DE2641840A1

DE2641840A1 - Thrombose-test

Info

Publication number: DE2641840A1
Application number: DE19762641840
Authority: DE
Inventors: Desire Collen
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 1975-09-19
Filing date: 1976-09-17
Publication date: 1977-04-07
Also published as: DE2641840C2; US4216291A; IT1125181B; FR2326705A1; JPS5241222A; BE846155A; FR2326705B1; CA1095406A; GB1525143A; NL7511055A; SE7610302L

Description

Thrombose-Test

Die Erfindung betrifft einen Thrombose-Test, der im klinischen Bereich ausgeführt werden kann sowie die Herstellung der hierzu erforderlichen Reagenzien.

Nach Operationen, Geburten, schweren Verletzungen oder Infektionen steigt die Gefahr venöser Thrombosen, während sonst arterielle Thrombosen im Zusammenhang mit Arteriosklerose häufiger ist. Des weiteren wurde beobachtet, daß manche Patienten ein abweichendes Verhalten zeigen, welches als Hyperfibrinolyse bekannt ist. Im Hinblick auf die beachtlichen Folgen dieser Phänomene, wie Embolien, Gehirnblutungen, Herzinfarkte usw. ist es erwünscht, über einen klinischen Diagnosetest zu verfügen, mit dem es möglich ist, intravenöse Blut-Koagulationen bereits in einem frühen Stadium zu erkennen.

Der Chemismus der Blut-Koagulation war bereits Gegen-

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stand intensiver Forschung. Es wurde gefunden, daß im menschlichen Blutplasma eine Gruppe von Proteinen oder Koagulationsfaktoren existiert, die bei derartigen Blut-Koagulationen eine Rolle spielt. Unter dem Einfluß von Enzymen kann jeder Koagulationsfaktor aus der inaktiven Form in eine aktive Form umgewandelt werden, wobei die Aktivierungsreaktion selbst durch Katalysatoren und Inhibitoren aktiviert bzw. inhibiert wird. Es wurde desgleichen erkannt, daß alle Aktivierungsreaktionen miteinander eine kontinuierliche Reaktionskette bilden, die sogenannte Koagulationskaskade, in der das Produkt einer jeden Reaktion als Enzym für die nachfolgende Reaktion vorkommt. So besteht beispielsweise einer der letzten Schritte in einer derartigen Koagulationskaskade in der Umwandlung des Prothrombins in Thrombin unter dem Einfluß eines Enzyms sowie zusätzlich von Kalziumionen und Phospholipoiden, während das dabei gebildete Thrombin umgekehrt als Enzym in dem letzten Schritt agiert, in dem Fibrinogen in Fibrin umgewandelt wird.

Desweiteren wurde erkannt, daß im Blut-Plasma noch eine andere Gruppe von Proteinen vorkommt, die zusammen das sogenannte fibrinolytische System bilden, welches als ein Komplementär zum Blut-Koagulationssystem wirkt. Auch in diesem System kann jeder Faktor

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iinter dem Einfluß von Enzymen aus einer inaktiven Form in eine aktive Form überführt werden, wobei die Aktivationsreaktion eine fibrinolytische Kaskade bildet, in der jedes Reaktionsprodukt als Enzym für die nachfolgende Reaktion wirkt. Einer der letzten Schritte in der Kaskade ist die Umwandlung von Plaminogen in Plasmin, welches dann im letzten Schritt als Enzym wirkt, nämlich die Umwandlung von Fibrin in Fibrin-Spaltprodukte bewirkt. Es ist demzufolge der Effekt des fibrinolytischen Systems, umgekehrt zu dem des Blut-Koagulationssystem zu wirken. In praxi ist jedoch eine Aktivation des Blut-Koagulationssystems stets mit einer Aktivation auch des fibrinolytischen Systems gekuppelt; man spricht von sekundärer Fibrinolyse.

Im normalen gesunden Blut befinden sich beide Systeme im Gleichgewicht und sind nur wenig aktiv. Wenn allerdings eines der beiden Systeme stark aktiviert wird, beispielsweise infolge von Krankheiten, Verletzung o.dgl., wird das Gleichgewicht gestört, so daß intravenöse Blut-Koagulation oder Hyperfibrinolyse eintritt .

Einige klinische Tests, mit denen es möglich ist intravenöse Blut-Koagulationen und/oder Hyperfibrino-

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lyse festzustellen, sind bereits bekannt und in Gebrauch. Diese Tests basieren auf der Feststellung aktiver oder inaktiver Komponenten des Blutkoagulationssystems oder des fibrinolytischen Systems im Blut-Plasma. Sie sind aber zu wenig empfindlich, um eine langsame und/oder regionale Aktivierung eines der genannten Systeme festzustellen.

Des weiteren sind bereits Verfahren vorgeschlagen worden, bei denen Reaktionsprodukte aus der Thrombin- oder Plasminzerfallsreaktion des Fibrinogens quantitativ bestimmt werden. Um einen Überblick zu geben, wird auf die Veröffentlichung von Fletcher und Alkjaersig, Diagnoselaboratorium für intravaskuläre Koagulation in dem Buch "Kürzlich erzielte Fortschritte in der Thrombosebekämpfung" Ed.L. Poller, Churchill Livingstone, Edinburgh, 1973, S. 87 ff verwiesen. Diese Methoden sind allerdings zu unspezifisch, zu kompliziert und zu langwierig, so daß sie im klinischen Bereich nicht gut anwendbar sind.

Es bleibt also der Wunsch nach einem einfachen, empfindlichen und klinisch anwendbaren Test für die laboratoriumsmäßige Diagnose von intravaskulären Blutkoagulationen sowie Hyperfibrinolyse des Blutplasmas. Es ist Aufgabe der Erfindung diesen Wunsch zu er-

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füllen.

Durch Versuche, die der Erfindung vorausgegangen sind, wurde festgestellt, daß die Enzyme des Blutkoagulationssystems und des fibrinoIytischen Systems die bei der Aktivation in einem speziellen Schritt der Kaskade entstehen im Blutplasma durch die vorhandenen Inhibitoren unter Bildung von Enzym-Inhibitor-Komplexen neutralisiert werden. Diese Enzym-Inhibitor-Komplexe können mit Hilfe physikalisch-chemischer Agentien isoliert werden und es wurde gefunden, daß sie weitgehend stabil sind, so daß sie im isolierten Zustand für einige Zeit erhalten bleiben.

Des weiteren wurde gefunden, daß die neuentdeckten Enzym-Inhibitor-Komplexe eine spezifische immunogene Struktur aufweisen, welche sich von der Struktur der bisher bekannten (inaktiven) Faktoren unterscheidet. Dies hat es möglich gemacht, Antisera und Antikörper gegen den Enzym-Inhibitor-Komplex zu entwickeln, die nun als Reagenzien zur direkten Bestimmung der speziellen Enzym-Inhibitor-Komplexe im menschlichen Blutplasma auf immunochemischem Wege dienen können.

Die Erfindung betrifft dementsprechend ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivierung des Blut-Koagulations-

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- ff-

oder fibrinolytischen Systems im Blutplasma, welches gekennzeichnet ist durch die Gegenwart eines spezifischen Enzym-Inhibitor-Komplexes, der ein Teil des aktivierten Blut-Koagulations- oder fibrinolytischen Systems im zu prüfenden Blutplasma ist und welches auf immunochemischem Wege bestimmt werden kann.

