SE460174B - Blodkoagulationsbefraemjande preparation baserad paa humanproteiner liksom saett att framstaella densamma - Google Patents

Description

460 174 10 15 20 30 Denna uppgift löses enligt uppfinningen medelst en blodkoa- gulationsbefrämjande preparation baserad på humanproteiner med ett innehåll av koagulationsfaktorerna II, VII, IX och X och en faktor VIII-inhibitor-bypass-aktivitet, vilken pre- paration kännetecknas av - att den saknar trombogen aktivitet upp till minst 2 en- heter FEIBA per kg kanin i den trombosinducerande akti- vitetstesten enligt Wessler, - att den saknar kallikreinaktivitet och prekallikrein- -aktivator-aktivitet, mätt i en vattenhaltig lösning av preparationen med en FEIBA-koncentration på minst 10 en- heter per ml, - att den affinitetskromatografiskt på dextransulfat- -agaros medelst en NaCl-gradient kan uppdelas så, att proteinet med faktor IX-aktivitet elueras vid lägre NaCl-koncentration än proteinet med FEIB-aktivitet, - att eluaten som innehåller proteinet med faktor IX- -aktivitet och proteinet med FEIB-aktivitet vid elektro- foretisk separation innehåller 0¿- och /9-globulin, var- vid elueringskurvan i Cí~området uppvisar en huvudtopp motsvarande 60 - 80% av det totala proteinet, en därtill anslutande ansats motsvarande 10 - 20% av den totala pro- teinmängden liksom en till elueringskurvans ansatsfor- miga förlopp anslutande, svagt utpräglad topp i.,Û-globu- linområdet motsvarande ett innehåll av 10 - 20% av det totala proteinet.

De ovan definierade kännetecknen, nämligen att preparationen saknar trombogen aktivitet och kallikrein-aktivitet respek- tive prekallikrein-aktivator-aktivitet, den senare ansvarar för de vasoaktiva effekterna, innebär att preparationen besitter en utomordentlig fördragbarhet. Den trombosindu- cerande aktivitetstesten och testerna med avseende på kalli- krein-aktivitet och prekallikrein-aktivator-aktivitet är kända för fackmannen. Dessa beskrivas närmare i anslutning s l0 15 20 25 30 460 174 till utföringsexemplen.

Det tredje kännetecknet hos preparationen enligt uppfinningen, nämligen separationsförmågan på affinitetskromatografisk väg på dextransulfat-agaros medelst en NaCl-gradient åskådlig- göres i fig. l på ritningarna i anslutning till ett utförings- exempel. Metoden med affinitetskromatografi på dextransul- fat-agaros är förut känd för fackmannen (D;S. Pepper and C. Prowse, Thrombosis Research ll (1977), 687-692). Härvid kopplas dextransulfat (molekylvikt 500.000) på CNBr-aktiverad SePhflrOS@ 41C) (från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala).

Den så framställda dextransulfat-sefarosen ekvillibreras i 0,4% trinatriumcitrat - ZHZO-lösning (pH 7,4) och fylles i en kolonn. Provet som skall undersökas påföres kolonnen och elueras därefter i fraktioner medelst en NaCl-lösning i 0,4% trinatriumcitrat - 2H2O (pH 7,4) med stigande NaCl- koncentration.

I fig. l är på abskissan angivna eluatets fraktionsnummer.

På den vänstra ordinatan anges aktiviteterna för koagula- tionsfaktorerna i enheter per ml och på högra ordinatan koncentrationen på natriumklorid-gradienten i mol/l. Gra- dientens linjära förlopp är inlagd som linjen G. Såsom fram- går av fig. l elueras proteinet med faktor IX-aktivitet i området 0,1 - 0,5 (molar), med ett maximum vid 0,3 (molar), proteinet med FEIB-aktivitet vid en NaCl-koncentration i intervallet 0,3 - 0,5, med ett maximum vid 0,4. Den stig- ande NaCl-koncentrationen anges av NaCl-gradienten G, som löper från 0 till 0,65 molar NaCl.

