DE3127318C2

DE3127318C2 -

Info

Publication number: DE3127318C2
Application number: DE3127318A
Authority: DE
Inventors: Johann Dr. Eibl; Otto Dr. Schwarz; Fritz Dr. Wien At Elsinger; Anton Ebenfurt At Philapitsch
Original assignee: Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1980-07-22
Filing date: 1981-07-10
Publication date: 1988-07-28
Also published as: NO157245C; US4395396A; AR227194A1; NO812500L; IT1142032B; FR2487199A1; SE460174B; HU188298B; DK155500B; LU83499A1; ES504000A0; GB2080312B; FR2487199B1; FI812295L; DK155500C; DE3127318A1; NO157245B; GB2080312A; IT8123070A0; NL8103329A

Description

Die Erfindung betrifft eine blutgerinnungsfördernde Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität.

Blutgerinnungsfördernde Präparationen mit Faktor VIII-Inhibito-Bypass-Aktivität, abgekürzt "FEIBA" (Factor Eight Inhibitor-Bypassing Activity), sind bekannt. In der AT-PS 3 50 726 (entsprechend der US-PS 41 60 025 bzw. der DE-OS 27 34 821) ist die Herstellung einer solchen Präparation beschrieben. Sie wird bei der Behandlung von Patienten, die an Hämophilie A leiden und deren Blut einen gegen Faktor VIII gerichteten Hemmstoff (Inhibitor) enthält, mit Erfolg angewandt. Die chemische Struktur des FEIBA-Faktors ist bisher unbekannt. Man weiß nur, daß es sich um ein Protein mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 000 handelt. Die Herstellung der Präparation nach den oben genannten Patentschriften erfolgte durch Generierung aus menschlichem, Zitat-Ionen enthaltendem Plasma in Abwesenheit von freien Calciumionen durch Behandlung mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffen, wie Kieselgel oder Kaolin, und anschließende Adsorption und Eluierung, wobei ein Gemisch der Faktoren II, VII, IX und X, des Faktors FEIBA und anderer Proteine erhalten wird, dessen Zusammensetzung bisher nicht beschrieben ist.

In der EP 00 41 173 A1 ist ebenfalls eine Präparation mit FEIB-Aktivität beschrieben, bei der die Generierung der FEIB-Aktivität mit Calciumionen vorgenommen wird. Über ihre spezifischen pharmakologischen Eigenschaften und ihr affinitätschromatographisches Verhalten ist nichts bekannt.

Des weiteren gehört zum Stand der Technik die DE-OS 22 62 520, aus der die Adsorption von Proteingemischen aus Humanplasma an basischen Ionenaustauschern mit nachfolgender Eluierung bekannt ist. Bei diesem Verfahren findet keine FEIB-Aktivitäts-Generierung statt.

Obwohl, wie erwähnt, die Präparation nach der DE-OS 27 34 821 sich bei der Behandlung von Faktor VIII-Inhibitor-Patienten als wertvoll erwiesen hat, besteht die Aufgabe, den Anwendungsbereich zu erweitern und die Verträglichkeit von FEIBA-Präparationen weiter zu verbessern, insbesondere unerwünschte Nebenreaktionen, wie thrombogene und vasoaktive Wirkungen, auf ein Minimum herabzusetzen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einer blutgerinnungsfördernden Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität gelöst, welche Präparation dadurch gekennzeichnet ist,

- daß sie frei ist von thrombogener Aktivität bis zu mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Kaninchen im Thrombose-induzierenden Aktivitätstest nach Wessler,
- daß sie frei ist von Kallikrein-Aktivität und frei von Präkallikrein-Aktivator-Aktivität - gemessen in einer wässerigen Lösung der Präparation mit einer FEIBA-Konzentration bis zu mindestens 10 Einheiten pro ml,
daß sie affinitätschromatographisch an Dextransulfat-Agarose mittels eines NaCl-Gradienten derart auftrennbar ist, daß das Protein mit Faktor IX-Aktivität bei niedriger NaCl-Konzentration eluiert als das Protein mit FEIB-Aktivität,
- daß die das Protein mit Faktor IX-Aktivität und das Protein mit FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate bei elektrophoretischer Auftrennung α- und β-Globuline enthalten, wobei die Auftrennungskurve im α-Bereich einen Hauptgipfel entsprechend 60 bis 80% des Gesamtproteins, eine daran anschließende Schulter von 10 bis 20% des Gesamtproteins sowie einen an den schulterförmigen Verlauf der Auftrennungskurve anschließenden schwach ausgeprägten Gipfel im β-Globulinbereich entsprechend einem Gehalt von 10 bis 20% des Gesamtproteins aufweist.

