados por los numeros romanos V-XIII. En algunas realizaciones, un tratamiento que consiste esencialmente en la administracion de FII solo o la administracion conjunta de una cantidad eficaz de fibrinogeno y FII, puede realizarse simultaneamente con procedimientos separados tales como transfusion, administracion de plaquetas congeladas, recuperacion de celulas sangumeas, fluidos que contienen cristaloides y/o coloides, y otros tratamientos convencionales que no comprenden la suplementacion activa de factores de coagulacion mas alla de lo que puede ser endogeno en sangre transfundida, preparados de plaquetas congeladas, o similares. En otras realizaciones, puede no ser necesario o desearse realizar simultaneamente cualquier procedimiento que comprenda la administracion separada de una composicion que incluya cantidades significativas de factores de coagulacion (por ejemplo, factores V-XIII) al realizar un tratamiento que consista esencialmente en la administracion de una cantidad eficaz de FII, 3F, fibrinogeno y FII o fibrinogeno y 3F.

Un metodo de tratamiento de un trastorno de hemorragia por traumatismo en un mamffero que lo necesita puede comprender administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion seleccionado del grupo que consiste en rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (b) rhFII solo, en el que (a), o (b) se proporciona opcionalmente en combinacion con fibrinogeno. En algunas realizaciones, un metodo de normalizacion de la hemostasia alterada asociada con un trastorno de hemorragia por traumatismo en un mamffero puede comprender administrar el tratamiento con el factor de coagulacion que consiste en (a) FII y FVIIa; (b) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (c) rhFll solo, en el que (a), (b) o (c) se proporciona opcionalmente en combinacion con fibrinogeno. Ademas, un metodo de reduccion de la mortalidad resultante de un trastorno de hemorragia traumatico puede comprender administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion seleccionado del grupo que consiste en (a) PCC (FII, FX, FIX, FVII y protema C); (b) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (c) rhFII solo, en el que (a), (b) o (c) se proporciona opcionalmente en combinacion con fibrinogeno.

Un metodo de tratamiento de un trastorno hemostatico o de normalizacion de la hemostasia asociada con una coagulopatfa por dilucion puede comprender aumentar la firmeza maxima del coagulo (FMC), reducir el tiempo de coagulacion (TC) y/o mejorar la generacion de trombina tras una hemorragia o perdida masiva de sangre asociada con un trastorno de hemorragia por traumatismo en un mamffero mediante la administracion de terapia de combinacion que comprenda, o que consista esencialmente en, uno o mas agentes hemostaticos incluyendo VII y, opcionalmente, fibrinogeno.

En cualquiera de estos metodos, el tratamiento mediante factor de coagulacion puede consistir en (a) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (b) rhFII. En una realizacion, el tratamiento mediante factor de coagulacion es una combinacion de FII, FVIla y FX. En otra realizacion, el tratamiento mediante factor de coagulacion es VII o rhFll solo. En otras realizaciones, el tratamiento mediante factor de coagulacion puede ser bien una combinacion de rhFII, rhFVIIa y rhFX o rhFII solo, esencialmente sin la suplementacion de cualquier otro factor hemostatico, en particular, otros factores de coagulacion denominados con numeros romanos. Es decir, en algunas realizaciones, los metodos pueden comprender administrar rhFII y, opcionalmente, fibrinogeno esencialmente sin la suplementacion de cualquier otro factor hemostatico, en particular, de factores V-XIII.

El metodo de tratamiento de un trastorno de hemorragia por traumatismo en un mamffero que lo necesita puede consistir en administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion como se ha descrito anteriormente. Del mismo modo, un metodo de normalizacion de la hemostasia alterada asociada con un trastorno de hemorragia por traumatismo en un mamffero puede consistir en administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion como se ha descrito anteriormente. Ademas, un metodo de reduccion de la mortalidad resultante de un trastorno de hemorragia por traumatismo puede consistir en administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion como se ha descrito anteriormente. Un metodo de tratamiento de un trastorno hemostatico o de normalizacion de la hemostasia asociada con una coagulopatfa por dilucion puede comprender aumentar la firmeza maxima del coagulo (FMC), reducir el tiempo de coagulacion (TC) y/o mejorar la generacion de trombina tras una hemorragia o perdida masiva de sangre asociada con un trastorno de hemorragia por traumatismo en un marnffero mediante un metodo que puede consistir en administrar un tratamiento mediante factor de coagulacion. En ciertas realizaciones, la firmeza maxima del coagulo se aumenta a aproximadamente 10 mm a aproximadamente 40 mm, a aproximadamente 10 mm a aproximadamente 30 mm, a aproximadamente 10 mm, a aproximadamente 15 mm, a aproximadamente 20 mm, a aproximadamente 25 mm o a aproximadamente 30 mm. En otras realizaciones, el tiempo de coagulacion se reduce en aproximadamente 35 a aproximadamente 75 segundos, o en aproximadamente 35 segundos, en aproximadamente 40 segundos, en aproximadamente 45 segundos, en aproximadamente 50 segundos, en aproximadamente 55 segundos, en aproximadamente 60 segundos, en aproximadamente 65 segundos, en aproximadamente 70 segundos o en aproximadamente 75 segundos. Como anteriormente, el tratamiento mediante factor de coagulacion, el tratamiento mediante factor de coagulacion puede consistir en (a) FII y FVIIa; (b) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (c) rhFll solo, en el que (a), (b) o (c) se proporciona opcionalmente en combinacion con fibrinogeno. En algunas realizaciones preferidas, el tratamiento mediante factor de coagulacion es

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una combinacion de (1) FII, FVIIa y FX; o (2) FII solo. El tratamiento mediante factor de coagulacion puede comprender factores humanos recombinantes, es decir, bien una combinacion de (1) rhFII, rhFVIIa y rhFX; o (2) rhFII solo. En algunas realizaciones, los metodos pueden consistir en la administracion conjunta de rhFII, y opcionalmente, la administracion conjunta de fibrinogeno.

