AT409334B

AT409334B - Pharmazeutisches präparat enthaltend vitamin k-abhängige einzelfaktoren

Info

Publication number: AT409334B
Application number: AT0159197A
Authority: AT
Inventors: Yendra Dr Linnau; Peter Dr Turecek; Hans-Peter Schwarz
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 2002-07-25
Also published as: AU9244998A; EP1015020A1; WO1999015196A1; ATA159197A; NO20001415L; SK4022000A3; BR9812222A; AU743102B2; CA2304396A1; NO20001415D0; JP2001517636A; HUP0003681A1

Description

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat enthaltend Vitamin K-abhängige Einzel- faktoren.

Vitamin K-abhängige Proteine zeichnen sich dadurch aus, dass sie für ihre Biosynthese in es- sentieller Weise Vitamin K benötigen. So kann beispielsweise Prothrombin (Faktor 11) das unter Einwirkung von Vitamin K-Antagonisten gebildet wird, im Gegensatz zu normalem Prothrombin kein Ca2+ binden. Normales Prothrombin enthält am N-terminalen Ende y-Carboxyglutamat, also eine zweite Carboxylgruppe am Glutamatrest Im Zuge der Biogenese von funktionellem Prothrom- bin werden namlich in der aminoterminalen Region des Proteins die ersten zehn Glutamatreste von einem Vitamin K-abhängigen Enzymsystem zu y-Carboxyglutamat carboxyliert. Diese y-Carboxy- glutamatgruppe ist ein sehr starker Chelator für Calciumionen. Über diese gebundenen Ca2+-lonen wird Prothrombin auf Phospholipidmembranen gebunden, die aus Zellmembranen, z.

B. aus Blutplättchen stammen, um so die richtige Topologie zur Initiierung der Blutgerinnung zu erhalten
Nicht nur Prothrombin besitzt y-Carboxyglutamatreste, sondern auch die Gerinnungsfaktoren VII, IX und X werden an spezifischen Glutamatresten carboxyliert, um so eine hohe Affinität ge- genüber Calciumionen auszubilden. Aber auch weitere an der Gerinnungskaskade beteiligte Prote- ine, wie Protein C, Protein S und Protein Z benötigen Vitamin K zu ihrer Biosynthese.

Vitamin K-abhängige Einzelfaktoren, insbesondere die Faktoren 11 VII, IX und X, weisen ähnli- che physiko-chemische Eigenschaften auf, wie z.B. ähnliche Molgewichte, pl's, elektrophoretische Mobilität, etc., und werden daher in der Regel gemeinsam als Prothrombinkomplex (andere Be- zeichnung : Faktor IX-Komplex oder PPSB-Komplex) gewonnen. Auf Grund der ähnlichen Protein- charakteristik ist es schwer, die Faktoren einzeln präparativ herzustellen. Die Herstellung von Prothrombinkomplex-Präparaten mit gleichzeitiger Isolierung aller enthaltenen Faktoren war daher im Stand der Technik immer gegenüber der Herstellung von Blutfaktor-Konzentraten bei der Her- stellung pharmazeutischer Präparate bevorzugt (siehe Brummelhuis in : Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academic Press, Seiten 117-128).

Es zeigte sich aber auch, dass die Prothrombinkomplex-Faktoren auf Grund ihrer unterschiedlichen Stabilität bzw. Halbwertszeit niemals im physiologischen Verhältnis (jeweils 1 E des Proteins) gewonnen werden können (siehe Müller et al., Krankenhauspharmazie 13 (11), (1992), 528-531 ; et al., Thrombosis Research 60 (1990), Seiten 63-70).

Es besteht das Risiko, dass Prothrombinkomplex-Konzentrate auf Grund ihrer Aufreinigung aus komplexen Proteingemischen aktivierte Gerinnungsfaktoren, welche zumeist aktive Serinproteasen sind, beinhalten. Gerade Patienten sollten aber nicht koaguliert werden, da die Entstehung von Thrombosen fatal sein kann bzw. ist. Selbst wenn nur Spuren dieser aktivierten Gerinnungsfakto- ren, insbesondere Thrombin, in einem solchen Präparat vorhanden sind, kommt es zu proteolyti- scher Inaktivierung der Einzelfaktoren, die je nach individueller Stabilität der Einzelfaktoren gravie- rende Folgen haben können. Insgesamt neigen daher Prothrombinkomplex-Konzentrate zu Instabi- litäten und sind für eine längere Lagerung ungeeignet. Diese Abbaureaktionen, insbesondere durch Thrombin, treten sogar im festen Zustand auf, d. h., auch eine Trocknung bzw.

Lyophilisie- rung der Präparate führt nicht zu einer verlässlichen Lagerstabilität.

Weiters sind Prothrombinkomplex-Konzentrate bezüglich der relativen Verhältnisse der enthal- tenen Einzelfaktoren äusserst unflexibel. Es gibt kaum Möglichkeiten, diese Relativverhältnisse im Zuge der Reinigung des Prothrominkomplexes zu beeinflussen, was vor allem dann von Nachteil ist, wenn ein an bestimmten Faktoren angereicherter Prothrombinkomplex erwünscht ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, pharmazeutische Kombinationspräparate von Vitamin K-abhängigen Proteinen zur Verfügung zu stellen, die in ihrer Zusammensetzung genau definiert bzw. definierbar sind, eine hohe Stabilität, insbesondere bei der längerfristigen Lagerung, aufweisen und eine hohe Flexibilität in der Variation ihrer Zusammensetzung haben.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein pharmazeutisches separiertes Pro- thrombinkomplex-Präparat enthaltend mindestens zwei hochgereinigte Vitamin K-abhängige Ein- zelfaktoren. Vor allem soll die erfindungsgemässe Präparation hochgereinigten Faktor IX in Kombi- nation mit zumindest einem weiteren hochgereinigten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktor enthalten.

Im Gegensatz zum Stand der Technik, bei welchem der Prothrombinkomplex immer als Kom- plex aufgereinigt und nicht durch Kombination von einzelnen Faktoren hergestellt wurde und ausserdem im besten Fall nur bis zu einer intermediären, also nur bis zu mässiger Reinheit vorliegt, wird mit der vorliegenden Erfindung ein Präparat zur Verfügung gestellt, welches die Einzelblutfak-

toren in hochgereinigter Form enthält, die von störenden Verunreinigungen, insbesondere von einer Thrombinaktivität, befreit sind. Insbesondere werden die erfindungsgemäss zu kombinierenden Einzelfaktoren durch chromatographische Reinigungsverfahren, wie der lonenaustauschchromatographie, der hydrophoben Chromatographie, der Affinitätschromatographie und/oder der Molekularausschlusschromatographie aus Plasma bzw. rekombinanten Zellen gereinigt.

Damit können für die meisten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren jeweils spezifische Aktivitäten von mindestens 50 % der theoretischen Reinheit, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 90 %, bis zur theoretischen Reinheit für den Einzelfaktor erreicht werden. Dementsprechend ist es auch bevorzugt, Faktoren zu verwenden, die im wesentlichen frei (¹ 5 %) von Denaturierungsprodukten sind.

Bei der pharmazeutischen Herstellung von Blutgerinnungsprotein-Präparationen werden in der Regel drei verschiedene Reinheitsgrade unterschieden ; niedrig,intermediär und hoch.

Tabelle 1
EMI2.1

<tb> in <SEP> vivo-Halbwertszeit <SEP> theoretische <SEP> Reinheit
<tb>
<tb> Faktor <SEP> 11 <SEP> 60 <SEP> h <SEP> 0,1 <SEP> E/ml
<tb>
<tb> Faktor <SEP> VII <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 2,5 <SEP> h <SEP> 2000 <SEP> (1667 <SEP> - <SEP> 2500) <SEP>
<tb>
<tb> Faktor <SEP> IX <SEP> 18 <SEP> - <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 250 <SEP> (200 <SEP> - <SEP> 333) <SEP>
<tb>
<tb> Faktor <SEP> X <SEP> 40 <SEP> h <SEP> 118 <SEP> (100-143)
<tb>
Insbesondere bei der Ermittlung der Faktor 11-Aktivität gibt es auf Grund der Anwesenheit von
EMI2.2
Konzentrationsbestimmung von Faktor 11 derart überlagern, dass dabei sogar um ein Vielfaches höhere Werte als die theoretische Reinheit ermittelt werden können.