Slutligen är för preparationen enligt uppfinningen som ett fjärde kännetecken också halten av globuliner vid elektro- foretisk separation kännetecknande, vilket visas närmare i fig. 2. Den övre delen i fig. 2 åskådliggör separations- kurvan för det proteinerna med faktor XX-aktivitet och 460 174 l0 15 20 25 30 FEIB-aktivitet innehållande eluatet enligt uppfinningen på dextransulfat-sefaros-kromatografi i anslutning till ett utföringsexempel, varemot den undre delen av fig. 2 åter- ger den elektroforetiska separeringskurvan för ett nativt humanplasma. Det skall noteras, att vid detta exempel hu- vudtoppen i 06-globulinområdet uppgår till 70% av den to- tala proteinmängden. Till huvudtoppen ansluter sig i Ci-globulinområdet en ansats, som utgör 14% av det totala proteininnehållet, varpå i anslutning till ansatsen i ß'-globulinområdet följer en svagt utpräglad topp, som upp- tar l6% av det totala proteininnehållet.

Företrädesvis består ytterligare ett kännetecken hos prepa- rationen enligt uppfinningen i, att FEIB-aktiviteten efter en timmes inkubation i faktor VIII-inhibitor-plasma förblir åtminstone 50%. Denna egenskap tyder på en längre bibehållen effekt vid användning på faktor VIII-inhibitor-patienter.

Företrädesvis består en ytterligare egenskap hos prepara- tionen enligt uppfinningen i, att faktor IX-aktiviteten efter en timmes inkubation i faktor IX-bristplasma bibe- hålles åtminstone till 50%. Detta betyder, att preparationen i någon eller mycket ringa utsträckning innehåller en akti- verad faktor IX. Det är förut känt, att aktiverad faktor IX i humanplasma inaktiveras. Aktiverad faktor IX skulle förorsaka ogynnsamma trombogena effekter. Av litteraturen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74, No. 7, 3028-3032, Juli 1977, “In vitro and in vivo correlation of clotting protease activity: Effect of heparin" von S.N. Gitel, R.C. Stephenson und S. Wessler) är känt, att just faktor IXa gentemot andra aktiverade koagulationsfaktorer, såsom Xa och IIa (trombin), besitter den högsta trombogena effek- ten.

Slutligen utgöres företrädesvis en egenskap hos den blod- l0 15 20 25 30 460 174 koagulationsbefrämjande preparationen enligt uppfinningen i, att den har en halt av inter-alfa-trypsin-inhibitor (ITI) på 0,05 - 5 mg per FEIBA-enhet.

Halten av ITI åstadkommer, att trombogeniteten hos prepara- tionen enligt uppfinningen är låg i Wessler-testet.

Uppfinningen omfattar dessutom ett sätt för framställning av den nya blodkoaguleringsbefrämjande preparationen base- rad på humanproteiner med ett innehåll av koagulationsfak- torerna II, VII, IX och X och en faktor VIII-inhibitor- -bypass-aktivitet, vilket sätt kännetecknas av att human- plasma behandlas med sulfaterade högpolymera kolhydrater och/eller med basiska jonbytare och att proteinblandningen med genererad FEIB-aktivitet adsorberas, varpå den genom eluering och koncentrering utvinnes.

Vid genomförande av sättet skall beaktas, att plasmat respektive reaktanterna hålles fria från substanser, som är i stånd att stegra antitrombin III-aktviteten, såsom heparin eller heparinoider.

Enligt en utföringsform av uppfinningen behandlas plasmat under kort tid med sulfaterade högpolymera kolhydrater, varefter proteinblandningen med genererad FEIB-aktivitet härpå adsorberas på en jonbytare baserad på dextran och elueras omedelbart därpå och koncentreras.

Enligt en andra utföringsform av uppfinningen behandlas plasmat med en jonbytare på dextranbas och efter åtminstone två timmars inverkan elueras den på jonbytaren adsorberade proteinblandningen med genererad FEIB-aktivitet och koncent- reras däfefter. Vid denna utföringsform är genereringen av FEIB-aktiviteten avhängig av påverkanstidslängden. Denna kan uppgå till 48 timmar. 460 174 10 15 20 25 De använda förfarandeåtgärderna är icke kritiska och kan varieras inom vida gränser. Sålunda kan pH-värdet ligga mellan 6 och 9, temperaturen mellan 0 och 40°C, de an- vända mängderna dextransulfat kan uppgå till 0,1 - 500 mg/1 plasma och DEAE-Sq$ßdexC)kan användas i en mängd av 0,01 - 10 g/l plasma. Som utgångsmaterial för sättet enligt uppfinningen ifrâgakommer inte endast nativt humanplasma utan också plasmafraktioner, t.ex. den överstående plasman av kryoprecipitat och precipitat I enligt Cohn (8% alkohol).