"Administracion conjunta " o "tratamiento conjunto" significa administrar una mezcla de componentes o administrar por separado los componentes de un tratamiento conjunto en momentos que estan proximos entre sf, por ejemplo, administrar los componentes administrados conjuntamente durante penodos que se solapan en el tiempo o comenzar la administracion de un componente en aproximadamente una hora, o media hora, o cuarto de hora del comienzo o la finalizacion de la administracion de un componente administrado conjuntamente.

Los componentes administrados en los metodos desvelados en el presente documento se formulan y administran usando tecnicas que estan bien establecidas en la materia. Por ejemplo, el fibrinogeno y FII, rhFII o 3f se pueden administrar por inyeccion o infusion intravenosa usando un vehuculo o excipiente farmaceuticamente aceptable. Los vehfculos y excipientes adecuados para la formulacion de los agentes activos incluyen cualquier agente farmaceutico que no induzca una respuesta inmune perjudicial para el individuo que recibe la composicion y que pueda administrarse sin producir la toxicidad indebida. Los excipientes farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin limitacion, lfquidos tales como agua, solucion salina, glicerol, azucares y etanol. Tambien se pueden incluir sales farmaceuticamente aceptables. Dichas sales incluyen sales de acidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de acidos organicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Ademas, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH, y similares, pueden estar presentes en dichos vehfculos. Hay una descripcion completa de excipientes farmaceuticamente aceptables disponible en “Remington's Pharmaceutical Sciences” (Mack Pub. Co., 18a edicion, Easton, Pa., 1990).

Un trastorno hemostatico puede estar asociado con cualquiera de entre una coagulopatfa (por ejemplo, coagulopatfa por dilucion), hemorragia por traumatismo, hemorragia periquirurgica, hemorragia postquirurgica, hemorragia postparto y similares. Un trastorno hemostatico puede estar asociado con un nivel de concentracion de fibrinogeno en sangre inferior a aproximadamente 2 a aproximadamente 1,5 g/l, inferior a aproximadamente 1 g/l, o inferior a aproximadamente 0,5 g/l. El trastorno hemostatico puede estar asociado con una perdida de sangre del aproximadamente 30 % al aproximadamente 85 %, por ejemplo, mas del aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 % o aproximadamente 85 % del volumen sangumeo total estimado de un marnffero. En algunas realizaciones, la coagulopatfa por dilucion se produce como resultado del restablecimiento de la normovolemia o del restablecimiento de la estabilizacion hemodinamica. Asf pues, un mamffero que necesita los tratamientos desvelados en el presente documento puede ser un marnffero que cumpla uno o mas de estos criterios.

Los trastornos hemostaticos tambien pueden incluir hemofilia A y B, pacientes con hemofilia A y B con anticuerpos inhibidores, deficiencias en factores de coagulacion, por ejemplo, fibrinogeno, FIl, FV, FVll, FIX, FVIII, FX, FXl, FXll y FXIII, factor de von Willebrand, deficiencia combinada de FV/FVII, deficiencia de vitamina K epoxido reductasa C1, deficiencia de gamma-carboxilasa; hemorragia asociada con traumatismo, lesion, trombosis, trombocitopenia, apoplejfa, coagulopatfa, coagulacion intravascular diseminada (DIC); sobre-anticoagulacion asociada con la heparina, heparina de bajo peso molecular, pentasacarido, warfarina, antitromboticos de molecula pequena (es decir, inhibidores de FXa); y trastornos plaquetarios tales como el smdrome de Bernard Soulier, tromboblastemia de Glanzman y deficiencia de la reserva de almacenamiento.

Un trastorno hemostatico tambien puede incluir hemorragia relacionada con trastornos tromboticos tales como trombosis venosa profunda, trombosis asociada con estados de enfermedad cardiovascular o neoplasias malignas, trombosis resultante de cateteres permanentes u otros procedimientos quirurgicos invasivos y trombosis asociada con enfermedades autoinmunes tales como lupus.

Los metodos descritos en el presente documento pueden comprender o consisten esencialmente en la administracion conjunta de fibrinogeno en una cantidad suficiente para elevar la concentracion de fibrinogeno en sangre por encima de aproximadamente 0,5, aproximadamente 1, aproximadamente 1,5 o aproximadamente 2 g/l. En algunas realizaciones, el fibrinogeno se administra a una dosis de 12,5-200 mg/kg, por ejemplo, a una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 12,5, 25, 50 100 o 200 mg/kg. En algunas realizaciones, el rhFII se administra a una dosis de 1, 2, 4, 8 o 10 mg/kg. En algunas realizaciones, la administracion conjunta de fibrinogeno y uno o mas agentes hemostaticos da lugar al mantenimiento de la coagulacion aproximadamente normalizada durante al menos dos horas despues de la administracion.

Los agentes activos para un tratamiento se pueden montar en un kit. El kit podna contener fibrinogeno y FII, rhFII y/o 3F, asf como cualquier excipiente apropiado, tal como, pero sin limitacion, solucion salina y solucion de sacarosa, y cualquier cofactor adicional para la estabilizacion o efectividad de los componentes de la composicion, tales como, pero sin limitacion, azucares, antioxidantes y albumina. Ademas, el kit puede comprender otros elementos implicados en el suministro de los agentes activos, incluyendo un dispositivo para la inyeccion de los agentes activos

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(por ejemplo, una jeringa), un torniquete y un hisopo de alcohol para limpiar el sitio de inyeccion. Tambien se pueden incluir otros elementos en un kit que incluye elementos para el cierre de heridas tales como material de sutura, agujas y forceps.

Aunque los metodos desvelados en el presente documento se han descrito en detalle con referencia a realizaciones de los mismos, resultara evidente para un experto en la materia que se pueden realizar diversos cambios y equivalentes empleados, sin apartarse del alcance de la divulgacion. Del mismo modo, los siguientes ejemplos se presentan como ilustrativos de los procedimientos desvelados, pero se han de interpretar como limitantes de los metodos desvelados.

