PT973544E

PT973544E - Preparacao de complexo de protrombina imunotolerante

Info

Publication number: PT973544E
Application number: PT98913425T
Authority: PT
Inventors: Peter Turecek; Schwarz Hans-Peter
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2001-12-28
Also published as: AU6812198A; ES2160410T3; CA2285935C; NO994822L; WO1998044942A1; DK0973544T3; EP0973544B1; JP3976351B2; DE59800935D1; CA2285935A1; ATE202483T1; BR9807936A; JP2001524953A; AU737566B2; SK139099A3; NO994822D0; US6358534B1; EP0973544A1

Description

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DESCRIÇÃO "PREPARAÇÃO DE COMPLEXO DE PROTROMBINAIMUNOTOLERANTE" A invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para o tratamento de perturbações da coagulação do sangue, em especial, de pacientes portadores de inibidores do factor VIII. A invenção diz ainda respeito a um processo para a preparação de uma composição desse tipo, bem como à sua utilização. O objectivo da invenção é indicado nas reivindicações 1-7. A coagulação do sangue resulta de um conjunto de sucessivas reacções de diferentes proteínas ou enzimas. Por uma falta de factores de coagulação do sangue, a formação de fibrina a partir de fibrinogénio e, consequentemente, a oclusão de feridas é inibida; as consequências são hemorragias. Um caso destes acontece na hemofilia A. Esta é a doença hemorrágica mais propagada e é provocada pela falta de factor VIII. Para o tratamento de substituição da hemofilia A, são utilizados preparados que contêm o factor VIII. O tratamento com estes preparados conduz, na maior parte dos casos, a um rápido estancamento do sangue.

No entanto, também existem pacientes, em que não só surge uma deficiência em factor VIII, mas os quais também desenvolveram uma substância inibidora dirigida ao factor VIII (inibidor). Outro conjunto de pacientes apresenta inibidores do factor VIII, sem com isso sofrer de hemofilia A. Consoante a quantidade de inibidores de factor VIII existente, assim é inibida a acção do factor VIII fornecido, por meio da sua neutralização.

Para o tratamento de pacientes portadores de inibidores do factor VIII, são actualmente oferecidos preparados com base numa fracção de plasma, que contém uma mistura de factores de coagulação. Esta fracção de plasma pode, por exemplo, conter os factores do complexo de protrombina (factor II, VII, IX e X). Uma preparação promotora da coagulação do sangue com actividade de "intercepção" do inibidor do factor VIII ("Factor Eight Inhibitor Bypass Activity" FEIBA® TIM 4, Fa. IMMUNO AG) é, por exemplo, obtida, segundo a AT-B 0 368 883, por meio de um tratamento do criosobrenadante. Esta preparação contém igualmente os factores de coagulação II, VII, IX eX. A acção de um preparado FEIBA é, devido à sua complexa composição, universal. Mariani et al., (Thrombosis Res. 31, 475-488 (1983)) menciona, como um principio de acção, o factor VIII na sua forma activada. Foi verificado que, após a infusão de uma preparação FEIBA, surge um teor elevado de factor Vila no plasma de hemofílicos.

Igualmente, é discutida por Teitel (Thrombosis and Haemostasis 66 (5) 559-564, (1991)), o papel do factor Vila nos concentrados de complexo de protrombina, com uma "actividade de intercepção do factor VIII". Simultaneamente, é também focado o principio de acção do factor Xa em tais preparados. Os concentrados de complexo de protrombina analisados continham factor Vila, expresso pela proporção da actividade do factor VII para o antigénio de factor VII de 2,1 e 2,5. A composição terapêutica contendo protrombina, preparada de acordo com a EP 0 044 343-B1, é apropriada para o tratamento de inibidores de factores de coagulação e contém um complexo de protrombina activado, no qual os factores se encontram parcialmente activados. A quota-parte em factor Vila situa-se entre 8-80 unidades/ml. A concentração de factor IX situa-se no intervalo de 15 a 112 unidades/ml. Correspondentemente, o teor de factor Vila é, relativamente ao factor IX, de 0,07 - 5,3 U factor Vlla/U factor IX. Vinazzer (Thromb. Res. 26:21-29 (1982)), mostra a diferença entre os preparados AUTOPLEX, que são preparados de acordo com a EP 0 044 343, e os FEIBA. Como aí é demonstrado, os ATJTOPT .F.X caracterizam-se por um teor de trombina (factor lia) mais elevado, medido em unidades de NHI, comparativamente aos FEIBA (vide tabela 1, página 22).

Mas, também preparações de factor Vila altamente purificadas são propostas para a terapia de estados de inibição dos factores de coagulação (por exemplo, EP 0 082 182-Bl) e Hedner et al. (Haemostasis 19, 335-343 (1989)).

Uma vantagem das preparações de factor Vila é a sua isenção em factor VIII. Na realidade, o teor de factor VIII em preparados de complexo de protrombina ou em preparados de complexo de protrombina activados, como por exemplo FEIBA, actua, em pacientes com inibidores do factor VIII funcionais, de modo a que estes anticorpos inibidores sejam aumentados por meio de nova administração de factor VIII, pelo que o estado da hemofilia inibidora até piora temporariamente.

Com efeito, foi confirmado que, para um estancamento sanguíneo eficaz, no caso da hemofilia inibidora do factor VIII, as preparações de factor Vila são, na sua acção inferiores aos preparados de complexo de protrombina (Turecek P. et al., Thrombosis & Haemostasis, 1997, p. 222).