Die Feststellung der Gegenwart des fraglichen Komplexes kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden, so daß verschiedene Wege der Realisierung möglich sind. So kann beispielsweise das zu prüfende Blutplasma mit einer Suspension roter Blutkörperchen oder auch Teilchen aus synthetischen Harzen, welche einen gereinigten Enzym-Inhibitor-Komplex an ihrer Oberfläche tragen, in Berührung gebracht und dann mit einem Antiserum gegen den speziellen Enzym-Inhibitor-Komplex versetzt werden, worauf zu beobachten ist, ob Agglutination vorkommt oder nicht (Agglutinations-Inhibitions-Test) .

Allerdings wird die Bestimmung bevorzugt in der Weise durchgeführt, daß das zu untersuchende Blutplasma mit einer Suspension von Teilchen aus synthetischem Harz oder Blutkörperchen, die Antikörper gegen einen der Enzym-Inhibitor-Komplexe auf ihrer Oberfläche tragen, kontaktiert und dann unmittelbar beobachtet wird,

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ob Agglutination vorkommt oder nicht (Agglutinations-Test) .

Im vorliegenden Zusammenhang muß festgestellt werden, daß immunochemische Bestimmungsmethoden mit unterdrückter oder direkt beobachteter Agglutination grundsätzlich bekannt sind. Im vorliegenden Fall wird jedoch ein gereinigter Enzym-Inhibitor-Komplex des Blut-Koagulations- oder fibrinolytischen Systems zusammen mit einem Antiserum oder Antikörpern gegen dieses System angewandt, ein Verfahren, welches in Verbindung mit diesen Ausgangsstoffen neu ist.

Darüber hinaus besteht keine Notwendigkeit, die Gegenwart des speziellen Komplexes immer durch Beobachtung der Agglutination oder der Agglutinations-Inhibition festzustellen, sondern es können ebenso andere bekannte Methoden angewandt werden, wie beispielsweise die Radial- Immunodiffusion (Mancine-Verfahren), die quantitative Immuno-Elektrophorese (Laurell-Verfahren), die Radioimmunitätsprüfung und ähnliches.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der im Diagnosetest verwendeten Reagenzien, wie beispielsweise der Antisera und der Suspensionen speziell hergestellter roter Blutkörperchen oder Teil-

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chen aus synthetischem Harz. Diese Herstellungsverfahren sollen in detaillierter Form im Folgenden beschrieben werden.

Als zu bestimmender Faktor bei der Ausübung des Diagnosetests kann prinzipiell jede Kombination eines Enzymes mit zugehörendem Inhibitor aus dem Blut-Koagulations- oder fibrinolytisehern System ausgewählt werden. Tatsächlich zeigt die Gegenwart eines derartigen Komplexes in jedem Fall- die Aktivation von einem oder mehreren Schritten der Blut-Koagulations oder der fibrinolytischen Kaskade an und, als Konsequenz hieraus, eine erhöhte Möglichkeit der Thrombose oder Hyperfibrinolyse. In der Praxis ist es allerdings eine wesentliche Bedingung, daß die Komplexe stabil sind (daß sie eine verhältnismäßig große Halbwertzeit haben) und daß sie aus dem Blut-Plasma auf einem gangbaren Weg isoliert werden können.

Bis heute wurden folgende Enzym-Inhibitor-Komplexe im vorliegenden Zusammenhang als verwendbar gefunden: Plasmin-Antiplasmin-Komplex, Plasmin-»^-Makroglobulin-Komplex und Thrombin-Antithrombin-III-Komplex. In diesem Zusammenhang wurde beobachtet, daß Thrombin und Plasmin bekannte Enzyme des Blut-Koagulations- bzw. des fibrinolytischen Systems sind, während Antithrombin-

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III ein bekannter Inhibitor des Thrombins ist. Das Material Antiplasmin ist ein kürzlich aufgefundener Plasmin-Inhibitor, und«^„-Makroglobulin ist ein Material in dem ein Inhibitor sowohl des Thrombins wie des Plasmins erkannt worden ist.

Dhr erwähnte Enzym-Inhibitor-Komplex wie er im Blut-Plasma gebildet ist. wurde vor dem Tage der Erfindung nicht im separierten Zustand und in isolierter Form aus aktiviertem Blut-Plasma erhalten.

Zur Isolation der Plasmin-Inhibitor-Komplexe wird menschliches Blut-Plasma mit bekannten Enzymen wie beispielsweise Streptokinase oder Urokinase aktiviert. Auf diese Weise wird das im Plasma enthaltene Plasminogen in das Plasmin-Enzym umgewandelt. Das gebildete Plasmin wird in situ von den vorhandenen Inhibitoren, nämlich Antiplasmin und-^-Makroglobulin, neutralisiert. Da Plasminogen in zwei Hauptformen A₁ und A₂ vorkommt, welche ebenso in dem gebildeten Plasmin vorhanden sind, werden wenigstens vier Enzym-Inhibitor-Komplexe aus dem aktivierten Plasma durch Säulenchromatographie isoliert, nämlich A₁- «^-Makroglobulin, Plasmin A₃- e^-Makro globulin, Plasmin A₁-Antiplasmin und Plasmin A₂~Antiplasmin. Die isolierten Fraktionen können konzentriert und weiter gereinigt sowie dann derart kombiniert werden, so daß einerseits gereinigtes Plasmin- «^-Makroglobulin 7098U/0681

und andererseits Plasmin-Antiplasmin erhalten wird.

Zur Isolation des Thrombin-Antithrombwn-III-Komplexes wird von menschlichem Blut-Plasma ausgegangen, welches zunächst mit Hilfes des Enzymes Reptilase defibriniert worden ist. Das defibrinierte Plasma wird dann durch Zusatz von Kalziumionen und Phospholipoiden aktiviert, wodurch die Koagulationskaskade eingeleitet wird und das gebildete Prothrombin in Thrombin überführt wird, welches dann durch die vorhandenen Inhibitoren neutralisiert wird, nämlich «^-Makroglobulin und Antithrombin III. Der spezielle Komplex von Thrombin und Antithrombin III kann chromatographisch isoliert werden. Nach der Konzentration und Reinigung steht er zur weiteren Verwendung zur Verfügung.

Von jedem Enzym-Inhibitor-Komplex kann ein Antiserum in üblicher Weise hergestellt werden, z.B. durch Einspritzen des Komplexes bei Ratten. Nach einiger Zeit wird den Ratten Blut entnommen und die Antisera werden gesammelt. Der Titer eines jeden Antiseri kann mit Hilfe eines Agglutinationstestes bestimmt werden.

Es wurde festgestellt, daß die erhaltenen Zwischenantisera nicht ausschließlich spezifische Antikörper gegen den in Frage stehenden Enzym-Inhibitor-Komplex

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enthalten, sondern außerdem noch verschiedene nichtspezifische Antikörper. Die Antisera geben nämlich bei der Immunodiffusion auf Agargel gegenüber frischem Blut-Plasma Präzipitationslinien. Diese nicht spezifischen Antikörper können durch Zusatz von frischem Blutplasma inaktiviert werden, so daß die Präzipitations· linien nicht mehr auftreten. Besser ist allerdings ein Zusatz von plasminogenfreiem Plasma. Bevorzugt wird allerdings die Reinigung, so daß sich der Titer des Antiserums während der Lagerung nicht erniedrigt. Eine derartige Reinigung kann durchgeführt werden, indem das frische Antiserum der Chromatorgraphie über eine Kolonne unterworfen wird, die unlösliches Blutplasma enthält, beispielsweise durch Kuppeln von frischem oder plasminogenfreiem Blutplasma auf Agarose welches mit Bromcyan aktiviert worden ist. Die spezifischen Antikörper verbleiben denn im Filtrat der Startsubstanz, wonach dieses Filtrat dann zur Anwendung als Antiserum im Diagnosetest zur Verfügung steht.