Se puede administrar fibrinogeno o concentrado de fibrinogeno ademas de uno o mas agentes hemostaticos para aumentar la resistencia del coagulo final. En ciertas realizaciones, la combinacion de fibrinogeno con rhFII o 3F acorta el tiempo de coagulacion y mejora la generacion de trombina. La administracion de rhFII combinada con fibrinogeno puede utilizarse para reducir la mortalidad en el tratamiento de la hemorragia no controlada. Se desvela que se puede usar la administracion de la combinacion de PCC y fibrinogeno para reforzar la coagulacion, hasta 0,5 horas, una hora o dos horas despues de la administracion. Por lo tanto, el uso de rhFII, en particular, en combinacion con fibrinogeno, puede ser una alternativa al PCC con una eficacia comparable, pero con menos riesgo de complicaciones tromboembolicas.

Un tratamiento que comprende la administracion conjunta de fibrinogeno y rhFII sin suplementacion de otros agentes hemostaticos puede ser eficaz para normalizar la hemostasia alterada tras una perdida sangumea severa al menos tan alta como aproximadamente un 60 % de hemodilucion con menos riesgo de complicaciones. Tambien es eficaz la administracion conjunta de fibrinogeno y rhFII que contiene 3F. Ademas, un tratamiento eficaz puede consistir esencialmente en administrar rhFII o 3F con o sin suplementacion de fibrinogeno.

Ejemplos

Ejemplo 1 METODOS

Preparacion y mediciones quirurgicas: el estudio se realizo con cincuenta cerdos sanos. Se realizo la medicacion previa de los animales con azaperona (4 mg/kg IM, agente neuroleptico, Stresnil™, Janssen, Viena, Austria) y atropina (0,1 mg/kg IM) una hora antes de iniciarse el estudio. Se indujo la anestesia y se mantuvo con propofol (12 mg/kg IV). Para la induccion de la analgesia, se inyecto piritramida (30 mg, opioide con una semivida de ~4 a 8 horas, Dipidolor™, janssen, Viena, Austria). Para la relajacion muscular, se inyectaron 0,2 mg/kg/h de pancuronio tras la anestesia endotraqueal. Despues de la intubacion, se inserto un cateter frances de 7,5 en la arteria femoral para la recogida de muestras de sangre y la medicion continua de la presion arterial. Se insertaron dos cateteres franceses de 7,5 en ambas venas femorales para la extraccion de sangre, la administracion de coloides y cristaloides, y la administracion del farmaco de estudio. Se coloco un cateter de Swan-Ganz a traves de la vena yugular derecha.

Protocolo experimental: se cubrio la necesidad basal de reemplazo de lfquidos (4 ml/kg) durante todo el curso del ensayo usando cristaloides (solucion de lactato de Ringer). Para inducir la coagulopatfa por dilucion estandarizada, se realizo una hemodilucion normovolemica con HES al 6% 130/0,4 (Voluven®, Fresenius Co., Bad Homburg, Alemania): se extrajo sangre de los animales a traves de los cateteres grandes y se reemplazo por coloide en una proporcion de 1:1. Una vez completada la hemodilucion, se proceso la sangre extrafda en un sistema Cell Saver (Cats®, Fresenius, Viena, Austria), se concentro y se volvio a transferir para evitar la anemia hemodinamicamente relevante. La hemodilucion normovolemica se completo cuando la coagulopatfa resultante alcanzo un nivel cntico determinado por ROTEM® y el uso del reactivo EXTEM: tiempo de coagulacion (TC) > 100 s y firmeza maxima del coagulo (FMC) < 40 mm. Los animales fueron asignados aleatoriamente a 200 mg/kg de concentrado de fibrinogeno (Haemocompiettan IIS®, CSL-Behring) (grupo de fibrinogeno), 200 mg/kg de concentrado de fibrinogeno y 35 UI/kg de PCC (Beriplex®, CSL Behring, Marburg, Alemania) (grupo de PCC), 200 mg/kg de concentrado de fibrinogeno y 4 mg/kg de concentrado de rhFII (AstraZeneca R&D Molndal, Suecia) (grupo de FII), 200 mg/kg de concentrado de fibrinogeno y un concentrado de combinacion de tres factores que inclrna 4 mg/kg de RhFII, 0,32 mg/kg de rhFX y 0,006 mg/kg de rhFVIIa (AstraZeneca R&D Molndal, Suecia) (grupo de 3F) o una cantidad igual de solucion salina normal (grupo salino). La dosis de concentrado de fibrinogeno y PCC se baso en datos previamente publicados de experimentos con animales. Sperry et al. J Trauma 2008, 64:9-14; Innerhofer P. et al., Anesth Analg 2002, 95:85865.

Se indujo una lesion hepatica estandarizada (12 cm de longitud y 3 cm de profundidad) usando un molde inmediatamente despues de la administracion de los factores de coagulacion o de la combinacion de factores de coagulacion descritos anteriormente. El corte se realizo sobre el lobulo derecho del hngado. El estudio se realizo con ocultacion para el personal que realizo los examenes de los tejidos, los ensayos de coagulacion, la documentacion de la hemodinamica, la incision del tngado o para los que participaron en la recogida y la medicion de la perdida de sangre.

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Tras la incision del Imgado, se evaluo la perdida sangumea subsiguiente, as^ como el tiempo transcurrido hasta que los animales murieron debido a choque hemorragico. Ademas de las mediciones trombelastometricas, se realizaron ensayos de coagulacion convencionales (PT, aPTT, fibrinogeno, recuento de plaquetas), los parametros para la coagulacion activada (D-dfmeros y TAT) y un ensayo de generacion de trombina para estimar el potencial de formacion de trombina (trombograffa calibrada automatizada, CAT).

Dos horas despues del traumatismo hepatico, se sacrificaron los animales supervivientes con infusion de potasio. Se extirparon el corazon, el pulmon, partes de los intestinos y los rinones, y se evaluaron para determinar la aparicion de trombosis microvascular.