Um objectivo da presente invenção é, por conseguinte, disponibilizar uma preparação, que possua a eficácia ou eficiência dos preparados de factores do complexo de protrombina, sem contudo apresentar as reacções imunológicas secundárias indesejadas de tais preparações. O objectivo anteriormente indicado é alcançado, na medida em que, de acordo com a presente invenção, é disponibilizada uma preparação farmacêutica de complexo de protrombina imunotolerante, que contém os factores II, IX, X e, eventualmente, VII, com um baixo teor de antigénio do factor VIII. O teor de antigénio do factor VIII da preparação de acordo com a invenção situa-se, preferencialmente, em menos de 10%, em especial menos de 5%. O teor de factor VIII é inferior a 0,1 de factor VHI/antigénio C/ U FEIBA. Numa forma de realização preferida, o teor de antigénio do factor VIII até se situa abaixo de 0,03/ U FEIBA, com mais preferência abaixo de 0,02/ U FEIBA e com maior preferência ainda abaixo do limite de detecção. et O resultado de que, em especial no caso de uma purificação posterior dos factores do complexo de protrombina do plasma ou de uma fracção de plasma, o teor de factor VIII e, eventualmente, também o teor de fosfolípidos possa ser reduzido desta forma, mantendo-se amplamente a actividade dos factores do complexo de protrombina, é considerado surpreendente.

Em particular, a preparação farmacêutica de acordo com a invenção contém pelo menos os factores IXa, Xa e Vila e apresenta uma actividade-FEIB, portanto, reduz o tempo de coagulação de um plasma deficiente em factor VIII com um inibidor funcional (vide para tal, por exemplo, a AT-B 350 726).

Uma preparação de acordo com a invenção pode ser preparada a partir de plasma ou de uma fracção de plasma. A fracção de plasma pode ser preparada a partir de plasma, em especial, de plasma de origem humana, por meio de um tratamento cromatográfico, precipitação ou centrifugação, ou é utilizado o sobrenadante do crioprecipitado. A fracção de plasma contém factores dependentes da vitamina K, como factores do complexo de protrombina, mas também as proteínas S, C e/ou Z estão preferencialmente contidas.

Numa forma de realização especialmente preferida, a preparação é isenta de fosfolípidos. Preferencialmente, o limite superior dos fosfolípidos contidos situa-se em 0,1 nmol/ U FEIBA (para a determinação vide exemplos).

Devido a esta isenção de fosfolípidos, a formação de anticorpos indesejados contra o factor VIII, pode ser reduzida ou inibida.

De acordo com a presente invenção, é também posto à disposição um processo para a produção desta preparação. Este processo engloba os seguintes passos: a) disponibilização de plasma ou de uma fracção de plasma contendo os factores II, IX, X e, eventualmente, VII, b) por em contacto o plasma ou a fracção de plasma com um material de suporte, eventualmente, na presença de um detergente, de modo a que o factor VIII e, eventualmente, os fosfolípidos sejam separados dos factores II, IX, X e, eventualmente, VII, c) purificação do plasma ou da fracção de plasma, e d) obtenção de uma fracção contendo os factores II, IX, X e, eventualmente, VII.

Numa variante preferida, os passos b e c ou b, c e d, são realizados como um passo processual.

No caso da fracção de plasma utilizada, trata-se preferencialmente de uma com pureza pelo menos intermédia.

Por uma preparação com pureza intermédia, deve entender-se uma fracção de plasma de tal tipo, que é análoga à definição de pureza intermédia de preparados de factor VIII (vide para tal, por exemplo, Wood Clive (ed.), Factor VIII: Purity and prophylaxis,

Royal Society of Medicine).

Proteínas associadas, que por uma purificação cromatográfica não são eliminadas, podem, assim, ainda existir num preparado de pureza intermédia.

Como material de partida, pode igualmente ser utilizada uma preparação de factores do complexo de protrombina usual, obtenível no mercado, como por exemplo, FEIBA S-TIM 4, IMMUNO ou complexo de protrombina activado.

Como processos de purificação correspondentes, são utilizados os métodos conhecidos do estado da técnica, preferencialmente, é realizado um tratamento cromatográfico, uma precipitação ou centrifugação. Como fracção de plasma pode também ser utilizado o sobrenadante do crioprecipitado. O material de suporte, corresponde a um material apropriado para a cromatografia, filtração e/ou nanofiltração. No caso da filtração, trata-se, em particular de uma filtração de afinidade ou de membrana. É utilizado um material pré-purificado, por exemplo, um material pré-purificado por troca aniónica, assim, pode ocorrer um readsorção a um outro material de suporte, preferencialmente ao mesmo material de suporte utilizado para a pré-purificação, sob condições diferentes.

Numa forma de realização preferida, o material de suporte é um material de suporte específico para o factor VIII, em especial, uma matriz apropriada para a cromatografia de afinidade. Com especial preferência é utilizada uma matriz contendo vWF. A um material de suporte desse tipo é preferencialmente adsorvido o factor VIII e, eventualmente, fosfolípidos, enquanto os factores II, IX, X e, eventualmente, VII não são ligados.

No entanto, o material de suporte pode também ser um material de suporte inespecífico para o factor VIII, por exemplo, um permutador aniónico fraco, por exemplo DEAE, TMAE ou outros permutadores aniónicos bastante conhecidos do estado da técnica.

De acordo com as condições seleccionadas, ou o factor VIII e, eventualmente fosfolípidos, são adsorvidos ao material de suporte, enquanto os factores II, IX, X e, eventualmente, VII não são ligados, ou o contrário.

