DE2734427C3

DE2734427C3 - Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen Enzymen aus Schlangengiften

Info

Publication number: DE2734427C3
Application number: DE2734427A
Authority: DE
Inventors: Kurt F. Oberwil Basel Stocker (Schweiz)
Original assignee: Pentapharm AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 1976-08-17
Filing date: 1977-07-29
Publication date: 1980-04-17
Also published as: NL186018C; LU77957A1; NL186018B; FR2362155A1; DE2734427A1; CA1078732A; AU2763377A; JPS5710718B2; DE2734427B2; NO772862L; NO147526C; DK147408B; NO147526B; AT361616B; BE857876A; IT1083927B; AU507161B2; ES461549A1; SE433619B; IL52607A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus den Giften von Schlangen der Familie der

y, Crotalidae, insbesondere der Gattungen Agkistrodon, Bothrops, Crotalus und Trimeresurus.

Thrombinartige proteolytische Enzyme sind Proteasen, welche z. B. aus gewissen Schlangengiften gewonnen werden und welche, wie das Thrombin, aus

ho Fibrinogen Fibrinopeptid A und/oder Fibrinopcptid B abspalten, sich jedoch von Thrombin dadurch unterscheiden, daß sie eine größere Substratspezifizität aufweisen [siehe z. B. D. L. Aronson in Thrombos. Haemostas. (Stuttgart) 1976, 36, Seiten 9 bis 13, und

Thrombinartige Schlangengiftenzyme werden als Reagenzien zur Untersuchung von Blutgerinnungsvorgängen, als antihaemorrhagische Arzneimittel sowie als

Mittel zur experimentellen und therapeutischen Defibrinogenierung und somit zur Antikoagulation verwendet. In der nachfolgenden Tabelle sind für die thrombinartigen Enzyme aus den Giften einiger Schlangenarten die Verwendung und die diesbezüglichen Literaturhinwe!se angegeben.

Tabelle 1

Gift der Arten

Verwendung für

Literatur

Agkistrodon Blutuntersuchung

contort rix

Agkistrodon
rhodostoma

Defibrinogenierung

Bothrops atrox Defibrinogenierung

Blutstillung

Blutuntersuchung

Bothrops jararaca Blutstillung

Crotalus
adamanteus

Defibrinogenierung

Trimeresurus Defibrinogenierung

gramineus

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Die genannten proteolytischen Enzyme sind Glykopeptide mit Molekulargewichten von 18 000 bis 55 000; aufgrund ihrer Hjmmbarkeit durch Diisopropylfluorophosphat sind sie der Gruppe der Serinproteasen zuzuordnen. Wie Thrombin bewirken thrombinartige Schlangengiftenzyme durch Fibrinopeptidabspallung die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin, sie unterscheiden sich aber von Thrombin in ihrem Verhalten gegenüber anderen Blutgerinnungsfaktoren, gegenüber Thrombozyten und insbesondere dadurch, daß ihre koagulierende Aktivität gegenüber Plasma durch Thrombininhibitoren wie Heparin, Hirudin, Antithrombin 111 und durch Heparinoide nicht signifikant gehemmt wirJ [siehe D. L. Aronson in Thrombos. Haemoslas. (Stuttgart). 1967,36, Seiten9bis 13}

Um aus den Schlangengiften, welche jeweils Gemische von bis über 20 verschiedenen pharmakologisch aktiven Polypeptiden darstellen, die thrombinartigen Enz>ms; anzureichern, wurden nach Deutsch (Deutsch, E.: Blutgerinnungsfaktoren, Verlag Deuticke, Wien

5i 1955) Ballaststoffe durch Säure- und Hitzefällungen aus gelöstem Rohgift ausgefällt und aus der verbleibenden flüssigen Phase die thrombinartigen Enzyme durch Lösungsmittel- oder Salzfällungen als angereicherte Fraktion gewonnen. Banerjee et al. beschreiben die

bo dreißigfaehe Anreicherung des thrombinartigen Enzyms von Bothropsjararaca-Gift durch Arrmoniumsulfatfällung jus einer 0,5%igen Rohgift-Losung, Wärmebehandlung des gelösten Präzipitats bei 65°C, Abtrennung von gefällter Ballaststoffen durch Zentrifugation,

b^r> Adsorption des thrombinartigen Enzyms an Calciumphosphatgel, Eluierung mit Natriumphosphatpuffer bei pH 7,2, erneute fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und schließlich Dialyse gegen Veronalpuffer (siehe