Muestreo de sangre y metodos analttcos. se realizo un muestreo de sangre arterial en la lmea basal (LB), tras la extraccion de sangre (ES), tras la hemodilucion (TH), terapia con los farmacos del estudio (FE) y 120 min despues de la incision hepatica o inmediatamente antes de la muerte anticipada (FIN). Todas las muestras de sangre se extrajeron de la arteria femoral, por lo que se desecharon los primeros 5 ml de sangre. Se recogieron muestras de sangre para los analisis de ROTEm® y de coagulacion en tubos de 3 ml que conteman 0,3 ml (0,106 mol/l) de citrato de sodio tamponado (pH 5,5) (Sarstedt, Numbrecht, Alemania). Se recogieron muestras de sangre para el recuento de las celulas sangumeas en tubos de 2,7 ml que conteman 1,6 mg de EDTA/ml (Sarstedt, Numbrecht, Alemania). Se determinaron el tiempo de protrombina (TP), el tiempo parcial de tromboplastina (PTT-LA1), la concentracion de fibrinogeno, la antitrombina (At) y el complejo de trombina-antitrombina (TAT) mediante metodos de laboratorio convencionales usando las pruebas apropiadas de Dade Behring, Marburg, Alemania, y el coagulometro de Amelung, Baxter, RU. Para las mediciones de dfmero D, se uso el dfmero D del ensayo 0020008500® (Instrumentation Laboratory Company, Lexington, EE.UU.). El recuento de celulas sangumeas se realizo usando el contador Poch-100i® de Sysmex (Sysmex, Lake Zurich, IL, EE.UU.). Se uso tromboelastometna (ROTEM®, Pentapharm, Munich, Alemania) para la evaluacion funcional del sistema de coagulacion. Para la aceleracion y la mejor estandarizacion, se uso el reactivo EXTEM. Luddington, Clin Lao Haematol 2005, 27.81-90.

El ensayo de trombograffa calibrada automatizada (CAT) se realizo en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Greiner microlon, en forma de U, de alta union, EE.UU.). Se mezclaron muestras de plasma tratadas con citradas (80 |jl) y solucion desencadenante (20 jl) (reactivo de PPP bajo n.° de cat. TS31.00, Thrombinoscope, Maastricht, Pafses Bajos) que conteman 1 pM de TF en pocillos de muestra. Paralelamente, se analizo un calibrador (n.° de catalogo TS20.00, Thrombinoscope) mezclando 20 jl de calibrador y 80 jl de plasma porcino normal tratado con citrato combinado en pocillos acoplados a los pocillos de muestra. A continuacion, se traslado la placa a un fluorometro (Ascent reader, Thermolabsystems OY, Helsinki, Finlandia) y se dispensaron con un instrumento 20 jl de solucion de FluCa (n.° de catalogo TS50.00, Thrombinoscope) que contema sustrato fluorogenico y CaCl2. Se midio la senal fluorogenica se midio a Aex de 390 nm, Aem de 460 nm durante 60 min. La placa de 96 pocillos se mantuvo en un bloque de calentamiento a 37 °C durante la adicion de los reactivos. El inicio de la actividad de trombina (tiempo de retardo), el tiempo hasta el maximo de la actividad de la trombina (thMax), la actividad de trombina maxima (Maximo) y la actividad total de trombina, es decir, el potencial de trombina endogena (PTE) se calcularon usando el software Thrombinoscope (version 3.0.0.29) de Thrombinoscope BV (Maastricht, Pafses Bajos).

Analisis estad^stico. todos los analisis estadfsticos se realizaron usando el paquete estadfstico SPSS 15.0 (SPSS, Chicago, 1L). Se uso la prueba de de Shapiro-Wilk para analizar la normalidad. Las variables no distribuidas normalmente se transformaron logantmicamente para permitir el analisis parametrico. Aplicando un procedimiento jerarquico, se realizo un analisis de varianza (ANOVA) para detectar los efectos globales de grupo y del tiempo (p < 0,05 se considero significativo). En el caso de diferencias significativas, se realizo un analisis de varianza (ANOVA) para detectar las diferencias entre los grupos. Se uso el procedimiento de Bonferroni-Holm para la correccion de comparaciones multiples. p < 0,005 se considero significativo. En el caso de diferencias significativas, se realizaron pruebas t pareadas dentro de pruebas t independientes entre los grupos. p < 0,001 se considero significativo. La supervivencia entre los grupos se analizo usando metodos de Kaplan-Meier con la comparacion de rango logantmico (Mantel Cox) de la supervivencia acumulada por grupo de tratamiento.

RESULTADOS

Se examinaron 50 cerdos con un peso medio de 36,98 kg (± 4,23) y una edad de entre cuatro y cinco meses. Al inicio, no se detectaron diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos con respecto a los parametros hemodinamicos ni los parametros de coagulacion, el recuento de plaquetas o de globulos rojos. Todos los resultados de las pruebas de coagulacion estaban dentro del intervalo normal. Velik-Salchner et al. Thromb Res 2006, 117.597602.

Tiempo de supervivencia. los animales tratados con fibrinogeno combinado con rhFIl (p = 0,029) o con PCC (p = 0,17) vivieron significativamente mas tiempo tras la lesion hepatica con hemorragia no controlada que los del grupo de control. Todos los grupos de animales tratados con al menos un factor sangumeo tuvieron un aumento de los tiempos de supervivencia en comparacion con el grupo de control, mientras que el fibrinogeno solo y la combinacion de fibrinogeno con 3F mostraron un efecto similar sobre la supervivencia tras la lesion hepatica en comparacion con el grupo de control. Un animal murio debido a una complicacion tromboembolica inmediatamente despues de la

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administracion de PCC.

Perdida de sangre: como se muestra en la Figura 1, tras una lesion hepatica con hemorragia no controlada, la perdida de sangre disminuyo significativamente en todos los grupos en comparacion con el grupo de solucion salina.

ROTEM®: el tiempo de coagulacion (TC) disminuyo significativamente tras la administracion de fibrinogeno combinado con PCC o con 3F en comparacion con el tratamiento con solucion salina o fibrinogeno solo. Como se muestra en la Figura 2a, al final del penodo de observacion (FIN), el TC se siguio acortando significativamente en los animales tratados con la combinacion de fibrinogeno y 3F en comparacion con la solucion salina o el fibrinogeno solo. La combinacion de fibrinogeno y PCC redujo significativamente el TC en comparacion con la solucion salina.