Noutra forma de realização preferida, o material de suporte apresenta uma maior afinidade para o complexo de protrombina, que para o factor VIII. Assim, por exemplo, os factores II, IX, X e, eventualmente, VIII são adsorvidos, enquanto o factor VIII e, eventualmente, os fosfolípidos são eluídos. O factor VIII pode também ser inactivado de forma orientada e depois, nesta forma inactivada, por exemplo, não se ligar mais ao material de suporte. Uma inactivação do factor VIII desse tipo pode, por exemplo, ser conseguida por dissociação, mediante utilização de, por exemplo, um agente quelante, por dissociação, em especial dissociação proteolítica, por exemplo, por meio de proteases de serina, como trombima ou proteína C activada, por ligação de parceiros de afinidade, como anticorpos ou péptidos.

Todas as variantes do processo descritas, podem também ser realizadas na presença de um detergente, em especial um detergente não iónico. De preferência, é utilizado como detergente um poliéter ou um polisorbato, em especial, é usado Tween ou Triton.

Caso esteja presente um detergente, então, numa forma de realização preferida, ele é novamente eliminado ou separado.

Noutra forma de realização preferida, está previsto um passo para a inactivação de agentes patogénicos eventualmente existentes, em especial um escolhido do grupo do tratamento com temperaturas elevadas, tratamento com vapor, tratamento com um solvente e/ou tratamento com um detergente.

De modo geral, a preparação de acordo com a invenção é, portanto, obtenível, segundo um processo anteriormente descrito. Em espacial, ela é apropriada para a preparação de um medicamento, o qual é adequado para o tratamento de pacientes portadores de inibidores do factor VIII (= hemofilia A), em especial, para aqueles pacientes com um título de inibição superior a 1 U Bethesda/ml de plasma, preferencialmente, superior a 5 U Bethesda/ml de plasma. Ela pode também ser preparada por combinação dos factores individuais II, IX, assim como, eventualmente, VII altamente purificados.

Dado que o material biológico, ou seja, o material originário de organismos ou fluidos corporais ou de microorganismos, pode estar contaminado com agentes patogénicos, como por exemplo, moléculas ou microorganismos infecciosos ou vírus, ou agentes pirogénicos, foram já desenvolvidos diversos processos para a inactivação ou eliminação de agentes patogénicos ou pirogénicos. 8 8

Tais processos incluem tratamentos físicos e/ou químicos, como por exemplo, diversos métodos de filtração (por exemplo, nano-, dia- ou ultrafiltração), tratamento com temperaturas elevadas, tratamento com ácido ou lixívia, tratamento com detergentes e/ou solventes orgânicos, assim como tratamento com luz UV ou com luz laser. Também diversas combinações destes processos, para a inactivação ou eliminação de agentes patogénicos foram inúmeras vezes propostas pelo estado da técnica.

Da EP 0 197 554 é, por exemplo, conhecido um processo para a despirogenização e inactivação de vírus, num produto biológico ou farmacêutico, o qual engloba um tratamento com um agente inactivador e despirogenizante virai, como por exemplo, uma substância anfifílica e/ou um solvente, de uma fase sólida, à qual o produto se encontra adsorvido. Após este tratamento, o agente de inactivação e de despirogenização virai é separado da fase sólida, o produto adsorvido lavado e, finalmente, eluido da fase sólida.

Da EP 0 131 740 é conhecido o tratamento de uma composição contendo proteína, numa solução com solventes orgânicos, como di- ou trialquilfosfatos, eventualmente na presença de um detergente (tratamento solvente/detergente), através do qual podem ser obtidas composições proteicas isentas de vírus contendo lípidos.

Da AT-PS 402 151 é conhecido um tratamento com temperaturas elevadas, no qual a um preparado presente em solução aquosa é adicionado um agente tensioactivo, numa concentração de pelo menos 1 % em peso, antes do aquecimento.

Outro processo para a redução ou supressão de actividades indesejadas em produtos biológicos ou farmacêuticos, é conhecido da EP 0 083 999. Este baseia-se num contacto prolongado com uma solução ou suspensão de um anfifílico não desnaturante. O produto despirogenizado é tratado com um permutador iónico, para a eliminação do anfifílico.

Uma desvantagem de muitos destes processos conhecidos do estado da técnica, são as frequentes perdas de actividade das proteínas lábeis contidas nas composições a serem tratadas, por exemplo, das proteínas do sangue. Em particular, na realização de um 9 passo de purificação cromatográfico, ocorre uma inactivação de proteínas numa extensão relativamente elevada. Uma degradação de proteínas pode igualmente conduzir a uma activação. Assim, é, por exemplo, sabido que o factor VII, durante uma purificação cromatográfica, devido a processos autocatalíticos, é muito facilmente activado para factor Vila, o qual é indesejado por ser demasiado lábil.

Outra desvantagem reside no elevado dispêndio de tempo e técnico de muitos processos, o que reduz drasticamente a sua praticabilidade e, por isso, toma frequentemente inapropriada a sua utilização a nível industrial.

Por conseguinte, no âmbito da presente invenção deve ser utilizado um processo, para inactivação eficaz de agentes patogénicos em materiais biológicos, que conserve as proteínas, em especial as proteínas do sangue, que também possa ser facilmente extrapolado para a escala industrial e ser realizado de forma económica. Em especial, durante o processo para a inactivação de agentes patogénicos deve ser amplamente evitada uma degradação e possível activação das proteínas, para isto, mais sensíveis.