Eine andere Reinigungsmöglichkeit besteht darin, daß das frische Antiserum mit Plasminogen und frischem Blutplasma inkubiert und die Gamma-Globulinfraktion des Antiserums danach ausgefällt und isoliert wird. Diese Gamma-Globulinfraktion enthält alle spezifischen Antikörper und ist daher für die Anwendung als Antise-

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rum im Diagnosetest nach erneutem Suspendieren ebenfalls geeignet.

Jeder Enzym-Inhibitor-Komplex kann des weiteren für die Kombination mit roten Blutkörperchen oder Teilchen aus sythetischem Harz kombiniert und so für die Herstellung eines spezifischen Reagenzes für den Diagnosetest verwendet werden. Falls beispielsweise von roten Blutkörperchen ausgegangen wird, werden diese zunächst in einer wässrigen Suspension gegerbt und schließlich mit einer Pufferlösung eines der Enzym-Inhibitor-Komplexe in Berührung gebracht, um so den in Frage stehenden Komplex an der Oberfläche der Blutkörperchen zu binden. Das erhaltene Reagenz behält seine speziellen Eigenschaften - vorausgesetzt es wurde an einem kühlen Platz aufbewahrt - für eine lange Zeit und kann für die Ausführung eines Hämoglutinations-Inhibitions-Testes verwendet werden. Des weiteren kann von einer wässrigen Suspension (Latex) von Teilchen aus synthetischem Harz, beispielsweise Polystyrol oder Polymethacrylat ausgegangen und diese mit einer wässrigen Lösung von einem der erwähnten Komplexe in ähnlicher Weise kombiniert werden. Ähnliche Latices sind für die in Rede stehenden Zwecke bekannt und käuflich erhältlich.

Ein anderes spezifisches Reagenz für die Ausführung

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des Diagnosetestes kann durch Kombination eines Latex von Teilchen aus synthetischem Harz mit einem Antiserum erhalten werden, welches dann in ähnlicher Weise wie oben beschrieben gereinigt wird. Das so erzeugte Reagenz in welchem die spezifischen Antikörper des Antiserums an der Oberfläche der Teilchen aus synthetischem Harz enthalten sind, kann für die Ausübung eines direkten Agglutinations-Testes verwendet werden. Naturgemäß ist desgleichen eine Suspension von roten Blutkörperchen die mit Antikörpern in ähnlicher Weise bedeckt sind verwendbar.

Bei der Ausübung des Diagnosetestes kann wahlweise ein Agglutinations-Inhibitations-Test oder ein Test mit direkter Agglutination angewandt werden. Beim Agglutinations-Inhibitations-Test sind zwei Reagenzien erforderlich, nämlich einerseits eine Suspension von roten Blutkörperchen oder Teilchen aus syntethischem Harz, die mit gereinigtem Enzym-Inhibitor-Komplex an der Oberfläche angereichert sind und andererseits ein Antiserum gegen den verwendeten Enzym-Inhibitor-Komplex. Der Test beruht dann auf der Inhibition der Reaktion zwischen zwei Reagenzien, wobei der Enzym-Inhibitor-Komplex in der zu untersuchenden Blutprobe anwesend ist. Falls die Blutprobe den fraglichen Komplex enthält, tritt eine Reaktion zwischen dem Komplex und den Antikörpern des

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Antiserums ein, so daß die Antikörper nicht in der Lage sind, mit dem Komplex an den Blutzellen oder Hartteilchen zu reagieren. Falls jedoch kein Enzym-Inhibitor-Komplex in der fraglichen Blutprobe vorhanden ist, ist der Komplex in der Lage, frei mit den Antikörpern des Antiserums zu reagieren; ein Vorgang der in der Agglutination der Zellen oder Partikel seinen Ausdruck findet. In der Praxis werden verschiedene Verdünnungen der zu untersuchenden Blutprobe hergestellt und auf diese Weise exakt bestimmt, bei welcher Verdünnung die Agglutination eintritt. Die Zahl die auf diese Weise gefunden wird, wird Titer genannt. Hohe Titerwerte (sehr starke Verdünnung) bedeuten die Gegenwart des Enzym-Inhibitor-Komplexes in der Blutprobe und dementsprechend die Aktivation des Blut-Koagulations- und/oder des fibrinolytischen Systems.

Zur Ausführung des Testes mit direkter Agglutination ist ausschließlich ein Reagenz notwendig, nämlich eine Suspension von Teilchen eines synthetischen Harzes, die an der Oberfläche mit einem Antikörper gegen eines der Enzym-Inhibitor-Komplexe bedeckt ist. Dieser Test beruht dann auf der direkten Reaktion zwischen den Antikörpern des Reagenzes und dem Enzym-Inhibitor-Komplex, der in der zu untersuchenden Blutprobe vor-

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-W-

handen ist. Falls die Blutprobe den in Frage stehenden Komplex enthält, tritt eine Reaktion ein, welche ihren Ausdruck in der Agglutination der Teilchen des synthetischen Harzes findet. Falls im Gegensatz dazu der in
Frage stehende Komplex nicht in der Blutprobe anwesend ist, tritt keine Agglutination ein. Ein spezifischer
Titer kann auch hier durch Herstellung von Verdünnungsreihen der Blutprobe erhalten werden, wobei beobachtet wird, bei welcher Verdünnung keine Agglutination mehr
eintritt.

Die Ausführung des Testes mit Agglutinations-Inhibitoren nimmt etwa 30 - 60 Minuten in Anspruch, während die direkte Agglutination in etwa 3 Minuten eintritt. Allerdings tritt im Falle der direkten Agglutination bei
Personen mit Rheumatismus eine falso-positive Reaktion (und ein hoher Titer) ein, so daß eine zusätzliche Bestimmung der Rheumafaktoren erforderlich ist.

Beispiel 1

Isolation des Plasmin-Inhibitor-Komplexes aus Blutplasma

Die Plasmin-Inhibitor-Komplexe werden aus Blutplasma
isoliert, welche mit Streptokinase oder Urokinase, zu

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-K-

welcher Spuren von radioaktiv markiertem Plasminogen gegeben wurden, aktiviert. Die Isolation wurde durch Oberflächenchromatographie an Lysin-Agarose und Gelfiltration an Sephadex G-2OO ausgeführt.

Ausgangsitiaterial: Blutbank-P las ma von normalen Spendern gebunden an einen ACD-Koagulator diente als Ausgangsmaterial. Streptokinase (Kabikinase der Firma Kabi AB, Stockholm) und Urokinase (von Abbott, Nord Chicago, Illinois, USA) wurden als Aktivatoren verwendet. Das radioaktiv markierte Plasminogen wurde wie folgt hergestellt: menschliches Plasminogen wurde aus einer frisch gefrorenen Plasmapröbe durch Oberflächenchromatographie an Lysin-Agarose, Gelfiltration an Sephadex G-150 und Chromatographie an DEAE-Sephadex erhalten, wie dies in der Arbeit von D-. Collen, "Plasminogen- und Prothrombinmetabolismus des Menschen", Universität von Leuven, Belgien, 1974 beschrieben ist. Aus diesem höchst gereinigten Material wurden die beiden Hauptformen des Plasminogens durch Oberflächenchromatographie an Lysin-Agarose abgeschieden. Die beiden Formen, welche als Plasminogen A- (erster peak) und Plasminogen A₂ (zweiter

125 peak) identifiziert wurden, wurden jeweils mit J und

J markiert; entsprechend der Anweisung von McFarlane,

in der Zeitschrift "Nature", (London) 182,53,158.