Como se muestra en la Figura 2b, la firmeza maxima del coagulo (FMC) aumento significativamente tras la administracion de fibrinogeno combinado con 3F o rhFll en comparacion con el tratamiento con solucion salina sola. Despues de la dilucion, la FMC disminuyo significativamente en la misma cantidad en todos los grupos. Despues de la administracion de fibrinogeno, la FMC aumento significativamente en comparacion con los animales de control tratados con solucion salina. Al final del penodo de observacion, la FMC estaba todavfa significativamente aumentada en los cerdos que recibieron la combinacion de fibrinogeno y concentrado de 3F (grupo de 3F) o fibrinogeno y rhFll en comparacion con el grupo de solucion salina.

Generacion de trombina (CAT): el tiempo de retardo y el tiempo hasta el maximo no difieren dentro de los grupos. La administracion de fibrinogeno combinado con PCC, rhFll o con 3F dio lugar a un valor maximo significativamente mas alto que en los animales tratados solo con fibrinogeno. En comparacion con el grupo de control, el valor maximo tambien aumento significativamente tras la administracion de fibrinogeno y rhFll, asf como de fibrinogeno y 3F. Dos horas despues de la lesion hepatica, el valor maximo se aumento significativamente en animales tratados con la combinacion de fibrinogeno y PCC en comparacion con todos los demas grupos. Los animales tratados con la combinacion de fibrinogeno y rhFII, asf como fibrinogeno y 3F tuvieron una PTE significativamente superior que los animales tratados solo con fibrinogeno (#), mientras que la combinacion de fibrinogeno y rhFII tambien dio lugar a una PTE significativamente superior en comparacion con el grupo de control. Al final del penodo de observacion, la combinacion de fibrinogeno y PCC tema una PTE significativamente superior que todos los demas grupos.

CONCLUSION

Como se ha demostrado anteriormente, la administracion de PCC o rhFII en combinacion con fibrinogeno, en comparacion con la solucion salina o el fibrinogeno solo, dio lugar a una reduccion significativa de la perdida de sangre tras la hemodilucion normovolemica y la lesion hepatica. La administracion de PCC o rhFII en combinacion con fibrinogeno tambien dio lugar a animales que vivieron significativamente mas tiempo tras la lesion hepatica. El tiempo de coagulacion se acorto significativamente con la administracion de rFII en combinacion con fibrinogeno en comparacion con los controles, y la firmeza maxima del coagulo tambien aumento significativamente con el tratamiento de rhFII en combinacion con fibrinogeno. Estos resultados demuestran que la administracion de rhFII (en este caso, en combinacion con fibrinogeno) es un tratamiento eficaz suficiente para restaurar la hemostasia normalizada, prevenir la perdida de sangre y disminuir la mortalidad. El uso de rhFII en el tratamiento de trastornos hemorragicos y la perdida de sangre es, por lo tanto, eficaz y podna evitar las complicaciones potencialmente graves de los episodios tromboembolicos que pueden acompanar a la administracion de una combinacion de multiples factores de coagulacion.

Ejemplo 2

METODOS

Anestesia y mantenimiento de la homeostasis: se medicaron previamente los cerdos con Dormicum (2 mg/kg) y Ketaminol (10 mg/kg) intramusculares. Tras aproximadamente 20 minutos, se inserto un cateter de polietileno (Venfion 1,0 x 32 mm, Becton Dickinson, Helsingborg, Suecia) en una vena del ofdo para usarlo para la administracion de anestesicos y solucion de Ringer. Los cerdos se anestesiaron inicialmente con pentobarbital sodico (Apoteksbolaget, Umea, Suecia), administrado por via intravenosa como una dosis en bolo (15 mg/kg) para hacer posible la intubacion. Durante el experimento, se mantuvo la anestesia con una infusion subsiguiente de pentobarbital (10-15 mg/kg/h) complementada con isoflurano al 1,8% (Isoba® vet, Schering-Plough, Dinamarca) durante la preparacion. Se ventilaron los cerdos (Servo Ventilator 900C, Siemens Elema, Solna, Suecia) con aire ambiente suministrado con O2 al 10 %. La velocidad respiratoria se mantuvo constante a 15 ciclos/min y se mantuvo el margen final de CO2 a ~5,5 kPa regulando el volumen corriente. Se administro solucion de Ringer (Fresenius Kabi AS, Halden, Noruega) a 1,5 ml/kg/h de manera continua para reemplazar la perdida de lfquido. Se mantuvo la temperatura corporal a una temperatura de 36 a 39 °C durante todo el experimento cubriendo los animales y calentando externamente. Al final del experimento, los animales tuvieron una dosis letal de pentobarbital (> 150 mg/kg).

Preparaciones quirurgicas: se inserto un cateter de polietileno (Intramedic PE-200 Clay Adams, Parsippany, NJ, EE.UU.) en la arteria femoral derecha para la medicion continua de la presion arterial y para la recogida de muestras

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de sangre. Se insertaron cateteres de polietileno (Intramedic PE-200 Clay Adams, Parsippany, NJ, EE.UU.) en ambas venas femorales para la extraccion de sangre y la administracion de globulos rojos procesados (PRC), almidon de hidroxietilo (HES) y farmaco de estudio/vehnculo. Se coloco un cuarto cateter de polietileno (Intramedic PE-200 Clay Adams, Parsippany, NJ, EE.UU.) para controlar la presion venosa central (CVP) en la vena yugular derecha. Se midio la temperatura corporal mediante una sonda rectal. Finalmente, se realizo una laparotoirna de la lmea media, aproximadamente 35 cm, para descubrir el hngado. Hasta que se realizo la incision del hngado, se cerro la herida con forceps hemostaticos y se protegio del secado mediante hisopos sumergidos en solucion salina.

Protocolo experimental: despues de las muestras basales de sangre (BS0), se sometieron los animales a un intercambio isovolemico y normotermico del ~60 % de su volumen sangumeo total (70 ml/kg) con HES a 60 mg/ml (Voluven®, Fresenius Kabi AB, Uppsala, Suecia). Se retiro la mayor cantidad posible de sangre con jeringas de 50 ml preparadas con 5 ml de citrato sodico 0,109 M, hasta que la presion arterial media (MAP) alcanzo un nivel cntico de 30 mm Hg a 35 mm Hg. A continuacion, los animales se dejaron en reposo hasta que la MAP aumento hasta un nivel estable (aproximadamente 10 minutos).