Banerjee. E.. Devi. Α.. Sarkar. N.: Isolation and purification of a coagulant from snake venom of (he species Bothrops jararaca and the study of its properties. Thromb. Diath. Haem. 5. 296 bis 303 [1960]). Die britischen Palentschriften 1094 301 und 11 77 506 beschreiben die Gewinnung des thrombinartigen Enzyms aus dem Gift von Agkistrodon rhodostoma durch Chromatographie an Triäthylaminoäthylcellulose und nachfolgende Reinigung durch Gelchromatographie: so werden 2 g rohes Agkistrodon-rhodostoma-Gift an einer Säule von 35 χ 3.9 cm TEAE-Cellulose ( = 417 ml) und hierauf an einer Säule von 97 χ 6 cm Sephadex G-100 (= 2826 ml) Chromatographien. Bonilla (Thromb. Res. 6. I 51 bis 169 [1975]) beschreibt die Gewinnung des thrombinartigen Enzyms aus dem Gift von Crotalus horridus durch Chromatographie von 20 g Rohgif; an einer Kolonne vor, 176fcml Scphadcx G-100. nachfolgende Chromatographie der aktigen Fraktion an einer Kolonne von 883 ml Diaminoäthylcellulose. nachfolgende Chromatographie an 883 ml Carboxymethylcellulose und eine letzte Reinigung durch Chromatographie an einer Kolonne von 2.5 χ 36 cm (176 ml) DEAE-Cellulosc unter Verwendung eines linear zunehmenden Pufferkonzentrationsgradienten und nachfolgende Chromatographie an einer Kolonne von 2.5 χ 33 cm Sephadcx G-200. Die genannten, unter Anwendung der Ionenaustausch- und Gelchromatographie durchgeführten Verfahren ermöglichen zwar die Erzielung einer weit höheren Reinheit als das eingangs beschriebene Adsorptionsverfahren, sie sind ledoch zeitraubend und unwirtschaftlich, da nur geringe Rohgiftmengen auf relativ großen Kolonner Chromatographien werden können. Das aktive F.luai enthält ferner eine relativ geringe Menge Enzym in einem großen Flüssigkeitsvolumen und muß daher entw. eder durch Ultrafiltration oder Vakuumdestillation eingeengt werden. Nach dem USA-Patent 38 49 252 wird das thrombinartige Enzym von Bothrops-atrox-Gift dadurch gewonnen, daß man aus 20 g Rohgift Ballaststoffe durch Ansäuern ausfällt, hierauf das Enzym durch Bildung eines schwerlöslichen Komplexes mit Phenol oder einem Phenolderivat zur Fällung bringt, diesen Komplex zerlegt, das derart angereicherte Enzym an einer Kolonne von 200 ml DEAE-Sephadex chromatographiert und hierauf an einer Kolonne von 1.8 χ 92 cm (233 ml) Sephadex G-100 reinigt. Durch die in diesem Verfahren angewandte Fällung des thrombinartigen Enzyms als Phenol- oder Phenolderivat-Komplex werden zwar die chromatographischen Reinigungsstufen bedeutend leistungsfähiger als bei der direkten Chromatographie von Rohgift, dennoch erfordern die zahlreichen Stufen dieses Verfahrens einen beträchtlichen Arbeitsaufwand und liefern ein Produkt von ungenügender Reinheit, welches mit prothrombinfreiem Plasma in Anwesenheit von Calcium ein in Monochloressigsäure unlösliches Gerinnsel bildet und daher Faktor XIII aktiviert. Hollemann und Weiss (j. Bio). Chem. 251, 1663 bis 1669 [1976]) erzielten die Isolierung und Reinigung des thrombinartigen Enzyms von Bothrops-atrox-Gift durch Affinitätschromatographie von 2 g Rohgift an einer Kolonne von 2,5 χ 56 cm (274 ml) p-Aminobenzamidin-succinyl-diaminodipropylamino-agarose bei 4°C unter Verwendung von 0,15 M Benzamidin in Natriumcitrat/NaCl-Puffer mit pH 9,0 und nachfolgende Entfernung des Benzamidins aus dem Eluat durch Dialyse. Sie erhielten so ein Produkt, welches Faktor XIII nicht aktivierte. Dieses Verfahren liefert zwar ein Produkt von genügender Reinheit in nur wenigen Stufen, erfordert aber eine verhältnismäßig große Kolonne eines kompliziert herzustellenden Adsorbens und benötigt außerdem zur Eluierung Benzamidin, welches wegen seiner Eigenschaft, UV-Licht zu absorbieren, die UV-photometrische Überwachung des Chromatographieverlaufs verunmöglicht und welches, da es eine beträchtliche Toxizität aufweist, restlos aus den Eluaten entfernt werden muß, was wiederum eine zeitraubende Dialyse erfordert.

Es wurde nun gefunden daß thrombinartige Schlangengiftenzyme, obwohl ihre Gerinnungsaktivität unter den für Blutgerinnungstests üblichen pH-, lonenstärke- und Temperaturbedingungen durch Heparin nicht gehemmt wird, erstaunlicherweise eine ausgeprägte Affinität zu an einem Träger gebundenem insolubilisiertem Heparin aufweisen und daher durch Affinitätschro-ΓΓΐίϊtosrsphic π"

Heparin ^aiic ^οπ^σϊΗ

von Schlangen oder Fraktionen desselben isoliert und gereinigt werden können.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus Schlangengiften bzw. Schlangengiftfraktionen, welches dadurch gekennzeichnet ist. daß man d.'s Schlangengift bzw. die Schlangengiftfraktion in einem wäßrigen Medium mit an einem in Wasser unlösli hen Träger gebundenem insolubilisiertem Heparin in Berührung bringt, um das thrombinartige Enzym an das insolubilisierte Heparin zu binden, die unerwünschten Begleiistoffe des Schlangengiftes entfernt und das thrombinartige Enzysi mit einem wäßrigen Medium vom insolubilisierten Heparin abspaltet.

/.;■. Ausgangsma:erialien für die Durchführung des erfindungsge. 'äßen Verfahrens eignen sich einerseits klar filtrierte oder zentrifugierte wäßrige Lösungen des rohen Giftes von Schlangen der Familie der Crotalidae. insbesondere der Gattungen Agkistrodon, Bothrops. Crotalus und Trimeresurus. Als Ausgangsmaterialien eignen sich andererseits auch klar filtrierte oder zentrifugierte Schlangengiftfraktionen, welche das thrombinartige Enzym angereichert enthalten und aus welchen Ballaststoffe durch Säure- oder Hitzetällungen entfernt worden sind. Als Ausgangsmaterialien eignen sich ferner rohe Präparate der thrombinartigen Schlangengiftenzyme, welche z. B. nach dem im USA-Patent 38 49 252 beschriebenen Verfahren durch Fällung mit Phenol oder einem Phenolderivat aus Rohgift gewonnen wurden.

