DE2734821C3

DE2734821C3 - Blutgerinnungsfördernde Präparation und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2734821C3
Application number: DE2734821A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr. Elsinger
Original assignee: Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1976-08-30
Filing date: 1977-08-02
Publication date: 1985-03-14
Also published as: SE443511B; DK151932B; NO148142B; ES461918A1; DE2734821A1; FI772408A; FI57421B; DE2734821B2; NL170922C; HU180816B; GB1554051A; ATA640576A; NO772978L; DK151932C; SE7707992L; FI57421C; CA1079191A; NL170922B; DK384577A; BE858031A

Description

Die Erfindung betrifft eine blutgerinnungsfördernde Präparation hergestellt aus menschlichem Zitratplasma, enthaltend einen gegen Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor wirksamen Faktor.

Diese Substanz beeinflußt in neuartiger Weise die Blutgerinnung und bewirkt eine Umgehur. > der Faktor VHI-Wirkung, was bedeutet, daß die Blutgerinnung ohne Faktor VHI-Zufuhr normalisiert wird.

Die Hämophilie A ist eine seit langem bekannten Krankheit (Bluterkrankheit), bei der der Blutgerinnungsablauf durch das Fehlen der Aktivität eines Blutgerinnungsfaktors gestört ist Dieser Faktor wird als Antihämophiler Faktor (AHF) oder Faktor VIII bezeichnet Eine Heilung dieser angeborenen, durch defekte Gene bedingten Krankheit als solche ist nicht möglich. Die Behandlung kann — im Falle einer Blutung

— nur durch intravenöse Zufuhr entsprechender Mengen an Faktor VIII, welcher aus dem Blut gesunder Spender stammt erfolgen. Während man früher auf Vollblut bzw. Vollplasma angewiesen war, von denen große Mengen appliziert werden mußten, gibt es heute Präparate, die den Faktor VIII in konzentrierter und auch stabiler, gefriergetrockneter Form enthalten. Die Behandlung mit diesen Präparaten führt in den meisten Fällen zu einer raschen Blutstillung.

Es gibt jedoch auch Patienten, bei denen nicht nur ein Fehlen der Faktor VIII-Aktivität vorliegt, sondern die auch einen gegen Faktor VIII gerichteten Hemmstoff (Inhibitor) besitzen, der — je nach vorhandener Menge

— die Wirkung von zugeführtem Faktor VIII durch Neutralisation (Inhibition) zunichte macht. Bei diesen Faktor VHI-Inhibitor-Patienten gab es bisher wenig Aussicht auf eine erfolgreiche Behandlung. Die einzige Möglichkeit bestand in der Entfernung des Inhibitors vor der Behandlung mit Faktor VIII-Konzentraten, was nur durch Austausch des Patientenplasmas gegen das Plasma eines gesunden Spenders oder gegen Plasmaersatzmittel möglich ist; dies erfordert einen großen technischen und medizinischen Aufwand. Der Plasmanjstausch muß vor neuerlicher Behandlung wiederholt werden, da der Inhibitor — speziell nach Zufuhr von neuem Faktor VIII als Antigen durch »Boostereffekt« — sich wieder nachbildet. Eine Behandlung der

Inhibitorpatienten mit sogenannten »Immunsuppressi-

va« zur Unterdrückung der in vivo-Synthese des

Inhibitors ist bisher meistens erfolglos verlaufen. Seit kurzem zeichnet sich eine neue Möglichkeit zur

Behandlung von Faktor VHI-Inhibitor-Patienten ab. Kurcynski und Penner, New Engl, I Med„ Bd, 291, Seiten 164 bis 167, 1974, berichteten als erste über eine erfolgreiche Behandlung von Faktor VHI-Inhibitor-Patienten mit sogenannten »aktivierten« Prothrombinkomplex-Konzentraten. Auch in Publikationen von Sultan, Brouet und Debre, New Engl. J. Med, Bd. 291, Seite 1087, 1974, und Abildgaard, Britton und Roberts, Blood, Bd. 44, Seite 933, 1974, wird über klinisch

erfolgreiche Anwendungen von aktivierten Prothrombinkomplex-Präparaten bei blutenden Faktor Vlll-Inhibitor-Patienten berichtet

Die sogenannte Aktivierung dieser Prothrombinkompiex-Konzentrate ist wahrscheinlich auf unbekannte Verunreinigungen zurückzuführen. Die Präparate konnten bezüglich ihres wirksamen Prinzips nickt getestet und nicht standardisiert werden. Die Ergebnisse sind daher unsicher und kaum wiederholbar.