Entonces, se prosiguio con la extraccion de sangre hasta que la MAP se redujo al mmimo de 30 mm Hg y se administro HES de inmediato i.v. (1 ml de HES: 1 ml de sangre) por medio de un manguito de presion. Normalmente, es diffcil tomar el volumen calculado de sangre necesario para establecer la coagulopatfa durante la primera serie de intercambio de sangre-HES. Si el nivel de coagulopatfa, controlado con el analisis ROTEM, es demasiado bajo, se retira mas sangre y se reemplaza por HES (1:1, aunque la sangre se diluye tras la primera serie de intercambio). Durante la segunda y todas las rondas siguientes, la presion arterial media no caera por debajo de 60 mm Hg, y no hay necesidad de ninguna pausa de la recuperacion. Para aumentar al maximo el volumen de sangre extrafdo en la primera serie de intercambio, aun cuando la MAP esta cayendo, se puede administrar clorhidrato de fenilefrina (Apoteket AB, Mondal, Suecia) i.v. para exprimir la sangre de los vasos perifericos. Se administra clorhidrato de fenilefrina (aproximadamente 2 ml de 0,1 mg/ml) tras la pausa de la recuperacion de 10 minutos, cuando la MAP ha cafdo a aproximadamente 40 mm Hg. Durante el aumento corto e inmediato de MAP, se pueden llenar algunas jeringas adicionales con sangre.

Se proceso la sangre derramada usando el programa de lavado de calidad en un dispositivo de ahorro de celulas (CATS®, Fresenius Kabi AB, Uppsala, Suecia) y, tras una reanimacion del volumen con HES, los animales recibieron un volumen apropiado de globulos rojos procesados para mantener el valor de hemoglobina por encima de 50 g/l y asf evitar la muerte prematura por anemia grave. Se realizo el analisis ROTEM tras la hemodilucion para determinar la extension de la coagulopatfa. Los criterios para la coagulopatfa fueron los siguientes: TCex-tem ^ 100 s y FMC < 40 mm. Despues de la coagulopatfa establecida, se recogio una muestra de sangre (BS2). A continuacion, se administro el farmaco del estudio. Los farmacos de estudio correspondfan a los siguientes: (1) control de solucion salina; (2) FII humano recombinante (rhFII) a 8 mg/kg; (3) combinacion de tres factores correspondiente a rhFII + rhFX + rhFVIIa a 4,0, 0,32 y 0,006 mg/kg, respectivamente (dosis baja); (4) combinacion de tres factores correspondiente a rhFII + rhFX + rhFVIIa a 8,0, 0,64 y 0,012 mg/kg, respectivamente (dosis alta); (5) FEIBA VH® (complejo coagulante anti-inhibidor (AICC), Baxter) a 40 U/kg; (6) NovoSeven® (Factor de coagulacion VIla, Novo Nordisk) a 200 + 100 pg/kg; o Haemocomplettan® HS (concentrado de fibrinogeno, CSL-Behring). Diez (10) minutos despues de completarse la infusion, se recogio otra muestra de sangre (BS3). Se realizo una incision estandarizada colocando un molde de elaboracion casera en el lobulo derecho del hngado y tirando de una cuchilla quirurgica (n.° 11) a traves de una hendidura del molde (longitud de 8 cm, profundidad de 3 cm) para inducir una hemorragia incontrolado. El tiempo maximo de observacion tras la incision del hngado fue de 120 min. Justo antes de la muerte, se recogio una ultima muestra de sangre (BS4). Se extrajo sangre del abdomen y se determino la perdida total de sangre, asf como el tiempo de supervivencia. La muerte se definio como la actividad electrica sin pulso, PAM por debajo de 15 mm Hg o margen final de dioxido de carbono inferior a 1,5 kPa.

Muestreo de sangre: se recogio sangre arterial en tubos tratados con citrato (S-Monovette® 9 NC/2,9 ml, Sarstedt, Numbrecht, Alemania) para las mediciones de ROTEM, y se reservo plasma para la generacion de trombina y el analisis del complejo de trombina-antitrombina. Se recogio sangre para determinar la concentracion en plasma de Factor II humano recombinante (rhFII), factor X humano recombinante (rhFX), FVI-la, fibrinogeno humano y recuento de celulas en tubos de EDTA de potasio (S-Monovette® 2,6 ml de K3E, Sarstedt, Numbrecht, Alemania).

Analisis de sangre entera

ROTEM: a lo largo del experimento, se obtuvieron muestras de sangre en serie para evaluar la competencia del sistema hemostatico con respecto al desarrollo de la elasticidad del coagulo mediante pruebas de coagulacion convencionales (EXTEM®, INTEM®, Pentapharm GmbH, Munich, Alemania) en tromboelastometna rotacional (ROTEM®, Pentapharm GmbH, Munich, Alemania). Se usaron reactivos disponibles en el mercado, excepto para la solucion de cloruro de calcio, que se preparo internamente con una concentracion similar a la solucion comercial disponible. Se siguieron las instrucciones del procedimiento del fabricante. En este estudio, se evaluaron el tiempo de coagulacion (TC), el tiempo de formacion de coagulos (TFC) y la firmeza maxima del coagulo (FMC).

Gases y electrolitos en sangre: durante el experimento, se analizaron los gases de la sangre arterial, parametros de acido-base y electrolitos (ABL 700, Radiometer Medical ApS, Bronshoj, Dinamarca). Los analisis se realizaron de

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acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los animales presentaron un buen estado de gases en sangre a lo largo de los experimented.