Neste processo, para a inactivação de agentes patogénicos, em especial de vírus, num material biológico, este material é incubado com agentes químicos, em que a incubação é realizada na presença de um sal eluotrópico, correspondente a uma concentração de NaCl de pelo menos 200 mmol/1, de preferência, de pelo menos 300 mmol/1. A inactivação de agentes patogénicos numa solução oferece, relativamente ao tratamento de um adsorvente, algumas vantagens. Assim, por exemplo, a praticabilidade de um processo desse tipo num sistema homogéneo, monofásico é maior e a validação do passo de inactivação mais provável. Igualmente, a melhor acessibilidade aos agentes patogénicos numa fase relativamente homogénea, parece aumentar a eficiência do passo do processo. O material biológico contém, de preferência, uma proteína humana e é, em especial, plasma ou uma fracção de plasma ou proveniente de uma cultura celular. Preferencialmente, o material biológico contém um factor sanguíneo, como o .factor XII, 1 10 XI, VIII, V, uma proteína dependente do factor de Willebrand ou fibrinc^génio^ em especial da vitamina K, como o factor II, factor VII, factor IX, factor X, proteína C, proteína S ou proteína Z.

As proteínas podem existir como factores isolados, especialmente na forma purificada, ou numa mistura complexa. Numa forma de realização muito especialmente preferida, o material biológico contém pelo menos um factor do complexo de protrombina e é, em especial, uma ffacção contendo o complexo de protrombina ou um material contendo um factor VII, por exemplo, parte-se do correspondente sobrenadante, após uma crioprecipitação do plasma (criosobrenadante). A preparação de acordo com a invenção é, preferencialmente, uma com actividade-FEIB (actividade de intercepção do inibidor do factor oito), ou seja, uma preparação que é apropriada para o tratamento de pacientes portadores de inibidores do factor VIII. O material resultante de uma cultura celular é, de preferência, um material contendo factores do sangue preparados por tecnologia recombinante, entre os quais factores da coagulação intrínseca ou extrínseca, da fribrinólise, da trombólise ou seus inibidores, em especial, factores do sangue dependentes da vitamina K. Como células interessam as células viáveis para a expressão de proteínas recombinantes, preferencialmente, células de mamíferos, como por exemplo, células Vero, CHO ou BHK. As correspondentes proteínas podem ser directamente sujeitas, a partir do extracto celular bruto, ao processo de acordo com a invenção, para a inactivação de agentes patogénicos eventualmente existentes, no entanto, pode também tratar-se de uma fracção celular pré-purificada. O agente químico é, por exemplo, um detergente (anfifílico, tensioactivo), o qual está contido, preferencialmente, numa quantidade de pelo menos 1%, com mais preferência numa quantidade superior a 5%, com especial preferência numa quantidade superior a 10%; contudo, de acordo com a invenção, podem também ser utilizados outros agentes químicos, em especial aqueles para os quais, por exemplo, já é conhecida uma acção vimcida, bactericida ou despirogenizante, ou misturas de diversos agente químicos. i 11 η

No entanto, a escolha é limitada, na medida em que a natividade do materialfbiológico não deve ser substancialmente afectada. Para um modo processual económico, é seleccionada uma química, que mantém mais de 50% da actividade biológica do material, relativamente à actividade antes da incubação, preferencialmente de pelo menos 70% e, em especial, de mais de 85%. A conservação da actividade biológica significa que, as proteínas contidas no material biológico conseguem desempenhar a sua função ou as suas diversas funções naturalmente atribuída(s). Consoante o tipo da proteína, esta actividade biológica pode, então, ser determinada e indicada, por exemplo, via um teste cromogénico padronizado ou uma determinação de antigénio. Eventualmente, o agente químico é separado após a incubação.

Por detergente deve entender-se, de modo geral, uma substância tensioactiva, orgânica, sintética.

De preferência, no processo de acordo com a invenção, é utilizado um detergente não iónico. Agentes tensioactivos não iónicos, como poliéteres, em especial, éteres alquilfenolpoliglicólicos, são, entre outros, produtos da etoxilação de ácidos gordos, amidas de ácidos gordos, aminas gordas, álcoois gordos, óxidos de amina, ésteres de ácidos gordos de poliálcoois e ésteres de açúcares.

Um agente tensioactivo desse tipo actua sobre a proteína de forma não desnaturante e é, preferencialmente, escolhido do grupo polisorbato e Triton. Como polisorbato é, por exemplo, utilizado Tween®.

Quando são utilizados detergentes como agentes químicos, então, de acordo com uma forma de realização preferida, eles são utilizados sem a adição de outros agentes, em especial, sem a adição de substâncias orgânicas tóxicas ou solventes, como por exemplo, ΊΓΝΒΡ. Com isto é minimizado um risco de contaminação. O material biológico é, segundo o processo de acordo com a invenção, incubado com um agente químico. A incubação significa pôr em contacto o material biológico com uma solução, suspensão ou emulsão de um agente químico, para uma inactivação de

12 agentes patogénicos ou pirogénicos eventualmente existentes, durante um período de tempo suticientemente longo, a uma determinada temperatura. O pôr em contacto pode, por exemplo, ocorrer, simplesmente, por deixar repousar a mistura durante um período de tempo definido.

De acordo com a presente invenção, a incubação ocorre na presença de um sal eluotrópico. No que se segue, por "sal eluotrópico" deve entender-se, o sal em mistura com agentes químicos ou o sal numa composição complexa, com a propriedade de eliminar e/ou deslocar substâncias adsorvidas de adsorventes sólidos ou impregnados com líquido, também do tipo gel. De preferência, no caso do sal eluotrópico trata-se de um agente de desadsorção, como o que é utilizado em processos cromatográficos. A substância adsorvida é, em geral, suficientemente solúvel na presença do sal eluotrópico, por conseguinte, são preferencialmente escolhidas condições, que não precipitem o material biológico. O tipo e concentração do sal ou da composição é, geralmente, escolhido consoante o adsorvente utilizado. A acção eluente de um sal depende, por exemplo, da polaridade do solvente, ouseja, cresce na sequência etanol - acetona - metanol - água. O adsorvente pode ser uma fase sólida, em especial, uma matriz apropriada para a cromatografia de troca iónica. Na composição que contém o sal eluotrópico, podem também estar contidos outros aditivos, por exemplo, outros sais. Preferencialmente, trata-se, no caso da composição, de uma composição aquosa com uma valor de pH no intervalo entre 6,0 a 8,0, de preferência à volta de 7,0.