125 131

Isolation: Spuren von J-Plasminogen-A.j und J-

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- Yf-

Plasminogen-A- wurden zu je ein Liter Blutplasma gegeben und danach wurde das Plasma durch Zusatz von 250 bzw. 500 CTA-Einheiten Aktivator pro ml Blutplasma aktiviert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Danach wurde das aktivierte Plasma durch eine Lysin-Agarose-Kolonne von 2,5 χ 45 cm Abmessungen geleitet, die mit einem 0,1 m Phosphatpuffer von pH 7,5 bei einer Geschwindigkeit von 50 - 70 ml pro Stunde äquilibriert war. Nicht absobiertes Protein wurde durch Waschen mit dem Äquilibrationspuffer entfernt. Unter diesen Umständen wurden wenigstens 90% der Radioaktivität in der Kolonne zurückgehalten. Die Elution wurde mit linearem Gradienten enthaltend 500 ml 0,1 m-Phosphatpuffer von pH 7,5 als Startpuffer ausgeführt und 500 ml 0,1 m Posphat 0,013 m ^-Aminocapron-Säure von pH 7,5 als Endpuffer. Das Elutionsprofil der Radioaktivität enthielt sechs peaks, die, in der Folge der

125 Elution wie folgt identifiziert wurden: (1) J-Plasmin

-i£₂-Makroglobulin, (2) J-Plasmin A₃-»^-Makro-

11C

globulin, (3) J-Plasmin A^Antiplasmin, (4) und (5)

131 125

J-Plasmin A₂-Antiplasmin und als Rückstand J-Plas-

131 minogen A-, und (6) als Rückstand J-Plasminogen A₃.

Verschiedene Fraktionen des Chromatogramms wurden durch Ultrafiltration konzentriert und durch Gelfiltration auf Sephadex G-200 weiter gereinigt, wonach die Elutions

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125 /*

seguenz war: J-Plasmin A₁- eC.j-Makroglobulin-Komplex

131 *■

und J-Plasmin A₃-«C^-Makroglobulin-Komplex im Füll-

125
volumen der Kolonne, (2) J-Plasmin A..-Antiplasmin

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und J-Plasmin A₂-Antiplasmin, kurz vor dem Globulinpeak durch Chromatographie des Plasmas erhalten und

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(3) J-Plasminogen A₁'und J-Plasminogen A₂, eluiert aus dem Bereich zwischen Globulinen und Albuminen.

Die Fraktionen verschiedener Sephadex G-2OO Kolonnen wurden später zu drei großen Fraktionen entsprechend den eben aufgeführten Gruppen 1,2 und 3 vereinigt. Diese Fraktionen wurden dialysiert gegen destilliertes Wasser und lyophilisiert. Die durschnittlichen Ausbeuten aus acht Isolationstests von einem Liter Blutplasma waren: 14,5 Einheiten O.D. bei 280 nm pro 100 ml des Plasmas der ersten Fraktion (im Folgenden als P-«£₂ ^M bezeichnet) und 7,3 Einheiten pro 100 ml des Plasmas in der zweiten Fraktion (im Folgenden als P-AP bezeichnet).

Identifikation: Bei der Gel-Elektrophorese der Fraktion P-*£₂ ^{M an} SDS-Polyacrylamid wurde ein Proteinband beobachtet, welches praktisch nicht in das Gel wanderte (Molekulargewicht über 400.000). Bei der Wiederholung dieses Testes nach Reduktion mit Dithiothreitol (DTT), wurden verschiedene Bänder beobachtet, von denen das erste ein Molekulargewicht von 95.000 aufwies. Die

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Iiranuno-Elektrophorese nach Laurell in einem Gel mit •^-Makroglobulin-Antiserum bestätigte die Identität mit dem P-·£₂ ^Μ Komplex. Der Komplex reagierte nicht mit Antisera gegen «£.-Antitrypsin, C₁ Inhibitor, Antithrombin III und Inter-»^-Trypsin-Inhibitor.

Bei der Gel-Elektrophorese von P-AP an Polyacrylamid wurden zwei Proteinbande erhalten mit einem Molekulargewicht von rund 120.000 und rund 140.000. Nach Reduktion mit DTT, wurden zwei Proteinbande mit Molekulargewichten von rund 65.000 und rund 15.000 beobachtet. Bei der Immuno-Elektrophorese nach Laurell in Gelen mit Antisera gegen ·£- Anti trypsin, «^l-Makroglobulin, C₁-Esteraseinhibitor, Inter-•i'-Trypsininhibitor, Antithrombin III und^e^"₂~^Anti^c^¹y^motryP^siⁿ wurde keine Bildung von Niederschlagen beobachtet'. Auf der anderen Seite wurde bei diesen Test eine Reaktion mit Antiserum gegen P-AP Komplex erhalten, welches mit gereinigtem Plasminogen absorbiert war. Dies deutet an, daß P-AP ein Komplex zwischen Plasmin und einem Plasmaprotein mit Antiplasmineigenschaften ist, die vorher nicht identifiziert worden sind und welche im folgenden Antiplasmin genannt werden sollen.

Beispiel 2

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Isolation des Thrombin-Antithrombin-III-Komplexes aus Blutplasma

Der Throiribin-Antithrombin-III-Komplex wurde aus Blutplasma isoliert, welches mit Reptilase defibriniert und bei dem der Koagulationsmechanismus auf dem beschriebenen Wege aktiviert war. Die Isolation wurde durch Oberflächenchromatographie an Heparin-Sepharose und Gelfiltration an Sephadex G-200 ausgeführt.

Ausgangsmaterial: Blutbankplasma von normalen Spendern gebunden an ACD-Antikoagulant diente als Ausgangsmaterial. Zur Defibrination wurde Reptilase (eine Defibrase der Firma Pentapharm, Basel) verwendet, während für die Aktivierung des Koagulationssystems Kalziumchlorid und ein Phospholipoid (Thrombofax der Firma Ortho Pharmaceutical Company) angewandt wurde. Darüber hinaus wurde radioaktiv markiertes Prothrombin verwendet, welches durch Markieren von gereinigtem

125 menschlichem Prothrombin mit J in der Arbeitsweise von McFarlane erhalten worden war.

Aktivierung: Zu zwei Literportionen des Blutplasmas wurde Defibrase in einer Menge von 1 ml pro Liter gegeben, wonach das Plasma zur Koagulation 4 Stunden lang auf 37 C erwärmt und dann über Nacht in einem kühlen Raum

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gelagert wurde. Das gebildete Fibrin wurde gradweise entfernt durch Auswalzen auf einem Glasblock. Eine

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Spur von J-Prothrombin wurde zum defibrinierten Plasma gegeben, wonach das Koagulationssystem durch Zugabe von 28 ml 1 m CaCl₂ und 40 ml Thrombofrax pro Liter defibriniertes Plasma aktiviert wurde. Die Aktivati on des Koagulationssystems folgte auf der Basis der graduellen Reduktion des anwesenden Prothrombins. Nach etwa 1 Stunde war der Restgehalt an Prothrombin kleiner als 5%.