Preparationen enligt uppfinningen och sättet för dess fram- ställning beskrives närmare i de följande utföringsexemplen, varvid i anslutning till exemplen de använda bestämnings- metoderna förklaras och resultaten sammanfattas i tabell- form.

Exempel l: 1000 l färsk frusen humancitratplasma upptinas vid 0 - +4°C och därvid resulterande kryoprecipitat avscpareras genom centrifugering vid +2°C. Den resulterande “överstående kryolösningen" tillsättes vid ett nativt pH-värde på 7,7 l0 g dextransulfat (molekylvikt 500.000) och omröres under 15 minuter vid +4°C, varvid substansen FEIBA genereras.

Härpå tillsättes 500 g anjonbytare DEAE-sefadex A-SOCD och omröres i l/2 timme vid +4oC, varvid den genererade substansen FEIBA tillsammans med protrombinkomplexets faktorer (II, VII, IX, X) och inerta proteiner adsorberas på det olösliga DEAE-Sephadex .

DEAE-Sephadex(® avsepareras omedelbart efter adsorptions- processen genom centrifugering eller filtrering, och den överståendê plasman kan användas för utvinning av gamma- globulin och albumin. f: l0 15 20 25 30 460 174 DEAE-Sephadax()underkastas en tvåstegs tvättprocess, och därvid omröres DEAE-Sephadex först under 15 minuter vid +4°C med 50 l av en lösning, bestående av 4 g/l trinatrium- citrat 2H2O, 7 g/l natriumklorid och 18 g/l dinatrium- hydrofosfat l2H20 i destillerat vatten, ph-värde 7,5.

Efter avskiljning genom filtrering omröres DEAE-Sephadex åter igen under 15 minuter vid +4°C med 50 l av en lösning, bestående av 4 g/l trinatriumcitrat - 2H2O och 7 g/l natrium- klorid i destillerat vatten, pH-värde 7,5 och avskiljes här- på åter genom filtrering.

För elueringen omröres DEAE-Sephadexzéaxned 25 l av en lös- ning, bestående av 30 g/l natriumklorid och l g/l trinatrium~ citrat - ZHZO i destillerat vatten, pH-värde 7,0, under 20 minuter vid +4OC. Eluatet, som innehåller den genererade substansen FEIBA, protrombinkomplexfaktorerna (II, VII, IX, X) liksom inert protein, utvinnes genom filtrering, och det förbrukade DEAE-Sephadex över natten mot 1000 l destillerat vatten vid +4°C, fryses kastas. Eluatet dialyseras härpâ in och underkastas en första lyofiliseringsprocess.

I det resulterande bulkmaterialet bestämmes FEIB~aktiviteten, och närmare bestämt enligt den i DE-OS 27 34 821 beskrivna metoden.

För framställning av den farmaceutiskt användbara prepara- tionen med FEIB-aktivitet upplöses bulkmaterialet i så mycket destillerat, pyrogenfritt vatten, att FEIB-aktiviteten upp- går till mellan 10 och 50 FEIBA-enheter/ml ( i föreliggande fall 25 FEIBA-enheter/ml). Efter tillsats av nödvändiga salter för åstadkommande av isotoni och inställning av pH-värdet mellan 7,0 och 7,5 klaras lösningen genom membran- filter och sterilfiltreras till sist genom ett 0,2,um memb- ranfilter. Lösningen ifylles undnr sterila betingelser till 20 ml i slutbehâllaren, djupfryses och lyofiliseras. 460 _174 Exemoel 2: 1000 l fiàskt fryst humancitratplasma upptinas vid 0 - +4°C och det därvid resulterande kryoprecipitatet avskiljes genom centrifugering vid +2°C. Den resulterande överstâende 5 plasman tillsättes vid ett nativt pH-värde på 7,7 500 g av anjonbytaren DEAE-Sephadex A-50 och omröres i en halv timme vid +4°C, varvid protrombinkomplexfaktorerna (II, VII, IX, X) och inert protein adsorberas på nämnda DEAE-Sephadex _ Härpâ lämnades blandningen att stå 12 timmar vid +4oC, var- 10 vid under denna "kontakttid" substansen FEIBA genereras.