Numa forma de realização preferida, como sal eluotrópico é utilizado o cloreto de sódio, mas também outros sais alcalinos ou também alcalino terrosos, entre os quais CaC^. Como sais eluotrópicos podem igualmente ser utilizados os assim designados caotrópicos, como por exemplo, ureia, tiocianatos ou guanidina. A concentração do sal é de pelo menos > 220 mmol/1, de preferência > 300 mmol/1. O limite superior para a concentração utilizada depende, em especial, da solubilidade do respectivo sal e para o NaCl situa-se, por exemplo, à volta de 2 mol/1. Substâncias caotrópica, como por 13 exemplo a ureia, podem até, eventualmente, ser utilizadas até uma concentração de 8 mol/1. A incubação do material biológico com o agente químico ocorre, para a inactivação de agentes patogénicos eventualmente existentes, durante um período de tempo suficientemente longo, de preferência, durante um período de tampo entre 10 minutos e 10 horas, com maior preferência entre 1 hora e 5 horas. O período de tempo necessário para o processo de acordo com a invenção pode ser determinado num ensaio por meio de vírus modelo, como os vírus HIV, Sindbis, FSME ou da hepatite.

Também a selecção da temperatura influencia o período de tempo a utilizar. No processo de acordo com a invenção, incuba-se preferencialmente à temperatura ambiente, por exemplo, num intervalo de temperatura entre 15 e 45°C, em especial entre 20 e 30°C.

No processo de acordo com a invenção, o material biológico é de preferência adsorvido a um suporte sólido, purificado e a incubação realizada imediatamente após a eluição do material purificado. A eluição e a incubação podem ser realizadas consecutivamente, contudo, podem também ocorrer simultaneamente.

De acordo com outra forma de realização preferida, a incubação é realizada após uma purificação cromatográfica do material biológico, em que o eluato ainda foi posteriormente processado, por exemplo, por centrifugação, filtração ou outros métodos físicos. O suporte sólido é, de preferência, um material apropriado para a cromatografia, em especial um material adequado para a cromatografia de troca iónica, cromatografia hidrófoba ou para a cromatografia de afinidade. Por exemplo, são utilizados materiais como Sepharose®, Superdex, Sephadex®, Spherodex®, Toyopearl®, ou materiais inorgânicos, como hidroxilapatite.

Como permutadores iónicos podem ser utilizados materiais permutadores aniónicos, como por exemplo, DEAE-Sephacel®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose® CL6B, DEAE-Sepharose® Fast Flow, QAE-Sephadex®, Q-Sepharose® Fast Flow, Q-Sepharose® High Performance, DEAE-Tris-Acrilo, DEAE-Spherodex®, Q-Hyper-D (obtémvel através da firma Sepracor), DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Fractogel® EMD-TMAE ou outros materiais de fractogel.

Como exemplos de materiais para a cromatografia hidrófoba, devem ser mencionados, por exemplo, Butil-Sepharose®, Octil-Sepharose®, Fenil-Sepharose®, Fractogel®TSK-Butilo, Suporte t-butil-HIC ou TSK-Gel Butilo Toyopearl®. O material biológico pode ser adsorvido ao suporte directamente a partir de uma mistura complexa e purificado, no entanto, ao passo de inactivação podem também ser acoplados, antes ou depois, outros passos para a purificação do material, em que no âmbito da presente invenção, outros passos de purificação cromatográficos são preferidos.

Por meio do processo de acordo com a invenção, os agentes patogénicos são inactivados. Por agente patogénico devem entender-se também, fragmentos de, por exemplo, vírus, em especial também o genoma isolado ou seus fragmentos.

Os agentes patogénicos podem ser agentes patogénicos com invólucro lipídico, como por exemplo, o vírus da hepatite B, ou agentes patogénicos sem invólucro lipídico, como por exemplo, o vírus da hepatite A.

Processos para a inactivação de vírus são, hoje em dia, designados como eficazes, quando após a aplicação do processo a uma amostra de um material biológico, que foi transformado com uma dose elevada de um vírus de teste, por exemplo, vírus Hl ou vírus Sindbis, como vírus modelo para vírus da hepatite, já não são detectados vírus na amostra e o título do vírus ser, assim, reduzido abaixo do limite de detecção. A detecção e quantificação dos ácidos nucleicos pode, por exemplo, ocorrer via um método de PCR, como descrito na AT-PS 401 062 ou por titulação directa.

Como medida para a inactivação é conhecido, o assim designado factor de redução, o qual é calculado a partir do logaritmo decimal do quociente entre o título do vírus inicial e o final, após uma única adição de vírus teste. Da norma europeia EC ΙΙΙ/8115/89-EN da comissão da comunidade europeia é ainda conhecido um assim designado factor de redução total. Este é calculado a partir da soma dos factores de redução de medidas de inactivação individuais subsequentes.

De preferência, é também realizado um outro passo independente para a inactivação ou eliminação de agentes patogénicos. Para tal interessam todos os processos conhecidos do estado da técnica, que minimizam o risco de infecção.