Die Erfindung bezweckt die Überwindung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, eine Präparation zu schaffen, die in wiederholbarer und gezielter Weise eine Generierung der gewünschten Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität gewährleistet. Die Faktor Vlll-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität bzw. mit anderen Worten die Wirksamkeit gegen Hämophilie A mit Inhibitor soll mit Hilfe eines geeigneten Testsystems meßbar und standardisierbar sein. Die Präparation soll klinisch wirksam und verträglich sein, d. h. bei blutenden Faktor VIH-Inhibitor-Patienten zu einer Blutstillung führen und keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine blutgerinnungsfördernde Präparation, hergestellt aus menschlichem Zitratplasma, enthaltend einen gegen Hämophilie A mit Faktor VHl-lnhibitor wirksamen Faktor mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000, erhältlich durch Behandeln des Zitrationen enthaltenden Blutplasmas in Abwesenheit von freien Calciumionen mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsoberflächen-aktiven Stoffen, wie Kieselgel, Kaolin oder Diatomeenerde, un!ii Einhaltung eines pH-Bereiches von 5,5 bis 8,5 und einer Temperatur von 0 bis 30⁰C, anschließendes Abscheiden der wasserunlöslichen Stoffe und Behandeln des Überstanöes irit schwachbasischen Ionenaustauschern, worauf der zusammen mit den Faktoren II, VlI, IX und X an den Ionenaustauschern adsorbierte blutgerrinnungsfördernde Faktor eluiert und zu lyophilisierten Präparaten verarbeitet wird, — gelöst

Die neue Substanz mit Faktor VHI-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität ist ein Protein mit einem höheren Molekulargewicht als jenes der nicht aktivierten Faktoren II, VII, IX und X (Prothrombinkomplex), die ein Molekulargewicht von etwa 70 000 aufweisen, und ist daher von diesen strukturell verschieden.

Weitere Merkmale der erfindungsgemäßen blutgerinnungsfördernden Präparation sowie des Verfahrens zu ihrer Herstellung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Es ist zwar aus der DE-OS 24 59 291 bereits bekannt, eine Lösung des Prothrombinkomplexes, der die Faktoren II, VII, IX und X umfaßt, mit kolloidaler Kieselsäure zu behandeln. Diese bekannte Behandlung erfolgt jedoch am Ende des Fraktionierungsprozesses lediglich zu Reinigungszwecken und zur Entfernung von Lipiden und unstabilen Proteinverunreinigungen aus dem Endprodukt. Eine Generierung des neuen Faktors mit Wirksamkeit gegen Hämophilie A mit Faktor VlH-Inhibitor kann in dieser Phase wie beim Arbeiten nach der DE-OS 24 59 291, nicht mehr erfolgen. Man muß vielmehr als Ausgangsmaterial für die Herstellung der neuen Präparation menschliches Zitratplasma verwenden, welches alle Gerinnungsfaktoren in nativer Form enthält.

Bezüglich des Standes der Technik ist noch anzumerken, daß die Maßnahmen der Adsorption an Ionenaustauschern und Eluierung bei der Aufarbeitung eines Prothrombinkomplexes an sich bekannt sind, vgL z. B. DE-OS 22 62 520 und DD-PS1 21 793.

Zur Verarbeitung im erfindungsgemäßen Verfahren

können außer Vollplasma auch Plasmafraktionen verwendet werden, die nach Abtrennen des Faktors VIII (AHF) anfallen, z.B. ein Plasmaüberstand von Kryopräzipitat oder von Präzipitat I nach Cohn.

Zweckmäßig werden bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die wasserunlöslichen anorganischen gerinnungs-physiologisch-oberflächenaictiven Stoffe in einer Menge von 0,05 bis 5%, vorzugsweise 0,1 bis 1%, bezogen auf die Menge des Plasmas, verwendet
Zur Generierung des neuen Faktors mit Aktivität ge-

