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Verfahren zur Entfernung von Viren aus Blut während der Entnahme
oder Übertrageung Es ist seit langem üblich, entnommenes Blut im ganzen zu verwenden,
um Blutverluste im Kreislauf von Patienten zu ersetzen, insbesondere bei chirurgischen
Operationen. Seit vielen Jahren ist es aber auch bekannt, daß bei solchen Bluttransfusionen
ein Risiko besteht, weil dabei auch Viren als Kreinkheitsträger übertragen werden
können. Bisher sind beim L'ntnehmen, aufbewahren und Übertragen von Blut keine Methoden
bekannt, um die etwaige Pnwesenheit von Viren im Blut festzustellen und diese Viren
während der Entnahme oder tabertragung des Blutes zu entfernen.
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Es wird angenommen, daß jährlich viele Tausende von Patienten Infektionen
erleiden, weil mit Viren infiziertes Blut für Blutübertragungen benutzt wurde. In
vielen Fällen sind in dieser Weise erworbene Infektionen tödlich. Unter den verschiedenen,
auf diese Weise übertragbaren Krankheiten überwiegt die Infektion mit Virus Hepatitis.
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Da Blutspender im Bedarfsfall nicht immer verfügbar sind, wurden Methoden
entwickelt, um Blut zu sammeln, zu konservieren und das Blut als Ganzes bei Gefriertemperaturen
zu lagern. Die Anwendung solchen gelagerten Blutes, welches im allgemeinen etwa
21 Tage lang verwendungsfähig bleibt, für Blutübertragungen ist heute allgemein
üblich.
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Um Blut als Ganzes lagern zu können, muß es in einer 1rt und Weise
gelagert werden, daß es nicht coagulieren kann. Dafür wurden mehrere Methoden entwickelt,
unter anderem die Anwendung von chemischen coagulationshemmen'den Mitteln, wie spuren
nitraten und Heparin, und die Anwendung von Ionenaustauscherharzen.
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So ist es üblich, Blut in eine wässrige Lösung eines coagulationshemmenden
Mittels einzugießen und es zu stabilisieren und die Klumpenbildung u.s.w. zu verhindern.
Ferner wird normalerweise Blut mit elektrolytfreien Lösungen verdünnt, um spontane
Hämolyse zu verhindern. Als ein wirksames,nicht elektrolytisches Verdünnungsmittel
hat sich Dextrose erwiesen, welche nicht nur
die Hämolyse inhibiert,
sondern auch als Substrat für glycolytische Enzyme der Erythrocyten im Blut dient.
Außerdem scheint die Dextrose während der Lagerungszeit Energie für den Metabolismus
der Blutzellen zu liefern.
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In manchen Fällen läßt sich stabiles Blut ohne Anwendung von chemischen
coagulationshemmenden Mitteln sammeln, inden man mit Hilfe von Kationenaustauscherharzen
das Kalzium aus dem Blut entfernt. Da das Calzium die Coagulation des Blutes einleitet,
sobald dasselbe aus dem Körperkreislauf entnommen ist, macht die Entfernung des
Calziums mit Hilfe von Kationenaustausoh die Anwendung löslicher, chemischer coagulationshemmender
Mittel entbehrlich. Unabhängig von der jeweils angewendeten Sammeliethode wird üblicherweise
Dextrose dem zu lagernden Blutzugesetzt, um die Hämolyse der roten Zellen zu verhindern
und Energie für den Metabolismus der Blutzellen wlihrend der Lagerung zu liefern.