Em especial, como passo adicional para a inactivação ou eliminação, é realizada uma filtração e/ou um tratamento com temperaturas elevadas.

Como filtração é preferencialmente realizada uma nanofiltração. Um tratamento com temperaturas elevadas preferido, é efectuado a um material biológico sólido, por exemplo, a um liofilizato com um teor de água controlado, por exemplo, com um teor de água entre 5 a 8% e uma temperatura entre 50 e 80°C, como descrito na EP-0 159 311.

Numa forma de realização preferida, é previsto um tratamento de dois passos com um detergente como agente químico. Neste caso, num primeiro passo, é utilizado um detergente numa quantidade de pelo menos 1%, de preferência de pelo menos 5%, e com maior preferência de pelo menos 10%. Num segundo passo, é utilizado outro detergente, numa quantidade de pelo menos 10%, de preferência de pelo menos 12% e com maior preferência de pelo menos 14%. O detergente utilizado para ambos os passos pode ser o mesmo, no entanto, podem também ser utilizados detergentes distintos. De modo muito geral, por combinação de passos para a inactivação de vírus, o risco de uma infecção virai após a administração de uma preparação correspondente pode ser fortemente reduzido ou excluído. 16 16 . .>· ·

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De acordo com a presente invenção, é também disponibilizada uma preparação purificada cromatograficamente, contendo um factor do sangue activável de modo autodinâmico, com uma quota-parte de factor do sangue activado inferior a 50%, relativamente ao teor de factor do sangue activado e não activado, de preferência inferior a 40%, com mais preferência inferior a 30%, com maior preferência ainda inferior a 20%, mais preferencialmente inferior a 10%, e com maior preferência ainda inferior a 1%, e um conteúdo em detergente.

Em especial, trata-se, no caso da preparação, de uma preparação contendo o complexo de protrombina, com uma actividade de factor Vila inferior a 50%, relativamente ao teor de factor VII activado e não activado, preferencialmente inferior a 10%, com especial preferência inferior a 1 %. O teor de detergente do preparado de acordo com a invenção situa-se, neste caso, no intervalo de uma quantidade farmaceuticamente aceitável, de preferência entre 1 % e o limite de detecção do detergente.

Por um factor do sangue activável de modo autodinâmico deve entender-se, de acordo com a presente invenção, um factor do sangue que pode ser activado por autocatálise, por contacto de superfície ou por processos, como por exemplo, processos cromatográficos. Em especial, um factor do sangue desse tipo é um seleccionado do grupo do factor VII, factor XII, factor XI e factor de Fletcher.

Noutra forma de realização preferida, a preparação é isenta de inibidores de proteases de serina, como por exemplo, inibidores de trombina ou dos cofactores, como por exemplo heparina. Numa forma de realização especial, a libertação de tais substâncias ocorre logo, durante um processo cromatográfíco.

Por conseguinte, a presente invenção também diz respeito a preparações correspondentes, obteníveis pelo processo de acordo com a invenção.

Na preparação de acordo com a invenção, podem também estar contidos outros aditivos, por exemplo, substâncias com acção estabilizadora, como aminoácidos.

Os exemplos que se seguem devem elucidar a presente invenção em mais pormenor, sem com isso a limitar.

Exemplo 1: Determinação do factor VIII A determinação do antigénio do factor VIII na FEIBA, foi realizada segundo o método de Moritz B. al., (Thromb. Haemost. 1997, Suppl : 31). Nesta determinação, detecta-se selectivamente o factor VIII, para além de outras proteínas plasmáticas na FEIBA, por meio de um anticorpo monoclonal contra a cadeia leve da molécula do factor VIII, como anticorpo de captura, e via um anticorpo monoclonal, igualmente contra a cadeia leve da molécula do factor VIII, mas dirigido contra outro epitopo, como anticorpo de detecção.

Exemplo 2: Determinação de fosfolípidos O fosfato ligado organicamente é extraído do pó liofolizado da fracção de FEIBA, segundo o método de Folch J. et al., (J. Biol. Chem. 1957, 226: 497-509), por meio de uma mistura de solventes constituída por clorofórmio, metanol, na proporção de 2 partes em volume de clorofórmio para 1 parte em volume de metanol. O extracto que contém a componente fosfolipídica total foi, subsequentemente, transferido para recipientes de teflon e os solventes orgânicos evaporados sob uma corrente de azoto. Após adição de uma solução tampão (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) e de reagente oxisolv (Fa. Merck), os recipientes de teflon foram fechados de forma estanque e digeriu-se a 160°, durante 5 h. O fosfato libertado através do processo de digestão, foi detectado fotometricamente de forma quantitativa, como complexo de molibdato, segundo o método de Ames B.N. (Methods in Enzymology 1966, 8:115-118).