Bei Faktor VII sind die Werte deshalb gegenüber den anderen Faktoren etwas niedriger, da Faktor VII ein sehr labiles Protein ist, das äusserst rasch zu Faktor Vlla umgewandelt wird. Daher wird schon eine Faktor VII-Präpa- ration die mehr als 10 % der theoretischen Reinheit aufweist, als hochgereinigt angesehen.

Da das erfindungsgemässe Präparat von insbesondere hinsichtlich ihrer Aktivität bzw. ihres Reinheitsgrades sehr genau definierten Einzelfaktorpräparationen zusammengesetzt wird, kann auch das Verhältnis der einzelnen Faktoren zueinander optimal eingestellt werden. Hiebei können auch Probleme, die sich im Zuge der Weiterverarbeitung von den Gesamtprotein-Komplexkonzen- traten im Stand der Technik ergeben, beispielsweise durch Aktivitätseinbussen bei der Virusinakti- vierung, aber auch durch Prozesse, die im Zuge des Reinigungsverfahrens auftreten, von vornher- ein vermieden werden, da nach der Vereinigung der hochgereinigten Einzelfaktoren zum erfin- dungsgemässen Präparat vorzugsweise keine weiteren Bearbeitungsschritte mehr durchgeführt werden.

Das erfindungsgemässe Präparat weist also insgesamt den Vorteil der Standardisierbarkeit auf.

Dadurch ist gewährleistet, dass die jeweiligen Einzelfaktoren in der zugegebenen Konzentration +/-10 % Abweichung im Präparat enthalten sind.

Bevorzugte Einzelfaktoren werden erfindungsgemäss ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Faktor 1 Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Protein Z. Bevorzugte Her- stellungsmethoden für hochgereinigte Präparate dieser Proteine finden sich z. B. in der EP 0 796 623 (Faktoren 11 und X), der AT-PS 405 608 (Faktor Vll) der EP 0 496 725 (Faktor IX), der EP 0 533 209 (Protein C) und der EP 0 406 216 (Protein S).

Im erfindungsgemässen Präparat werden vorzugsweise zumindest die Faktoren ll. VII, IX und X ausgehend von hochgereinigten Einzelfaktoren zusammengefügt, wobei gegebenenfalls auch noch die hochgereinigten Einzelfaktoren Protein C, Protein S und/oder Protein Z zugemischt werden, um einen möglichst physiologischen Prothrombinkomplex bereitstellen zu können, d. h. einen Pro- thrombinkomplex, der in der Zusammensetzung dem physiologischen entspricht - nur ohne die störenden Begleitproteine, die im Zuge der Prothrombinkomplex-Reinigung aus Plasma einfliessen, wie z. B. Thrombin.

Die Einzelfaktoren können aus Plasma, insbesondere Humanplasma, aufgereinigt werden oder rekombinant hergestellt werden. Da bei der Herstellung durch rekombinante DNA-Technologie eine Trennung der strukturell und physikochemisch sehr ähnlichen Faktoren nicht erforderlich ist, wird

das erfindungsgemässe Präparat vorzugsweise aus hochgereinigten rekombinanten Einzelfaktoren zusammengesetzt. Der Faktor kann auch transgen hergestellt sein ; er kann ein Derivat sein, ins- besondere ein Peptid und/oder ein Fragment.

Die Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren Faktor ll Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein S und C sind kioniert und sequenziert worden und deren Darstellung wird beispielsweise in Falkner et al., Thrombosis and Haemostasis 68 (2) (1992), Seiten 119 bis 124 für Vitamin K-abhängige Proteine beschrieben.

Erfindungsgemäss sind die Relatiwerhältnisse der hochgereinigten Einzelfaktoren leicht und in beliebiger Relation zueinander im Präparat einstellbar, beispielsweise indem diese Verhältnisse den natürlichen Verhältnissen im Blut entsprechen, also in etwa pro Einheit des einen Faktors, jeweils eine Einheit des anderen Faktors vorhanden ist. Ein bevorzugtes Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung enthält daher die hochgereinigten Einzelfaktoren Faktor ll Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relativverhältnis, bezogen auf internationale Einheiten von (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) . 0,5 bis 2) : (0,5 bis 2). Sind auch Protein C, Protein S und/oder Protein Z im Präparat vorhanden, so weisen auch diese Einzelfaktoren bevorzugterweise Relatiwerhältnisse von 0,5 bis 2 auf.

Andererseits ist es erfindungsgemäss auch möglich, die Einzelfaktoren auf Grund ihrer relativen Stabilitäten, insbesondere im Verhältnis ihrer relativen Halbwertszeiten, einzustellen, d. h., dass von einem weniger stabilen Faktor mehr vorgesehen wird und vom stabilen Faktor entsprechend weni- ger. Dabei kann auch die vorgesehene Zeitdauer der Anwendung bzw. Wirkung mitberücksichtigt werden, d. h., je länger diese Zeitdauer ist, umso grösser sind auch diese Relativverhältnisse zu gewichten.

Auch rekombinante Proteine mit beispielsweise veränderter Halbwertszeit können dann ent- sprechend standardisiert werden. Auch weitere Faktoren, wie z. B. die in vivo-Wiederauffindung (recovery), können in eine Standardisierung der Faktoren miteinbezogen werden.

Ein in dieser Hinsicht bevorzugtes Präparat umfasst daher die Einzelfaktoren Faktor ll Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relatiwerhältnis, bezogen auf internationale Einheiten von (0,5 bis 2) : (5 bis 35) : (0,5 bis 7) : bis 5), da die Halbwertszeiten von Prothrombin 60 Stun- den, von Faktor VII 2 Stunden, von Faktor IX 20 Stunden und von Faktor X 40 Stunden betragen.

Ein bevorzugtes Präparat mit diesen Faktoren enthält daher die Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Relatiwerhältnis, bezogen auf internationale Einheiten von (0,5 bis 2) : (5 bis 35) : (0,5 bis 7) : (0,5 bis 5) : (1 bis 15) : (1 bis 15).

Da Faktor II der mit Abstand stabilste dieser Faktoren ist und darüberhinaus auch in seiner aktivierten Form Thrombin das grösste Stabilitätsrisiko trägt, ist eine Präparation, die kein Prothrom- bin enthält, bevorzugt. Faktor VII wird meist als recht instabil angesehen und wird daher bevorzug- terweise in erhöhtem Masse, z. B. in 10-facher Konzentration (bezogen auf internationale Einheiten) im erfindungsgemässen Präparat vorgesehen. Ein besonders bevorzugtes Präparat enthält daher Einzelfaktor VIIund Einzelfaktor 11 in einem Verhältnis von grösser 10 : 1.

Bevorzugterweise wird mit dem vorliegenden Präparat ein Prothrombinkomplex oder ein par- tieller Prothrombinkomplex aus hochgereinigten Einzelfaktoren zur Verfügung gestellt. Es ist jeden- falls bevorzugt, dass die Einzelfaktoren im Präparat keinen Komplex bilden. Dies kann beispielswei- se durch analytische lonenaustauschchromatographie an einem perlförmigen Material auf Basis modifizierter, dreidimensional vernetzter Agarose (Q-Sepharose (Pharmacia)) gezeigt werden, wobei die einzelnen Faktoren bei Elution mit einem Salzgradienten diskret eluiert werden können.

Im Gegensatz dazu stehen die Komplexe wie sie bei der Prothrombinase oder bei der Pro- Prothrombinase vorliegen.

Die Prothrombinase ist ein Enzym-Substratkomplex, der sich an einer Phospholipidoberfläche bildet und die Aktivierung von Prothrombin ermöglicht. Die Prothrombinase besteht definitionsge- mäss aus dem Faktor 11 (Prothrombin), dem aktivierten Faktor X (Faktor Xa), den Cofaktor V bzw.