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Ungeachtet der recht umfangreichen Anwendung der eben erwähnten Methoden
zum Sammeln von Blut als Ganzem, hat jede derselben verschiedene Nachteile. Blut,
das nach der Entnahme mit einer sauren Lösung von Zitrat und Dextrose (ACD) konserviert
und im Kühlschrank bei + 50 C gelagert wird, erleidet einige Veränderungen, welche
für den Patienten, der schließlich dieses Blut in seinen Organismus aufnimmt, schädlich
sein können. In erster Linie tritt eine Senkung des PH-Wertes von der üblichen Größenordnung
von 7, - 7,40 auf etwa 6,5 ein. Dann nimmt der Gehalt an Plasma-Hämoglobin, Kalium,
Ammonium, Pyruvat, Lactat und Phosphat zu. Wenn derart verändertes Blut einem Patienten
in großen Mengen selbst über einen kurzen Zeitraum zugeführt wird, da kann Herzstillstand
eintreten. Außerordentlich gefährlich ist dieses Blut für Patienten mit erkrankten
Nieren und Lebern. Die ange stiegenen Ammonium-Konzentrationen können in solchen
Fällen hepatitisches Coma auslösen. Uyperkalemie kann bei elektrokardiographischen
Anomalien,
Arrhythnien oder Asystolen des Herzens eintreten.
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Der Kationenaustausoherprozess beim Blutsammeln wirft noch ein anderes
Problem auf, da die üblicherweise angewendete Methode nicht nur das Calium sondern
praktisch auch das gehemmte Kalium entfernt. Obwohl gelagertes ganzes Blut seinen
Kaliumgehalt steigert, welcher dem Patienten unter Umständen ernste Komplikationen
bringen kann und obwohl dieser Kaliumspiegel daher gesenkt werden auß, darf der
spiegel nicht unter die normale Menge von etwa 4 Milliäquivalent im Liter sinken,
da sonst Häaolyse eintritt und das Blut nicht mehr für Ubertragungen geeignet ist.
In der US-Patentschrift 2 833 691 wurde beschrieben, daß es ein kritisches Verhältnis
von Kalium zu Natrium gibt, welches im Blutplasma und in den Blutsellen aufrechterhalten
werden muß, um übermäßige Hälolyse zu vermeiden und eine Jteigerung der Zellbrüchigkeit
Ru verhindern. Zu diesem Zweck wird gemä# der genannten Patentschrift ein Gemisch
von auf PH 7,2 -7,4 gepufferten Kationenaustauscherharzen benutzt, von denen ein
Teil in der Form des Kaliumealsea, der andere Teil in der Form des Natriumealzes
vorliegt.
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Die geschilderten Schwierigkeiten fallen bereits recht stark ins Gewioht,
wenn normale unmittelbare Blutübertragungen mit Hilfe von gelagertem ganzem Blut
ausgeführt werden. Sie vervielfältigen sich aber noch erheblich, wenn sehr große
Mengen gelagertes Blut in massiven Dosen zugeführt werden müssen, beispielsweise
in Operationen am geöffneten Herzen unter Anwendung der Herz-Lungen-Maschine. llinzu
tritt auch noch die Gefahr, daß der Patient bei Jeder einzelnen Bluttransfusion
eine Viruserkrankung erleidet, da keine der bekannten Sammel- une Konservierungsmethoden
g@@ignet ist, Viren aus dem Blut zu entfernen. Bisher hatte dieses Problem noch
keine Lösung gefunden.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, das erstmalig dieses Problem
löst und krankheitsverursachende Viren aus dem Blut entfernt.
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Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ganzes Blut entweder
bei der Entnahme vom Blutspender oder bei der Transfusion zu einem Patienten durch
ein Gemisch geleitet wird, welches aus mindestens einem Kationaustauscherharz und
mindestens einem Anionaustauscherharz besteht. Das Gemisch braucht nicht nur je
einen dieser Harztypen zu enthalten, sondern man kann auch drei oder vier Austauscherharze
mischen, die aus einer Gruppe von mindestens zwei Kationaustauscherharzen und zwei
Anionaustauscherharzen ausgewählt sind. Die Kationaustauscher bestehen zweckmäßig
aus einem stark sauren und einem schwach sauren Hars, die Anionaustauscherharze
bestehen zweckmäßig aus einem stark basischen und einem schwach basischen Harz.