Die vorstehend definierten Merkmale, nämlich das Freisein der Präparation von thrombogener Aktivität und von Kallikrein-Aktivität bzw. von Präkallikrein-Aktivator-Aktivität - letztere sind für die vasoaktiven Wirkungen verantwortlich -, bedeuten, daß die Präparation eine hervorragende Verträglichkeit besitzt. Der Thromboseinduzierende Aktivitätstest und die Tests auf Kallikrein-Aktivität und Präkallikrein-Aktivator-Aktivität sind dem Fachmann bekannt. Im einzelnen werden diese im Anschluß an die Beispiele noch genauer angegeben.

Das dritte Merkmal der erfindungsgemäßen Präparation, die Auftrennbarkeit auf affinitätschromatographischem Weg an Dextransulfat-Agarose mittels eines NaCl-Gradienten ist in Fig. 1 der Zeichnung anhand eines Beispieles veranschaulicht. Die Methode der Affinitätschromatographie an Dextransulfat-Agarose ist dem Fachmann bekannt (D. S. Pepper and C. Prowse, Thrombosis Research 11 (1977), 687-692). Hierbei wird Dextransulfat (Molekulargewicht 500 000) an CNBr-aktivierte Sepharose 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gekoppelt. Die so gewonnene Dextransulfat-Sepharose wird in 0,4% Trinatriumcitrat · 2 H₂O-Lösung (pH 7,4) äquilibriert und in eine Säule gefüllt. Die zu untersuchende Probe wird auf die Säule aufgetragen und anschließend mit einer NaCl-Lösung in 0,4% Trinatriumcitrat · 2 H₂O (pH 7,4) mit steigender NaCl-Konzentration fraktioniert eluiert.

In Fig. 1 sind auf der Abszisse die Fraktionsnummern der Eluate aufgetragen. Auf der linken Ordinate sind die Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren in Einheiten pro ml aufgetragen und auf der rechten Ordinate die Konzentration des Natriumchlorid-Gradienten in mol/l. Der lineare Verlauf des Gradienten ist als Linie G eingetragen. Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, eluiert das Protein mit Faktor IX-Aktivität im Bereich von 0,1 bis 0,5 (molar), mit einem Maximum bei 0,3 (molar), das Protein mit FEIB-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration im Bereich von 0,3 bis 0,5 (molar), mit einem Maximum bei 0,4 (molar). Die steigende NaCl-Konzentration ist an dem NaCl-Gradienten G zu erkennen, der von 0 molar bis 0,65 molar NaCl reicht.

Schließlich ist für die erfindungsgemäße Präparation als viertes Merkmal auch der Gehalt an Globulinen bei elektrophoretischer Auftrennung charakteristisch, was in Fig. 2 der Zeichnung erläutert wird. Der obere Teil der Fig. 2 veranschaulicht die Auftrennungskurve der erfindungsgemäßen, die Proteine mit Faktor IX-Aktivität und FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate der Dextransulfat-Sepharose-Chromatographie anhand eines Beispieles, wogegen der untere Teil der Fig. 2 die elektrophoretische Auftrennungskurve eines nativen Humanplasmas wiedergibt. Es ist zu erkennen, daß bei diesem Beispiel der Hauptgipfel in α-Globulinbereich 70% des Gesamtproteins beträgt. An den Hauptgipfel schließt sich im a-Globulinbereich eine Schulter an, die 14% des Gesamtproteingehaltes ausmacht, worauf anschließend an die Schulter im β-Globulinbereich ein schwach ausgeprägter Gipfel folgt, der 16% des Gesamtproteins beträgt.

Weitere Merkmale der erfindungsgemäßen Präparation sind darin zu sehen, daß die FEIB-Aktivität nach einstündiger Inkubation in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma mindestens zu 50% erhalten bleibt. Diese Eigenschaft deutet auf eine länger anhaltende Wirksamkeit bei Applikation an Faktor VIII-Inhibitor-Patienten hin.