Isolation: Zur Durchführung der AbsorptionsChromatographie wurde Heparin-Sepharose benutzt, welche gewaschen und ins Gleichgewicht gesetzt wurde mit 0,1 m tris-HCl, 0,15 m NaCl, 0,01 m Zitratpuffer von pH 7,5. 150 ml dieser Heparin-Sepharose (Volumen nach Sedimentation) wurde mit 2000 ml defibriniertem und in der oben beschriebenen Weise für 2 Stunden bei Raumtemperatur aktiviertem Blutplasma gemischt. Alsdann wurde das Gel auf einem Buchner-Trichter mit 3 1 Gleichgewichtspuffer gewaschen und in eine Kolonne geschüttet. Das absorbierte Material wurde mit einem Salzgradienten eluiert enthaltend 500 ml 0,01 m tris-HCl, 0,15 m NaCl, 0,01 m Zitratpuffer pH 7,5 als Startpuffer und 0,01 m tris-HCl, 1 m NaCl und 0,01 m tris-HCl, 1 m NaCl und 0,01 m Zitrat pH 7,5 als Schlußpuffer.

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Es wurden drei verschiedene Fraktionen erhalten, nämlich: (1) Lipoproteine die speziell bei Beginn des Durchlaufes eluiert wurden und deren Gehalt von Präparat zu Präparat variierte; (2) ein Thrombin-Antithrombin III Komplex der durch gleichzeitige Elution

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mit J und einem Antigen bezogen auf Antithrombin III bei einer Salzkonzentration von rund 0,4 m aufgedeckt wurde und (3) restliches Antithrombin III, welches im Anschluß an den peak der vorausgehenden Fraktion eluiert wurde.

Die Thrombin-Antithrombin III Fraktionen der verschiedenen Versuche wurden miteinander kombiniert und durch Ultrafiltration konzentriert. An dieser Stufe der Präparation wurde mit Lipoproteinen verschnitten, die aus ihrer Trübung in Lösung sowie ihrer geringen Beweglichkeit in einem Polyacrylamidgel bekannt waren. Danach wurde die Präparation weiter durch Gelfiltration an einer Kolonne aus Ultragel AcA 22 mit 2,5 χ cm Abmessungen gereinigt, die im Gleichgewicht stand mit einem Puffer aus 0,1 m NaCl, 0,05 m Phosphat, 0,02 % Azid pH=7,5. Hierbei wurden die Lipoproteine nahe dem Füllvolumen der Kolonne eluiert. Der Thrombin-Antithrombin Komplex (im Folgenden als T-AT bezeichnet), der nach der Reinigung die Tendenz zur Aggregatbildung zeigte, wurde in einem breiten peak eluiert. Das freie

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Antithrombin III eluierte später. Die T-AT Fraktion aus verschiedenen Versuchen, lokalisiert durch Messung

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der J Aktivität und eines Antigens zum Antithrombin III wurden kombiniert und durch Vakuumdialyse konzentriert. Die Durchschnittsausbeite von vier Isolationstests jedes mit einem Ausgangsmaterial· von 2 1 Blutplasma begonnen, ergab 25 Einheiten O.D. pro Liter Plasma.

Identifikation: Bei der Elektrophorese von T-AT auf einem SDS-Polyacrylamidgel wurde eine scharfe Proteinbande mit einem Molekulargewicht von rund 65.000 (freies Antithrombin III) beobachtet sowie ferner verwaschene Banden mit langsamer Wandergeschwindigkeit. Nach der Reduktion mit DTT wurden drei scharfe Bänder erhalten, deren Molekulargewicht zwischen 65.000 und 95.000 bestimmt wurde. Unter diesen Bändern befanden sich Antithrombin III und Thrombin-Antithrombin III.

Beispiel 3

Herstellung von Antisera

Präparation: Ratten wurden mit Plasmin-Antiplasmin-Komplex immunisiert (5 Ratten) , mit Plasmin- «^

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globulin-Komplex (2 Ratten) und mit Thrombin-Antithrombin III-Komplex (4 Ratten). Zu diesem Zweck wurde der Komplex in 0,15 m Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 2 mg pro ml gelöst und mit 1 ml Zusatzmittel nach Freund vermischt. Von dieser Mischung wurde jeder Ratte 1 ml injiziert und zwar verteilt auf die Fußsohlen, das Subkutangewebe des Nackens sowie die Oberschenkelmuskulatur. Dreimal danach, jedes mal mit einem Intervall von 1 oder 2 Wochen wurde eine gleiche Menge von Antigen verabfolgt, vermischt mit unvollständigem Zusatzmittel nach Freund und verteilt auf die subkutanen und intramuskulären Regionen. Beginnend etwa 1 Woche nach der vierten Infektion wurden 30-80 ml Blut zweimal die Woche durch Punktion aus den Ohrenarterien entnommen. Jedesmal wurden die Seren von 3 oder 4 aufeinanderfolgenden Blutentnahmen miteinander kombiniert und zusammen weiterverarbeitet. Die Titer der Antisera wurden mit Hilfe eines Hämagglutiantionstestes bestimmt. Während einer Zeit von 3 Monaten wurden bis zu 500 ml Serum pro Ratte gewonnen.

Bestimmung des Titers: Für die Durchführung der Agglutinations-Tests wurde ein spezielles Reagenz aus roten Blutkörperchen hergestellt, welche mit einem gereinigten Komplex des Types P-AP, P-«^*₂m oder T-AT an der Oberfläche angereichert waren. Das Reagenz wurde durch Gerben von menschlichen roten Blutzellen der Blut-

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- ys -

gruppe O und anschließendes Kontaktieren mit einem der gereinigten Komplexe in der Weise hergestellt, wie dies von Merskey et al für fibrinogene Spaltprodukte beschrieben worden ist (siehe Proc.Soc.Exp.Biol. Med., 131,871,1969). Die verwendeten Mengen der Komplexe waren: eine Einheit O.D. (bei 280 nm) des P-AP-Komplexes, 2 Einheiten OD des T-AT-Komplexes und 5 Einheiten OD des P-o£₂m-Komplexes, gelöst in 100 ml Zitratpuffer. Das Reagenz wurde bei 4°C aufbewahrt und während eines Monats verbraucht.

Von den Antisera wurden verschiedene Verdünnungen hergestellt, worauf jede Verdünnung mit einem korrespondierenden Reagenz in Berührung gebracht wurde, worauf dann das Vorkommen der Hämaglutination beobachtet wurde. Die höchste Verdünnung, bei der Hämaglutination klar erkennbar war, wurde festgestellt und als Titer des Antiserums betrachtet. Es wurde gefunden, daß die erhaltenen Werte in beträchtlichem Maße divergieren, in Abhängigkeit von den verwendeten Versuchstieren und im Augenblick der Blutentnahme.

Bestimmung anderer Bewertungsziffern: um noch andere Bewertungsziffern zu erhalten, wurden zahlreiche Agglutinations-Inhibitierungs-Tests mit den erhaltenen Antisera ausgeführt, bei denen das jeweilige Antiserum mit einem Reagenz in Kontakt gebracht wurde, welches

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aus roten Blutzellen der oben beschriebenen Weise sowie einem Drittmaterial kontaktiert wurde, wonach das Vorkommen oder Nichtvorkommen der Agglutination festgestellt wurde. Frisches Blutplasma, Blutserum und urokinaseaktiviertes Plasma dienten als Drittmaterial. Das Serum wurde hergestellt durch koagulieren von Blut während einer Stunde bei einer Temperatur von 37 C und es enthielt weniger als 5% Rest-Prothrombin. Das urokinaseaktivierte Plasma wurde durch Zusatz von 500 CTA Einheiten Urokinase pro ml frisches Plasma und Inkobieren des Plasmas für 30 Minuten bei 25⁰C erhalten.