DEAE-Sephadex avsepareras efter denna 12 timmars "kontakt- tid" genom centrifugering eller filtrering, och den över- stående plasman kan användas för utvinning av gammaglobulin och albumin. 15 Den ytterligare bearbetningen av DEAE-Sephadexcë (tvåstegs tvättning, eluering etc.) sker på samma sätt, som beskrivits i Exempel l.

Den trombos-inducerande aktivitetstesten enligt Wessler, som beskrives i litteraturen, t.ex. J. Appl. Physiol. 20 lg (1959), 943-946, “Biologic assay of a thrombosis-in- ducing activity in human serum" von Stanford Wessler, Stanley M. Reimer und Mindel C. Sheps, utföres enligt föl- jande: För testet användes 3 kaniner. Djuren ges narkos med nembutal, och efter ytterligare lokal anestesi fri- 25 lägges den på hjärtsidan belägna vena jugularis, och på avståndet l - 2 cm förberedes tvâ ligaturer.

Preparatet som skall undersökas, sprutas nu in i den önskade dosen i den mot den frilagda vena jugularis på andra sidan liggande öronvenen inom 15 sek. Inom 10 - 25 sek. efter av- 30 slutningen av preparatets injicering dras de förberedda l l 2 h) (11 0 5 O 460 174 ligaturerna till. Det isolerade vensegmentet förblir nu under 10 min in situ i kaninen. Härpà avlägsnas venstycket ur djuret och snittas upp i en petriskål i en 5% natrium- citratlösning och innehållet utvärderas enligt följande schema. = ingen koagulering = ett fåtal makroskopiskt skönjbara fibrinpartiklar några små tromber = två eller fler stora tromber »àbJkll-'O ll = en enda, hela det isolerade vensegmentet utfyllande tromb När testet utvisar en 4-reaktion värderas det som positivt.

För preparationen enligt uppfinningen är det väsentligt, att vid injektion av preparationen, innehållande upptill åtminsto- ne 2 enheter FEIBA per kg försöksdjur, ingen reaktion 4 upp- träder.

Bestämningen av kallikrein-aktiviteten och prekallikrein- -aktivator-aktiviteten genomföres på följande sätt.

KALLIKREIN: l. Metod: Kallikrein spaltar amidolytiskt av p-nitroanilin (pNA) från ett specifikt kromgent substrat. Koncentrationen pNA upp- mätes Fotometriskt vid en våglängd på 405 nm. 2. Reagenser: Buffert: Lösning A: 3,03 g "TRIS" och 1,7 g imidazol upplöses i 500 ml 0,1 normal saltsyra och vatten påfyllcs upp till 1000 ml. 4,04 g "TRIS" och 2, Lösning B: 27 q imidazol upplöses i 500 460 174 10 ml 0,1 normal saltsyra och vatten fylles på upp till 1000 ml. I Lösning C: 11,69 g natriumklorid upplöses i vatten till 1000 ml. 5 Lösning A och B blandas tills ett pH-värde på 7,9 uppnås.

Denna blandning försättes med samma volym av lösning C.

Kromogent substrat S-2302 (Firma Kabi, Stockholm): H-D-Prolyl-L-fenylalanyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydro- klorid LO 1 mM lösning av S-2302: 25 mg i 41 ml vatten.

PIOV:, Provet upplöses i ursprungsvolymen och användes outspätt i testet. 3. Test: 15 I ett vattenbad vid en temperatur på 3700 pipetteras i ett plaströr 1,0 ml buffert, förtempererat till 37°C, 0,1 ml prov och 0,2 ml kromogent substrat S-2302. Denna blandning införes i en till 37°C tempererad fotometer och ökningen av den optiska tätheten per minut (ÅÄ OD/min) uppmätes vid en 20 våglängd pâ 405 nm, och vid en skikttjocklek på 10 mm.

Aktiviteten för ett prov uttryckas i ÃÄOD/min.

PREKALLIKREIN-AKTIVATOR: 1. Metod: Av en renad prekallikrcinpreparation (DKK) genereras mdelst en pre- 25 kallikreinaktivator (PKKA) kallikrein (KK). Kallikreinet spaltar amidolytiskt av p-nitroanilin (pNA) från ett speci- fikt kromogent substrat. Koncentrationen av pNA bestämmas fotometriskt vid en våglängd på 405 nm. l5 20 460 174 ll 2. Reagenser: Buffert och kromogent substrat motsvarande de vid kallikrein- -bestämningen beskrivna reagenserna.