Als ein Beispiel für einen stark sauren Kationaustauscherharz wird das Handelsprodukt
Amberlite 200 von Rohm & Hass Company, ein sulfoniertes Mischpolymerisat aus
Styrol und Divinylbenzol mit macroretikularer Struktur, genannt. Als Beispiel eines
schwach sauren Kationenaustauschers wird Amberlite IRC-50, Handelsprodukt der Firma
ohm @ flaas Company, Philadelphia, erwähnt, welches im Molekül Carboxylgruppen enthält
und durch Suspensions-Mischpolymerisation von Methacrylsäure mit etwa 3 bis 10 %
Divinylbenzol erhalten wird.
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Ein typischer geeignet@r@ stark basischer Anionaustauscher ist das
Handelsprodukt mberlite IRA-402 der Firma Rohm und Haas Company, Philadelphia, ein
Mischpolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol, welches Chlor@methyliert und ansohließend
mit Trimethylamin @miniert ist. Bin Vertreter der schwach basischen Anionaustauscher
ist Amberlite IRA-68, Handelsprodukt der Firma Rohm & Haas, Philadelphia, ein
Harz, welches durch Umsetzung einer Polyamino-Verbindung mit mindestens einer primuren
Aminogruppe mit einem unlöslichen, vernetzten Mißchpolymerisat aus einem Ester der
Acryl- oder Methaorylsäure und Divinylbenzol als Vernetzungsmittel .erhalten wird.
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Sämtliche, für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten
Ionenaustauscherharze
sind aus einer ganzen Reihe von Quellen erhältlich. Beispielsweise sind die sulfonierten
Verbindungen bekannte unlösliche Stoffe, welche Wasserstoff gegen Mettallionen löslicher
Salze austauschen können. Es können unlösliche Phenol-Formaldehydkondensationsprodukte
mit rtethylensulfogruppen sein, aber auch Styrolmischpolymerisate, welche mit einer
vernetzenden Komponente, wie Divinylbenzol oder Trivinylbenzoljunlöslich gemacht
sind und in Krnpositionen Sulfogruppen enthalten. Geeignet sind auch kohlenstoffhaltige
Zeolite, welche aus Kohlen und Ligniten durch Sultonierung oder durch Sulfonierung
und Oxydation hergestellt werden. Das gleiche gilt für sulfonierte, kondensierte
Lignine. Einzelheiten über die Herstellung einiger sulfonierter Kationenaustauscherharse
sind in den US-Patentschriften 2 195 196, 2 228 159, 2 228 160, 2 366 007 und 2
597 438 zu finden.
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Die quaternären Ammoniumharze sind stark basische Stoffe, welche Salze
zu spalten vermögen und Hydroxylionen und andere Anionen liefern. Sie stellen unlösliche
quaternäre Ammonium-Verbindungen dar, in denen das Anion ein Hydroxylion oder der
Rest einer außerordentlich schwachen Säure, beispielsweise Kohlensäure, Borsäure
oder das Bicarbonat-Ion ist. Die Substituenten am Stickstoffatom umfassen in erster
Linie eine oder mehrere harzbildende Gruppen oder Teile und ferner kleine Kohlenwasserstoff-oder
Oxyalkylengruppen. Die funktionale Gruppe dieser anionischen Stoffe wird am einfachsten
durch die nachstehende Formel gekennzeichnet
In der Formel bedeutet X eine Hydroxylgruppe oder das Anion
einer
schwachen Säure, R', R'' und R''' sind kleine Kohlenwasserstoff- oder Oxyalkylgruppen,
wie Methyl, Äthyl, Propyl, Butyl, Benzyl, Oxyäthyl, Oxypropyl und dergleichen, R''''
ist eine Mischpolymerisatkette, welche das Stickatoffatom trägt.