• 5 ger: Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor können Stof Ja eingesetzt werden, die zum Großteil aus feinteiligem Siliciumdioxid bestehen, z. B. Stoffe aus der Gruppe der Diatonieenerden, wie Celit oder Stoffe, die aus Siliciumdioxid und Aluminiumoxid zusammengeletzt sind, z. B. Kaolin. Allgemein sind Stoffe geeignet, die als »oberflächenaktiv im Gerinnungssystem« bekannt sind bzw. die durch ihre Oberflächenaktivität in der Lage sind, die Kontaktphase der Blutgerinnung einzuleiten. Während die durch diese Stoffe oberflächenaktivierbaren Gerinnungsfaktoren (Faktoren XI und XII) in ihrer aktivierten Form in dieser Stufe adsorbiert werden, bleiben die Faktoren H, VIl, IX, X zusammen mit dem generierten blutgerinnunjjsfördernden Faktor im Überstand und können nach Abtrennung der oberflächenaktiven, wasserunlöslichen Stoffe unter Anwendung bekannter Methoden abgetrennt bzw. angereichert werden. Für letzteren Schritt können z. B. schwach basische Ionenaustauscher verwendet werden; Diäthylamincäthyl (DEAE)-Gruppen-haltige, hochmolekulare Stoffe, z. B. DEAE gebunden an Cellulose oder quervernetzte Dextrane, haben sich besonders bewährt. Durch Adsorption an die erwähnten Ionenaustauscher, Waschen und Eluieren der adsorbierten Plasmaproteine mit erhöhter Ionenstärke kann die Proteinfraktion, welche die Faktor VIII-Inhibitor-ÜberhOckungs-Aktivität nun in gereinigter und angereicherter Form enthält isoliert werden. Nach Entfernung der Salze durch Dialyse und anschließende Gefriertrocknung erhält man die rohe, die Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität enthaltende Fraktion in trockener, stabiler Form. Aus dieser entsteht das fertige Präparat durch Wiederauflösung in Wasser, Zusatz von Salzen, pH-Einstellung, Sterilfiltration und neuerliche Gefriertrocknung.

Untersuchungen über die Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Präparatinnen brachten den Beweis, daß für die Faktor Vlll-lnhibitor-Überbrükkungi-Aktivität die Faktoren Ua (Thrombin) und Xa nichts beitragen. Thrombin in Spuren, wie es in der erfindungsgemäß hergestellten Präparation enthalten sein kann, ergibt keine Verkürzung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit von Faktor VI11-Inhibitorplasma. Auch Sojabohnen-Trypsininhibitor — ein bekannter Inhibitor von Faktor Xa-Aktivität — hemmt die Faktor VIII-Inhibitor-Überbriickungs-Aktivität der Präparation nicht. Aufgrund von gelchromatographischen Untersuchungen hat sich ergeben, daß die neue Substanz ein höheres Molekulargewicht aufweist als die bekannten Faktoren des Prothrombinkomplexes II, VII, IX und X. Da ferner die aktivierten Faktoren des Prothrombinkomplexes durch enzymatische Abspaltung eines Bruchstückes des entsprechenden nativen (nicht aktivierten) Gerinnungsfaktors entstehen, somit

kleinere Moleküle entstehen als die Moleküle der entsprechenden nicht aktivierten Faktoren, ist mit Sicherheit anzunehmen, daß die Faktor VW-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität in den erfindungsgemäß hergestellten Präparationen, nicht durch einen aktivierten Faktor des Prothrombinkomplexes bewirkt wird, sondern eben durch die neu generierte Substanz mit höherem Molekulargewicht

Zur Kennzeichnung der neuen Substanz kann einerseits das Verhältnis der Aktivitätea der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X zur Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität herangezogen werden: Dieses Verhältnis, ausgedrückt in Einheiten, liegt zwischen 0,1 und 10, vorzugsweise zwischen 0,5 und 2, wobei eine Einheit Faktor II, VII, IX₁ X der Aktivität dieser Faktoren entspricht, die durchschnittlich in 1 ml frischem menschlichein Zitratplasma enthalten ist, und eine Einheit der Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität als jene Aktivität definiert ist, welche die aktivierte partielle Thromboplastinzeit eines hochtitrigen Faktor Vlll-Inhibitorplasmas auf die Hälfte des Leerwertes verkürzt Andererseits kann zur Kennzeichnung der neuen Substanz auch ihre amidolytische Aktivität herangezogen werden. Unter amidolytischer Aktivität versteht man die Fähigkeit einer Substanz, in standardisierten Peptidverbindungen, die über eine Amidbindung mit dem Chromophor p-Nitroanilin verbunden sind, das p-Nitroanilin abzuspalten, welches photometrisch bestimmt wird. Solche standardisierten Peptidpräparate werden z. B. von der F^;rma KABI in Schweden hergestellt; so sind das Peptid

S-2160N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyI-L-arginin-p-nitroanilid · HCl (Kurzform: Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid · HCl) für Thrombin spezifisch,

S-2222N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilid ■ HCI (Kurzform: Bz-Ile-Glu-Gly-Argp-nitroanilid ■ HCl) für

Xa und S-2251 D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-

p-nitroaniiid · 2 HCl (Kurzform: D-Val-Leu-Lysp-nitroanilid · 2 HCl) für Plasmin. Testet man die erfindungsgemäß hergestellte Präparation gegenüber den genannten Substraten, so findet man eine vernachlässigbar geringe amidolytische Aktivität. Andererseits würde ein Test eines Präparates mit einem Gehalt von Thrombin und/od« Faktor Xa, wenn man diese auf die gleiche Faktor VIH-Inhibitor-Überbrükkungs-Aktivität einstellt, die die erfindungsgemäß hergestellte Präparation zeigt, eine hohe amidolytische Aktivität zeigen.

Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Präparation ist auch darin zu sehen, daß sie, wenn überhaupt, nur eine geringe Thrombinaktivität besitzt. Das Verhältnis der Thrombinaktivität zur Faktor VIH-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität übersteigt 0,02 nicht, wobei die Thrombin-Aktivität in NIH-Einheiten (NIH-US-National Institute of Health) und die Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität in Einheiten dieser Aktivität ausgedrückt ist

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Eigenschaften der danach hergestellten Präparationen sind in den folgenden Beispielen und Testergebnissen näher erläutert:

Beispiel 1

Frisch gefrorenes Plasma wird bei 0° bis +4'C aufgetaut und das dabei anfallende Kryopräzipitat

65 durch Zentrifugieren abgetrennt Der Kryoüberstand wird mit 0,5 η Salzsaure auf pH 7,0 gestellt, mit 5 g Kaolin pro 1 Liter Kryoüberstand versetzt und bei +4⁰C 1 Stunde gerührt Hierauf wird Kaolin durch Zentrifugieren abgetrennt Die generierte Substanz mit Faktor VIII-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität wird nun — zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes — an DEAE-Sephadex adsorbiert

Zu diesem Zweck werden Op g DEAE-Sephadex A-50 pro 11 Kaolinüberstand zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4⁰C gerührt Die DEAE-Sephadex wird abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin verwendet werden; DEAE-Sephadex wird einem zweifachen Waschprozeß mit einer Trinatriumcitrat-Natriumchlorid-Lösung unterworfen, wobei ein pH-Wert von 7,5 eingehalten wird.

Zur Elution wird das DEAE-Sephadex mit 3% Natriumchlorid, 0,1% Trinatriumcitrat2 H₂O (2% des ursprünglichen Plasmavolumens) 20 Minuten gerührt und durch Filtration das Eluat ?Twonnen. Dieses wird über Nacht gegen 0,05% Trinairiuir.citrat2 H₂O 0,!% Natriumchlorid-Lösung bei pH 7,0 bei +4"C dialysiert, hierauf eingefroren und einem ersten Lyophilisationsvorgang unterworfen (bulk). Im bulk-Material wird die Faktor VHI-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität sowie die Aktivität der Faktoren des Prothrombinkomplexes bestimmt

Für die Herstellung der pharmazeutisch anwendbaren Präparation mit Faktor Vill-Inhibitor-Überbrükkungs-Aktivität soll das Verhältnis Einheiten Faktor II-VII-IX-X zu Einheiten dieser Aktivität zwischen 0,5 und 2 liegen; dies kann durch Mischung geeigneter bulk-Chargen erfolgen. Das bulk-Material wird mit destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst so daß die Faktor VIII-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität zwischen 10 und 50 Einheiten pro ml beträgt (vorliegendenfalls 25 Einheiten pro ml). Nach Zusatz der nötigen Salze zur Herstellung der Isotonie und Einstellung des pH zwischen 7,0 und 7,5 wird die Lösung durch Membranfilter geklärt und zuletzt durch ein 0,2 μπι Membranfilter sterilfiltriert. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen zu 20 ml in die Endbehälter verfüllt, tiefgefroren und Iyophilisiert.

Beispiel 2

Als Ausgangsmaterial dient wieder frisch gefrorenes Plasma bzw. der daraus resultierende Kryoüberstand. Dem Kryoüberstand werden ohne pH-Stellung (nativer pH = 7,8) 10 g Celit 512 pro 1 Liter Kryoüberstand zugesetzt und 3 Stunden bei +4° C gerührt. Nach Abtrennung des Celits durch Zentrifugation wird die Aufarbeitung der Präparation mit ier generierten Substanz mit Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückurigs-Aktivität in gleicher Weise vorgenommen wie in Beispiel 1.

An den fertigen Präparationen wurden neben den üblichen Sich-rheitstests auf Sterilität, Unschädlichkeit Pyrogenfreiheit, Abwesenheit von HBj-Antigen Tests auf Wirksamkeit (Faktor Vln-lnhibitor-Öberbrükkungs-Aktivität), Gehalt an Prothrombinkomplex-Faktoren, Thrombingehalt sowie die amidolytische Aktivität mit den drei Substraten S-2160, S-2222 und S-2251 durchgeführt.