Eine andere Eigenschaft der erfindungsgemäßen Präparation besteht darin, daß die Faktor IX-Aktivität nach einstündiger Inkubation in Faktor IX-Mangelplasma mindestens zu 50% erhalten bleibt. Dies bedeutet, daß die Präparation wenig oder einen sehr geringen Anteil an aktiviertem Faktor IX enthält. Es ist bekannt, daß aktivierter Faktor IX in Humanplasma inaktiviert wird. Aktivierter Faktor IX würde nachteilige thrombogene Wirkungen verursachen. Aus der Literatur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74, No. 7, 3028-3032, Juli 1977, "In vitro and in vivo correlation of clotting protease activity: Effect of heparin" von S. N. Gitel, R. C. Stephenson und S. Wessler) ist bekannt, daß gerade der Faktor IXa gegenüber anderen aktivierten Gerinnungsfaktoren, wie Xa und IIa (Thrombin), die höchste thrombogene Wirksamkeit besitzt.

Schließlich besteht eine Eigenschaft der blutgerinnungsfördernden Präparation gemäß der Erfindung darin, daß sie einen Gehalt an Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor (ITI) von 0,05 bis 5 mg pro FEIBA-Einheit besitzt.

Der Gehalt an ITI bewirkt, daß die Thrombogenität der erfindungsgemäßen Präparation im Wessler-Test niedrig ist.

Die Erfindung umfaßt des weiteren zwei Verfahren zur Herstellung der neuen blutgerinnungsfördernden Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität.

Das eine Verfahren, bei dem das vorbehandelte Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität an einem basischen Ionenaustauscher auf Dextranbasis adsorbiert und unmittelbar darauf eluiert und konzentriert wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß Humanplasma mit sulfatierten hochpolymeren Kohlehydraten kurzzeitig vorbehandelt wird und ohne Abtrennung desselben anschließend die Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wird.

Das andere Verfahren, bei dem ein Proteingemisch aus Humanplasma an einem basischen Ionenaustauscher auf Dextranbasis adsorbiert wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß die Kontaktzeit des Ionenaustauschers mit dem daran adsorbierten Proteingemisch zwecks Generierung der FEIB-Aktivität mindestens zwei Stunden beträgt, worauf das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität eluiert und konzentriert wird. Bei dieser Ausführungsform ist die Generierung der FEIB-Aktivität an dem Ionenaustauscher von der Kontaktzeit abhängig. Diese kann bis zu 48 Stunden betragen.

Bei der Durchführung der Verfahren ist darauf zu achten, daß das Plasma bzw. die Reaktionsteilnehmer frei gehalten werden von Substanzen, die die Antithrombin III-Aktivität zu steigern imstande sind, wie Heparin oder Heparinoiden.

Die angewendeten Verfahrensmaßnahmen sind nicht kritisch und können in weiten Grenzen schwanken; so kann der pH-Wert zwischen 6 und 9 betragen, die Temperatur zwischen 0 und 40°C liegen, die angewendeten Mengen an Dextransulfat können 0,1 bis 500 mg/l Plasma betragen, und an DEAE-Sephadex können 0,01 bis 10 g/l Plasma eingesetzt werden. Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren kommt nicht nur natives Humanplasma, sondern auch Plasmafraktionen, z. B. Kryoüberstand und der Cohn-I-Überstand (8% Alkohol) in Frage.

Die Präparation gemäß der Erfindung und das Verfahren zu ihrer Herstellung werden in den folgenden Beispielen näher erläutert, wobei im Anschluß an die Beispiele die angewendeten Bestimmungsmethoden erläutert und die Ergebnisse tabellarisch erfaßt sind.

Beispiel 1

1000 l frisch gefrorenes menschliches Citratplasma werden bei 0 bis +4°C aufgetaut und das dabei anfallende Kryopräzipitat durch Zentrifugation bei +2°C abgetrennt. Dem resultierenden "Kryoüberstand" werden bei einem nativen pH-Wert von 7,7 10 g Dextransulfat (Molekulargewicht 500 000) zugesetzt und 15 Minuten bei +4°C gerührt, wobei die Substanz FEIBA generiert wird.

Hierauf werden 500 g des Anionenaustauschers DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4°C gerührt, wobei die generierte Substanz FEIBA zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) und inerten Proteinen an das unlösliche DEAE-Sephadex adsorbiert wird.

Das DEAE-Sephadex wird unmittelbar nach dem Adsorptionsvorgang durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin verwendet werden.