Va, Phospholipiden und Calciumionen. Diese Faktoren liegen in vivo als transienter Komplex zur Aktivierung des Prothrombins und Bildung des Thrombins vor. Eine entsprechende Pro-Prothrom- binase ist als Komplex von Faktoren definiert, die zumindest teilweise modifiziert bzw. aktiviert zur Bildung einer Prothrombinase vorliegen. Die Pro-Prothrombinase ist daher als Vorstufe der Pro- thrombinase und als Komplex zu verstehen, bei welchem eine oder mehrere Komponenten in ihren Vorstufen, als Zymogene oder als Proformen vorliegen und der aufgrund von Affinitäten der Kom-

ponenten zueinander gebildet wird.

Aus Stabilitätsgründen ist es vorteilhaft, jegliche Präsenz von aktivierten Gerinnungsfaktoren im erfindungsgemässen Präparat zu vermeiden. Eine bevorzugte Ausführungsform ist daher da- durch gekennzeichnet, dass das Präparat keine aktivierten Gerinnungsfaktoren, insbesondere keinen Faktor lla IXa, Xa und gegebenenfalls Vlla, enthält.

Bevorzugte erfindungsgemässe Präparate enthalten weniger als 0,1 E Faktor VIII:C oder Faktor VIII:Ag/mg Protein und/oder weniger als 0,1 E Faktor Ha/Einheit Prothrombin und/oder weniger 0,1E Faktor Xa/Einheit Faktor X.

Um die hervorragende Stabilität des erfindungsgemässen Präparats möglichst lange zu bewah- ren, ist es vorteilhaft, die erfindungsgemässe Präparation in lyophilisierter Form bereitzustellen. Da- durch ist es möglich, das erfindungsgemässe Präparat nahezu unbegrenzt lange zu lagern und trotzdem als Lyophilisat innerhalb kurzer Zeit zu einer gebrauchsfertigen Lösung zu rekonstituie- ren.

Entsprechend einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemässe Präparation weiters Magnesiumionen. Diese Ionen wirken kompetitiv zu Calciumionen und können die Calciumionen vor allem im vollständig oder partiellen Prothrombinkomplex verdrängen. Damit wird eine vorzeitige Thrombinbildung in einer Lösung der erfindungsgemässen Präparation in noch grösserem Ausmass unterbunden und damit diese soweit stabilisiert, dass sie sogar in einer wässeri- gen Lösung über viele Stunden stabil bleibt.

Es hat sich herausgestellt, dass die pharmazeutische Präparation gemäss der vorliegenden Er- findung sogar als stabile Infusionslösung zur Verfügung gestellt werden kann, vor allem wenn gewährleistet ist, dass sie keine freien Calciumionen enthält. Der Gehalt an freien Calciumionen kann leicht durch bekannte lonentitrationen oder andere analytische Methoden bestimmt werden.

Zur Komplexierung der Calciumionen eignet sich z. B. ein pharmazeutisch akzeptabler Chelatbild- ner, vorzugsweise EDTA, und verwandte Substanzen, wie Citrat.

Bevorzugterweise enthält das erfindungsgemässe Präparat weiters Antithrombin lll in den Men- gen, in denen es bisher in Prothrombinkomplex-Konzentraten als stabilisierend eingesetzt worden ist, gegebenenfalls gemeinsam mit Heparin. Obwohl diese Massnahme auf Grund des hohen Rein- heitsgrades der Einzelfaktoren nicht unbedingt notwendig erscheint, kann sie aus pharmazeuti- schen Gründen oder auch Erfordernissen von Pharmakopöen oder sonstigen Vorschriften im Hinblick auf die Prothrombinkomplex-Konzentrate des Standes der Technik als vorteilhaft angese- hen werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Präparation deshalb frei von Albumin und/oder Stabilisatoren, wie insbesondere Antithrombin lll und/oder Heparin. Insbesondere ist das erfindungsgemässe Präparat auch frei von Phospholipiden.

Das erfindungsgemässe pharmazeutische Präparat wird gemäss einer bevorzugten Ausfüh- rungsform auf Grund einer Behandlung zur Virusinaktivierung von infektiösen Viren oder anderen infektiösen Agenzien behandelt. Diese Behandlung zur Virusinaktivierung wird vorzugsweise durch zwei voneinander unabhängige Virusinaktivierungs- oder Virusabreicherungsverfahren gewähr- leistet.

Diese Inaktivierungsbehandlung wird vorzugsweise durch eine Tensid- und/oder Hitzebehand- lung gewährleistet, beispielsweise durch eine Hitzebehandlung in festem Zustand, insbesondere eine Dampfbehandlung gemäss der EP-0 159 311, der EP-0 519 901 oder der EP-0 674 531.

Weitere Behandlungen zur Inaktivierung von Viren umfassen auch die Behandlung mit chemi- schen oder chemisch/physikalischen Methoden, z. B. mit chaotropen Stoffen gemäss der W094/13329, der DE 44 34 538 oder der EP-0 131 740 (Lösungsmittel) oder die Photoinaktivie- rung.

Die Nanofiltration oder die Antikörper-verstärkte Nanofiltration (siehe WO 97/40861 A stellt ebenfalls ein bevorzugtes Verfahren zur Abreicherung von Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar.

Vorzugsweise enthält das erfindungsgemässe Präparat weiters pharmazeutisch akzeptable Puf- fersubstanzen oder Stabilisatoren, beispielsweise die in Pharmakopöen bereits für Prothrombin- komplex-Konzentrate vorgesehenen Substanzen.

Eine besonders bevorzugte Variante der Gewährleistung der Virusfreiheit des erfindungsge- mässen Produktes besteht darin, dass es aus hochgereinigten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren

zusammengesetzt ist, die ihrerseits schon virusinaktiviert sind und gegebenenfalls von entstande- nen Denaturierungsprodukten und Stabilisatoren bereits befreit worden sind, so dass sie in virus- inaktivierter und trotzdem in vor allem bezüglich ihrer Aktivität sehr genau definierter Form vorlie- gen können.

Da v.a. bei thermischen Virusinaktivierungsverfahren teilweise Inaktivierungsprozesse der Pro- thrombinfaktoren auftreten können, die je nach Stabilität des Einzelfaktors zu unterschiedlichen Ausbeuten und spezifischen Aktivitäten nach Durchführung der thermischen Behandlung von Prothrombinkomplex-Präparaten führen können, erlaubt eine Ausführungsform des erfindungsge- mässen Verfahrens, die Verhältnisse in der Mischung an Einzelfaktoren so einzustellen, dass auch nach erfolgter thermischer Behandlung die Faktoren in gewünschten Verhältnissen zueinander vorliegen.

Wenn beispielsweise bekannt ist, dass die thermische Behandlung von Prothrombin mit keinem Verlust der Aktivität verbunden ist, während die im Kombinationspräparat auch enthaltenen Faktoren Faktor X und Faktor IX zu jeweils 20% inaktiviert werden, kann ein gemischter, thermisch virusinaktivierter "Komplex" eingestellt werden, indem die Faktoren lll IX und X in Aktivitätsverhält- nissen von 1 : 1,25 kombiniert werden. Nach dieser Einstellung der Verhältnisse kann dann die Virusinaktivierung durchgeführt werden, und daraus resultiert unmittelbar ein Präparat enthal- tend diese Faktoren im Verhältnis 1 : 1 : 1.

Faktor X wird bevorzugterweise in seiner a-Form und/oder &num;-Form eingesetzt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein diagnostisches Präparat, welches erfin- dungsgemäss aus den hochgereinigten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren zusammengesetzt ist.

Auch für die Diagnose sind die Vorteile der Definiertheit, der Variabilität der Konzentrationsverhält- nisse und der Stabilität von besonderem Vorteil.

Das erfindungsgemässe pharmazeutische Präparat kann selbstverständlich für alle bisherigen Indikationen des Prothrombinkomplexes verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungsgemä- &num;en Präparats zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von erworbenen oder vererbten Blutgerinnungsstörungen, zur Behandlung von schweren Blutungen, zur Prophylaxe von Blutun- gen, insbesondere bei Vorliegen von vererbten Blutgerinnungsstörungen, zur Substitutionstherapie und zur Behandlung von Hämophilie B.

Auch bei Leberfunktionsstörungen erweist sich das erfindungsgemässe Präparat als indiziert.