Die vorgenommenen Tests wurden in nachfolgend beschriebener Weise durchgeführt:

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1. Wirksamkeitstest (Bestimmung der Einheiten
mit Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs· Aktivität)

a) Reagenzien:

Faktor Vlll-Inhibitorplasma:

Zitratplasma eines Patienten mit Haemophilie A mit einem Inhibitor gegen Faktor VIII (Inhibitortiter mindestens 10 Einheiten per ml), lyophilisiert. Während der Testperiode wird das Inhibitorplasma ins Eisbad gestellt ι ο

Phospholipid- Kaolin-Suspension:

Das Phospholipid-Konzentrat (Tachostyptan, Hormon Chemie München) wird 1 :200 im Owrens Puffer verdünnt und mit 0,5% Kaolin G/V (04 g pro 100 ml) versetzt Das Gemisch wird tiefgefroren gelagert Während der Testperiode wird es bei Raumtemperatur gehalten.

Zitrat-/Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel
für Proben:

0,7% Natriumchlorid/0,7% Natriumzitrat · 2 H₂O

m/20 Kalziumchlorid:

Während der Testperiode wird es bei 37⁰C gehalten.

b) Testmethode:

Nach Auflösung der zu untersuchenden Probe mit Faktor VIU Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität und eines Standardpräparates mit Faktor Vlll-lnhibitor-Überbrückungs-Aktivität mit definierten Einheiten dieser Aktivität pro ml in der angegebenen Menge destillierten Wassers, werden unter Ver-Wendung von Zitrat'/Kochsalzlosung 6 geometrische Verdünnungen hergestellt, wobei man mit 5 Einheiten mit Faktor VilMnhibhor überbrükkungs-Aktivität pro ml beginnt Diese Verdünnungen werden während der Testperiode in einem Eisbad gehalten. Die Reagenzien wurden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor Vlll-Inhibitorplasma

0,05 ml Probe (Verdünnungen der Testproben und des Standards, sowie auch Zitrat-/Koch-

salzlösung als Leerwert)
0,05 ml Phospholipid Kaolin Suspension
6 Minuten bei 37° C inkubieren
0,05 ml m/20 Kalziumchlorid

Die Zeit von der Kalziumchloridzugabe bis zur Gerinnselbiidung wird mit einer Stoppuhr gemessen (Kippen der Teströhrchen oder Anwendung eines automatischen Koagulometers).

c) Berechnung der Einheiten mit Faktor Vlll-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität pro Flasche:

Es wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten (in Sekunden) der Verdünnungen des Standard-Präparates mit Faktor Vlll-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität gegen die entsprechenden Konzentrationen (in Einheiten pro ml) auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt Die Faktor VTIMnhibitor-Oberbrückungs-Aktivitäten der Tesiprobcnverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve und durch Multiplikation mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor errechnet Der Mittelwert dieser Ergebnisse entspricht der Faktor VHI-Inhibitor-Überbrükkungs-Aktivität der Testprobe, ausgedrückt in Einheiten pro ml. Multipliziert man diesen Wert mit dem Lösungsvolumen (in ml), dann erhält man die Gesamtmenge der Einheiten pro Flasche.

2. Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren II, VII₁IX und X

A) Faktor !!-Bestimmung

a) Reagenzien:

Serum:

Blut eines gesunden Spenders (ohne Antikoagulans) wird 24 Stunden bei 37° C inkubiert Vom geronnenen Blut wird das Serum entfernt zentrifugiert in Portionen aufgeteilt und tiefgefroren aufbewahrt.

Rinderoxalatplasma mit Bariumsulfat absorbiert (als Quelle für Faktor V und als Verdünnungsmittel für Proben):

Neun Teile Rinderblut werden mit einem Teil l,34%igen Natriumoxalat vermischt Das sich ergebende Plasma wird mit 10% Bariumsulfat absorbiert Nach der Zentrifugierung wird das absorbierte Plasma in Portionen abgefüllt und tiefgekühlt aufbewahrt

»Thromborel« (kalziumhaltiges, menschliches Thromboplastin) Behringwerke AG, Marburg-Lahn.

b) Testmethode:

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Thromborel während des Testvorganges in einem Eisbad aufbewahrt), werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Serum

0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. eines »normalen Plasmas« oder eines Standards)

eine Minute bei 37°C inkubieren

Oi ml Thromborel (ist während des Testvorganges auf 37° C zu halten)

Die Zeit ab der Zugabe von Thromborel bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor II-Konzentration:

Aus gepoolten Plasmaproben von mindestens 15 gesunden Spendern wird ein Standardplasma hergestellt Dieses »Poolplasma« gilt als »normales Plasma« und seine Faktor II-Aktivität wird mit 100% angenommen. Nun wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten der Plasmareihenverdünnungen dieses gepoolten Plasmas (unverdünnt, 1:2, 1 :4, 1:8,...) gegen die entsprechenden Konzentrationen auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt Die Faktor II-Konzentrationen der Testprobenverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve in Prozent des normalen Plasmas ausgedrückt und mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert Der Durchschnittswert dieser Ergebnisse entspricht der Aktivität des Testmaterials in

Prozent des Faktors II. Die Menge des in einer Flasche vorhandenen Faktors II wird nach der folgenden Formel berechnet:

_. , . _ , ,, (% Faktor II-Konzentration) χ (Volumen in ml) Einheiten Faktor II = ——-—i .