Das DEAE-Sephadex wird einem zweifachen Waschprozeß unterworfen; dabei wird das DEAE-Sephadex zuerst mit 50 l einer Lösung, bestehend aus 4 g/l Trinatriumcitrat · 2 H₂O, 7 g/l Natriumchlorid und 18 g/l Dinatriumhydrogen phosphat · 12H₂0 in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,5, während 15 Minuten bei +4°C gerührt. Nach Abtrennung durch Filtration wird das DEAE-Sephadex mit 50 l einer Lösung, bestehend aus 4 g/l Trinatriumcitrat · 2 H₂O und 7 g/l Natriumchlorid in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,5, während 15 Minuten bei +4°C gerührt und hierauf wieder durch Filtration abgetrennt.

Zur Elution wird das DEAE-Sephadex mit 25 l einer Lösung, bestehend aus 30 g/l Natriumchlorid und 1 g/l Trinatriumcitrat · 2 H₂O in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,0, während 20 Minuten bei +4°C gerührt. Das Eluat, enthaltend die generierte Substanz FEIBA, die Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) sowie inertes Protein, wird durch Filtration gewonnen, das DEAE-Sephadex wird verworfen. Das Eluat wird über Nacht gegen 1000 l destilliertes Wasser bei +4°C dialysiert, hierauf eingefroren und einem ersten Lyophilisationsvorgang unterworfen. In dem resultierenden Bulk-Material wird die FEIB-Aktivität bestimmt, u. zw. nach der in der DE-OS 27 34 821 beschriebenen Methode.

Für die Herstellung der pharmazeutisch anwendbaren Präparation mit FEIB-Aktivität wird das Bulk-Material in so viel destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst, daß die FEIB-Aktivität zwischen 10 und 50 FEIBA-Einheiten pro ml beträgt (vorliegendenfalls 25 FEIBA-Einheiten pro ml). Nach Zusatz der nötigen Salze zur Herstellung der Isotonie und Einstellung des pH-Wertes zwischen 7,0 und 7,5 wird die Lösung durch Membranfilter geklärt und zuletzt durch ein 0,2 µm Membranfilter sterilfiltriert. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen zu 20 ml in die Endbehälter verfüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.

Beispiel 2

1000 l frisch gefrorenes menschliches Citratplasma werden bei 0 bis +4°C aufgetaut und das dabei anfallende Kryopräzipitat durch Zentrifugation bei +2°C abgetrennt. Dem resultierenden "Kryoüberstand" werden bei einem nativen pH-Wert von 7,7 500 g des Anionenaustauschers DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4°C gerührt, wobei die Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) und inerte Proteine an das DEAE-Sephadex adsorbiert werden.

Hierauf wird das Gemisch 12 Stunden bei +4°C stehen gelassen; während dieser "Kontaktzeit" wird die Substanz FEIBA generiert.

Das DEAE-Sephadex wird nach der 12-stündigen "Kontaktzeit" durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin verwendet werden.

Die weitere Verarbeitung des DEAE-Sephadex (zweimalige Waschung, Elution etc.) erfolgt in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Der Thrombose-induzierende Aktivitätstest nach Wessler, welcher in der Literatur, u. zw. in J. Appl. Physiol. 14 (1959), 943-946, "Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum" von Stanford Wessler, Stanley M. Reimer und Mindel C. Sheps, beschrieben ist, wird folgendermaßen ausgeführt: Pro Test werden 3 Kaninchen verwendet. Die Tiere werden mit Nembutal narkotisiert; nach zusätzlicher lokaler Anästhesie wird die herzseitige vena jugularis freigelegt, im Abstand von 1 bis 2 cm werden zwei Ligaturen vorbereitet.

Das zu untersuchende Präparat wird nun in der gewünschten Dosis in die der freigelegten vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene innerhalb von 15 Sekunden injiziert. Innerhalb von 10 bis 25 Sekunden nach Beendigung der Injektion des Präparates werden die vorbereiteten Ligaturen zugezogen. Das isolierte Venensegment bleibt nun 10 Minuten in situ im Kaninchen. Hierauf wird das Venenstück aus dem Tier entfernt und in einer Petrischale in einer 5% Natriumcitrat-Lösung aufgeschnitten und der Inhalt nach folgendem Schema bewertet.