Prekallikreinpreparation: Preparationens framställning sker enligt vad Harpel före- skriver, modifierat av M.S. Horowitz (New York Blood Center).

Därvid behandlas humant citratplasma med hjälp av en DEAE- ~cellulosa. Den fraktion som inte är bunden vid DEAE-cellu- losan innehåller prekallikreinet.

Positiv kontroll (standard): Som standard (=referensvärde) användes en albuminpreparation från Bureau of Biologics (BOB), Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland 20205, USA. Denna preparation innehåller en prekallikreinaktivator. Kallikreingenereringen med denna BOB-standard utgör referensvärdet l respektive sättes lika med l00%.

Prov: Provet upplöses i originalvolymen och användes outspätt i testet. 3. Test: I ett vattenbad vid en temperatur på 37OC pipetteras i ett plaströr 0,05 ml prekallikreinprcparation, 0,05 ml prov a) BoB-standard för referensvärdet och b) testprovet (i en andra testomqång). Efter en inkubation på 10 minuter vid 3700 pipetteras 0,7 ml buffertlösning och 0,1 ml kromogent substrat S~2302. Denna blandning införas i en till 37oC tempererad fotometer och ökningen i den optiska tätheten per minut (ÄÄOD/min) uppmätes vid en våglängd på 405 nm vid en skikttjocklek på 10 mm. Aktiviteten hos ett prov (KÄ OD/min) uttryckes faktoricllt - mot BQB-standarden med talet l - respektive i % av BOB-standarden. 460 174 l0 15 20 25 30 12 Karaktäriseringen av preparationen enligt uppfinningen genom affinitetskromatografisk separation av preparationen Vi: på dextransulfat-Sepharose har beskrivits i anslutning till fig. 1.

Den elektroforetiska separationen av proteinet av faktor IX-aktivitet och med FEIB-aktivitet, varvid hänvisas till fig. 2, kan genomföras på följande sätt.

Som bärare för den elektroforetiska separationen av de olika proteinerna fungerar ett cellulosaacetat-membran, vilket är fuktat med elektroforesbufferten (pH 8,6, jonstyrka 0,075).

På detta membran pâföres provet som skall analyseras till- sammans med ett normalt humanplasma som standard och upp- delas härefter i det elektriska fältet. Separationen sker genom att de olika laddade proteinerna vandrar olika snabbt i det elektriska fältet. Härför behandlas det med proven försedda membranet i en speciell, med elektroforesbuffert fylld cell under 16 till 18 minuter vid en spänning på 250 volt och en begynnelseströmstyrka på 4 - 6 milliampere.

Efter avslutning av separationsprocessen göres de olika proteinerna synbara genom inläggning av membranet i en fixer- respektive färglösning. Efter några spolbad göres membranet i ett ytterligare bad transparent, pålägges på en glasplatta och torkas i ett torkskåp vid l00OC.

Det torkade membranet analyseras nu i en automatiskt regist- rerande och integrerande densitometer och ger upphov till separationskurvan,som visas i fig. 2. De olika proteinerna framstår därvid som olika starka band, vars ytor är propor- tionella mot den relativa procentandelen au ifrågavarande protein, varvid dessa ytor kan bestämmas genom den auto- 5 matiska integrationen som utförs av densitometern. l0 15 20 25 460 174 13 Tillordnandet av de olika banden respektive proteinerna i testprovet till definierade proteiner respektive pro- teingrupper sker genom jämförelse av banden med det som standard medanalyserade normala humanplasmat. Det senare uppdelas vid elektroforetisk analys i 5 proteingrupper, vilka definitionsmässigt - i ordningsföljd med avtagande vandringshastigheter i det elektriska fältet - betecknas enligt följande: albumin, 0%-globulin, /6-globulin, fibrinogen och y -globulin.

Definitionen av FEIBA-enheten liksom dess bestämning (verk- samhetstest) finns beskrivet i litteraturen, och närmare bestämt i AT-PS 350.726 (US-PS 4.160.025, DE-OS 27 34 821).

Bestämningen av aktiviteten hos koaguleringsfaktorerna II, VII, IX och X finns likaledes beskriven i ovannämnda litte- ratur.