Insolubilisiertes Heparin kann dadurch gewonnen werden, daß man Heparin nach einer an sich be\*nnten Methode über seine Aminogruppen mit den reaktiven Gruppen einer polymeren wasserunlöslichen Trägersubstanz zur Reaktion bringt und dadurch kovalent an den Träger bindet Das insolubilisierte Heparin kann z. B. nach einem der von Schmer beschriebenen Verfahren durch Bindung von Heparin an Agarose nach der Cyanogenbromidmethode, durch Bindung an Putrescinagarose nach der Thiphosgenmethode oder durch Bindung an Epsilonaminocaproylagarose nach der Carbodiimidmethode gewonnen werden (siehe G. Schmer: The biological activity of covalently immobilized heparin, Trans. Am. Soc Artificial Int Org. 18, 321 bis 323 [1972]). Man kann als Trägersubstanz auch Cellulose und die entsprechenden Derivate, d.h. Putrescinceiiuiose und Epsiionaminocaproylceliuiose, verwenden. Insolubilisiertes Heparin kann zweckmäßigerweise auch durch Umsetzung von Heparin mit in Form von Perlen genormter Größe käuflich erhältlicher quervernetzter Cyanogenbromidagarose (z. B. CNBr-

Sephiirose 4B von der Firma AB Pharmacia. Uppsala. Schweden) hcrge' teilt werden.

Die Behandlung des Aiisgangsmalerials mil dem insolubilisierten Heparin (el. h. die Bindung des thrombinartigen Schlangengiftcnzyms an das Heparin) und die A!--,paltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin kann chargenmäßig durch Ausrühren des in Wasser, einer wäßrigen Pufferlösung, einer wäßrigen Elektrolytlösung ohne oder höchstens mi; schwacher Pufferwirkung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Ncutralsal/. z. B. Natriumchlorid, enthallendcn wäßrigen Lösung gelösten Ausgangsmaterials mit dem Affinitätsadsorberis (d. h. dem insolubilisierten Heparin) und nachfolgende filtration oder aber auch vorzugsweise durch Affinitätschromatographic an einer Säule durchgeführt werden. Als F.lcktrolytc eignen sich anorganische und organische Salze, z. B. Natriumchlorid. Animoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat. Calciumchlorid. Ammoniumbicarbonat. Ammoniiimformiiil, Natriumacetat oder Triäthylamin-hydrochlorid; oder organische Säuren, z. B. Essigsäure. Weinsäure oder Zitronensäure: oder Basen, z. B. Ammoniumhydroxyd. Trimethylamin oder Triethylamin. Bei der Affinitätschromatographie wird das insolubilisierte Heparin in eine Säule, deren Durchmesser etwa einem Zehntel ihrer Höhe entspricht, eingefüllt und mit demselben wäßrigen Medium, in welchem auch das Ausgangsmaterial gelöst ist, äquilibriert. Der Sätilrnauslauf ist zweckmäßigcrwcisc mit einem Durchflußphoiomctcr verbunden, welches die optische Dichte der ausfließenden Fluate bei einer geeigneten Wellen länge (üblicherweise 280 nm oder 254 nm) mißt und automatisch registriert. Die Fluate werden vorzugsweise mittels eines automatischen Fraktionensammlers in Fraktionen unterteilt und gesammelt.

Die Affinitätschromatographic kann im einzelnen wie folgt durchgeführt werden:

Das Ausgangsmaterial (Schlangenrohgift oder Schlangengiftfraktion) wird in Wasser, einer wäßrigen Pufferlösung oder einer wäßrigen Elektrol) tlösung, z. B.

Puffer als auch ein Neutralsalz, z. B. Natriumchlorid, enthaltenden wäßrigen Lösung gelöst. Die Lösung wird klar filtriert oder zentrifugiert und dann auf die Chromatographiesäule gegeben. Die Säule wird mit dem gleichen wäßrigen Medium wie dasjenige, in welchem das Ausgangsmaterial gelöst worden ist, so lange gewaschen, bis im auslaufenden Eluat keine UV-absorbierenden Substanzen mehr nachweisbar sind. Nun wird die Säule mit einem wäßrigen Eluierungsmit-IeI. z. B. einer Pufferlösung oder einer Elektrolytlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz, z. B. Natriumchlorid, enthaltenden Lösung, deren Konzentration größer ist als diejenige des wäßrigen Mediums, in welchem das Ausgangsmaterial gelöst wurde, gewaschen, um das thrombinartige Schlangengiftenzym von dem insolubilisierten Heparin abzuspalten. Es wird so lange gewaschen, bis kein UV-absorbierendes Material mehr eluiert wird. Schließlich wird die Säule mit einer Pufferlösung oder einer Elektrolytlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz, z. B. Natriumchlorid, enthaltenden Lösung von so hoher Konzentration nachgewaschen, daß auch Substanzen, die stärker an das insolubilisierte Heparin gebunden sind als die thrombinartigen Enzyme, restlos aus der Kolonne entfernt werden, so daß das Affinitätsadsorbens nach Äquilibrierung, mit dem gleichen Äquilibrierungsmittel wieder regeneriert wird

und somit für einen neuen Arbeitsgang bereit ist.