0 = kein Gerinsel
1 = wenige makroskopisch sichtbare Fibrinpartikel
2 = einige kleine Thromben
3 = zwei oder mehr große Thromben
4 = ein einziger, das ganze isolierte Venensegment ausfüllender Thrombus

Der Test im Falle einer 4-Reaktion als positiv gewertet. Für die erfindungsgemäße Präparation ist wesentlich, daß bei Injektion der Präparation, enthaltend bis zu mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Versuchstier, keine 4-Reaktion auftritt.

Die Bestimmung der Kallikrein-Aktivität und der Präkallikrein-Aktivator-Aktivität wird in folgender Weise durchgeführt.

KALLIKREIN 1. Methode

Kallikrein spaltet amidolytisch para-Nitroanilin (pNA) von einem spezifischen chromogenen Substrat ab. Die Konzentration von pNA wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

2. Reagenzien

Puffer:

Lösung A:3,03 g "TRIS" und 1,7 g Imidazol werden in 500 ml 0,1 n Salzsäure gelöst und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Lösung B:4,04 g "TRIS" und 2,27 g Imidazol werden in 500 ml 0,1 n Salzsäure gelöst und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Lösung C:11,69 g Natriumchlorid werden mit Wasser auf 1000 ml gelöst.

Lösung A und B werden solange gemischt, bis ein pH-Wert von 7,9 erreicht ist. Diese Mischung wird mit dem gleichen Volumen von Lösung C versetzt.

Chromogenes Substrat S-2302 (Firma Kabi, Stockholm):
H-D-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydrochlorid 1 milimolare Lösung von S-2302 25 mg in 41 ml Wasser.

Probe:
Die Probe wird im Originalvolumen gelöst und unverdünnt in den Test eingesetzt.

3. Test

In einem Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C werden in ein Plastikröhrchen

1,0 ml Puffer, vortemperiert auf 37°C
0,1 ml Probe
0,2 ml chromogenes Substrat S-2302

pipettiert. Diese Mischung wird in ein auf 37°C temperiertes Fotometer eingebracht und die Zunahme der optischen Dichte pro Minute (Δ OD/Min.) bei einer Wellenlänge von 405 nm, bei einer Schichtdicke von 10 mm, gemessen. Die Aktivität einer Probe wird in Δ OD/Min. ausgedrückt.

PRÄKALLIKREIN-AKTIVATOR 1. Methode

Aus einer gereinigten Präkallikreinpräparaten (PKK) wird mittels eines Präkallikreinaktivators (PKKA) Kallikrein (KK) generiert. Das Kallikrein spaltet amidolytisch para-Nitroanilin (pNA) von einem spezifischen chromogenen Substrat ab. Die Konzentration von pNA wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

2. Reagenzien

Puffer und chromogenes Substrat entsprechen den bei der Kallikrein-Bestimmung beschriebenen Reagenzien.

Präkallikreinpräparation:
Die Herstellung der Präparation erfolgt nach einer Vorschrift von Harpel, modifiziert von M. S. Horowitz (New York Blood Center). Dabei wird humanes Citratplasma mit Hilfe einer DEAE-Cellulose behandelt. Die nicht an DEAE-Cellulose gebundene Fraktion enthält das Präkallikrein.

Positive Kontrolle (Standard):
Als Standard (= Bezugswert) wird eine Albuminpräparation des Bureau of Biologics (BOB) der Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland 20 205, USA, verwendet. Diese Präparation enthält einen Präkallikreinaktivator. Die Kallikreingeneration mit diesem BoB-Standard stellt den Bezugswert 1 dar bzw. wird gleich 100% gesetzt.

Probe:
Die Probe wird im Originalvolumen gelöst und unverdünnt in den Rest eingesetzt.

3. Test

0,05 ml Präkallikreinpräpartion
0,05 ml Probe
a) BoB-Standard für den Bezugswert
b) Testprobe (in einem zweiten Testansatz)

pipettiert. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei 37°C wird

0,7 ml Pufferlösung
0,1 ml chromogenes Substrat S-2302

pipettiert. Diese Mischung wird in ein auf 37°C temperiertes Fotometer eingebracht und die Zunahme der optischen Dichte pro Minute (Δ OD/Min.) bei einer Wellenlänge von 405 nm, bei einer Schichtdicke von 10 mm, gemessen. Die Aktivität einer Probe (Δ OD/Min.) wird faktoriell - gegenüber dem BoB-Standard mit der Zahl 1 - bzw. in % vom BoB-Standard ausgedrückt.