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Typische quaternäre Ammoniumionenaustauscherharze werden durch Misohpolymerisation
von styrol mit einer vernetzenden Komponente, wie Divinylbenzol, Chlormethylierunr
des Mischpolymerisates und Umsetzung der Chlormethylgruppen mit einem tertiären
Amin, wie Trimethylamin, Butyldimethylamin, Oxyäthyldimethylamin und dergleichen,
hergestellt. Das Chlorion wird durch Behandlung mit einer Base, wie Natriumhydroxyd
ereetzt, Styrol kann auch mit Methylengruppen vernetzt, halogenmethyliert und dann
quaterniert werden. Näheres über die Herstellung solcher quaternärer Ammoniumanionenaustauscherharze
ist aus den US-Patentschriften 2 540 985, 2 591 573 und 2 614 09'3 zu entnehmen.
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Die carboxylischen Kationenaustauscherharze sind unlösliche polymere
Stoffe, welche ale funktionale Gruppe die Carboxylgruppen tragen. Diese Harze erhält
man aus Carbonsäuren oder deren Anhydriden, welche eine ungesättigte Bindung enthalten,
durch deren Vermittlung sie in Mischpolymerisate oder ijeteropolymerisate mit polymerisierbaren
Verbindungen, auch solche, welche vernetzend wirken, eintreten können. Beispieleweise
ist bekannt, daß man Maleinsäureanhydrid und styrol miteinander polymerisieren kann,
und wenn mindestens eine ungesättigte Verbindung mit mindestens swei nicht-konjugierten
Doppelbindungen anwesend ist, dann entsteht ein unlösliches Harz. Die vernetzende
Verbindung kann beispielsweise Divinylbenzol, Trivinylbenzol, Äthylendiacrylat,
Diallylmaleat, -fumarat oder -itaconat und dergleichen sein. Andere Carboxylaustauscher
werden erhalten durch Miachpolymerisatioll von Acryl- oder Methacrylsäure mit einer
menrfach ungesattigten, zur Polymerisation befähigten Verbindung, wie Diallylmaleat,
-fumarat oder -itaconat, Allylacrylat, Allylmethaorylat, Diallyläther, Äthylendimethylaorylat,
Divinylbenzol und dergl-
Die Mischpolymerisate oder Heteropolymerisate
werden in der üblichen Weise mit Hilfe eines Katalysators, wie Benzoylperoxyd, Lauroylperoxyd,
tert-Perbensost, tert-Butylhydroperoxyd und dergleichen gebildet. Das entstandene
Harz kann zu einem feinen Pulver vermahlen werden. Die unlöslichen Carboxylharze
lassen sich auch nach der Emulsionsmethode herstellen und werden dann als feine
Teilchen ausgefällt. Säureanhydridgruppen werden in Carboxylgruppen übergeführt,
indem man die Harze mit einem Alkohol oder einer starken Säure behandelt. Bei Anwendung
von Alkali läßt sich die entstehende Salzform des Harzes leicht durch@schen mit
einer Saure in die Säureform überführen. Einzelheiten über die Herstellung einiger
Carboxyl-Kationenaustauscherharze sind den US-Patentschriften 2 340 110, 2 340 111
und 2 597 437 zu entnehmen.
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Aminoanionenaus tauscherharze sind aus vielen Quellen erhältlich.
man kann nach bekannten methoden Phenole, Aldehyde oder Ketone und stark basische
Amine zu unlöslichen Ilarzen kondensieren, welche Säuren aufnehmen. Besonders brauchbare
Harze dieser Art sind solche aus Polyphenolverbindungen, wie T)i(oxyphenyl)methan,
oder Di (oxyphenyl) aulion, Formaldehyd, und Polyalkylenpolyaminen, wie Diäthylentetramin
oder Tetraäthylenpentamin. Ein anderer Typ von Anionenaustauschern lä#t sich herstellen
durch Chlormethylierung eines unlöslichen Mischpolymcrisets des Styrols, beispielsweise
aus Styrol und Divinylbenzol, und Umsetzung des chlormethylierten Produktes mit
einem primären oder sekundären Amin, das also noch Wasserstoff am Sticketoffatom
tragt. Polyamine, wie Diäthylentriemin, Tetraäthylenpentamin und dergleichen, sind
besonders günstig, wenn auch Pmine, wie Dimethylamin, Diäthylamin, Methylemin, Äthylamin,
Äthanolamin und dergleichen, ebenfalls sehr breuchbere Aminanionenaustauscherharze
ergeben.