Als Pufferlösungen eignen sich wäßrige Lösungen von Salzen anorganischer oder organischer Basen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Salze von amphoteren Substanzen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen, welche eine Pufferwirkung innerhalb des pH-Bereiches von 4 bis 10 entfalten. Besonders geeignet sind untoxische Substanzen oder Substanzgemische, die keine aromatischen Gruppen aufweisen, daher Licht von einer Wellenlänge von 280 bzw. 254 nm nicht absorbieren und somit die UV-photometrische Überwachung des Chromatographieverlaufs nicht stören, insbesondere Glycin/NaOII-, Essigsäure/ Na/OH-, Zitronensäurc/NaOH-, Triäthanolamin/HCI-. l.ysin/HCI-, Glycylglycin/HCI-, Natriumphosphatpuffer sowie auch vakuumflüchtige Puffersystemc wie Aminoniumformiat-. Aminoniumacelat- und Äthylendiamintetraaceiatpuffer. Für das chargenmäßige Arbeiten eignen sich ferner Natriumhydrogencarbonat- und Ammoniumhydrogencarbonatpuffer. die jedoch wegen COj-Entwicklung für das chromatographische Verfahren unbrauchbar sind. Die thrombinartigen Enzyme verschiedener Schlangengifte besitzen eine unterschiedliche Affinität gegenüber dem an einen unlöslichen Träger gebundenen insolubilisierten Heparin; dementsprechend muß auch die Zusammensetzung der Puffer der biologischen Herkunft der zu isolierenden Enzyme angepaßt werden. )e geringer die Konzentration der Puffer- oder Elektrolytlösung oder der Puffer-Neutralsalz-Lösung ist. um so besser wird das Enzym an insolubilisiertcs Heparin gebunden. Da aber bei geringer Konzentration auch das unspezifische Bindungsvermögen des Heparins für Proteine am größten ist, müssen Konzentrationen gewählt werden, bei weichen das thrombinartige Enzym gebunden wird, andere Proteine jedoch die Kolonne ungehindert durchlaufen. Für jedes Gift können die optimalen Konzentrationsbedingungen durch einfache Vorversuche ermittelt werden. Die Bindung aller untersuchten thrombinartigen Schlangengiftenzyme erfolgt bei Kon-/.ciiti aiiuiiL'ii der Pufferlösungen oder Eiekiruiyiiö:>uiigen oder Puffer-Neutralsalz-Lösungen, die je nach Giftart in einem Molaritätsbereich von 0,01 bis 0,5 liegen und bei einem pH von 4 bis 10. Zur Abspaltung der an insolubilisiertes Heparin gebundenen thrombinartigen Schlangengiftenzyme werden Pufferlösungen oder Elektrolytlösungen oder Puffer-Neutralsalz-Lösungen verwendet, die eine höhere Konzentration aufweisen als die zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete Lösung. Vorzugsweise verwendet man die gleiche Pufferlösung wie diejenige, welche zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendet wurde, erhöht jedoch deren Konzentration durch Zusatz eines stark dissoziierenden Neutralsalzes, vorzugsweise Natriumchlorid, derart, daß das gebundene Enzym von dem insolubilisierten Heparin abgespalten wird. Da in einigen Schlangengiften auch andere Substanzen mit einer Affinität gegenüber insolubilisiertem Heparin vorhanden sind, wird die Konzentration der zur Eluierung verwendeten Lösung vorzugsweise so eingestellt, daß das thrombinartige Enzym abgespalten wird, andere Substanzen mit höherer Affinität jedoch an dem insolubilisierten Heparin gebunden bleiben. Die Abspaltung aller an insolubilisiertes Heparin gebundenen thrombinartigen Schlangengiftenzyme wird vorzugsweise bei Konzentrationen, die zwischen 0,1 und 2 Mol liegen, und in einem pH-Bereich von 4 bis 10 durchgeführt. Die restlose Entfernung aller am insolubi-

lisierten Heparin gebundenen Giftbestandteile mit einer Heparinaffinität, die stärker als diejenige der thrombinartigen Enzyme ist, wird zweckmäßigerweise mit Pufferlösungen oder Elektrolytlösungen oder Puffer Neutralsalz-Iösungen, die ein pH von 4 bis 10 und eine τ Molarität von 0,5 bis 2 aufweisen, durchgeführt. Vorzugsweise wird wiederum die erste Pufferlösung, welche zui bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendet wurde, durch Zusatz eines Neutralsalzes, vorzugsweise Natriumchlorid, auf die gewiinsch- in te Konzentration gebracht. Das Affinitätsadsorbcns kann nun durch Waschung m't der ersten Pufferlösung, welche zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin diente, wieder in den gebrauchsfertigen Zustand versetzt werden. ι >

Die Affinität von insolubilisiertem Heparin gegenüber den thrombinartigen Schlangengiftenzymcn ist bei tiefer Temperatur am größten und nimmt mit steigender Temperatur ab. Man kann dieses Phänomen dazu nutzen, die Bindung des Enzyms an das insolubilisierte 2» Heparin bei tiefer Temperatur, z.B. in einer mit Eiswasscr gekühlten Kolonne, und die Abspaltung des Enzyms durch Erhöhung der Temperatur im Kühl- bzw. Heizmantel der Kolonne, z. B. auf 40°C, unter Verwendung einer einzigen Pufferlösung von gleichblei- r> bender Konzentration und gleichbleibendem pH zu bewirken.

Die Abspaltung des Enzyms vom insolubilisierten Heparin kann ferner bei gleichbleibender Konzentration des wäßrigen Mediums an Puffer und/oder tu Neutralsalz durch Erhöhung oder Herabsetzung des pH über bzw. unter den Wert, bei welchem die Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin stattgefunden hat, durchgeführt werden. Der für jedes Enzym geeignete pH-Bereich läßt sich durch einfache Vorver- r, suche ermitteln.