Eine Einheit Faktor II ist äquivalent zu jener Faktor ΪΙ-Aktivität, die durchschnittlich in 1 ml frischem Zitratplasma vorhanden ist.

B) Faktor VII-Besiimmung

a) Reagenzien:

Faktor VII-Mangelplasma:

Zitratplasma eines Patienten mit schwerem Faktor VII-Mangel (Faktor VII unter 1%), in tiefgefrorenem Zustand gelagert oder nach Zugabe von 1% Gewicht/Voiumen HEPES iyophiiisicrt, iiiii einen! pH-Wert von 7,0.

Zitrierte Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel der Proben:

0,7% Trinatriumzitrat · 2 H₂O, 0,7% Natriumchlorid. »Thromborel« (kalziumhaltigcs humanes Thromboplastin) der Behring-Werke AG, Marburg/Lahn.

b) Testmethode:

Das Mangelplasma und die Verdünnungen der Probe werden im Eisbad aufbewahrt. »Thromborel« wird während der Untersuchung bei 37° C gelagert

Die Reagenzien werden auf folgende Wtise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor VII-Mangelplasma

0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe, bzw. eines »normalen Plasmas« oder eines Standards)

Eine Minute inkubieren bei 37° C

0,2 ml »Thromborel«

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40

Die Zeit von der »Thrombore!«-Zugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor VII-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor VII-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

C) Faktor IX-Bestimmung
a) Reagenzien:

Faktor IX-Mangelplasma:

Zitratplasma eines Patienten mit schwerer Hämophilie B (Faktor IX unter 1%), in tiefgefrorenem Zustand gelagert
Phospholipid/Kaolin-Suspension:
Phospholipid-Konzentrat (Tachostyptan, Hormon ω Chemie München) wird 1 :200 in Owren's Puffer verdünnt, mit Kaolin versetzt (0,5 g per 100 ml) und tiefgekühlt gelagert

Rinderoxalatplasma, mit Bariumsulfat absorbiert, als Verdünnungsmittel für Proben:

9 Teile Rinderblut werden mit einem Teil l,34%igem Natriumoxalat vermischt. Das sich ergebende Plasma wird mit 10% Bariumsulfat absorbiert. Nach dem Zentrifugieren wird das absorbierte Plasma in Portionen abgefüllt und tiefgefroren aufbewahrt
m/20 Kalziumchlorid

b) Testmethode:

Inkubation von Faktor IX-Mangelplasma mit Phospholipid/Kaolin-Suspension: Die erforderliche Menge von Mangelplasma wird

mit einem gleichen Volumen von Phospholipid/

Kaolin-Suspension vermischt, 5 Minuten bei 37° C

iiikübicri und dsnn 30 Minuten in einem Eisbad gelagert

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Kalziumchlorid während des Testvorganges in

einem Eisbad aufbewahrt), werden auf folgende

Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,20 ml inkubierte Mangelplasma-Phospholipid/ Kaolin-Suspension

0,10 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. eines »normalen Plasmas« oder eines Standards)

eine Minute bei 37°C inkubieren

0,10 ml m/20 Kalziumchlorid (ist während des Testvorganges bei 37⁰C zu halten)

Die Zeit ab der Zugabe von Kalziumchlorid bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor IX-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor lX-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

D) Faktor X-Bestimmung:

a) Reagenzien:

Faktor X-Mangelplasma: Zitratplasma von einem Patienten mit schwerem Faktor X-Mangel (Faktor X unter 1%) wird

tiefgekühlt gelagert oder nach Hinzufügung von 1% HEPES und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 lyophilisiert

Zitrat-Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für

Proben:

0,7% Natriumchlorid/0,7% Natriumzitrat · 2 H₂O »Thromborel« (kalziumhaltiges, menschliches

Thromboplastin), Behringwerke AG, Marburg/

Lahn.

b) Testverfahren:

0,05 ml Faktor X-Mangelplasma

0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. des »normalen Piasmas« oder eines Standards)

eine Minute bei 37⁰C inkubieren
0,20 ml Thromborel (ist während des Testvorganges auf 37° C zu halten).

c) Berechnung siner Faktor X-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor X-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

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3.Thrombintest

a) Reagenzien:

i%ige Fibrinogeniösung menschlichen Ursprungs standardisiertes Thrombin (Topostasin, Roche, 3000 NIH-Thrombin-Einheiten pro Flasche)
0,7% Natriumchlorid/0,7% Natriumzitrat · 2 H₂O als Verdünnungsmittel (Zitrat'/Kochsalzlosung).