Die Charakterisierung der erfindungsgemäßen Präparation durch affinitätschromatographische Auftrennung der Präparation an Dextransulfat-Sepharose wurde bereits in Verbindung mit Fig. 1 beschrieben.

Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine mit Faktor IX-Aktivität und mit FEIB-Aktivität, auf die in Verbindung mit Fig. 2 hingewiesen wird, kann in folgender Weise durchgeführt werden.

Als Träger für die elektrophoretische Auftrennung der verschiedenen Proteine dient eine Celluloseacetat-Membran, welche mit dem Elektrophoresepuffer (pH 8,6, Ionenstärke 0,075) befeuchtet ist. Auf dieser Membran werden die zu analysierenden Proben - zusammen mit einem normalen Humanplasma als Standard - aufgetragen und hierauf im elektrischen Feld aufgetrennt; die Trennung erfolgt dadurch, daß verschieden geladene Proteine im elektrischen Feld verschieden rasch wandern. Zu diesem Zweck wird die mit den Proben versehene Membran in einer speziellen, mit Elektrophoresepuffer gefüllten Zelle 16 bis 18 Minuten bei einer Spannung von 250 Volt und 4 bis 6 Miliampere anfänglicher Stromstärke behandelt.

Nach Beendigung des Trennvorganges werden die verschiedenen Proteine durch Einlegen der Membran in eine Fixier- bzw. Färbelösung sichtbar gemacht. Nach einigen Spülbädern wird die Membran in einem weiteren Bad transparent gemacht, auf eine Glasplatte aufgetragen und in einem Trockenschrank bei 100°C getrocknet.

Die getrocknete Membran wird nun in einem automatisch registrierenden und integrierenden Densitometer analysiert und ergibt Auftrennungskurven, wie in Fig. 2 dargestellt. Die verschiedenen Proteine erscheinen dabei als verschieden starke Banden, deren Flächen den Relativprozentwerten der entsprechenden Proteine proportional sind, wobei diese Flächen durch die automatische Integration des Densitometers bestimmt werden.

Die Zuordnung der verschiedenen Banden bzw. Proteine der Testprobe zu definierten Proteinen bzw. Proteingruppen erfolgt durch Vergleich mit den Banden des als Standard mitanalysierten normalen Humanplasmas. Letzteres wird bei der elektrophoretischen Analyse in 5 Proteingruppen aufgetrennt, welche definitionsgemäß - in der Reihenfolge abnehmender Wanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen Feld - wie folgt bezeichnet werden: Albumin, α-Globuline, β-Globulin, Fibrinogen und γ-Globulin.

Die Definition der FEIBA-Einheit sowie ihre Bestimmung (Wirksamkeitstest) ist in der Literatur, u. zw. in der AT-PS 3 50 726 (US-PS 41 60 025, DE-OS 27 34 821) beschrieben. Die Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X ist ebenfalls in der vorgenannten Literatur beschrieben.

Die Bestimmung der Restaktivität von FEIBA nach Inkubation in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma wird in folgender Weise durchgeführt.

1. Reagenzien

Die zu verwendenden Reagenzien sind in Verbindung mit der Bestimmung der FEIBA-Einheiten (Wirksamkeitstest) in der AT-PS 3 50 726 (US-PS 41 60 025, DE-OS 27 34 821) beschrieben.

2. Test

Von einer auf 50 FEIBA-Einheiten/ml eingestellten Präparation werden mit einer Lösung von 7 g/l Natriumchlorid und 7 g/l Natriumcitrat · 2H₂O als Verdünnungsmittel folgende Verdünnungen hergestellt: 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16, 1 : 32 und 1 : 64. Von diesen 6 Verdünnungen wird jeweils eine 1 : 10-Verdünnung in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma hergestellt (0,05 ml vorverdünnte Probe + 0,45 ml Faktor VIII-Inhibitor-Plasma).

Diese 1 : 10-Verdünnungen in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma ("Inkubationsgemische") werden nun sofort und nach einer Stunde Inkubation bei 37°C nach folgendem Testschema analysiert:

0,1 ml "Inkubationsgemisch
0,1 ml Phospholipid-Kaolin-Suspension 1 Minute bei 37°C inkubieren
0,1 ml m/40 Calciumchlorid

Die Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zur Gerinselbildung wird mit einer Stoppuhr wie im Wirksamkeitstest gemessen.