Der Gehalt der bei der Kolonnenchromatographie erhaltenen Eluate an thrombinartigem Schlangcngiftenzym kann durch einen Gerinnungstest, vorzugsweise an Fibrinogen, geprüft werden. Als Gerinnungstest eignet sich z. B. die Messung der Gerinnungszeit in Sekunden, inv_|[ Zu.-kw/. VUIi 0,2 in! vciuüiiiiiciii Erna ι zu 0,2 mi 0,4%igem Rinderfibrinogen, bei pH 7,4 und 37°C. Die einfache Gerinnungszeitbestimmung eignet sich gut zur Einstellung eines Aktivitätsprofils in chromatography r> sehen Eluierkurven (siehe F i g. 1 der Zeichnung). Aus einer nach derselben Technik unter Verwendung eines Thrombin-Standardpräparats (z. B. US-Standard Thrombin, National Institute of Health, Bethesda, Md.) oder unter Verwendung eines Standardpräparats für v) das betreffende thrombinartige Schlangengiftenzym (z. B. Ancrod-Standard der Weltgesundheitsorganisation oder Betroxobin moojeni Standard, First British Standard) ermittelten Eichgeraden kann aus der Gerinnungszeit die Aktivität quantitativ in NI H-Throm- « bin-Einheiten bzw. in Ancrod-Einheiten oder in Batroxobin-Einheiten abgelesen werden. Der Gehalt an thrombinartigem Enzym kann aber auch in einem photometrischen Test unter Verwendung eines synthetischen chromogenen Thrombinsubstrats, wie ζ. Β. m> Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.HCI, in Enzym-Einheiten bestimmt werden. Eine Einheit (U) ist dann die Menge Enzym, welche unter den Testbedingungen innert einer Minute 1 μΜοΙ Substrat spaltet

Aus den vereinigten aktiven Fraktionen können unerwünschte Puffersubstanzen und Salze Curch Dialyse ganz oder teilweise entfernt werden. Eine gleichzeitige Errtsalzung und Konzentrierung der vereinigten aktiven Fraktionen kann durch Ultrafiltration, ζ. Β. durch eine Diaflo-Membran UM-2 (Amicon, Oosterhout, Holland), vorgenommen werden. Ob die das thrombinartige Schlangcngiftenzym enthaltende Fraktion entsalzt und konzentriert werden soll, hängt von der Art des verwendeten Puffers, von der chromatographierten Substanzmenge und vom Verwendungszweck des Produktes ab. Bei Verwendung untoxischcr Puffersysteme, wie /.. B. Glycin/NaOH/NaCI, zur Gewinniing thrombinartiger Enzympräparate für die experimentelle und/oder therapeutische Defibrinogenicrung muß man nicht oder nur partiell entsalzen, um aus den vereinigten aktiven Fraktionen des Eluats nach herkömmlichen Methoden eine isotonische sterile, phyrogenfreie Lösung herstellen zu können. PartHle Entsalzung genügt auch dann, wenn das in einem Eluat enthaltene thrombinartige Schlangcngiftenzym zwecks weiterer Reinigung rechromalngrnnhirrl u/ortlpn so!!: es genügt dann, die Puffer- bzw. Salzkonzentration des Eluats auf den zur Affinitätsbindung erforderlichen tieferen Wert zu reduzieren, um das Enzym erneut an insolubilisiertes Heparin binden zu können.

Die Natur der Bindung zwischen dem insolubilisierten Heparin und den ihrombinarligcn Enzymen ist nicht genau aufgeklärt worden. Sehr wahrscheinlich ist diese Bindung analog der chemischen Bindung, die zwischen Enzymen und Substraten sowie zwischen Enzymen und Inhibitoren bei reversibler Hemmung auftritt (siehe S. M. Rapoport: »Medizinische Biochemie«, VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin 1975. Seiten 133 bis 155).

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt gegenüber den bekannten Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen Schlangengiftcnzymen mehrere erhebliche Vorteile. Das Bindungsvermögen von insolubilisierieni Heparin für (hrombinartige Schlangcngiftenzyme ist so groß, daß an einer Chromatographiesäule von nur 20 ml Inhalt mehr als 4 g Rohgift oder eine äquivalente Menge vorgereinigte Enzymfraktion aufgetrennt werden können, wobei thrombinartige Enzyme von einem hohen Reinheitsgrad erhalten werden. Dies entspricht etwa dem 40fachen der Leistungsfähigkeit einer lonenauslauscncnromaiographie an Lelluloseausiauschern, etwa dem 400fachen der Leistungsfähigkeit einer Gelchromatographie und etwa dem 25fachen der Leistungsfähigkeit der Affinitätschromatographie an p-Aminobenzamidin-succinyl-diaminodipropylaminoagarose. Dieses große Bindungsvermögen des insolubilisierten Heparins erhöht nicht nur die Trennkapazität einer relativ kleinen Chromatographieapparatur, sondem bewirkt auch, daß die aktiven Fraktionen des Eluats das Enzym in wesentlich höheren Konzentrationen enthalten als dies bei Ionenaustausch- und Gelchromatographie der Fall ist, wodurch viel weniger Arbeitsaufwand für Konzentrierung und Entsalzung der Eluate aufgebracht werden muß. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die thrombinartigen Schlangengiftenzyme in wenigen, leicht durchzuführenden und weitgehend automatisierbaren, gut registrierbaren Arbeitsgängen gewonnen. Eine Verwendung von toxischen Eluiermitteln ist nicht erforderlich.