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b) Testmethode:

Nach Auflösung des lyophilisierten Produktes in der angegebenen Menge destillierten Wassers werden sechs geometrische Verdünnungen unter Verwendung von Zitrat-/K.ochsalzlösung und acht geometrische Verdünnungen vom standardisierten Thrombin hergestellt, wobei man mit 1 NIH-Einheit per ml beginnt

Testverfahren: ^3>

0,20 ml 1 %ige Fibrinogeniösung und
0,20 ml Probe (Präparation mit Faktor Vlll-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität und Thrombinverdünnungen, sowie auch ein Leerwert mit ZitraWKochsalzlösung)

werden bei 37° C inkubiert Die Zeit bis zur Gerinnselbildung wirii durch Kippen der Teströhrchen in immer größer werdenden Zeitabständen, u.zw. von 10 Minuten bis zu einer Stunde, gemessen. Dieser Vorgang erstreckt sich auf mindestens 6 Stunden. Ein letztes Kippen der Röhrchen erfolgt nach der Inkubation über Nacht Der Leerwert (Verdünnungsmittel als Probe) muß über Nacht stabil bleiben (keine Gerinnselbildung).

c) Berechnung der Thrombin- Konzentration:

Es wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten der geometrischen Verdünnungen des Standardthrombins gegen die entsprechende Konzentration (Thrombineinheiten pro ml) auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt Die Thrombin-Konzentrationen der Testprobenverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve und durch Multplikation mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor errechnet Der Mittelwert dieser Ergebnisse entspricht der Thrombin-Aktivität der Testprobe, ausgedrückt in Thrombineinheiten pro mL Multipliziert man diesen Wert mit dem Lösungsvohimen in mL so erhält man die Gesamtmenge der Thrombin-Einheiten pro Flasche.

4. Bestimmung der amidolytischen Aktivität.

a) Reagenzien:

Chromogene Substrate:

S-2160: N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid ■ HCl
(Kurzform: Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid · HCI)
03 mg/ml H₂O = 0,73 m molar

S-2222: N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-

L-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilid · HCI
(Kurzform: Bz-Ile-Glu-Gly-Argp-nitroanilid · HCI)
1,4 mg/ml H₂O= 1,91 m molar

S 2251: D-Valyl-I-Ieucyl- L-iysyl-p-nitro-

anilid · 2 HCI (Kurzform: D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid · 2 HCl)
1,65 mg/ml H₂O = 2,99 m molar

Puffer:
6,06 g »Tris« (Tris(hydroxymethyl)-amino-

methan)=0,05 molar
10,60 g Natriumchlorid = 0,18 molar

Mit 1 Liter dest Wasser lösen. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Salzsäure auf 7,4 eingestellt.

b) Testverfahren:

1,0 ml Puffer

0,1 ml Testprobe (Präparation mit Faktor VIIi-In-

hibitor-Überbrückungs-Aktivität)
0,2 ml Substrat (S-2160 bzw. S-2222 bzw. S-2251)

Dieses Gemisch wird in eine auf 37° C temperierbare Küvette (Schichtdicke 1 cm) gefüllt und in

405

die

hme der

unahme

optischen Dichte in Zeitintervallen von 1 Minute gemessen.

c) Auswertung:

Aus mindestens 5 Einzelmessungen wird die durchschnittliche Zunahme der optischen Dichte pro Minute berechnet und mit 1000 multipliziert; dieser Wert wird mit Δ OD · W/min bezeichnet und dient zur Charakterisierung der amidolytischen Aktivität (Enzymaktivität) der untersuchten Probe zu Bezug auf das jeweils eingesetzte Substrat.
Dividiert man nun die gemessenen Δ OD ■ 10³/ min-Werte durch die Aktivität der Testprobe in Einheiten mit Faktor Vlll-Inhibitor-Oberbrükkungs-Aktivität pro 0,1 ml (eingesetzte Probenmenge) bzw. in Faktor II, VII, IX, X-Einheiten pro 0,1 mL so ergibt sich eine für die jeweilige Testprobe — unter den erwähnten Testbedingungen — charakteristische »spezifische amidolytische Aktivität«, d.h. der auf 1 Einheit mit Faktor VIII-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität bzw. 1 Einheit Faktor II, VII, IX, X bezogen Δ OD · 1(P/ min-Wert

Die nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Psüparationen zeigten bei den in der beschriebenen Weise durchgeführten Tests die in der Tabelle angegebenen Eigenschaften.