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Eine andere geeignete Gruppe von Anionenaustauscherharzen wird erhalten
aus Harnstoff, Melamin oder dergleichen, Formaldehyd und einem Polyamins aul der
oben genannten Gruppe oder einer Kombination, welche Guanidin oder Biguanid enthält.
Ein anderer Harztyp beruht auf Phenylendismin. Bekanntlich ergeben m-Phenylendiamin
und
Formaldchyd unlösliche, harzartige Stoffe mit einem guten Aufnahmevermögen für Säuren.
Auch alle anderen Typen von Aminaustauschern sind verwendbar. Diese Anionenausteuscherharze
enthalten tertiäre oder sekundäre Aminogruppen oder beides, welche eine gute Aufnahmefähigkeit
für Säuren und doch keine nennenswerte Tendenz zum Spelten von Salzen starker B@@en
und starker Säuren haben, Viele der Aminoanionenaustauscherharze sind in der Literatur
beschrleben, beispielsweise in den US-Patentschriften 2 591 574 und 2 675 359.
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Obwohl bereits bisher verschiedene Ionenaustauscherharze für die aintiernung
von Viren aus biologischen Flüssigkeiten benutzt worden sind, eignen sich die in
diesem Zusammenheng angewendeten Harze wegen ihrer Form und der Arbeitsbedingungen
nicht zum Entfernen von Viren aus Blut, ohne den Wert des Blutes zu zerstören. Alle
diese Verfahren wurden entwickelt, um Viren, die in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten
gezüchtet wurden, zu gewinnen, zu konzentrieren und zu reinigen. Die Flüssigkeit
war dabei Nebensache und wurde nach der Gewinnung der Viren weggegossen. @ufgabe
und Verhältnisse sind selbstverständlich ganz andere, wenn die Flüssigkeit, nämlich
das Blut, erhalten und verwendet werden soll, wihrend die daraus isolierten, durchaus
unerr'Unschten'Viren @bfellprodukt sind.
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@es vorliegende Verff hren der Reinigung des Blutes von Viren bei
der Entnahme vom Spender oder bei der Transfusion an den Empfänger ist von gewissen
kritischen Bedingungen abhängig. Einerseits muß ein Gemisch bestimmter Harze angewendet
werden, welche bestimmte begrenzte lonenformen besitzen und andererseits müssen
die Teichen der Austauscherharze innerhalb eines kritischen Teilchengrö@enbereiches
liegen.
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Die Harzteilchen müssen nicht grdDer als 1190 Micron und nicht kleiner
eln 297 Micron sein. Besonders günstig ist der Bereich von 840 -420 Micron. Harze
mit Teilchengrößen oberhalb 1190 und unterhalb 297 Micron haben im Rahmen des Verfahrens
der
Erfindung keine befriedigende Wirksamkeit. Arbeitet man mit
Harsen einer sof kleinen Teilchengröße, wie sie bisher für die Gewinnung von Viren
aus biologischen Flüssigkeiten benutzt wurden, so werden aus dem Blut nicht nur
die Viren, sondern auch die geformten Elemente, nämlich rote Zellen, Plättchen und
weiß Zellen edsorbiert. Wählt man dagegen die Teilchengrößen zu groß, eo kann ein
erheblicher Anteil der im Blut entheltenen Viren durch die Ionenaustauschstation
hindurchfließen ohne adsorbiert zu werden.