Bei jedem Versuch wurde der Titer des Drittmaterials durch Bestimmung der Verdünnung festgestellt, bei der Hämagglutination eintrat. Jeder Titer wurde durch Bildung des Kehrwertes der gefundenen Verdünnung bestimmt.

Es wurde gefunden, das frisches Plasma einen Titer von 32-512 für T-AT, einen Titer von 32-64 für P-AP und einen Titer von 32-128 von P-*C₂ ^m hatte. Serum inhibitierte 2-4 mal mehr als Plasma aus T-AT, während urokinaseaktiviertes Plasma 4-16 mal besser inhibitierte als frisches Plasma aus P-AP und 1-2 mal besser

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- ti -

für P-*&2^m' ^Aus ^^er Gesamtzahl dieser Versuche wurden die folgenden Bewertungsziffern abgeleitet: Ein Serumplasma zeigte das Verhältnis 2-4 für T-AT und ein UK Plasma -zu-Plasmaverhältnis von 4-15 für P-AP und 1,2 für P-<dC₂m.

Inaktivierung von nicht spezifischen Antikörpern:

Bei graduellem Zusatz von frischem Plasma zu Antisera (bis zu einem Gehalt von 50% Vol./Vol.), wurde der Titer des frischen Plasmas 2-4 mal erniedrigt. Bei den Veruschen mit T-AT und P-AP und 1-2 mal bei den Versuchen mit P-^C₂m. Das Verhältnis zwischen den Titern des Serums und frischem Plasmas für T-AT erhöhte sich 2-4 mal, ebenso das Verhältnis von UK Plasma zu Plasma für P-AP.

Beispiel 4

Reinigung des Antiserums

Das gemäß Beispiel 4 erhaltene P-AP Antiserum wurde chromatographisch an einer Kolonne aus unlöslichem Blutplasma (frisch oder plasminogenfrei) gereinigt.

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Herstellung des unlöslichen Plasmas: 75 ml Agarose (sedimentiertes Volumen) aktiviert mit 10 g CNBr wurden mit 100 ml eines Puffers gemischt (0,1 m NaHCO^, 0,5 m NaCl, pH=9,O) und 10 ml frisches oder plasminogenfreies menschliches Blutplasma zugesetzt. In beiden Fällen wurden etwa 60% des vorhandenen Proteins an die Agarose gebunden. Das plasminogenfreie Plasma war ein Filtrat, welches bei der Chromatographie von frischem Plasma über Lysin-Agarose erhalten wurde.

Chromatographie: Fraktionen der substituierten Agarose wurden mit einer Pufferlösung equilibriert (0,1 m NaCl, 0,05 m Phosphat, pH=7,5; oder 0,03 m Na₃HPO₄, 0,05 m KH₂PO₄, 0,07 m NaCl; pH=6,4) und in eine Chromatographensäule gegossen. Anschließend wurde das Antiserum auf die Kolonne aufgetragen und zwar mit

einer Geschwindigkeit von 10 ml/cm pro Stunde. Die gebundenen Antikörper wurden mit 0,1 m Glycin-HCl-Puffer bei pH 2,8 ausgewaschen. Die Titer im Filtrat und Eluat wurden mit Hilfe von Agglutinations-Tests unter Verwendung eines Reagenzes aus roten Blutkörperchen wie oben beschrieben bestimmt. Die Unterscheidung von spezifischen und nichtspezifischen Substanzen wurde nach der Größe des Verhältnisses zwischen den Inhibitions-Titern von mit Urokinase aktiviertem Plasma und nicht aktiviertem Plasma bestimmt.

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a) 50 ml P-AP-Antiserum mit einem Titer von 1/512 und einem UK-Plasma-Plasmaverhältnis von 8 wurden über eine Säule mit Menschenplasma-Agarose von 1,25 χ 25 cm bei einer Geschwindigkeit von 20 ml pro Stunde chromatographiert. Ungefähr 25-50 % der agglutinierten Antikörper wurde von der Kolonne nicht zurückgehalten, während 25-50 % nach der Absorption eluiert werden konnten. Das UK-Plasma-Plasmaverhältnis im Filtrat war 16-32 und im Eluat 2-4.

Nach ReChromatographie der nicht absorbierten Fraktion wurden 10-20 % der Agglutinationsantikörper nicht absorbiert und 20 % wurden mit Glycin-HCl eluiert. Das UK-Plasma-Plasmaverhältnis im Filtrat war 32-64 und im Eluat 16.

Durch diese doppelte Chromatographie konnte die Gesamtmenge der Agglutinationskörper auf 5 % reduziert werden, aber das UK-Plasma-Plasmaverhältnis stieg 4-8 mal an.

b) 80 ml P-AP-Antiserum mit einem Titer von 1/512 und einem UK-Plasma-Plasmaverhältnis von 8 wurde über eine Säule mit plasminogenfreier Menschenplasma-Agarose von 1,25 χ 30 cm bei einer Geschwindigkeit von 25 ml pro Stunde chromatographiert. Ungefähr 90% der Agglutina-

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tionsantikörper wurden im Filtrat wieder gefunden und etwa 2-5 % wurden mit Glycin-HCl eluiert. Das UK-Plasma-Plasmaverhältnis im Filtrat war 9-16 und im Eluat 1-2.

Nach erneuter Chromatographie von 30 ml dieses Filtrates wurden wiederum 90 % der Agglutinationsantikörper nicht durch die Säule zurückgehalten. Das UK-Plasma-Plasmaverhältnis im Filtrat stieg nicht mehr an.

Beispiel 5

Reinigung des Antiserums

Ein P-AP Antiserum, welches gemäß Beispiel 3 erhalten wurde, wurde gereinigt durch Inkubation mit Plasminogen und frischem Blutplasma, abgetrennt von der Gamma-Globulin-Fraktion und resuspendiert.

Zu einer frischen Antiserummenge von 1000 KIU Aprotinin (Trasylol von Bayer, Leverkusen, ein Protease-Inhibitor), 0,1 ml von gereinigtem Plasminogen und 0,16 ml frisches menschliches Blutplasma wurden pro ml hinzugefügt. Nach 15 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag durch Separation ent-

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fernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde im Verhältnis 1:2 mit einem Puffer verdünnt (0,1 m NaCl, 0,05 m Phosphat, pH 7,0), wonach die Gamma-Globulin-Fraktion bei 4°C durch Zusatz von Ammoniumsulfat bis zur Sättigung (37,5 %) abgeschieden wurde. Nach 30 Minuten langem rühren wurde der Niederschlag abgetrennt, im ursprünglichen Volumen 0,1 m tris-HCl von pH 8,6 gelöst und gegen einen Puffer für eine Zeit von 2 Stunden dialysiert und schließlich durch Separation geklärt.

Beispiel 6

Blutzellen-Reagenz für den Diagnostik-Test

Ein spezielles Reagenz für die Durchführung des klinischen Diagnostik-Testes wurde durch Ausrüstung von Blutzellen an der Oberfläche mit einem gereinigten P-AP-Komplex hergestellt.

Menschliche rote Blutzellen der 0 Gruppe wurden gegerbt und mit gereinigtem P-AP-Komplex der gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, kontaktiert und zwar in der Weise, wie es von Merskey at al für Fibrinogenbruchstücke beschrieben worden ist. Eine Einheit OD (bei 280 nm) des P-AP-Komplexes gelöst in 100 ml

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Zitrat-Phosphat-Puffer wurde verwendet. Das erhaltene Reagenz wurde bei 4°C aufbewahrt und war für die Durchführung des Agglutinations-Inhibitions-Testes geeignet.