Recuento de celulas: para controlar las posibles variaciones en las concentraciones de celulas sangumeas, se analizaron las muestras de sangre arterial en un instrumento de contador celular automatizado (KX-21N, Sysmex, Kobe, Japon) en todas las ocasiones de muestreo de sangre. Los analisis se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Analisis de Plasma

Complejo de trombina-antitrombina (TAT): se midieron los niveles de TAT en plasma usando un inmunoensayo enzimatico de tipo sandwich (Enzygnost® TAT micro, Dade Behring GmbH, Marburg, Alemania). Se siguieron las instrucciones del fabricante. Si se obtuvieron concentraciones > 90 pg/ml, las muestras se diluyeron 10 veces en tampon diluyente y se volvieron a analizar. Si se observaron coagulos en muestras de plasma, no se analizaron para determinar el TAT.

CAT: el ensayo de CAT se realizo como se ha descrito en el Ejemplo 1.

RESULTADOS

Analisis de los datos: se recogieron la presion arterial media, la presion venosa central y los datos de la frecuencia cardfaca usando un software interno (PharmLab V6.0, AstraZeneca R&D Molndal). Los resultados se presentan como estadfstica descriptiva con valores medios ± error tfpico de la media (ETM), excepto para los resultados del tiempo de coagulacion de la sangre entera y de la concentracion de TAT. Estos resultados se presentan como valores medianos, porque los valores atfpicos en estos datos afectaron al valor medio de una manera enganosa. La ultima muestra de sangre de cada experimento, denominada "fin del experimento", se toma antes de la muerte, que se produce en diferentes momentos experimentales para la mayona de los animales.

Perdida de sangre: la Figura 3 muestra la perdida de sangre por kg de peso corporal en ml tras la administracion de vehteulo, sustancias de ensayo y de control e incision hepatica. Los datos se muestran como valores individuales con la mediana representada por una barra horizontal.

Tiempo de supervivencia: la Figura 4 muestra las curvas de supervivencia para los diferentes grupos de tratamiento. En el grupo de vehteulo, el 25 % de los animales sobrevivio durante todo el experimento. La supervivencia durante 2 h de tiempo de observacion en los grupos de tratamiento fue para la dosis inferior de la combinacion de tres factores del 67 %, la combinacion de tres factores a la dosis superior, NovoSeven® y Haemocomplettan® del 80 %, rhFII y FEIBA® del 100 %, respectivamente

ROTEM: los resultados de la activacion de EXTEM, es decir, la activacion a traves de TF, de muestras de sangre entera extratelas en la lmea basal, tras la dilucion, tras la administracion del farmaco y al final del experimento se muestran en las Figuras 5a y 5b. En la lmea basal, el TC y la FMC son similares para todos los grupos de tratamiento. Tras la dilucion, el TC aumenta el doble del nivel basal, mientras que la FMC se reduce a aproximadamente la mitad del nivel en la lmea basal. Despues de la dilucion, ambas variables muestran una mayor variabilidad entre los grupos en comparacion con la lmea basal. Despues de la administracion de los tratamientos, el TC para todos los tratamientos incluidos se desplazo de manera similar hacia los valores basales sin normalizacion completa. El efecto sobre la FMC por los diferentes tratamientos fue bajo, a excepcion de Haemocomplettan® (fibrinogeno), que mostro una FMC casi normalizada tras la administracion del farmaco.

CAT: en las Figuras 6 (a-d), se muestran los resultados del analisis de trombograffa calibrada automatizada de muestras de plasma extratelas en la lmea basal, tras la dilucion, tras la administracion del farmaco y al final del experimento.

Despues de la dilucion, el tiempo de retardo (TR) y el tiempo hasta el maximo (thMax) se redujeron, mientras que el Maximo y el potencial de trombina endogena (PTE) aumentaron en comparacion con los valores basales. Despues de la administracion de las sustancias el TR aumento aproximadamente un 50 % para el rhFll, y se observo un ligero aumento para Haemocomplettan®, mientras que las otras sustancias produjeron ligeras disminuciones del TR. Mas adelante, el thMax mostro el mismo patron que el TR. Los valores maximos aumentaron para rhFII en un 100%, para la combinacion de tres factores (dosis baja) en un 30%, para la combinacion de tres factores (dosis alta) en un 150% y para la FEIBA® en un 150% en comparacion con el valor tras la dilucion. El vehteulo, NovoSeven® y Haemocomplettan® no cambiaron el Maximo en comparacion con el valor inmediatamente posterior a la dilucion. Finalmente, los valores de PTE se aumentaron en casi un 200 % para rhFII, para la combinacion de tres factores (dosis alta) y para FEIBA® en comparacion con los valores posteriores a la etapa de diucion. La PTE para la combinacion de tres dosis de dosis baja se aumento en aproximadamente un 30 % en comparacion con la dilucion posterior.

Al final del experimento, el TR correspondfa al mismo pertedo de tiempo que tras la administracion de la dosis, con

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la excepcion de que RhFII ha^a disminuido hasta el mismo nivel que tras la etapa de dilucion. Los valores de thMax fueron como para el TR. La situacion para el Maximo mostro que todos los grupos de sustancias, a excepcion de FEIBA® habfan vuelto al nivel encontrado una vez finalizada la dilucion. FEIBA® aun mostro un Maximo comparable al nivel encontrado inmediatamente despues de la administracion de la sustancia. Los valores de PTE al final del experimento eran todos similares al patron del maximo.

TAT: como se muestra en la Figura 7, los niveles de TAT fueron similares en todos los grupos de tratamiento tras la etapa de dilucion. Cuando se habfan administrado farmacos, se observo un aumento en los niveles de TAT entre 2-3 veces para todos los tratamientos que conteman protrombina, es decir, las combinaciones de tres factores, rhFII y FEIBA®. Al final del experimento, el patron obtenido tras la administracion del farmaco segrna siendo uniforme, con un aumento aun mayor en los niveles de TAT para los tratamientos que conteman protrombina excepto para rhFII solo, que mostro un nivel de TAT reducido en comparacion con el valor posterior a la administracion. Haemocomplettan® y NovoSeven® tambien habfan aumentado los niveles de TAT al final del experimento en comparacion con tanto despues de la dilucion como despues de la administracion por un factor de 2 a 3.