Bestämningen av restaktiviteten av FEIBA efter inkubation i faktor VIII-inhibitor-plasma genomföres på följande sätt. l. Reagenser: Reagenserna som skall användas vid bestämningen av FEIBA- -enheten (verksamhetstest) beskrives i AT-PS 350.726 (US-PS 4.160.025, DE-OS 27 34 821). 2. Test: Av en på 50 FEIBA-enheter/ml inställd preparation beredes med en lösning av 7 g/l natriumklorld och 7 g/l natrium- citrat - 2H2O som utspädningsmedel följande utspädningar: 1:2, 1:4, 1:8, l:l6, 1:32 och l:64. Av dessa 6 utspädninqar beredes vardera en 1:10-utspädning i faktor VIII-inhibitor- -plasma (0,05 ml förutspätt prov + 0,45 ml faktor VIII- -inhíbitor-plasma). 460 10 15 20 25 174 14 Dessa 1:10-utspädningar i faktor VIII-inhibitor-plasma ("inkubationsblandning") analyseras nu genast och efter en timmes inkubation vid 37°C enligt följande testschema: 0,1 ml "inkubationsblandning" 0,1 ml fosfolipid-kaolin-suspension inkubering 1 minut vid 37°c 0,1 m1 m/4o kaiciumkioria ' Tiden från kalciumkloridtillsatsen till koagulering upp- mätes medelst ett stoppur såsom i verksamhetstesten. 3. Beräkning av restaktiviteten: Analogt med beskrivningen av verksamhetstestet framställ~ des nu med koaguleringstiderna för deredan bestämda ut- spädningarna en kalibreringskurva (outspätt prov = 50 FEIBA-enheter/ml). Aktiviteterna (FEIBA-enheter/ml) för de en timme inkuberade olika utspädningarna beräknas nu under användning av kalibreringskurvan och uttryckes i procent av respektive aktiviteter för de icke inkuberade utspädningarna. Medelvärdet för de så beräknade aktivi- teterna ger då provets genomsnittliga restaktivitet efter en timmes inkubation, uttryckt i procent av utgångsaktivi- teten före inkubation.

Bestämningen av restaktiviteten av faktor IX efter in- kubering i faktor IX-bristplasma genomföres på följande sätt: 1. Reagenser: Faktor IX-bristplasma: Citratplasma från en patient med svår haemophili B_(íaktor IX under l %).

Fosfolipid/kaclin-suspension: PTT-reagens från firma V? 10 15 20 25 30 460 174 15 Immuno Diagnostica GmbH. För testningen blandas den erforderliga mängden faktor IX-bristplasma med en lika stor volym fosfolipid/kaolin~suspension, inkuberas 5 minuter vid 37oC och förvaras sedan under testperioden i ett isbad.

Citrat-/koksaltlösning som utspädningsmedel för proverna: 7g/l trinatriumcitrat-2H2O, 7 g/l natriumklorid.

Kalciumklorid m/20 (0,05 molar): hâlles vid 37°C under testperioden. 2. Test: Av en på 50 faktor IX-enheter/ml inställd preparation framställes 7 geometriska utspädningar (1:2, 1:4 etc. till 1:128) med citrat-/koksaltlösning. Av det out- spädda provet liksom av de 7 geometriska utspädningar- na framställes vardera en 1:10-utspädning i faktor IX- bristplasma (0,05 ml outspätt prov + 0,45 ml faktor IX- bristplasma).

Dessa 1:10-utspädningar i faktor IX-bristplasma ("inkuba- tionsblandning") analyseras nu genast och efter en tim- mes inkubation vid 37OC enligt följande testschema, var- vid varje inkubationsblandning före bestämningen ut- spädes 1:10 med citrat-/koksaltlösning: 0,2 ml av en blandning av en faktor IX-bristplasma och fosfolidpid/kaolin 0,1 ml "inkubationsblandning" utspätt 1:10 med citrat~/koksaltlösning inkubering 1 minut vid 37OC 0,1 ml m/20 kalciumklorid Tiden från kalciumklorid~tillsatsen fram till koagulering uppmätes med ett stoppur. 460 174 16 10 15 20 25 30 3. Beräkning av restaktiviteten: Med koaguleringstiderna hos de omedelbart bestämda ut- a spädningarna uppritas en kalibreringskurva (outspätt prov = 50 faktor IX-enheter/ml), varvid man ritar upp koaguleringstiderna mot motsvarande utspädning på dub- belt logaritmiskt millimeterpapper. Aktiviteterna (faktor IX-enheter/ml) hos de en timme inkuberade olika utspädningarna beräknas nu med hjälp av kalibrerings- kurvan och uttryckes i procent av rådande aktivitet hos de icke inkuberade utspädningarna. Medelvärdet för de så beräknade aktiviteterna ger sedan den genomsnittliga restaktiviteten hos provet efter en timmes inkubation, uttryck i procent av utgångsaktiviteten före inkubationen.