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Die oben angegebenen, zahlenmäßigen Grenzen für die Teilchengröße
haben sich in der experimentelien Erprobung @ls geeignet erwlesen, um Blut von Viren
zu befreien ohne die Qualität des Blutes ungünstig zu verändern.
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Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen t. usführungeformen der
Erfindung.
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Beispiel 1 Ein steriles Rohr aus blutabstoßendem Kunststoff mit einem
100-Maschenfilter am Ausgu#ende wird mit einem gut gemischten Bett aus sterilen
Ionenaustauscherharzen, bestehend aus etwa 47 g @mberlite 200 in der Natriumform,
3 g mberlite 200 in der Kaliumform und 20 g Amberlite IRA-402 in der Chloridform
gefüllt.
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Die Teilchengrö#en liegen zwischen 640 und 420 Micron. Nach der Füllung
wird das Harzbett gründlich mit steriler, physiologischer Dextrose-Lösung gewaschen.
Man entnimmt einer Blutbank 500 cm3, 20 Tage gelagertes, menschliches Blut, setzt
etwa 250 Fällungseinheiten Je cm3 an Virus Influenza A zu und leitet das Blut eine
Stunde lang durch des Harzbett. Bei der anschließenden Untersuchung zeigt das 80
behandelte Blut normale Hämatologie und ist frei von Influenza-Virus.
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Beispiel 2 Man wiederholt den Versuch von Beispiel 1, Jedoch mit einer
fünffach
gröberen Teilchengröße der Harze ( 100 - 200-Maschensieb ) Auch in diesem Fall erweist
sich in der Analyse das behandelte Blut als vollständig virenfrei. Coagulation und
Adsorption der geformten Elemente des Blutes hat aber einen solchen Umfang angenommen,
daß das behandelte Blut für transfusionszwecke nicht mehr geeignet ist.
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Beispiel 3 Man wiederholt den Versuch von Beispiel 1, Jedoch mit Harzen
von Teilchengrößen zwischen 149 und 250 Uicron. Die Ergebnisse sind die gleichen
wie in Bespiel 2.
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Beispiel 4 Man wiederholt den Versuch von Beispiel 1, aber mit Harzen
von Teilchengrößen zwischen 1410 und 2000 Micron. Am behandelten Blut ist eine anormale
IIEmatologio und unvollständige Entfernung des Virus festzustellen.
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Beispiel 5 Man arbeitet nach Beispiel 1, aber mit Harzen von Teilchengrößen
zwischen 297 und 1190 Microm.
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Das Ergebnis der Behandlung ist das gleiche wie in Beispiell.
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Beispiel 6 Man wiederholt den Versuch von Beispiel 1, aber unter Infizierung
des Blutes mit dem Virus, der Encephalitis. flach der Behandlung hat das Blut normale
Hämatologie und ist frei von Viren.
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Beispiel 7 Man wiederholt den Versuch von Beispiel 1, aber unter Infektion
des Blutes mit Mumps-Virus und setzt dem Harzgemisch 2 Gramm Amberlite IRC-50 und
2 Gramm Amberlite IRA-68 zu, bei Teilchengrößen sämtlicher Harze zwischen 840 und
420 Micron.
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Nach der Behandlung ist das Blut frei von Viren, zeigt normale Hämatologie
und sein PH-Wert ist von 6,5 auf 7,2 angestiegen.
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Beispiel 8 Man wiederholt den Versuch von Beispiel 1, aber mit Teilchengrö#en
oberhalb 1190 Micron.
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Das behandelte Blut zeigt zwar eine normale Hämatologie, enthält ber
immer noch 35 der ursprünglich zugeeetzten Virusmenge.
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Beispiel 9 Man wiederholt den Versuch von Beispiel 1, ersetzt aber
den Influenzavirus durch den Virus der Poliomyelitis und ersetzt das Amberlite IRA-403
durch 20 Grmm Amberlite IRA-93 in der Chloridform.
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Nach der Behandlung zeigt das Blut normale Hämatologie und ist virenfrei.