CONCLUSION

Como se ha demostrado anteriormente, la administracion de rhFII solo, en comparacion con la solucion salina u otros tratamientos, dio lugar a una reduccion significativa de la perdida de sangre tras la hemodilucion normovolemica y la lesion hepatica. Los analisis de trombograffa revelaron un aumento en el tiempo de retardo del aproximadamente 50% para rhFII solo, y un aumento del valor del Maximo para rhFII solo en un 100% y un aumento en el valor de PTE para rhFII solo en casi el 200 %. Estos resultados demuestran ademas que la administracion de rhFII solo es un tratamiento eficaz suficiente para restablecer la hemostasia normalizada, prevenir la perdida de sangre y aumentar el tiempo de supervivencia.

El uso de rhFII solo o el uso de la combinacion de tres factores no se han probado previamente en un modelo animal complejo de hemorragia no controlada debida a la coagulopatfa por dilucion. Por lo tanto, la presente invencion, proporciona por primera vez la eficacia de rhFII solo o la eficacia de 3F para el tratamiento de trastornos hemorragicos y la perdida de sangre. Como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior, los niveles de TAT y los datos de generacion de trombina al final del experimento se redujeron hasta los niveles previos a la administracion para todas las muestras. Para la administracion de factores de coagulacion tales como el rhFlI solo, esto puede ser ventajoso, ya que permite una mejor modulacion de un regimen de tratamiento en el transcurso del episodio hemorragico cntico o penodo de perdida de sangre. Un penodo de mayor duracion puede no permitir los ajustes necesarios en los regfmenes de tratamiento. Ademas, la administracion de rhFII solo, como se ha descrito anteriormente, puede evitar, durante el tratamiento, las complicaciones potencialmente graves de los episodios tromboembolicos que, a veces, acompanan a la administracion de una combinacion de multiples factores de coagulacion.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un tratamiento mediante factor de coagulacion que consiste en:

   (1) FII;

   o (2) una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (3) fibrinogeno y una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (4) fibrinogeno y FII; o (5) FII y FVIIa;

   o (6) fibrinogeno, FII y FVIIa;

   para su uso en la normalizacion de la hemostasia alterada asociada con una coagulopatfa por dilucion en un mairnfero que lo necesita.
2. 2. Un tratamiento mediante factor de coagulacion que consiste en:

   (1) FII;

   o (2) una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (3) fibrinogeno y una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (4) fibrinogeno y FII; o (5) FII y FVIIa;

   o (6) fibrinogeno, FII y FVIIa;

   para su uso en el aumento de la firmeza maxima del coagulo (FMC) en un mamffero que tiene hemostasia alterada asociada con una coagulopatfa por dilucion.
3. 3. Un tratamiento mediante factor de coagulacion que consiste en:

   (1) FII;

   o (2) una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (3) fibrinogeno y una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (4) fibrinogeno y FII; o (5) FII y FVIIa;

   o (6) fibrinogeno, FII y FVIIa;

   para su uso en la reduccion del tiempo de coagulacion (TC) en un mamffero que tiene hemostasia alterada asociada con una coagulopatfa por dilucion.
4. 4. Un tratamiento mediante factor de coagulacion que consiste en:

   (1) FII;

   o (2) una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (3) fibrinogeno y una combinacion de FII, FVIIa y FX; o

   (4) fibrinogeno y FII; o (5) FII y FVIIa;

   o (6) fibrinogeno, FII y FVIIa;

   para su uso en la mejora de la generacion de trombina en un mamffero que tiene hemostasia alterada asociada con una coagulopatfa por dilucion.
5. 5. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el FII es rhFII y se administra a una dosis de 1 a 10 mg/kg.
6. 6. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha hemostasia alterada asociada con una coagulopatfa por dilucion se asocia con una perdida masiva de sangre, tal como una perdida masiva de sangre asociada con una coagulopatfa, una hemorragia o un episodio de hemorragia por traumatismo, tal como el asociado con la hemorragia periquirurgica, la hemorragia postquirurgica o la hemorragia postparto.
7. 7. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho FII, FVIIa o FX son FII humano recombinante (rhFII), FVIIa recombinante (rhFVIIa) o FX recombinante (rhFX).
8. 8. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el mamffero que necesita el tratamiento tiene un nivel de concentracion de fibrinogeno en sangre

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   inferior a aproximadamente 2 g/l, inferior a aproximadamente 1 g/l, inferior a aproximadamente 0,5 g/l, inferior a aproximadamente 200 mg/dl, inferior a aproximadamente 150 mg/dl, inferior a aproximadamente 100 mg/dl o inferior a aproximadamente 50 mg/dl g/l.
9. 9. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicha hemostasia afectada esta asociada con una perdida de sangre superior al aproximadamente 30 %, superior al aproximadamente 40 %, superior al aproximadamente 50 %, superior al aproximadamente 60 %, superior al aproximadamente 70 %, superior al aproximadamente 80 % o superior al aproximadamente 85 % del volumen en sangre total estimado de un mairnfero.
10. 10. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que dicha coagulopatfa por dilucion se debe al restablecimiento de la normovolemia o la estabilizacion hemodinamica.
11. 11. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el fibrinogeno se administra en una cantidad suficiente para elevar la concentracion de fibrinogeno en sangre por encima de aproximadamente 0,5 g/l, por encima de aproximadamente 1 g/l, por encima de aproximadamente 1,5 g/l o por encima de aproximadamente 2 mg/l.
12. 12. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el fibrinogeno se administra a una dosis de 12,5 a 200 mg/kg.
13. 13. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el tratamiento mediante factor de coagulacion se administra a una dosis que reduce el tiempo de coagulacion en de aproximadamente 40 segundos a aproximadamente 60 segundos, que aumenta la firmeza maxima del coagulo hasta de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 30 mm y/o que da lugar al mantenimiento de la coagulacion normalizada durante al menos dos horas despues de la administracion.
14. 14. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicho tratamiento mediante factor de coagulacion es (2) la combinacion de FII, FVIIa y FX, o (3) la combinacion de FII, FVIIa y FX con fibrinogeno; y en el que FII y FVIIa se administran en una proporcion de al menos 1:90.
15. 15. El tratamiento mediante factor de coagulacion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicho tratamiento mediante factor de coagulacion es (1) FII o (4) fibrinogeno y FII.