Es war durchaus nicht vorauszusehen, daß man thrombinartige Enzyme durch Bindung an insolubilisiertes Heparin aus Schlangengiften isolieren könnte. Es war zwar bekannt (siehe I. Danishefsky et aL, Thrombosis Research 8,134 [1976]), Thrombin durch Affinitätschromatographie an durch Bindung an Sepharose unlöslich gemachtem Heparin zu reinigen. Bei dieser Methode wird davon Gebrauch gemacht, daß Heparin

Thrombin hemmt, d. h. gegenüber Thrombin eine hohe Affinitäi bzw. Bindungsfähigkeit aufweist. Die F.ntdekkung der Tatsache, daß auch thrombinartige pro'.eolytische Schlangengiftenzyme, welche als solche durch Heparin nicht gehemmt werden, d. h. gegenüber gelöstem Heparin keine erkennbare Affinität bzw. Bindungsfähigkeit aufweisen, oder anders ausgedrückt, von gelöstem Heparin nicht gebunden werden, durch insolubilisiertes Heparin gebunden und somit durch Affinitälschromatographie an insolubilisiertem Heparin isoliert und gereinigt werden können, war sehr überraschend und nicht voraussehbar.

Die meisten Serinproteasen, wie z. B. Trypsin, Plasmin, Thrombin, Gerinnungsfaktor Xa, Kallikrein sowie verschiedene Sehlangengifiproteasen katalysieren bevorzugt die hydrolytische Spaltung von Peptidbindungen auf der Carboxylseite von Arginin oder

aktiven Zentrum aller Serinproleasen und Arginin, was sich darin , aßert, daß Arginin eine gewisse Konkurrenzhemmung (kompetitive Hemmung auf Serinproteasen ausübt und daß Argininamide oder Argininester durch Serinproteasen gespalten werden können (siehe HoIIcman und Weiss, ). Biol. Chem. 251, 1663 bis 1669, 1976). Derivate des Arginins und analoge Verbindungen wie z. B. Benzamidine üben eine wesentlich stärkere Hemm wirkung auf Serinproteason aus (siehe Markwardt, Folia Haemotal. 101 293 bis 312, 1976) als Arginin.

An einen unlöslichen Träger gebundenes Arginin, Argininderivatc wie z. B. Agmalin (Nolan et al. in: Methods in Enzymology, L I.orand ed. p.. 205 bis 213. 1976) oder Argininanaloge wie z. B. p-Aminoben/amidin (Schleunig und Fritz, Sperm Acrosin in: Methods in Enzymology, p. 330 bis 342, 1976) werden daher zur Affinitätschromatographie von Serinproleasen verwendet.

Von den zahlreichen in Schlangengiften vorkommenden Proteasen sind viele der Gruppe der Serinproteasen zuzuordnen, sie üben über verschiedene Mechanismen eine beschleunigende oder hemmende Wirkung auf die Blutgerinnung aus und nehmen über eine Freisetzung von Bradykinin, durch Abbau von Collagen und Elastin etc. an der Tötung und Verdauung der Beutetiere teil (siehe Denson et al.. Characterization of the Coagulant Activity of Some Snake Venoms, Toxicon 10,557 bis 562 [1972], und Sato et al. Studies on Snake Venoms, |. Biochem.57,380.165).

Die DE-OS 24 28 955 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von gerinnungsaktiven Schlangengiftenzymen über eine unspezifische und unselektive Anreicherung von Serinproteasen an Arginin-Agarose. Demgegenüber zeigt die Erfindung ein Verfahren, welches thrombinartige Schlangengiftproteasen aufgrund ihrer Affinität gegenüber dem sehr spezifischen Thrombininhibitor Heparin in einem affinitätschromatographischen Prozeß sehr selektiv reinigt. Da gelöstes Heparin thrombinartige Schlangengiftenzyme nicht heiTimt, ist die Bindung dieser Enzyme an insolubilisiertes Heparin überraschend und muß dadurch erklärt werden, daß zwischen Heparin und anderen Molekülregionen als dem allen Serinproteasen gemeinen aktiven Zentrum eine Affinität besteht.

Beispiel 1

9 g Heparin-Natrium mit einer spezifischen biologischen Aktivität von 162 internationalen Einheiten er mg wurden in 1 Liter 0,1-molarem Natriumbicarbonatpurfer, der 0,5 Mol/Liter Natriumchlorid enthielt und ein pH von 8,3 aufwies, gelöst. Der Lösung wurden 45 g CNBr-Sepharose 4F.· (AB Pharmacia, Uppsala, Schweden), welche zuvor in 0,00t N Salzsäure gequollen und > gewaschen worden war, zugesetzt. Die Mischung wurde während 2 Stunden gerührt. Nacli beendeter Reaktion wurde die Mischung durch eine Galsfilternutsche G-3 filtriert und das abfiltrierte Sepharose-Heparin fünfmal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer der oben

in angegebenen Zusammensetzung gewaschen. Zur Absättigung von allfällig noch vorhandenen reaktionsfähigen CNBr-Gruppen wurde das Sepharose-Heparin während 2 Stunden mit 1 Liier 0,5°/oigem Äthanolamin im Natriumbicarbonatpuffer der obigen Zusammensetzung

π gerührt. Das Sepharose-Heparin wurde wiederum auf einer Glasfilternutsche gesammelt und noch dreimal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer gewaschen. Nun

Würde uu.S ScpnaTOSC-1 icptinn Su itingO iViii 0,i-i'i'iuiiil ein

Natriumacetatpuffer von pH 4,0 nachgewaschen, bis das

-'ο pH des Filtrats 4,0 betrug. Schließlich wurde das insolubilisierte Heparin mit mehreren Portionen 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8.5 gcvasehen, in eine Kolonne von 26 mm Durchmesser eingefüllt und mit demselben Glycin/NaOH-Puffer

_') äquilibriert. Die Kolonne, die eine Höhe von 29cm aufwies und somit etwa 153 ml insolubilisiertes Heparin enthielt, wurde nun zur absteigenden Chromatographie eingerichtet. Der Säulcnauslauf wurde über ein auf die Messung bei 280 nm eingestelltes, mit einem automati-

in sehen Schreiber ausgerüstetes Durchflußphotomeier an einen Fraktionensammler, der zur Sammlung von Fraktionen von je 350 Tropfen eingestellt war.

angeschlossen.