3. Berechnung der Restaktivität

Analog zur Beschreibung im Wirksamkeitstest wird nun mit den Gerinnungszeiten der sofort bestimmten Verdünnungen eine Eichkurve erstellt (unverdünnte Probe = 50 FEIBA-Einheiten/ml). Die Aktivitäten (FEIBA-Einheiten/ml) der eine Stunde inkubierten verschiedenen Verdünnungen werden nun unter Verwendung der Eichkurve berechnet und in Prozent der jeweiligen Aktivitäten der nicht inkubierten Verdünnungen ausgedrückt. Die Mittelwerte der so berechneten Aktivitäten ergeben dann die durchschnittliche Restaktivität der Probe nach einer Stunde Inkubation, ausgedrückt in Prozent der Ausgangsaktivität vor Inkubation.

Die Bestimmung der Restaktivität von Faktor IX nach Inkubation in Faktor IX-Mangelplasma wird in folgender Weise durchgeführt:

1. Reagenzien

Faktor IX-Mangelplasma: Citratplasma eines Patienten mit schwerer Hämophilie B (Faktor IX unter 1%).

Phospholipid/Kaolin-Suspension: PTT-Reagenz der Firma Immuno Diagnostica Ges.m.b.H. Für die Testung wird die erforderliche Menge Faktor IX-Mangelplasma mit einem gleichen Volumen Phospholipid/Kaolin-Suspension gemischt, 5 Minuten bei 37°C inkubiert und dann während der Testperiode in einem Eisbad aufbewahrt.
Citrat-/Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für Proben: 7 g/l Trinatriumcitrat · 2 H₂O, 7 g/l Natriumchlorid Calciumchlorid m/20 (0,05 molar): während der Testperiode bei 37°C aufbewahren.

2. Test

Von einer auf 50 Faktor IX-Einheiten/ml eingestellten Präparation werden 7 geometrische Verdünnungen (1 : 2, 1 : 4 etc. bis 1 : 128) mit Citrat-/Kochsalzlösung hergestellt. Von der unverdünnten Probe sowie von den 7 geometrischen Verdünnungen wird jeweils eine 1 : 10-Verdünnung in Faktor IX-Mangelplasma hergestellt (0,05 ml vorverdünnte Probe + 0,45 ml Faktor IX-Mangelplasma).

Diese 1 : 10-Verdünnungen in Faktor IX-Mangelplasma ("Inkubationsgemische") werden nun sofort und nach einer Stunde Inkubation bei 37°C nach folgendem Testschema analysiert, wobei jedes Inkubationsgemisch vor der Bestimmung 1 : 10 mit Citrat-/Kochsalzlösung verdünnt wird:
0,2 ml Gemisch von Faktor IX-Mangelplasma und Phospholipid/Kaolin
0,1 ml "Inkubationsgemisch", 1 : 10 verdünnt mit Citrat-/Kochsalzlösung
1 Minute bei 37°C inkubieren
0,1 ml m/20 Calciumchlorid

Die Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

3. Berechnung der Reaktivität

Mit den Gerinnungszeiten der sofort bestimmten Verdünnungen wird eine Eichkurve erstellt (unverdünnte Probe = 50 Faktor IX-Einheiten/ml), indem man die Gerinnungszeiten gegen die entsprechenden Verdünnungen auf doppelt logarithmischen Millimeterpapier aufträgt. Die Aktivitäten (Faktor IX-Einheiten/ml) der eine Stunde inkubierten verschiedenen Verdünnungen werden nun unter Verwendung der Eichkurve berechnet und in Prozent der jeweiligen Aktivitäten der nicht inkubierten Verdünnungen ausgedrückt. Die Mittelwerte der so berechneten Aktivitäten ergeben dann die durchschnittliche Restaktivität der Probe nach einer Stunde Inkubation, ausgedrückt in Prozent der Ausgangsaktivität vor Inkubation.

Immunologische Bestimmung des Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitors (ITI):

1. Methode

Die Bestimmung erfolgt mit der Ouchterlony-Technik, wobei ein spezifischer Antikörper gegen eine antigenhaltige Probe in einem Agarmedium diffundiert. Das Antigen reagiert spezifisch mit dem Antikörper und bildet eine Immunpräzipitationsbande, die als positive Reaktion gewertet wird.