Bei der Verabreichung an Patienten ist bei der Dosierung von bisherigen Verabreichungsre- gimes auszugehen, wobei jedoch die genauere Definiertheit der erfindungsgemässen Präparate von Vorteil ist.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele auf die sie jedoch nicht einge- schränkt werden soll, näher erläutert.

Beispiele:
Beispiel 1 : Herstellung der Einzelfaktorpräparationen
1.

Claims

1. Herstellung von Einzelfaktorpräparationen von plasmatischem Faktor X und plas- matischem Faktor ll Eine lyophilisierte Prothrombinkomplexfaktorenpräparation, welche die Faktoren ll IX, X sowie Protein C und Protein S enthielt, wurde nach der Methode von Brummelhuis, H. G.J., Preparation of the Prothrombincomplex. In: Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J. M. ed., 117-128, Academic Press, New York, (1980), hergestellt und zur Virusinaktivierung nach EP 159 311 hitze- behandelt. Entsprechend wurde das Lyophilisat (1000 E Faktor X/g, 1200 E Faktor ll/g) in destillier- tem Wasser gelöst, sodass dieses 50 000 E Faktor x/ enthielt, und auf pH 7,0 eingestellt. Nach Zusatz von 12 % (v/v) Polyethoxysorbitanoleat (TWEEN 80) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wurde mit einem 20 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7,0,1:5 verdünnt und die Prothrombinkomplexproteinfraktion an Calciumphosphat (Ca3 (P04)2) in einer Konzentration von 30 g Ca3 (P04)2 pro 1 Prothrombinkomplexlösung durch einstündiges Rühren bei Raumtemperatur adsorbiert. Anschliessend wurde die feste Phase durch Zentrifugation, 20 Minuten bei 5000 rpm, abgetrennt und der Niederschlag zweimal mit 20 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7,0, enthaltend 10 % <Desc/Clms Page number 6> Ammoniumsulfat, durch Resuspension und erneute Zentrifugation gewaschen. Eine dritte Wa- schung wurde mit 20 mM Tns-HCI-Puffer, pH 7,0, enthaltend 150 mM NaCI in analoger Weise durchgeführt. Die Elution der Prothrombinkomplexfraktion erfolgte mit 1 M Natriumphosphatlösung, pH 7,0, wobei 25 ml dieser Lösung pro g Calciumphosphat 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend der verbleibende Niederschlag durch Zentrifugation wie oben abgetrennt wurde Der Überstand wurde anschliessend einer Ammoniumsulfatfällung mit 366 g Ammoniumsulfat pro I 15 h bei 4 C unter Rühren unterzogen. Das Präzipitat, enthaltend die Prothrombinkomplexfraktion, wurde wie oben abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in einem 25 mM Trinatriumcitratdihydrat- Puffer, enthaltend 100 mM NaCI, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, aufgenommen und auf einer Säule, gefüllt mit Sephadex G-25, bei 4 C mit einem linearen Fluss von 1 cm/min gegen 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaC1 und 1 mM Benzamidinhydrochlo- rid, pH 6,0, umgepuffert, um das Ammoniumsulfat abzutrennen. Dabei wurde im Eluatstrom die UV-Absorption bei 280 nm und die elektrische Leitfähigkeit gemessen. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und anschliessend einer lonenaustauschchromatographie über quer- vernetztes Dextran mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose FF Fa. Pharmacia) unter- zogen. Die Fraktionen wurden auf einer Säule (Innendurchmesser : Gelbetthöhe = 1 : 1,3) mit einem Gelvolumen von 8,2 I, 0,55 g Protein/1 Gel, bei einem linearen Fluss von 0,36 cm/min aufge- tragen. Die Chromatographie erfolgte bei 22 C. Vor Auftrag der Proteine war die Säule mit einem 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCI, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, äquilibriert worden. Die Elution der Proteinfraktionen erfolgte in mehreren Stufen mit einem Puffer 1 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 245 mM NaC1 pH 6,0), Puffer 2 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 270 mM NaC1 pH 6,0) und einem Puffer 3 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 400 mM NaCI, pH 6,0). Die Elution mit Puffer 1 wurde mit 2,4 Säulenvolumen durchgeführt, dabei wurde Inertpro- tein abgetrennt. Die Elution wurde mit 5,6 Säulenvolumen mit Puffer 2 durchgeführt, wobei hier Fraktionen gesammelt wurden, die auf Gehalt von Faktor ll Faktor X, Protein C und Faktor IX analysiert wurden. Die Faktor X enthaltenden Fraktionen, die frei von Faktor ll IX und Protein C wurden vereinigt. Diese hochgereinigte Faktor X-Präparation wies eine spezifische Aktivität von 60 E/mg Protein auf. Durch Elution mit Puffer 3 (1,9 Säulenvolumen) wurde Faktor ll desorbiert, wobei wieder Frak- tionen gesammelt und auf den Gehalt an Faktor X, Faktor IX und Faktor lluntersucht wurde. Die Faktor ll enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt. Sowohl der Faktor ll als auch der Faktor X enthaltende Pool konnten gegebenenfalls durch Zusatz von 1 M KSCN und Inkubation bei 22 C für mehrere Stunden einer zusätzlichen Behandlung zur Inaktivierung pathogener Verunreinigungen unterworfen werden. Der so gewonnene Faktor 11-Pool wurde durch Zugabe von Natriumchlorid auf 1,8 M NaCI ein- gestellt und der pH-Wert auf pH 7,0 korrigiert. Diese Lösung wurde anschliessend durch hydropho- be Interaktion an ein Gel aus dreidimensional vernetzter Agarose mit Phenyl-Gruppen (Phenyl- sepharose High Performance, Fa. Pharmacia) adsorbiert, wobei 3 g Protein/1 Gel gebunden wurden. In einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser : Gelbetthöhe = 1 : wurde bei einem linearen Fluss von 0,25 cm/min die Proteinfraktion adsorbiert und anschliessend durch Wa- schen mit einem Puffer (25 mM Tris-HCI, 3 M NaC1 pH 7,4) vom Inertprotein befreit. Durch Gra- dientenelution mit 11,5 Säulenvolumina von 3 M - 0,9 M NaCI unter gleichzeitiger Sammlung von Fraktionen wurde Faktor ll von der Säule eluiert, wobei jene Fraktionen gepoolt wurden, die Faktor 11-Aktivität enthielten, aber frei von Faktor X und Faktor IX waren. Die gesammelten Faktor ll-Frak- tionen wurden anschliessend durch Ultra-/Diafiltration über eine Ultrafiltrationsmembran mit einem cut-off von 30 kD zehnfach aufkonzentriert und gegen einen Puffer enthaltend 4 g Trinatriumcitrat- dihydrat/l, 8 g NaCI/l, pH 7,0, umgepuffert. Eine so hergestellte Faktor 11-Präparation wies eine spezifische Aktivität von 6,9 E/mg Protein auf. Die Bestimmung der Faktor 11-Aktivität erfolgte mit der 1-Stufen-Methode, basierend auf der Thromboplastinzeit, unter Verwendung eines Faktor 11-Mangelplasmas gegen den Internationalen Faktor 11-Standard unter Verwendung der Reagens- kombination von IMMUNO, Wien. Andere Gerinnungsfaktoren waren in Gerinnungsanalysen in Spuren oder gar nicht mehr nachweisbar (Faktor VII < 0,00002 E/E Faktor ll, Faktor IX 0,0002 E/E EMI6.1 Faktor 11). <Desc/Clms Page number 7> Als alternatives Herstellungsverfahren für einen hochgereinigten Faktor 11 wurde auch ein Ver- fahren verwendet, bei dem aus einem lyophilisierten Prothrombinkomplexfaktorenpräparat durch hydrophobe Chromatographie zuerst Faktor IX abgetrennt, anschliessend Faktor ll isoliert und dieser dann durch Chromatographie an Hydroxylapatit hochgereinigt wurde. Die Prothrombinkomplexfaktorenpräparation wurde wie oben beschrieben gelöst und mit Deter- gens 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend wurde durch lonenaustauschchromato- graphie auf Agarosebasis mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose FFd Fa Pharmacia) eine Faktor ll IX und X-hältige Fraktion isoliert. Aus dieser wurde anschliessend durch Interaktion mit einem Gel auf Basis von Methacrylat (Butyl-Toyopearl, Fa. toso Haas) die Faktor IX-enthal- tende Fraktion entfernt. Der Adsorptionsüberstand wurde anschliessend an einem hydrophoben Gel auf Basis von Agarose mit Phenylgruppen (Phenyl-Sepharose High Performance, Fa. Pharmacia) durch eine weitere hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt, wobei ca. 4 g Protein/1 Gel adsorbiert werden konnten. In einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser : Gelbetthöhe = 1 : 1,9 wurde bei einem linearen Fluss von 0,25 cm/min die Proteinfraktion adsorbiert, anschliessend durch Waschen mit 20 mM Tris-HCI, 3 M NaCI, pH 7,4, das Inertprotein entfernt und schliesslich durch stufenweise Elution die Faktor llenthaltende Fraktion isoliert, die bei fallender Leitfähigkeit bei 1,9 M NaCI vom Gel desorbierte. Die Faktor ll enthaltende Fraktion wurde anschliessend direkt an eine feste Hydroxylapatit-Oberfläche (Ceramik-Hydroxylapatit, Fa. Biorad) adsorbiert. Dies erfolgte auf einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser : Gelbetthöhe = 1 : Die Elution erfolgte bei einem linearen Fluss von 3 cm/min. Durch Elution mit einem Salzgradienten konnte Faktor ll von der Säule desorbiert werden. Die Faktor ll enthaltenden Fraktionen wurden gesam- melt und über Ultra-/Diafiltration über Polysulfonmembranen mit einem cut-off von 30 kD aufkon- zentriert bis die Faktor 11-Konzentration 50 - 100 E/ml betrug. Eine so hergestellt Faktor ll-Präpa ration wies eine spezifische Aktivität von mindestens 7 E/mg Protein auf. Andere Gerinnungsfakto- ren, insbesondere Faktor IX und Faktor VIII, waren nur mehr in Spuren oder gar nicht mehr nach- weisbar. Durch Wahl eines geeigneten Diafiltrationspuffers wurde die Faktor 11-Präparation in einem pharmazeutisch verträglichen Puffer (z. B. 4 g Trinatriumcitratdihydrat/l, 8 g NaCI/l, pH 7,0) übergeführt. 1.