Beispiel 7

Latexreagenz für den Diagnostik-Test

Ein anderes spezielles Reagenz für die Durchführung des klinischen Diagnostik-Testes wurde durch überziehen der Oberfläche von Teilchen aus synthetischem Harz mit spezifischen Antikörpern gegen den P-AP-Komplex hergestellt.

Ein Latex aus Teilchen von synthetischem Harz (Bacto-Latex 0,81 der Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA.), wurde zweimal mit einer Pufferlösung (0,02 m Glycin, 0,03 m NaCl, pH 9,0) gewaschen, und danach die Teilchen abgetrennt (Sorvall RC2, 10.000 rpm, 5 Minuten). Anschließend wurde in derselben Pufferlösung resuspendiert (1,6 χ das Ursprungsvolumen). Pro ml Suspension wurden 0,1 ml Gamma-Globulinlösung zugesetzt, die entsprechend Beispiel 5 erhalten worden waren und 60 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die

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beladenen Teilchen des synthetischen Harzes wurden abgetrennt, mit Pufferlösung gewaschen (0,02 m Glycin, 0,03 m NaCl, pH 9,0) und in einer anderen Pufferlösung (0,1 m Glycin, 0,15 m NaCl, pH 9,0) resuspendiert und schließlich 1 % Kow's Albumin ( Povite, Amsterdam) und 0,1 % Natriumazid zugesetzt. Das erhaltene Reagenz war zur Durchführung des unmittelbaren Agglutinationstestes geeignet.

Beispiel 8

Diagnostik-Test mit Blutzellen-Reagenz

Zur Durchführung des Diagnostik-Testes mit dem Reagenz gemäß Beispiel 6 wurde verschiedene Verdünnungen einer zu testenden Blutplasmaprobe hergestellt, wonach jede Verdünnung mit dem in Frage stehenden Reagenz und einem gereinigten P-AP-Antiserum, welches nach Beispiel 4b hergestellt wurde, in Berührung gebracht worden ist. Danach wurde das Auftreten von Agglutinationen beobachtet, Die höchte Verdünnung bei der noch eine Agglutination vorkam, ergab den Titer (Kehrwert).

Beispiel 9

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Diagnostik-Test mit Blutzellen-Reagenz

Bei der Durchführung des Diagnostik-Testes mit dem Reagenz gemäß Beispiel 8 wurden verschiedene Verdünnungen der zu untersuchenden Blutplasmaprobe in einer Pufferlösung (0,1 m Glycin, 0,15 m NaCl, 1 % Albumin, pH 9,0) hergestellt. Auf einer schwarzen Platte wurden 20 Mikroliter einer jeden Verdünnung oder von der Pufferlösung allein (Blindversuch) mit 20 Mikroliter des in Frage kommenden Latex Reagenzes vermischt. Die Suspension wurde kontinuierlich durch Schwenken der Platte hin und her vermischt und das Auftreten der Agglutination wurde nach 3 und nach 5 Minuten abgelesen (+ oder -).

Beispiel 10

Ergebnis des Diagnostik-Tests

A. Bei der Durchführung des Diagnostik-Testes nach Beispiel 9 mit verschiedenen Proben konnten klare Resultate erhalten werden.

Frisches Plasma agglutinierte die Teilchen von synthetischem Harz in Verdünnungen von 1:5 bis 1:8

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(so daß der Titer war 5-8), wogegen der gereinigte P-AP-Komplex (in einer Konzentration von 20 mg pro 100 ml) einen Titer von 1.024 - 2.048 zeigte,, Wenn 500 CTA Einheiten von urokinase pro ml zu frischem Plasma hinzugefügt wurden, gefolgt von einer Inkubination bei Raumtemperatur, trat eine Agglutinationsaktivität ein, welche nach 30 Minuten einen Titer von 640 erreichte. Dies zeigt eine klare Anreicherung des P-AP-Komplexes in der Probe, die in vitro aktiviert worden ist, an.

Frisches Serum eines Patienten mit Rheumafaktor im Serum wurde ebenfalls als agglutinierend befunden und daher mit einem hohen Titer bezeichnet. Bei der Behandlung des Serums mit unlöslich gemachtem menschlichem Gamma-Globulin konnte diese Agglutinationsaktivität im Gegensatz zur Agglutinationsaktivität die durch Urokinase ausgelöst wurde absorbiert werden.

B. In der Folge wurden Diagnostik-Tests mit Blutproben von Patienten durchgeführt, die sich einer Behandlung mit Streptokinase oder Repilase unterzogen hatten. Eine derartige Behandlung bewirkt eine primäre bzw. shkundäre Aktivation des fibrinolytischen Systems in vivo.

Die Streptokinasebehandlung bestand in einer intra-7098U/0681

venösen Injektion von 600.000 IE während 30 Minuten. Blutproben wurden über Kalziumoxalat genommen (Endkonzentration 0,25 %) vor sowie 1,2,3 und 24 Stunden nach dem Beginn der Behandlung. Die Repilasebehandlung bestand in einer intravenösen Injektion von 2 ml Repilase (Defibrase) für 1 Stunde. Die Blutproben wurden über Trinatriumzitrat (Endkonzentration 0,313 %) genommen und zwar ebenfalls vor sowie 3,6,9 15 und 24 Stunden nach dem Beginn der Behandlung. Die Gegenwart des P-AP-Komplexes in den Proben wurde mit den in den Beispielen 8-11 beschriebenen Verfahren bestimmt.

Bei den Proben der Streptokinasebehandlung wurde ein starkes Ansteigen des P-AP Titers erhalten (mit beiden Methoden) jeweils am Ende der Behandlung. Diese Proben reichten an diejenigen Plasmaproben heran, welche in vitro mit Urokinase aktiviert worden waren. Für die ersten 3 Stunden nach der Behandlung blieben die Titer meist unverändert, um dann nach 24 Stunden anzusteigen.

Bei den Blutproben der Repilasebehandung nach beiden Verfahren wurde ebhnfalls bei Ende der Behandlung bis 24 Stunden danach ein starkes Ansteigen beobachtet, wobei ein submaximaler Titer festgestellt wurde, welcher das Ansteigen des P-AP Gehaltes im

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Plasma kennzeichnet. Dies spricht für eine sekundäre Aktivation des fibrinolytischen Systems.

Die Ergebnisse, welche an den Blutproben die in vivo aktiviert wurden erhalten worden sind, entsprechen deshalb denjenigen Ergebnissen, die an den Proben die in vitro aktiviert wurden, gemessen worden sind.

C. Mit Hilfe des Diagnostik-Tests nach Beispiel 9 wurden die P-AP Titer in 23 4 Plasmaproben bestimmt, welche von Patienten eines Krankenhauses erhalten wurden.

Die Plasmaproben wurden 1:10 verdünnt mit einer Pufferlösung (0,1 m Glycin, 0,15 m NaCl, 1 % Albumin, pH 9,0). Diejenigen Proben, welche Agglutination bewirkten, wurden auf das Vorhandensein eines Rheumafaktors untersucht (RF Latex Test, Behringwerke) und, falls negativ,weiterhin austitriert. Insgesamt ergaben 13 Proben eine positive Eheumareaktion; 163 Proben waren negativ in einer 1:10 Verdünnung, 25 Proben waren positiv in einer Verdünnung von 1:40 oder mehr.

Von den zuletzt genannten 25 Proben wurde der Titer, mit den Resultaten des Hämostase-Testes verglichen.

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In den Fällen, in denen ein Titer von 40-80 gefunden wurde, wurde der Hämostase-Test als normal aussortiert. Titer von 120-240 wurden bei 7 Patienten gefunden, bei denen der Hämostase-Test intravaskuläre Koagulationen in" ej.nem Fall und leichte Neigung hierzu in vier Fällen gezeigt hat.