Beispiel 1 Beispiel 2 Abfull- bzw.Auflösungsvolumen

Einheiten mit Faktor Vlll-Inhibitor-ÜberbrückungS' Aktivität pro Flasche

Faktor II-Einheiten pro Flasche Faktor VII-Einheiten pro Flasche Faktor IX-Einheiten pro Flasche Faktor X-Einheiten pro Flasche

Thrombin NIH-Einheiten pro Flasche

Amidolytische Aktivitäten (AOD. lOVmin) S-2160
S-2222
S-2251

20 ml	20 ml
470	280
610 (1,30)	240 (0,86)
520(1,11)	260 (0,93)
700(1,49)	300 (1,07)
540(1,15)	210 (0,75)

1,4 (0,003)

1,0 (0,004)

1 (0,43)	1 (0,71)
3 (1,28)	2,5 (1,79)
4 (1.70)	2(1.43)

Die Zahi_-n in Klammern geben das jeweilige Verhältnis zu den Einheiten mit Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität an. Bei den amidolytischen Aktivitäten ist die Zahl in Klammer die »spezifische amidolytische Aktivität«, d.h. der jeweilige AOD. 10 /min-Wert pro eine im beschriebenen Testsystem eingesetzte Einheit mit Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität.

Claims

Patentansprüche:

1. Blutgerinnungsfördernde Präparation, hergestellt aus menschlichem Zitrat-Plasma, enthaltend einen gegen Hämophilie-A mit Faktor Vlll-Inhibitor wirksamen Faktor mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000, erhältlich durch Behandeln des Zitrat-Ionen enthaltenden Blutplasmas in Abwesenheit von freien Calciumionen mit wasserunlöslichen, anorganischen, gerinnungs-oberflächenaktiven Stoffen, wie Kieselgel, Kaolin oder Diatomeenerde, unter Einhaltung eines pH-Bereiches von 5,5 bis 8,5 und einer Temperatur von 0 bis 30⁰C, anschließendes Abscheiden der wasserunlöslichen Stoffe und Behandeln des Oberstandes mit schwachbasischen Ionenaustauschern, worauf der zusammen mit den Faktoren II, VII, IX und X an den Ionenaustauschern adsorbierte blutgerinnungsfördernde Faktor eluiert und zu lyophilisierten Präparaten verarbeitet wird.

2. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Blutplasma nach Abtrennung von Faktor VIII erhältlich ist

3. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren H₁ VII, IX und X zur Aktivität des blutgerinnungsfördernden, gegen Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor wirksamen Faktors, ausgedrückt in Einheiten, zwischen 0,1 und 10 liegt, wobei eine Einheit Faktor II, VII, IX und X der Aktivität dieser Faktoren entspricht, die durchschnittlich in 1 ml frischem menschlichem Zitratplasma enthalten ist, und eine Einheit des blutgerinnungsfördernden Faktors als jene Aktivität des Faktors, welche die aktivierte partielle Thromboplastinzeit eines hochtitrigen Faktor VHI-Inhibitorplasmas auf die Hälfte des Leerwertes verkürzt, definiert ist

4. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische amidolytische Aktivität bezüglich der Substrate

N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-

p-nitroanilid · HC!,
N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glycyl-

L-arginyl-p-nitroanilid · HCl,
D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroani-

lid · 2 HCl,

d. h. die Δ OD · 10Vmin-Werte pro Einheit des blutgerinnungsfördernden, gegen Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor wirksamen Faktors nicht größer als 4 sind und die Δ OD · lOVmin-Werte pro 1 Einheit Faktor II, VIl, IX und X nicht größer als 3 sind.

5. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Thrombinaktivität zu der Aktivität des blutgerinnungsfördernden, gegen Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor wirksamen Faktors 0,02 nicht übersteigt, wobei die Thrombinaktivität in NIH-Einheiten und die Aktivität des blutgerinnungsfördernden Faktors in Einheiten dieses Faktors ausgedrückt ist.

6. Verfahren zur Herstellung der blutgerinnungsfördernden Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches, Zitrat-Ionen enthaltendes Plasma in Abwesenheit von freien Calciumionen, gegebenenfalls nach Abtrennung von Faktor VIII, mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffen behandelt, anschließend die wasserunlöslichen Stoffe abscheidet und schließlich den Oberstand mit basischen Ionenaustauschern behandelt, wobei der zusammen mit den Faktoren Ii, VII, IX und X an den Ionenaustauschern adsorbierte blutgerinnungsfördernde Faktor mit der den Faktor Vlll-Inhibitor fiberbrückenden Aktivität eluiert und konzentriert wird.