2. Gewinnung von plasmatischem Faktor VII: 30 ml frisch gefrorenes menschliches Citratplasma wurden bei 0 - +4 C aufgetaut und das da- bei anfallende Kryopräzipitat durch Zentrifugation bei +2 C abgetrennt. Der daraus resultierende "Kryoüberstand" wurde mit 2 IE Heparin/ml versetzt. Danach wurden die Proteine des Prothrom- binkomplexes mit quervernetztem Dextran mit Diethylaminoethyl-Gruppe (DEAE-Sephadex A-50, Fa. Pharmacia) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml adsorbiert. Der Gel-Proteinkomplex wurde EMI7.1 7 g/1 NaCI, 500 IE Heparin/I, pH 7,5) gewaschen. Dadurch wurde die Prothrombinkomplexfraktion enthaltend die Gerinnungsfaktoren Prothrom- bin, geringe Teile von Faktor VII, Faktor IX und Faktor X abgetrennt. Der im Überstand nach Ad- sorption an DEAE-Sephadex A50 verbleibende Grossteil des Gerinnungsfaktors VII wurde nun durch Adsorption an Aluminiumhydroxid gewonnen. Dazu wurden pro 1 I Überstand nach Abtren- nung des Prothrombinkomplexes 10 ml 2 %iger Aluminium-hydrogelsuspension zugesetzt und 30 min bei 4 C gerührt. Anschliessend wurde durch Zentrifugation bei 5000 rpm 10 min bei ca. 4 C in einem Sorvall RC3B Rotor H6000A der Aluminiumhydroxid-Proteinkomplex abgetrennt, der Überstand verworfen und der Niederschlag mit 3,5 % des Volumens des zur Adsorption verwende- EMI7.2 7,5, suspendiert und 30 min gerührt. Dadurch wurde Inertprotein vom Aluminiumhydroxid desor- biert. Der am Aluminiumhydroxid verbleibende Faktor VII wurde durch neuerliche Zentrifugation wie oben beschrieben pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag zur Weiter- verarbeitung weiterverwendet. Zur Desorption der Proteinfraktion wurde der Aluminiumhydroxid- Faktor VII-Komplex mit 1 Vol.% des zur Adsorption verwendeten Prothrombinkomplexüberstandes eines 0,3 mol/l Phosphatpuffers, pH 8,6, (53,4 g Na2HP04 2H2O/1 wurden mit einer Lösung von EMI7.3 <Desc/Clms Page number 8> &num;end wurde zur Pathogeninaktivierung auf eine Endkonzentration von 15 % TWEEN-80-Deter- gens zugesetzt und anschliessend 1 h bei 40 C gerührt. Nach Abkühlen der Lösung auf 22 C wurde ein Aliquot von 20 ml über dreidimensional ver- netztem Dextran-Polysaccharid (Sephadex G-50 (Firma Pharmacia)) säulenchromatographisch gegen eine Lösung von 4 g Na3Citrat.2H20, pH 7,4, umgepuffert und mit der gleichen Lösung auf das 10fache verdünnt. Die gesamte Lösung wurde anschliessend auf eine Säule, die mit einem Heparin-gekoppelten Agarasematerial (Heparinsepharose CL6B (Fa. Pharmacia)) gepackt war, mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Höhe von 10 cm, aufgetragen. Die Flussrate betrug 1 ml/min. Anschliessend wurde mit einem Salzgradienten von 0-1 M NaCI in einer Lösung von 4 g EMI8.1 durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm quantifiziert. Gleichzeitig wurden Fraktionen ge- sammelt und in diesen Faktor VII mit einem chromogenen Faktor VII-Test (Immunochrom Faktor VII:10, IMMUNO AG, Wien) bestimmt. Die Fraktionen des eluierenden Proteins, welche Faktor VII enthielten, wurden gesammelt und vereinigt. Das Elutionsvolumen der Faktor VII-Fraktion betrug 25 ml. In der Proteinfraktion wurde der Proteingehalt nach der Methode von Bradford, M.M. (Anal. Biochem. 72 : 1976) Faktor VII, wie oben, bestimmt. Ebenso wurde Faktor Vlla nach der Methode aus US 5 472 850 A quantitativ bestimmt. Daraus konnte ermittelt werden, dass die eluie- rende Faktor VII-Fraktion eine spezifische Aktivität von 98 Einheiten/mg Protein aufwies, während der Faktor Vlla-Gehalt unter einer Einheit/ml lag. Entsprechend konnte eine hochgereinigte Faktor EMI8.2 der Chromatographie betrug über 50 %. 1.3. Plasmatischer Faktor IX: 150 ml Prothrombinkomplex wurden mittels Dextransulfat vorgereinigt (Miletich et al., Analytical Biochemistry 105,304 (1980)). 20 ml Eluat (912 I.E. Faktor IX, 160 I.E. Faktor X) wurden auf eine Säule mit 20 ml eines Agarose-Polymers mit Octyl-Gruppen (Octyl-Sepharose-CL-4B (Pharmacia, Schweden)) mit einer Flussrate von 360 ml/h aufgetragen. Die Säule wurde zuvor mit 80 ml Puffer A equilibriert. Nach dem Waschen des beladenen Gels mit 120 ml Puffer A wurde die Faktor IX-hälti- ge Fraktion mit 80 ml einer 250 mmolaren NaCI-Lösung eluiert. Die Ausbeute an Faktor IX lag bei 54 % der Ausgangsaktivität. Die spezifische Aktivität betrug 186 I.E. Faktor IX/mg Protein. Faktor X war nur mehr in Spuren vorhanden. 1. 4. Gewinnung von plasmatischem Protein C Hochreines Protein C wurde aus einer rohen Protein C-Fraktion gewonnen, die aus kommer- ziell erhältlichem Prothrombinkomplex-Konzentrat hergestellt wurde. Die Reinigung erfolgte affini- tätschromatographisch mittels monoklonaler Antikörper. Monoklonale Anti-Protein C-Antikörper wurden wie folgt hergestellt : BALB/C-Mäuse wurden mit 100 ug menschlichem Protein C in zweiwöchigen Abständen durch intraperitoneale Injektion immunisiert Nach sechs Wochen wurden noch einmal 50 ug des menschlichen Protein C injiziert und drei Tage später die Fusion vorgenommen. Die Myelomzellinie (P3-X-63-AG8-653,1,5 x 107-Zellen) wurde vermischt mit 1,7 x 108-Milzzellen von einer Maus, und die Fusion nach modifizierter Köhler & Milstein-Methode unter Verwendung von PEG 1500 durch- geführt (Köhler G., Milstein C., Nature 256 (1975), 495-497). Positive Klone, getestet mittels eines ELISA, wurden zweimal subgeklont. Aszitesproduktion er- folgte durch Injektion von 5 x 106-Hybridomzellen je BALB/C-Maus zwei Wochen nach Pristan- Behandlung. Das Immunglobulin wurde aus Aszites durch Ammoniumsulfatpräzipitation und anschliessende Chromatographie mittels quervernetztem Dextran mit Diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl-Gruppe (QAE-Sephadex) und darauffolgend Chromatographie an einem Gelchromatographiematerial aus quervernetztem Dextran (Sephadex G200) gereinigt. Um das Risiko der Übertragung muriner Viren zu reduzieren, wurde der Antikörper vor der Immobilisierung noch einem Virusinaktivierungsschritt unterworfen. Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper gegen Protein C wurden an einem CNBr- aktivierten Agarosematerial (CNBR-Sepharose 4B (Pharmacia)) gekoppelt. Für die Reinigung des <Desc/Clms Page number 9> Protein C mittels Affinitätschromatographie wurden folgende Puffer verwendet: Als Adsorptionspuffer : 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCI und 5 mM Benzamidin; als Waschpuffer wurde verwendet: 20 mM Tris, 1 M NaCI, 2 mM Benzamidin, 2 mM EDTA; der pH- Wert betrug 7,4; als Elutionspuffer wurde verwendet : M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M NaCI, 0,5 mM Benzamidin, 2 mM EDTA. Ein weiterer geeigneter monoklonaler Antikörper zur Reinigung von Protein C ist in der US 5,336,610 beschrieben. Dieser Antikörper bindet an das Aktivierungspeptid von Protein C und ist daher geeignet, das Zymogen Protein C selektiv von der aktivierten Form zu reinigen. Im einzelnen : Das Prothrombinkomplex-Konzentrat wurde im Adsorptionspuffer aufgelöst, wo- bei etwa 10 g des Prothrombinkomplex-Konzentrates für eine 20 ml monoklonale Antikörpersäule zur Verwendung kamen. Anschliessend wurde das aufgelöste Prothrombinkomplex-Konzentrat filtriert, bei 20 000 rpm 15 min lang zentrifugiert und durch ein 0,8 um-filter sterilfiltriert. Das steril- filtrierte und gelöste Prothrombinkomplex-Konzentrat wurde auf die Säule aufgetragen mit einer Flussrate von 10 ml/h. Anschliessend wurde die Säule mit dem Waschpuffer proteinfrei gewaschen und schliesslich das gebundene Protein C mit dem Elutionspuffer bei einer Flussrate von 5 ml/h eluiert und die Fraktionen gesammelt. Das