Immunologisk bestämning av inter-alpha-trypsin-inhibi- torerna (ITI): 1. Metod: Bestämningen sker med ouchterlony-tekniken, varvid en specifik antikropp diffunderar mot ett antigenhaltigt prov i ett agarmedium. Antigenet reagerar specifikt med antikroppen och bildar ett immunprecipitations- band, som betecknas som positiv reaktion. 2. Reagenser: Antiserum mot ITI från kanin, Behringswerke AG, Marburg/ Lahn, BRD.

Agar: En lösning av 1,25 g agar, 0,9 g natriumklorid och 100 mg natriumacid i 100 ml vatten uppkokas hastigt och den heta, homogena lösningen hälles i en skikttjocklek av cirka 2 mm i plattor. I den avkylda, stelnade gelen stan- sas på ett avstånd av 5 mm cirka 2 mm stora hål i två (jo rader. 10 15 20 N 'al 460 174 17 Standard respektive prov: Ett protein-standardserum från ovannämnda Behringswerke fungerar som kalibreringssubstans med en definierad halt av ITI. Från detta referensserum framställes en geomet- risk utspädningsrad i fysiologisk natriumkloridlösning (9 g NaCl/l).

Med provet som skall testas förfars på samma sätt som med standardprovet. 3. Test: I en hålrad i nämnda agar införes utspädningarna av kalibreringssubstansen respektive provet som skall testas, i angränsande hålrad pipetteras det outspädda specifika anti- serat. Den så beskickade agarplattan inkuberas 15 timmar vid 37OC. Härefter sker avläsningen av immunprecipitationen. 4. Beräkning av ITI-koncentrationen: Som måttstock för ITI-koncentrationen hos ett prov gäller varje spädningssteg, vid vilket precis ytterligare en precipitation kan skönjas (provets "titer"). ITI-koncentra- tionen hos provet som skall testas beräknas enligt följande: E ñ __ , _ . šââšdígšâšš ïåïâí x standardens ITl koncentration ITI~koncentrationen anges i mg % (mg/100 ml).

De enligt exemplen l och 2 framställda preparationerna hade efter genomförande av ovanstående bestämningsmetoder följ- ande kännetecken: Frænnställningarna på fig. 1 och 2 på ritningen motsvarar vad beträffar den affinitetskromatografiska och elektroforetiska sepa- rationen de efterföljande angivelserna för exempel 2. 18 460 174 HUMZ E AUMZ E HOMZ E HUMZ E o«.o @m_o|,m_° o~.o om_o|mf_o HUMZ E AUMZ E HUMZ E HUMZ E ~«~o m«_o|m~.@ Pm~o m«.o| øfl> nmumsfim uwufi>Huxm|mHmm flmšflxmz Uflb Umuwflaw umufl>fluxmImHwh @fi> wmuwsfiø »m»H>fi»xm1xH.m ñmsfixmz @fl> wmuwsfio uoufl>fluxm|xH.@ wmoumsmmmrumuflsmcmuuxmc mm flumumoumëouxmumwficfiwwæ mx\m| m1\m| >m mcwuowon co Hflflß man cmxuw> cmmonëouu >m @m:xmm>m "MÜUMÜSI-Hüfimmwv» .w flüflflxwflüvfim CUÜOQEOHB f.mN f~wN H§\Hmvm:cm|x Houxmh «_>N N.mN fiE\umum:cm|xH uopxøm m_w~ o_«~ He\Hmuwncø|HH> Houxøæ o~mN w.mN HE\umu@ccw1HH Houxmh ~.«~ Q~@~ fie\~wpw:c@1 N fimmšwxm fi flwmëmxm umflficw uflfimßwsøww =ofi»m»mmwH@| 460 174 19 m« m1 uowflnflscficflmaæuulmmHmlnwuzfi wammHm1»wfl~Q1xH.m fl coflwmnøxøfl w mm w om wmëëfiu H umuwm xfl uouxmm umuflbfluxæumøm w mammH@|~øuHn@::fl|HHH>.@ H cofiuflnøßcfl w ßm w mw mmšeflu H uwwwø dmfimm um~fl>Hflxmwmox w o o @wnH>Huxm1HOum>fluxmxflfimnxflHfimxwum o o umu«>Hwxm|:HmuxflHHmm w mv w ßw CfiHDQOfiOIQ w vw w mv mumwcm _:flH:noflm|8 w on w ßw ßmOuUS>DL ;ÅH:QoH@|K uwufl>«uMm|mHmm 500 |XH.m GWE møumcflwvoum >m coflumummww xmflwwnomouuxwflm N fimmšmxm H awmšmxm umflflcw øflfimuwämnw cofiumHmmmHm|4mHmh L. ^coHHwQm4w@ .møuow.