Exemplo 3: Preparação de um suporte de afinidade ligante de factor VIII

Um clone celular CHO, que produz recobinantes do factor de Willebrand, é preparado como descrito em FEBS. Lett. 1994; 351:345-348. Por transfecção com um vector que codifica para o cDNA da furina humana (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 1990; 18:664), conduziu-se a linha celular à coexpressão da furina humana. Tais clones celulares estáveis foram fermentados em larga escala, em reactores de perfusão sobre microportadores (Bliiml et al., em: Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds. Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, 1994 : 267-269). A purificação foi realizada através de um processo cromatográfíco de dois passos, segundo Thromb. Haemost. 1995; 73 : 1160. A fracção desadsorvida por eluição com cloreto de sódio, foi recolhida e sujeita a uma troca de tampão, para uma solução tampão contendo 20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5, por filtração em gel através de Sephadex G25 (Fa. Pharmacia). Subsequentemente, a preparação foi concentrada por ultraconcentração, através de uma membrana Amicon YM30 (limite de exclusão: 30 000 D), para uma concentração proteica de 3 mg/ml. A concentração de factor de Willebrand nesta preparação foi de 60 U de antigénio de vWF/ mg de proteína. A preparação do recombinante do factor de Willebrand foi diluída para 1,5 mg/ml, com uma solução tampão constituída por 20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5. Um gel apropriado para a cromatografia de afinidade, pré-activado (Actigel, ALD-Superflow, Fa. Sterogene), foi excessivamente lavado com uma solução tampão contendo 20 mM de tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5. Uma parte em volume do gel pré-lavado foi feita reagir com 1,1 partes em volume da solução de proteína a imobilizar e, subsequentemente, foram adicionadas 0,15 partes em volume de uma solução de 0,1 M de cianoboro-hidreto (NaCNBHj) em 0,1 M de tampão fosfato, pH 7,0. O gel foi suspenso por agitação neste tampão e incubado durante 16 horas, à temperatura ambiente, sob agitação. Subsequentemente, o gel foi lavado através de um filtro de sucção sinterizado, com 10 vezes o volume de um tampão contendo 20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5 e com 5 vezes o volume de um tampão contendo 20 mM de Tris-HCl, 2 M de NaCl, pH 7,5. Depois, equilibrou-se novamente com 5 partes em volume do tampão 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 e o gel foi transferido para uma coluna cromatográfica, com uma dimensão de diâmetro para a altura do gel de 1:4. Por determinação da concentração proteica das soluções do sobrenadante de incubação, separadas através do filtro de sucção sinterizado, da solução de factor de Willebrand e do gel de afinidade, assim como das soluções de lavagem, pôde ser determinada uma taxa de acoplamento superior a 90% da proteína inicial. 19

Exemplo 4: Preparação do complexo de protrombina isento de factor VIII, por contacto com um gel de afinidade (Nessa altura, a melhor forma de realização da invenção, segundo o ponto de vista da requerente). 0 preparado farmacêutico FEIBA S-TIM4 IMMUNO (1000 unidades) foi reconstituído com 20 ml de água destilada. Após dissolução completa do pó liofilizado, a solução continha uma concentração de substância activa de 50 unidades por ml. 10 ml desta solução foram postos em contacto com os 100 mg do imobilizado de factor de Willebrand, anteriormente descrito, e incubados durante 1 h à temperatura ambiente, sob ligeira agitação. Subsequentemente, o imobilizado foi eliminado por filtração através de um filtro de sucção sinterizado. A solução de FEIBA obtida no filtrado apresentou uma actividade de 49 unidades de FEIBA/ml. Devido à ligação do factor VIII contido no preparado ao imobilizado do factor de Willebrand, o antigénio do factor VIII nesta preparação encontrava-se abaixo do limite de detecção.

Exemplo 5: Preparação do complexo de protrombina activado, isento de factor VIII, por readsorção a um suporte inespecífico. 15 mg de DEAE-Sephadex® A-50, Fa. Pharmacia, foram incubados durante 15 min. à temperatura ambiente, com 1 ml de uma solução de 30g/l de NaCl em água, para inchamento. Em seguida, o gel foi separado do sobrenadante de inchamento por centrifugação. Subsequentemente, seguiram-se cinco lavagens do gel, cada uma com 1 ml de tampão (9 g/1 Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl, pH 7,0) e mais duas lavagens com um tampão (7 g/1 Nascitrato . 2H20, 7 g/1 NaCl), igualmente por ressuspensão e centrifugação. 30 ml dè plasma humano em citrato, congelado de fresco, foram descongelados a 0 -+4°C e o crioprecipitado que surge separado por centrifugação a +2°C. O "criosobrenadante" daí resultante foi incubado com a DEAE-Sephadex® lavada, sendo gerada a FEIBA e adsorvida ao gel, em conjunto com os factores do complexo de protrombina, factor VIII e proteína inerte. Em seguida, a proteína inerte coadsorvida foi eliminada do gel de DEAE, por lavagem com uma solução tampão (9 g/1 Na2HP04 . 2H20, 7 g/1 NaCl). 20

O complexo gel-proteína humedecido em tampão foi, então, suspenso com 1,5 ml de uma solução de 150 mg/ml de TWEEN®-80 e 30 mg/ml NaCl, durante 1 h a 26°C. Por tratamento com a solução de elevada força iónica, a proteína foi desadsorvida em conjunto com os factores do complexo de protrombina e o factor VIII. Subsequentemente, a suspensão foi diluída por meio da adição de 6,5 ml de água e readsorvida durante 1 h à temperatura ambiente, sendo a fracção do complexo de protrombina novamente readsorvida. Simultaneamente, foi apenas readsorvida ao gel uma reduzida parte do factor VIII contido na fracção proteica. O complexo gel/proteína foi, então, liberto do detergente, por lavagem cinco vezes com 1 ml de uma solução de 7 g/1 NaCl em água, de cada vez.

Para a eluição, o gel foi tratado com 0,7 ml de uma solução de 30 g/1 de NaCl em água, mediante agitação. O eluato foi, então, dialisado contra água destilada, congelado e liofilizado. Após reconstituição do liofilizado, a actividade-FEIB foi determinada de acordo com a AT 350 726.

Além disso, foi determinado o teor de antigénio de factor VIII. Como controlo serviu um preparado de FEIBA produzido de forma convencional, como é descrito na AT 350 726. A preparação obtida segundo o processo descrito, apresentou um teor de factor VIII reduzido por um factor de 10, em comparação com o controlo.