eluierte Protein C wurde gegen einen Puffer (0,2 M Tris, 0,15 M Glycin und 1 mM EDTA, pH 8,3) dialysiert. Der Protein C-Gehalt wurde antigenmässig mittels der Methode nach Laurell und aktivitätsmässig nach Protac-Aktivierung bestimmt. Das erhaltene Protein C-Eluat wurde in folgender Weise zu einer pharmazeutisch applizierba- ren Präparation fertiggestellt: Das Eluat wurde zuerst einem Ultrafiltrations- und einem Diafiltrationsschritt unterworfen. Für die Diafiltration wurde ein Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet, der 150 mM NaCI und 15 mM Trinatriumcitrat.2H20 enthielt Das erhaltene Filtrat wurde gefriergetrocknet und durch eine einstündige Dampfbehandlung bei 80 C 5 C und 1375 35 mbar virusinaktiviert. Das lyophilisierte virusinaktivierte Material wurde sodann in einer sterilen isotonen NaCI- Lösung gelöst und mittels lonenaustauschchromatographie an Q-Sepharose wurden eventuell vor- handene Antikörper bzw. Serumamyloid P entfernt. Die gereinigte Lösung wurde durch einen weiteren Ultrafiltrations- und Diafiltrationsschritt konzentriert. Danach wurden zur erhaltenen Lö- sung 10 Albumin, 150 mM NaCI und 15 mM Trinatriumcitrat zugegeben. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,5. Maus-Immunglobulin sowie die Faktoren ll, VII, IX und X konnten nicht nachgewiesen werden. Anschliessend wurde die Lösung sterilfiltriert, abgefüllt und lyophilisiert. Die spezifische Aktivität betrug 14 Einheiten Protein C/mg. Als Aktivitätstest wurde ein amidolytischer Test ver- wendet, wobei das Protein C mittels Protac (Fa. Pentapharm) aktiviert wurde. 1. 5. Reinigung von plasmatischem Protein S Menschliches Protein S wurde aus Faktor IX-Konzentrat (Prothrombinkomplex STIM-3 IMMU- NO AG Vienna) mittels QAE-Sephadex und einer dreidimensional vernetzten Agarose mit Affinität zu Biomolekülen (Blue Sepharose CL-6B-Chromatographie (Pharmacia)) in folgender Weise hergestellt: Das lyophilisierte Konzentrat (100 g) wurde in 200 ml sterilem, ionenfreiem Wasser gelöst und gegen einen Puffer, bestehend aus 0,01 M 2-(N-Morpholinethansulfonsäure), pH 6,0; 0,18 M NaCI, 10 mM EDTA, 2 mM Benzamidin-HCI und 0,02 % NaN3 (Startpuffer), dialysiert. Das dialysierte Material wurde dann auf eine QAE-Sephadex-Säule (8 x 19 cm) aufgetragen und mit dem genann- ten Puffer equilibriert Als Waschlösung wurden 1,5 I Puffer (Startpuffer) verwendet. Protein S wurde mit 110 ml/h mit einem linearen NaCI-Gradienten, bestehend aus 1,2 I Start- puffer und 1,2 I eines weiteren Puffers, der sich von dem ersten Puffer durch Zusatz von 0,5 M NaCI unterscheidet, eluiert. Die Protein S-Fraktionen wurden mittels einer SDS Polyacrylamid- Gelelektrophorese (Fast Flow SDS Page (Pharmacia)) und Antigenbestimmung (Laurell) nach Protein S untersucht, und Fraktionen, die Protein S enthielten, wurden gepoolt und schliesslich gegen einen Puffer dialysiert. Dieser Puffer enthielt 50 mM TRIS-HCI, pH 7,4,150 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM Benzamidin-HCI und 0,2 % NaN3. Nach der Dialyse wurde der Protein S-Pool an eine Blue Sepharose-Säule CL-6B (2,5 cm x 10,5 cm) aufgetragen und mit dem Startpuffer equilibriert. Die Waschung erfolgte bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/t mit 500 ml Startpuffer. Das <Desc/Clms Page number 10> Protein S konnte so im "void volume" eluiert werden, während Prothrombin an der Säule adsorbier- te. Die Protein S-reichen Fraktionen wurden wieder mittels SDS-Page Fast Flow System (Pharma- cia) und gemäss Laurell (Scand. J. Clin. Invest. (Suppl.) 29 (1977) 21 (Suppl. 124)) bestimmt. Das so hergestellte Protein S hatte die für Protein S charakteristische Morphologie an einem reduzierten SDS-Page, nämlich zwei nahe Banden (Doublett) mit einem Molekulargewicht von etwa 86. 000 bzw. 76. 000. Die Proteinkonzentration wurde spektrophotometrisch bestimmt anhand eines Extinktionskoeffizienten von 0,1 bei 280 nm für menschliches Protein S, und wurde durch die Methode nach LOWRY bestätigt (Lowry 0., Rosebrough N., Farr AL, Randall R., Protein measure- mentwith the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265). Das so hergestellte vorgereinigte Protein S wurde zur Herstellung von Schaf-Antiserum gegen Protein S verwendet, indem vier Immunisierungsinjektionen vorgenommen wurden, wobei bei den ersten zwei Injektionen 100 ug Protein S mit Freund'schem Adjuvans subkutan appliziert wurden und bei den folgenden Boosterungen mit inkomplettem Adjuvans gearbeitet wurde. Nach weiteren Boosterungen wurde das Antiserum mittels doppelter Immunodiffusion getestet und zeigte eine Präzipitation mit gereinigtem Protein S und mit Normalplasma. Die IgG-Fraktion aus 450 ml Antiserum wurde durch Alkoholfällung und anschliessende Adsorp- tion an Sephadex A 50 in TRIS-HCI-Puffer, pH 6,8, erhalten. Aus 450 ml Antiserum waren im Überstand 1,14 g Anti-Protein S-lgG. Die IgG-Fraktion wurde an 450 ml dreidimensional vernetzte Agarose (Sepharose CL-4B) gekoppelt, wobei 5,7 mg Protein/ml Sepharose eingesetzt wurden. Die Kopplungseffizienz betrug 76 %. Die Anti-Protein S-Säule wurde mit Glycin-HCI, pH 3, und Adsorptionspuffer, pH 7,5, equilibriert. Der Adsorptionspuffer bestand aus 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCI, 2 mM Benzami- din, 0,02 % Polyethoxysorbitanlaurat (Tween 20) und 0,02 % NaN3, pH 7,4. Die Waschpufferlö- sung hatte folgende Gehalte: 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 1,0 M NaCI, 0,5 mM Benzamidin, 0,01 % Tween 20 ; 0,02 % NaN3, pH 7,4. Der Elutionspuffer war wie die Waschpufferlösung zusammengesetzt, mit der Änderung, dass 0,05 % Tween 20 und zusätzlich 243,3 g NaSCN, pH 7,4 (eine 3 M Rhodanid-Lösung) verwendet wurden. Die Dialysepufferlösung enthielt 20 mM Tns, 0,15 mM Glycin, 1 mM EDTA, 2 mM Benzamidin, pH 8,3. Zur weiteren Reinigung der Protein S-Fraktion, hergestellt aus Prothrombinkomplex-Konzentrat wurden 100 g der Fraktion in 1 I Adsorptionspuffer gelöst und über Nacht gegen eine Adsorptions- pufferlösung dialysiert. Die Säule wurde nach Auftragen der Probe mit Waschpuffer, ca. 5 I, prote- infrei gewaschen, anschliessend erfolgte die Elution mit 3 M NaSCN in der Elutionspufferlösung. Das Eluat wurde sofort dialysiert, bis SCN unter der Nachweisgrenze lag; das Eluat hatte eine Konzentration von 500 ug/mi Protein S. Es war frei von C4-binding-Protein. Monoklonale Anti-Protein S-Antikörper wurden wie folgt hergestellt: BALB/C-Mäuse wurden mit 100 ug des hergestellten Protein S in zweiwöchigen Abständen durch intraperitoneale Injektion immunisiert. Nach sechs Wochen wurden noch einmal 50 ug des menschlichen Protein S injiziert und drei Tage später die Fusion vorgenommen. Die Myelomzellinie (P3-X-63-AG8-653,1,5 x 107-Zellen) wurde vermischt mit 1,7 x 108-Milzzellen von einer Maus, und die Fusion nach modifizierter Köhler & Milstein-Methode unter Verwendung von PEG 1500 durch- geführt (Köhler G., Milstein C., Nature 256 (1975) 495-497). Positive Klone, getestet mittels eines ELISA, wurden zweimal subgeklont. Aszitesproduktion er- folgte durch Injektion von 5 x 106-Hybridomzellen je BALB/C-Maus zwei Wochen nach Pristan- Behandlung. Das Immunglobulin wurde aus Aszites durch Ammoniumsulfatpräzipitation und anschliessende Chromatographie mittels QAE-Sephadex und darauffolgend Chromatographie an Sephadex G200 gereinigt. Die aus Aszites gewonnene und an Protein A-Sepharose vorgereinigte IgG-Fraktion wurde an Sepharose CL-4B gekoppelt. Die affinitätschromatographische Reinigung von Protein S, welches aus Prothrombinkomplexkonzentrat gewonnen