2. Reagenzien

Antiserum gegen ITI vom Kaninchen, Behringwerke AG, Marburg/Lahn, BRD

Agar:
Eine Lösung von 1,25 g Agar, 0,9 g Natrimchlorid und 100 mg Natriumazid in 100 ml Wasser wird kurz aufgekocht und die heiße, homogene Lösung in einer Schichtdicke von ca. 2 mm in Platten gegossen. In das abgekühlte, verfestigte Gel werden im Abstand von 5 mm ca. 2 mm große Löcher in 2 Reihen gestanzt.

Standard bzw. Probe:
Als Eichsubstanz dient ein Protein-Standardserum der Behringwerke mit einem definierten Gehalt an ITI. Von diesem Referenzserum wird eine geometrische Verdünnungsreihe in physiologischer Natriumchlorid-Lösung (9 g NaCl/l) hergestellt. Mit der zu testenden Probe wird wie mit dem Standard verfahren.

3. Test

In eine Lochreihe des Agars werden die Verdünnungen der Eichsubstanz bzw. der zu testenden Probe eingebracht, in der nebenanliegenden Lochreihe wird das unverdünnte spezifische Antiserum pipettiert. Die so beschickte Agarplatte wird 15 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgt die Ablesung der Immunpräzipitationen.

4. Berechnung der ITI-Konzentration

Als Maßstab für die ITI-Konzentration einer Probe gilt jene Verdünnungsstufe, bei der gerade noch eine Präzipitation sichtbar ist ("Titer" der Probe). Die ITI-Konzentration der zu testenden Probe errechnet sich wie folgt:

Die ITI-Konzentration wird in mg % (mg/100 ml) angegeben.

Die nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Präparationen hatten nach Durchführung der vorstehenden Bestimmungsmethoden die folgenden Kennwerte:

Die Darstellungen in den Fig. 1 und 2 der Zeichnung entsprechen hinsichtlich der affinitätschromatographischen und elektrophoretischen Auftrennung den nachstehenden Angaben des Beispieles 2.

Claims

1. Blutgerinnungsfördernde Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität (FEIBA), dadurch gekennzeichnet,

- daß sie frei ist von trombogener Aktivität bis zu mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Kaninchen im Thrombose-induzierenden Aktivitätstest nach Wessler,
- daß sie frei ist von Kallikrein-Aktivität und frei von Präkallikrein-Aktivator-Aktivität - gemessen in einer wässerigen Lösung der Präparation mit einer FEIBA-Konzentration bis zu mindestens 10 Einheiten pro ml,
- daß sie affinitätschromatographisch an Dextransulfat-Agarose mittels eines NaCl-Gradienten derart auftrennbar ist, daß das Protein mit Faktor IX-Aktivität bei niedrigerer NaCl-Konzentration eluiert als das Protein mit FEIB-Aktivität,
- daß die das Protein mit Faktor IX-Aktivität und das Protein mit FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate bei elektrophoretischer Auftrennung α- und β-Globuline enthalten, wobei die Auftrennungskurve im α-Bereich einen Hauptgipfel entsprechend 60 bis 80% des Gesamtproteins, eine daran anschließende Schulter von 10 bis 20% des Gesamtproteins sowie einen an den schulterförmigen Verlauf der Auftrennungskurve anschließenden schwach ausgeprägten Gipfel im β-Globulinbereich entsprechend einem Gehalt von 10 bis 20% des Gesamtproteins aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung einer blutgerinngsfördernden Präparation nach Anspruch 1, bei dem das vorbehandelte Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität an einem basischen Ionenaustauscher auf Destranbasis adsorbiert und unmittelbar darauf eluiert und konzentriert triert wird, dadurch gekennzeichnet, daß Humanplasma mit sulfatierten hochpolymeren Kohlehydraten kurzzeitig vorbehandelt wird und ohne Abtrennung desselben anschließend die Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wird.

3. Verfahren zur Herstellung einer blutgerinnungsfördernden Präparation nach Anspruch 1, wobei ein Proteingemisch aus Humanplasma an einem basischen Ionenaustauscher auf Dextranbasis adsorbiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontaktzeit des Ionenaustauschers mit dem daran adsorbierten Proteingemisch zwecks Generierung der FEIB-Aktivität mindestens zwei Stunden beträgt, worauf das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität eluiert und konzentriert wird.