Pelo contacto com o detergente foram também inactivados agentes patogénicos, em especial, vírus com invólucro lipídico, eventualmente existentes.

Exemplo 6: Preparação do complexo de protrombina activado, isento de factor VIII e isento de fosfolípidos, por readsorção a um suporte inespecífico 15 mg de DEAE-Sephadex® A-50, fa. Pharmacia, foram incubados durante 15 min. à temperatura ambiente, com 1 ml de uma solução de 30 g/1 de NaCl em água, para inchamento. Em seguida, o gel foi separado do sobrenadante de inchamento por centrifugação. Subsequentemente, seguiram-se cinco lavagens do gel, cada uma com 1 ml de tampão (9 g/1 de Na2HPC>4.2H2O, 7 g/1 NaCl, pH 7,0) e mais duas lavagens com 21

uma solução tampão (7 g/1 Nascitrato . 2H20, 7 g/1 NaCl), igualmente por réssuspensão e centrifugação. 30 ml de plasma humano em citrato, congelado de fresco, foram descongelados a 0 -+4°C e o crioprecipitado que surge separado por centrifugação a +2°C. O "criosobrenadante" daí resultante, foi incubado com a DEAE-Sephadex® lavada, sendo gerada a FEIBA e adsorvida ao gel, em conjunto com os factores do complexo de protrombina, factor VIII, fosfolípidos e proteína inerte. Em seguida, a proteína inerte coadsorvida foi eliminada do gel de DEAE, por lavagem com uma solução tampão (9 g/1 Na2HP04.2H20, 7 g/1 NaCl). O complexo gel-proteína humedecido em tampão foi, então, suspenso em 1,5 ml de uma solução de 1 mg/ml de TWEEN®-80 e 30 mg/ml de NaCl, durante 1 h à temperatura ambiente, sendo a fracção proteica e impurezas inespecificamente adsorvidas, desadsorvidas. Subsequentemente, o gel foi separado por filtração. A solução proteica foi, então, ajustada para uma concentração de detergente de 150 mg/ml, por adição de TWEEN®-80 e, subsequentemente incubada durante 1 hora a 40°C, mediante agitação. Em seguida, diluiu-se por adição de 6,5 ml de água e readsorveu-se a um gel de DEAE-Sephadex® A-50 lavado de fresco previamente preparado, sendo a fracção do complexo de protrombina novamente readsorvida. Simultaneamente, foi apenas ligada ao gel uma reduzida parte do factor VIII contido na fracção proteica. Em seguida, eliminou-se o detergente por meio de cinco lavagens com 1 ml de uma solução de 7 g/1 NaCl em água, de cada vez. Com isto, foi também eliminado o fosfolípido ligado, o qual por contacto com o anfifílo estava presente de forma solubilizada.

Para a eluição, o gel foi tratado com 0,7 ml de uma solução de 30 g/1 de NaCl em água, mediante agitação. O eluato foi, então, dialisado contra água destilada, congelado e liofilizado. Após reconstituição do liofilizado, a actividade-FEIB foi determinada de acordo com a AT-B 350 726.

Além disso, foi determinado o teor de antigénio de factor VIII e de fosfolípido, como descrito. Como controlo serviu um preparado FEIBA produzido de forma convencional, 22

descrito, apresentou um teor de F VIII reduzido, comparativamente ao controlo e era livre de fosfolípidos. Os resultados das análises encontram-se resumidos na tabela 1.

Tabela 1

FEIBA: TEOR DE FVIII/FOSFOLÍPIDOS FEIBA FVm C:Ag FVIII C:Ag FEIBA Fosfolípido U/ml U/ml u/u nM fosfato/U FEIBA FEIBA (Padrão) 51 7,0 0,14 0,14 FEIBA (Produto de acordo com a invenção) 70 1,0 0,01 <0,02

Lisboa, 2 7 SET, m\

Dra. Maria FHvina Ferreira AgenteOrV ' .·. * '.-.4-strial R. Cait: r j -:. . .j- ,.U;bB0A Teleís. 215851550 - 2138150 50

Claims

1

f REIVINDICA ÇÕES 1. Preparação farmacêutica de complexo de protrombina imunotolerante, contendo os factores II, IX, X e, eventualmente, VII, caracterizada pelo facto de apresentar um teor de antigénio de factor VIII inferior a 0,1 de factor VIII: antigénio C/U FEIBA.

2. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser preparada a partir do plasma ou de uma ffacção do plasma.

3. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de a preparação conter pelo menos um dos factores IXa, Xa e Vila e apresentar actividade-FEIB.

4. Preparação farmacêutica de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de ser livre de fosfolípidos.

5. Processo para a produção de uma preparação de complexo de protrombina englobando os seguintes passos: a) disponibilização do plasma ou de uma fracção de plasma, contendo os factores II, IX, X e, eventualmente, VII, b) colocar em contacto o plasma ou a ffacção de plasma com um material de suporte, eventualmente, na presença de um detergente, de modo a que o factor VIII e, eventualmente, fosfolípidos, sejam separados dos factores II, IX, X e, eventualmente VII, c) purificação do plasma ou da fracção de plasma, e d) obtenção de uma fracção, contendo os factores II, IX, X e, eventualmente, VII.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de os passos b e c serem realizados como um passo do processo. Ο 2

7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo facto de o material de suporte ser um material apropriado para a cromatografia, filtração e/ou nanofiltração. Lisboa, 2 7 SET, 2001

Dra. Maria Agente Ofv.j·' j. teieíi. 's'lj 35 j Wvma Ferreira - Cairia/ '--L.iBOA - 21 j8 í 50 5o