wurde, erfolgte unter den für polyklonale Protein-S- Antikörper beschriebenen Bedingungen. Die Konzentration des Eluates an Protein S betrug 600 ug/ml Es war frei von C4-binding-Protein. Die nach der Methode der polyklonalen oder der monoklonalen Affinitätschromatographie <Desc/Clms Page number 11> hochgereinigten Protein S- Präparationen wurden einer SDS-Page (Gradientengel 8 bis 12 %) unterworfen und sie können anhand von Coomassie-Färbung (Laemmli UK : Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970), 680) als über 95 % rein bezeichnet werden. Die Eluate wurden anschliessend einem Ultrafiltrations- und einem Diafiltrationsschritt unterwor- fen. Für die Diafiltration wurde ein Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet, der 150 mM NaCI und 15 mM Trinatriumcitrat.2H20 enthielt. Die erhaltenen Filtrate wurden gefriergetrocknet und durch eine einstündige Dampfbehandlung bei 80 C 5 C und 1375 35 mbar virusinaktiviert (zwecks Beseitigung eventuell vorhandener viraler Kontaminationen von polyklonalem oder mono- klonalem Antikörper). Das lyophilisierte virusinaktivierte Material wurde sodann in einer sterilen isotonen NaCI- Lösung gelöst und mittels lonenaustauschchromatographie an Q-Sepharose wurden eventuell vorhandene Antikörper bzw. Serumamyloid P entfernt. Die gereinigte Lösung wurde durch einen weiteren Ultrafiltrations- und Diafiltrationsschritt konzentriert. Danach wurden zur erhaltenen Lö- sung pro Liter 10 g Albumin, 150 mM NaCI und 15 mM Trinatriumcitrat zugegeben. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,5. Sie enthielt 3000 ug/ml Protein S. Dieser Gehalt an Protein S entspricht einer 500-fachen Anreicherung im Vergleich zu Plasma. Maus-Immunglobulin sowie die Faktoren ll VII, IX und X konnten nicht nachgewiesen werden. Anschliessend wurde die Lösung sterilfiltriert, abgefüllt und lyophilisiert. Beispiel I 2 : Pharmazeutische Zubereitung hochgereinigter Vitamin K einiger Prote- ine: Die hochgereinigten Einzelfaktoren Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S wurden derartig vereinigt, dass eine Lösung, enthaltend jeweils 25000 Einheiten/l, der einzelnen Faktoren in wässeriger Lösung von 4 g Na3Citrat.2H20 und 8 g NaCl/l entstand. Die Lösung wurde über ein Nylonfilter mit einer Rückhalterate von 0,2 um sterilfiltriert und anschlie- &num;end zu jeweils 20 ml in sterilisierte Glasfläschchen mit 50 ml Füllvolumen abgefüllt. Anschliessend wurde erst unter Sterilbedingungen gefriergetrocknet und dann die Fläschchen steril verschlossen. B e i s p i e 1 3: Pharmazeutische Zubereitung des Prothrombinkomplexes: Wie im vorigen Beispiel beschrieben, wurde ein hochgereinigter Prothrombinkomplex, enthal- tend die Faktoren Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX, und Faktor X, jedoch ohne Protein C und Protein S, dargestellt und steril verfüllt. Gemäss internationalen Empfehlungen wurden der Losung vor Abfüllung 10000 internationale Einheiten Heparin/1 zugesetzt. B e i s p i e l 4 : Pharmazeutische Zubereitung der Vitamin K-abhängiger Proteine zur Dauersubstitution und Erhaltung konstanter Plasmaspiegel: Nach Substitution mit einem Vitamin-K-abhängigen Protein-Konzentrat, bei welchem möglichst konstante Plasmaspiegel der Faktoren des Prothrombinkomplexes erreicht werden sollen, ergibt sich aufgrund der unterschiedlichen Halbwertszeiten der einzelnen Faktoren die Notwendigkeit, die Substitutionsraten dieser Proteine in einem nicht äquivalenten Verhältnis durchzuführen. Entspre- chend wurde eine pharmazeutische Zubereitung wie oben beschrieben, dargestellt, die Prothrom- bin, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Verhältnis von 1:30:3:1,5:6:6 enthielt. Beispiel I 5 : Pharmazeutische Zubereitung eines partiellen Prothrombinkomplexes: Durch die unterschiedlichen in vivo Halbwertszeiten der Faktoren des Prothrombinkomplexes, insbesondere durch die lange Halbwertszeit von Prothrombin von 2-5 Tagen im Vergleich zur kurzen Halbwertszeit des Faktor VII von 4 bis 7 h, und des Faktor IX von unter 24 h, ergibt sich bei Dauersubstitution mit Prothrombinkomplexpräparaten, das bei Einstellung einer normalen Plasma- konzentration von 1 Einheit Faktor Vll/Ml, Plasmakonzentration nach 24 h schon wieder unter die <Desc/Clms Page number 12> für eine funktionierende Haemostase erforderliche Konzentration von mindestens 20 % abgenom- men hat, während z. B. der Prothrombin-Plasmaspiegel noch annähernd normal, d. h. bei 1 Ein- heit/ml, ist. Bei neuerlicher Substitution mit einem Prothombinkomplexkonzentrat der gleichen Zusammensetzung wie bei der primären Substitution, ergibt sich nun, dass die Prothrombinplasma- konzentration im Patienten über den normalen Bereich erhöht wird, um neuerlich äquivalente Faktor VII- oder Faktor IX-Plasmakonzentrationen zu erreichen. Die Erhöhung der Plasmapro- thrombinkonzentration über den Normbereich, bedeutet jedoch ein erhöhtes Thromboserisiko für den behandelten Patienten, weil von Poort et al. (Blood 88 :3698-3703, 1996) festgestellt wurde, dass ein nur um 30 % erhöhter Plasmaspiegel an Prothrombin mit einem signifikant erhöhten Risiko zu venösen Thrombosen verbunden ist. Dieses Problem kann vermieden werden, indem für Sekundärsubstitutionen gezielt kombinierte Prothrombinkomplexpräparate eingesetzt werden. Ein solches wird wie folgt hergestellt: Wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, wird ein Prothrombinkomplexkonzentrat, bestehend aus Faktor VII, IX und X in einem Verhältnis von 30 :3:1,5, jedoch ohne Prothrombin, dargestellt und als pharmazeutische Formulierung zubereitet. Die zur Verabreichung vorgesehenen Behälter dieses Präparates enthielten jeweils 500 Internatio- ale Einheiten der Gerinnungsfaktoren VII, IX und X in einem Lösevolumen von 10 ml nach Re- konstitution des lyophilisierten Pulvers. Beispiel I 6 : Qualitätskontrolle der Prothrombinkomplexpräparate: Die einzelnen Gerinnungsfaktoren in den Endbehältern der Prothrombinkomplexpräparate wurden mit 1-Stufen-Gerinnungstests nach Standardmethoden, unter Verwendung von defizienten Plasmen und Gerinnungsreagenzien der Firma IMMUNO, Wien, auf den Gehalt an Prothrombin, Faktor Vll,Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S untersucht. Details zu den jeweils verwendeten Methoden sind der Arbeit von Müller, H. G. und Bonik K. (Krankenhauspharmazie 13:528-531, 1992) zu entnehmen. Zur Bestimmung des Gehaltes an aktivierten Prothrombinkomplexfaktoren wurden die chromo- genen Substrate S-2238, S-2222, S-2444, S-2366 und S-2251 der Firma Chromogenix verwendet. Die Bestimmungen wurden unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Pufferbedingun- gen durchgeführt. Durch die chromogenen Substrate konnten jeweils die aktivierten Faktoren Thrombin, Faktor Vlla, Faktor IXa, Faktor Xa, aktiviertes Protein C, welche proteolytische Aktivitä- ten gegen die eingesetzten Peptidsubstrate entwickelten, bestimmt werden. Nach Auswertung der photometrischen Analyse des chromogenen Substratumsatzes konnte bestimmt werden, dass für alle Substrate der Gehalt in den vorher beschriebenen Präparationen, enthaltend Vitamin K, Prote- ine oder ausgewählte Faktoren des Prothrombinkomplexes jeweils unter 10 mU/ml, lagen. PATENTANSPRÜCHE : 1. Pharmazeutisches separiertes Prothrombinkomplex-Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 2 hochgereinigte Vitamin K-abhängige Einzelfaktoren enthält. 2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelfaktoren ausgewählt sind aus der Gruppe Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Protein Z.