Die Resultate zeigen gute Brauchbarkeit für klinische Teste.

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Claims

Leuven Research & Development V.Z.W., at Louvain, Belgien Patentansprüche

1. Verfahren zur Feststellung einer Aktivierung des Blut-Koagulierungs- und/oder des fibrinolytischen Systems im Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwesenheit eines spezifischen Enzym-Inhibitor-Komplexes, der ein Teil des aktivierten Blut-Koagulations- oder fibrinolytischen Systems im Blutplasma ist, auf immunochemischem Wege festgestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Blutplasma mit einem Antiserum gegen einen der in Frage stehenden Enzym-Inhibitor-Komplexe und darauf mit einer Suspension von roten Blutzellen oder einem Latex von Teilchen aus einem synthetischem Harz in Kontakt gebracht wird, deren bzw. dessen Zellen oder Teilchen den jeweiligen Enzym-Inhibitor-Komplex an ihrer Oberfläche tragen und daß alsdann festgestellt wird, ob Agglutination eintritt oder nicht.

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Blutplasma mit einem Latex von Teilchen aus einem synthetischem Harz oder einer Suspension von Blutzellen in Kontakt gebracht wird, deren Teilchen oder Zellen Antikörper gegen eines des Enzym-Inhibitor-Komplexe an der Oberfläche tragen und daß alsdann festgestellt wird, ob Agglutination eintritt oder nicht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gegenwart des in Frage stehenden Enzym-Inhibitor- Komplexes im zu untersuchenden Blutplasma mit Hilfe der radialen Immunodiffusion, der quantitativen Immunoelektrophorese, auf radioimmunologischem Wege oder mit anderen bekannten Methoden festgestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die immunochemische Bestimmung des Enzym-Inhibitor-Komplexes im Blutplasma für die Diagnose intravaskulärer Blut-Kaogulationen, Thrombosen oder Hyperfibrinolysen beim Menschen angewandt wird.

6. Verfahren zum Herstellen eines geeigneten Antiserus für die Anwendung in der Methode gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß aus Blutplasma, in welchem das Blut-Kaogulations- oder das fibrinolytische System aktiviert worden ist, ein Enzym-Inhibitor-Komplex, der Teil de§ aktiVxötten Blut-Kaogulations oder • 7098U/0S81

fibrinolytischen Systems ist, auf physikalisch-chemischem Wege isoliert wird, daß Versuchstiere mit diesem isolierten Komplex injiziert werden und daß aus dem Blut der Versuchstiere ein Antiserum gegen den jeweiligen
Enzym-Inhibitor-Komplex gewonnen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß nicht-spezifische Antikörper im Antiserum durch
Zusatz von frischem oder plasminogenfreien Blutplasma zum frischen Antiserum inaktiviert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum durch Chromatographie über unlöslich gemachtem Blutplasma gereinigt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das unlöslich gemachte Blutplasma durch Kuppeln
von Blutplasma mit Agarose gewonnen wird, die mit Hilfe von Bromzyan aktiviert worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum durch Inkubation mit Plasminogen und frischem Blutplasma gereinigt wird, worauf die Gamma-Globulin-Fraktion aus dem Antiserum isoliert und resuspendiert wird.

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11. Antiserum, hergestellt nach den Verfahren gemäß
Anspruch 6 - 10.

12. Antiserum für die Verwendung in einem Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,daß es sich um Antiserum gegen den Enzym-Inhibitor-Komplex handelt, der Teil des aktivierten Blut-Koagulations- oder des fibrinolytischen Systems im Blutplasma ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines speziellen Reagenzes für die Anwendung beim Verfahren gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet/ daß eine wässrige Suspension von roten Blutzellen oder ein Latex von Teilchen aus synthetischem Harz mit einer wässrigen Lösung von einem der erwähnten Enzym-Inhibitor-Komplexe in Berührung
gebracht wird, so daß eine Suspension oder ein Latex erhalten wird, in dem der spezielle Enzym-Inhibitor-Komplex an der Oberfläche der Zellen oder Teilchen
vorhanden ist.

14. Reagenz, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 13.

15. Reagenz für die Anwendung beim Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wässrige Suspension von Blutzellen oder einen Latex aus Teil-

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chen eines synthetischen Harzes enthält, deren Zellen oder Teilchen an der Oberfläche einen Enzym-Inhibitor-Komplex tragen, der aus dem aktivierten Blut-Koagulations- oder dem fibrinolytischen System des Blutplasmas gewonnen worden ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines speziellen Reagenzes für die Anwendung beim Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Suspension von roten Blutzellen oder ein Latex von Teilchen aus synthetischem Harz mit einem Antiserum in Berührung gebracht wird, welches gemäß den Ansprüchen 6-10 hergestellt worden ist, so daß eine Suspension oder ein Latex gewonnen wird, in welchem die Antikörper des Antiserums an der Oberfläche der Zellen oder Teilchen anwesend sind.

17. Ein Reagenz, welches nach dem Verfahren gemäß Anspruch 16 erhalten worden ist.

18. Ein Reagenz für die Anwendung beim Verfahren gemäß Anspruch 3, welches aus einer Suspension von Blutzellen oder einem Latex von Teilchen aus synthetischem Harz besteht, wobei diese Zellen oder Teilchen Antikörper gegen einen Enzym-Inhibitor-Komplex an ihrer Oberfläche tragen, der aus dem aktivierten Blut-Koagulationsoder dem fibrinolytischen System des Blutplasmas ge-

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wonnen worden ist.

19. Verfahren zur Herstellung eines Enzym-Inhibitor-Komplexes, entsprechend dem Blut-Koagulations- oder dem fibrinoloytischen System, gekennzeichnet durch die Herstellung eines Plasmin-Antiplasmin-Komplexes mit einem Molekulargewicht von 120.000 - 140.000, welches eine immunochemische Reaktion mit Antiseren gegen Plasmin und Antiplasmin, jedoch keine immunochemische Reaktion mit Antiseren gegen andere bekannte Proteaseinhibitoren zeigt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Plasmin-Antiplasmin-Komplex auf physikalisch-chemischem Wege aus einem Blutplasma isoliert wird, in welchem das fibrinolytische System künstlich aktiviert worden ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Plasmin-Antiplasmin-Komplex durch Oberflächenchromatographie auf einer lysinsubstituierten Agaröse gewonnen wird.

22. Ein Plasmin-Antiplasmin-Komplex, der gemäß den Ansprüchen 19-21 hergestellt worden ist.

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23. Ein Plasmin-Antiplasmin-Komplex, dadurch gekennzeichnet/ daß er ein Molekulargewicht von 120.000 bis 140.000 hat und eine immunochemische Reaktion mit Antisera gegen Plasmin und Antiplasmin, jedoch keine immunochemische Reaktion mit anderen bekannten Proteaseinhibitoren zeigt.

24. Verfahren zum Herstellen eines Enzym-Inhibitor-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß ein Thrombin-Antithrombin-III-Komplex hergestellt wird, indem dieser Komplex auf physikalisch-chemischem Wege aus defibriniertem Blutplasma isoliert wird, in welchem das Blutkoagulationssystem künstlich aktiviert worden ist.

25. Verfahren·nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet/ daß der erwähnte Thrombin-Antithrombin-III-Komplex durch Oberflächenchromatographie auf heparin-substituierter Sepharose isoliert worden ist.

26. Ein Thrombin-Antithrombin-III-Komplex hergestellt nach den Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25.

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