Claims (8)

460 174 10 15 20 25 30 20 P a t e n t k r a v

1. Blodkoagulationsbefrämjande preparation på basis U) av humanproteiner med ett innehåll av koagulations- faktorerna II, VII, IX och X och en faktor VIII- inhibitor-bypass-aktivitet, k ä n n e t e c k n a d av - att den saknar trombogen aktivitet upp till minst 2 enheter FEIBA per kg kanin i den trombosinducerande aktivitetstesten enligt Wessler, - att den saknar kallikreinaktivitet och prekallikrein- aktivator-aktivitet, mätt i en vattenhaltig lösning av preparationen med en FEIBA-koncentration på minst 10 enheter per ml, - att den jonbyteskromatografiskt på dextransulfat- agaros medelst en NaCl-gradient kan uppdelas så, att proteinet med faktor IX-aktivitet elueras vid lägre NaCl-koncentration än proteinet med FEIB-aktivitet, - att eluaten som innehåller proteinet med faktor IX- aktivitet och proteinet med FEIB-aktivitet vid elektro- foretisk separation innehåller ot - och ß -globulim varvid elueringskurvan iii-området uppvisar en huvud- topp motsvarande 60 - 80% av det totala proteinet, en därtill anslutande ansats motsvarande 10 - 20% av den totala proteinmänqden liksom en till eluerings- kurvans ansatsformiga förlopp anslutande, svagt ut- präglad topp i/2-globulinområdet motsvarande ett inne- håll av 10 - 20% av det totala proteinet.

2. Preparation enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att proteinet med faktor IX-aktivitet elueras vid en NaCl-koncentration på 0,1 - 0,5 (molar) och att proteinet med FEIB-aktivitet elueras vid en NaCl-koncentration på 0,3 - 0,5 (molar), varvid den maximala faktor IX- /Jà aktiviteten elueras vid 0,3 (molar) och den maximala FEIB-aktiviteten elueras vid 0,4 (molar). f; 10 15 20 25 30 460 174 21

3. Preparation enligt krav 1 och 2, k ä n n e - t e c k n a d av att FEIB-aktiviteten efter en timmes inkubation i faktor VIII-inhibitor-plasma bibehålles åtminstone till 50%.

4. Preparation enligt krav 1 och 2, t e c k n a d av att faktor IX-aktiviteten efter en timmes inkubation i faktor IX-bristplasma bibehålles k ä n n e ; åtminstone till 50%.

5. Preparation enligt krav 1 - 4, k ä n n e - t e c k n a d av att den har ett innehåll av inter-alfa-trypsin~inhibitor (ITI) på 0,05 - 5 mg per FEIBA-enhet.

6. Förfarande för framställning av en blodkoagulations- befrämjande preparation enligt krav 1 - 5, k ä n n e - t e c k n a t av att humanplasma behandlas med sulfa- terade högpolymera kolhydrater och/eller med basiska jonbytare och att proteinblandningen med genererad FEIB-aktivitet adsorberas, varpå den utvinnes genom eluering och koncentrering.

7. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att plasmat först under kort tid behandlas med sulfa- terade högpolymera kolhydrater, att proteinblandningen med genererad FEIB-aktivitet sedan adsorberas på en jonbytare på dextranbasis och omedelbart därpå elueras och koncentreras.

8. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att plasmat behandlas med en jonbytare på dextranbasis och efter minst två timmars inverkan den på jonbytaren adsorberade proteinblandningen med genererad FEIB- aktivitet elueras och därefter koncentreras.