3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest die Fakto- ren ll, VII, IX und X enthält.

4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es die Einzel- faktoren Protein C und Protein S enthält.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Einzelfaktoren ein rekombinanter Faktor, ein transgen hergestellter Faktor, ein Derivat dieses Faktors, insbesondere ein Peptid, und/oder ein Fragment dieses Faktors ist.

6. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die enthal- tenen Einzelfaktoren in einem Verhältnis umfasst, welches im wesentlichen dem Verhältnis dieser Faktoren im Blut entspricht.

7. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Einzel- <Desc/Clms Page number 13> faktoren Faktor ll, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relativverhältnis, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) umfasst

8. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es die Einzel- faktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Rela- tivverhältnis, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) umfasst.

9. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die enthal- tenen Einzelfaktoren in einem Verhältnis umfasst, das den relativen Halbwertszeiten der Einzelfaktoren entspricht.

10. Präparat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es die Einzelfaktoren Faktor ll, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relativverhältnis, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) : (5 bis 35) : (0,5 bis 7) : (0,5 bis 5) umfasst.

11. Präparat nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die Ein- zelfaktoren Faktor ll, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Relativverhältnis, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) : (5 bis 35) : (0,5bis 7) : (0,5 bis 5) : (1 bis 15) : (1 bis 15) umfasst.

12. Präparat nach Anspruch 1,2, 4,5, 6 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es Faktor VII und Faktor 11 in einem Verhältnis grösser als 10 :1 umfasst.

13. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelfak- toren im Präparat keinen Komplex bilden.

14. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es einen par- tiellen Prothrombinkomplex umfasst.

15. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es frei von aktivierten Gerinnungsfaktor, ausgewählt aus lla IXa, Xa und gegebenenfalls Vlla, ist

16. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es weniger als 0,1E Faktor VIII:C oder Faktor VIII:Ag/mg Protein enthält.

17. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es weniger als 0,1E Faktor lla/E Prothrombin enthält.

18. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es weniger als 0,1E Faktor Xa/E Faktor X enthält.

19. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es in lyophili- sierter Form vorliegt.

20. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es Magnesi- umionen enthält.

21. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es keine frei- en Calciumionen enthält.

22. Präparat nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Chelatbildner zum Komplexieren von freien Calciumionen enthält.

23. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters Antithrombin lll in stabilisierenden Mengen, gegebenenfalls gemeinsam mit Heparin, ent- hält.

24. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass es auf Grund einer Virusinaktivierungs- oder Virusabreicherungsbehandlung frei von infektiösen Viren ist.

25. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters pharmazeutisch akzeptable Puffersubstanzen oder Stabilisatoren umfasst.

26. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass es aus hoch- gereinigten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren besteht, die virusinaktiviert sind.

27. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass es den Einzel- faktor Faktor X in seiner a-Form und/oder &num;-Form umfasst.

28. Diagnostisches Präparat enthaltend ein Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 27.

29. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von erworbenen oder vererbten Blutgerinnungsstörungen.

30. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von schweren Blutungen. <Desc/Clms Page number 14>

31. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer Präparation zur Prophylaxe von Blutungen, insbesondere bei Vorliegen von vererbten Blutgerinnungsstörungen.

32. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer Präparation zur Substitutionstherapie.

33. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von Hämophilie B.

34. Verfahren zur Herstellung eines Präparates nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 2 Präparate hochgereinigter Vitamin K-abhängiger Ein- zelfaktoren miteinander gemischt werden.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat und/oder die Präparate der Einzelfaktoren durch zwei voneinander unabhängige Inaktivierungs- oder Abreicherungsverfahren für Viren behandelt wird.