30 g Bothrops-atrox-Gift (Bolhrops moojcni nach

r. Hoge) wurden in 600 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mittels 1 N HCI auf 3,0 und nach einer Stunde Inkubationszeit mil I N NaOH auf 7,3 eingestellt. Das dabei entstandene flockige Produkt wurde durch Zentrifugation abgetrennt und

w verworfen. Dem Überstand wurde eine Lösung von 15 g Natriumsalicylat in 300 ml destilliertem Wasser zugesetzt. Das pH der Lösung wurde mit 1 N HCI auf 3,0 gestellt. Nach 60 Minuten wurde der gebildete Niederschlag abzentrifugiert, in 200 ml 0,1-molarem

-r, Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 aufgenommen und auf einem Ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) so lange mit demselben Puffer gewaschen, bis eine Filtratprobe nach Zusatz von Eisen(III)-chlorid keine violette Färbung mehr gab und daher frei von

ίο Salicylsäure war. Das auf dem Filter überstehende Konzentrat von etwa 30 ml wurde mit 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 auf ein Volumen von 50 ml eingestellt. Es enthielt dann 2240 Betraoxobin-Einheiten (BU) per ml and wurde auf die vorbereitete Sepharose-Heparin-Säule gegeben. Durch Spülung mit 75OmI 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer I) wurden Ballaststoffe eluiert. Hierauf wurde die Kolonne mit 0,1 Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5

bo (Puffer II) eluiert, bis 1120 ml Flüssigkeit durchgeflossen waren, wobei erneut Ballaststoffe eluiert wurden. Nun wurde das thrombinartige Enzym in Form von zwei UV-absorbierenden und Fibrinogenkoagulierenden Zonen durch Eluierung mit 0,25 Mol/Liter Natriumchlorid

b5 enthaltendem 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer III) bis zu einem Durchflußvolumen von 900 ml aufgefangen. Schließlich wurden noch an dem Sepharose-Heparin gebunden gebliebene Substanzen

durch Eluierung mit 600 ml 1 Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer IV) entfernt. Der Chromatographieverlauf isi in der Figur der Zeichnung schematisch dargestellt.

Die Figur ist e'nie graphische Darstellung, in welcher einerseits die UV-Absorption (Abs) bei 280 Nanometer und andererseits die mit Eluatproben in Verdünnung ! : 10 erzielten Fibrinogengerinnungszeiten (Gz) in Sekunden als Funktionen der aufgefangenen Flössigkeitsvolumina in ml aufgetragen sind. Die Absorption ist durch die ausgezogene Kurve dargestellt, während die Gerinnungsaktivität durch das gestrichelte Profil dargestellt ist. Die gerafite Aufzeichnung der Flüssig-Keitsvolumina ist durch die gestrichelten Unterbrüche in der Absorptionskurve angedeutet. Das thrombinartige Enzym (Batroxobin) war in 800 ml Eluat in einer Konzentration von 100 Baroxobin-Einheiten per ml enthalten. Die Ausbeute, bezogen auf die aufgetragenen 112 000 BU, betrug somit 71,4%. Das Eluat wurde auf einem Ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) auf 80 ml eiwgeengt und dieme als Batroxobinkonzentrat für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats mit einem Batroxobingehalt von 22 Batroxobin-Einheiten per ml zur therapeutischen Defibrinogenierung.

Beispiel 2

0.1 g Gift der Schlangenart Agkistrodon contortrix wurde in 13 ml wäßrigem 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer mit pH 6,0 gelöst. Die Lösung wurde auf eine Säule (17 χ 70 mm; 16 ml) von Heparin-Sepharose gegeben. Die Säule wurde mit demselben Puffer so lange nachgewaschen, bis die abfließende Waschflüssigkeit bei 280 nm keine Lichtabsorption mehr aufwies. Nun wurde die Säule mit 0.Ί-molarem Glycinpuffer mit pH 6,0, der 0,75 MoI NaCI pro Liter enthielt, gespült, bis kein UV-absorbierendes Material mehr aus der Säule ausgewaschen wurde. Dieses Ballastmaterial enthaltende Eluat wurde verworfen. Nun wurde durch Eluierung mit 0,1-molarem Glycinpuffer mit pH 6,0, der 1,0 Mol NaCI pro Liter enthielt, das thrombinartige Enzym isoliert. Es wurden 22 ml Eluat mit Gerinnungsaktivität an Fibrinogen erhalten. Gemessen am synthetischen chromogenen Substrat Benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-Nitroamilid betrug die Aktivität insgesamt 6996 mE (Millieinheiien). Der totale Proteingehalt des aktiven Eluats betrug 6,2 mg. Das auf diese Weise gereinigte ϊ thrombinartige Enzym aus Agkistrodon-contortrix-Gift zeigte eine einzige Zone bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat, und es erwies sich, getestet auf der nichterhitzten Fibrinplatte (P. Brakman und T. Astrup in: Thrombosis

ίο and Bleeding Disorders, verlegt von N. U. Bang, F. K. Beller, E. Deutsch und E Mammen, Thieme und Academic Press, Stuttgart, New York, London, 1971, Seite 332) als frei von fibrinolytischer Aktivität Das Eluat wurde auf einem Ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon, Oosterhout, Holland) auf 1 bis 2 ml eingeengt Das Konzentrat wurde mit 150 mg Lactose versetzt, mit destilliertem Wasser auf 30 ml verdünnt, in Fläschchen von je 1,0 ml abgefüllt und lyophilisiert. Es wurden so 30 Fläschchen mit je 20OmE Enzym in stabiler, sofort löslicher Form erhalten, in dieser Form eignet sich das Präparat zur Untersuchung der Flbrinogen-Fibrin-Umwandlung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

,. Beispiel 3

0,1 g Gift der Schlangengattung Agkistrodon rhodostoma (10 500 Ancrod-Einheiten) wurde in UmI wäßrigem 0.01-molarem Glycinpuffer mit pH 6,0 gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit demselben Puffer

jo äquilibrierte Säule (17 χ 70 mm: 16 mg) von Heparin-Sepharose gegeben. Die Säule wurde so lange mit demselben Puffer nachgewaschen, bis mittels Durchflußphotometer im Eluat kein UV-absorbierendes Materials mehr nachweisbar war. Nun wurde die Säule

j-, mit 0,01-molarem Glycinpuffer mit pH 6.0, der 0,1 Mol NaCI pro Liter enthielt, gewaschen, um Ballastmaterial zu entfernen. Schließlich wurde das thrombinartige Enzym (Ancrod) mit 0,01-molarem Glycinpuffer mit pH 6.0. der 0.25 Mol NaCI pro Liter enthielt, eluiert Es wurden 120 ml einer Lösung mit 27 Ancrod-Einheiten per ml erhalten. Dieses Produkt zeigte eine einzige Zone bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus Schlangengiften bzw. Schlangengiftfraktionen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Schlangengift bzw. die Schlangengiftfraktion in einem wäßrigen Medium mit an einem in Wasser unlöslichen Träger gebundenem insolubilisiertem Heparin in Berührung bringt, um das thrombinartige Enzym an das insolubilisierte Heparin zu binden, die unerwünschten Begleitstoffe des Schlangengiftes entfernt und das thrombinartige Enzym mit einem wäßrigen Medium vom insolubilisierten Heparin abspaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wäßrige Medium Wassc; ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wäßrige Medium eine 0,01- bis 0,5molare Pufferlösung ist, die ein pH von 4 bis 10 aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wäßrige Medium eine wäßrige 0,01- bis 0,5molare Elektrolytlösung ohne oder höchstens mit schwacher Pufferwirkung ist, die ein pH von 4 bis 10 aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Eiektrol} sfösung eine wäßrige Natriumchloridlösung ist.

6. Verfahren nach Ansprucl. 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wäßrige Medium eine sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltende wäßrige Lösung ist, die eine Gesamtkonzentration von 0,01 bis 0,5 Mol/Liter und ein pH von 4 bis 10 aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als insoiubilisiertes Heparin ein durch Bindung von Heparin über seine Aminogruppen an die reaktiven Gruppen einer polymeren wasserunlöslichen Trägersubstanz, z. B. Agarose, Putrescinagarose, Epsilonaminocaproylagarose oder Cyanogenbromidagarose, erhaltenes Produkt verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin eine wäßrige Pufferlösung verwendet, welche eine molare Konzentration, die größer ist als diejenige der zum Binden des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendeten Lösung ist und zwischen 0,1 und I Mol pro Liter liegt und welche ein pH von 4 bis 10 aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch I und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Pufferlösung 0,1 bis 1 Mol pro Liter eines Neutralsalzes, z. B. Natriumchlorid, enthält und eine Gesamtkonzentration von 0,1 bis 2 Mol pro Liter aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin bei einer Temperatur durchführt, die über der Temperatur liegt, bei welcher das Enzym an das insolubilisierte Heparin gebunden wird.

11. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekenn-

zeichnet, daß man die Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin mittels der gleichen Pufferlösung oder Puffer-Neutralsalz-Lösung, wie sie zum Binden des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendet wird, jedoch bei einem pH durchführt, das unter oder über dem pH liegt, bei welchem das Enzym an das insolubilisierte Heparin gebunden wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es chargenmäßig durchgeführt wird, indem man das Schlangengift bzw. die Schlangengiftfraktion in dem zur Bindung des Enzyms an das Heparin bestimmten wäßrigen Medium mit dem insolubilisierten Heparin rührt, das erhaltene Reaktionsprodukt abfiltriert und mit dem zur Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin bestimmten wäßrigen Medium rührt, um das Enzym in Freiheit zu setzen.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Chromatographie durchgeführt wird, indem man eine Lösung des Schlangengiftes bzw. der Schlangengiftfraktion in dem zur Bindung des Enzyms an das Heparin bestimmten wäßrigen Medium auf eine aus dem insolubilisierten Heparin bestehende Säule gibt, die unerwünschten Begleitstoffe des Schlangengiftes aus der Säule herauswäscht und die Säule mit dem zur Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten' Heparin bestimmten wäßrigen Medium wäscht, um das Enzym von dem insolubilisierten Heparin abzuspalten und aus der Säule herauszuwaschen.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung der genannten unerwünschten Begleitstoffe durch Eluierung derselben einerseits mit dem für die Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendeten wäßrigen Medium und andererseits mit einer Puffer- und/oder Elektrolytlösung, dfren Konzentration größer als diejenige des zum Binden des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendeten wäßrigen Mediums, jedoch kleiner als diejenige des zur Abspaltung des Enzyms vom insolubilisierten Heparin verwendeten wäßrigen Mediums ist, durchgeführt wird.