ES2258264T3 - Produccion de trombina de grado terapeutico y productos obtenidos. - Google Patents
Produccion de trombina de grado terapeutico y productos obtenidos.Info
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO MEJORADO DE PRODUCCION A GRAN ESCALA DE TROMBINA DE TIPO TERAPEUTICO CON PROPIEDADES DE INOCUIDAD VIRAL Y ESTABILIDAD AL ALMACENAMIENTO EXCELENTES. DICHO PROCEDIMIENTO COMPRENDE LA PURIFICACION DE TROMBINA BRUTA, TRATADA CON VIRICIDA, MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO EN UNA UNICA COLUMNA, UTILIZANDO UN POLISACARIDO ACTIVADO CON SULFALQUILO, ESPECIALMENTE SULFOPROPILSPHERODEX, COMO MEDIO DE INTERCAMBIO IONICO, Y EL AUMENTO DE LAS CONCENTRACIONES DE TAMPON FOSFATO PARA LA ELUCION. TRAS LA RECUPERACION DE LA TROMBINA EN EL ELUATO FINAL, EL TAMPON FOSFATO SE INTERCAMBIA POR UN TAMPON DE FORMULACION ESTABILIZANTE, Y LA TROMBINA ESTABILIZADA ES SOMETIDA A FILTRACION VIRAL Y, OPCIONALMENTE, A UN TRATAMIENTO CON CALOR SECO, PARA UNA ULTERIOR INACTIVACION VIRAL. EL PRODUCTO FINAL TIENE UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA ELEVADA, Y SE OBTIENE CON BUEN RENDIMIENTO.
Description
Producción de trombina de grado terapéutico y
productos obtenidos.
La invención se refiere a la producción de
productos de trombina de grado terapéutico para uso clínico
(incluyendo el uso veterinario). La trombina se caracteriza por su
elevada seguridad vírica, elevada actividad específica, estabilidad
de almacenamiento y baja pirogenicidad. La invención se refiere
además a procedimientos para la preparación de los productos de
trombina que resultan eficientes, económicos y adecuados para la
producción a escala comercial.
La trombina se utiliza ampliamente en
aplicaciones clínicas como factor de coagulación para detener el
sangrado de heridas mediante la conversión del fibrinógeno en
fibrina. Es un componente frecuente de los apósitos quirúrgicos, y
se ha utilizado en combinación con el fibrinógeno y con otras
proteínas de coagulación en sistemas hemostáticos de dos
componentes, tales como colas, adhesivos y sellantes de fibrina. El
plasma tanto humano como bovino se considera una fuente de trombina
para la utilización clínica en seres humanos. Sin embargo, en parte
debido a la dificultad para purificar la trombina a partir de plasma
humano no autólogo eliminando o inactivando sustancialmente
cualquier virus posiblemente presente en el plasma inicial, se
derivan productos de trombina de grado terapéutico a partir de
plasma bovino, que presenta un bajo potencial inherente de albergar
virus perjudiciales para el ser humano, a pesar del reconocido
potencial inmunogénico de la trombina bovina en el ser humano, que
constituye un problema clínico considerable.
Para el uso clínico, la trombina típicamente se
deriva a partir de plasma sanguíneo en forma de complejo de
proteínas con protrombina, seguido habitualmente de la conversión
del proenzima en trombina mediante la reacción con tromboplastina en
presencia de iones de calcio. El producto crudo de trombina
seguidamente se procesa con el fin de separar la trombina de las
proteínas sanguíneas contaminantes y con el fin de inactivar o de
eliminar cualquier toxina o patógeno posiblemente presente.
Idealmente, el producto recuperado es una trombina de grado
terapéutico (trombina conforme a los estándares de la USFDA para el
uso en el ser humano) con elevada actividad específica, buena
estabilidad de almacenamiento, baja pirogenicidad y que se encuentra
sustancialmente libre de
virus.
virus.
Dicho ideal se cumple raramente o nunca. En los
procedimientos de purificación utilizados generalmente para obtener
trombina de grado terapéutico, la recuperación de trombina altamente
pura se consigue típicamente a expensas de cantidades significativas
de trombina activa debido a la pérdida o a la inactivación de la
trombina en el material de partida durante la purificación. En los
productos menos puros, la presencia de proteínas plasmáticas
extrañas (sean proteínas bovinas o humanas no autólogas) incrementa
el riesgo de reacciones inmunológicas posiblemente severas en el
paciente y típicamente afecta de manera negativa a las propiedades
del producto. En particular, los procedimientos de purificación
actuales generalmente permiten únicamente una purificación muy
limitada del plasma con respecto a los contaminantes víricos sin que
se produzcan pérdidas inaceptables de actividad de la trombina.
Además, muchos procedimientos de purificación de la trombina
informados como relativamente efectivos en el contexto de
laboratorio para la provisión de productos de trombina
terapéuticamente atractivos, no se prestan a una producción
comercial a gran escala económica. Como resultado, los productos de
trombina que se han propuesto para el uso humano clínico comportan
un riesgo significativo de toxicidad, no resultan de manera
consistente altamente eficaces y/o requieren complejos
procedimientos de preparación no adaptables a la producción a gran
escala. Además, los procedimientos conocidos de purificación, o los
productos resultantes de los mismos, carecen de versatilidad: por
ejemplo, los productos, en términos prácticos, generalmente no
pueden aplicarse a la práctica veterinaria, y los procedimientos
resultan excesivamente complejos o inefectivos para su utilización
en un contexto clínico para la purificación de plasma autólogo.
La trombina se purifica convencionalmente a
partir del producto de trombina cruda mediante cromatografía
utilizando como medio de separación, diversos polímeros de
intercambio iónico, particularmente polisacáridos activados, tales
como agarosa, dextrano o celulosa. Con el fin de obtener un producto
de trombina con una actividad específica adecuadamente elevada a
partir del material de partida de trombina cruda, se utiliza
típicamente cromatografía multietapa utilizando medios alternativos
de intercambio aniónico y catiónico, por ejemplo DEAE
(dietilaminoetil)Sepharose® como medio de intercambio
aniónico y CM-Sepharose® o
S-Sepharose® como medio de intercambio catiónico
(ver, por ejemplo, la patente US nº 5.149.540 de Kunihiro et
al., publicada el 22 de septiembre de 1992, o la patente US nº
4.965.203 de Slbering et al., publicada el 23 de octubre de
1990). Estas múltiples etapas de cromatografía requieren mucho
tiempo, incrementan el coste del procedimiento y con frecuencia no
pueden adaptarse a la producción a gran escala de trombina de grado
terapéutico.
Tal como es conocido en la técnica, la trombina
puede tratarse durante el curso del procedimiento de purificación
con el fin de inactivar los viriones que contienen lípidos con una
composición disolvente-detergente (DD) que comprenda
un detergente no iónico y un disolvente orgánico capaz de alterar
los lípidos víricos e inactivar el virus sin desnaturalizar la
trombina. Aunque estos productos purificados de trombina en
ocasiones se caracterizan como "libres de virus" (ver, por
ejemplo, el documento EP 0 443 724 A1, publicado el 28 de agosto de
1991), con frecuencia no lo son. Aunque el tratamiento con DD del
material que contiene trombina generalmente resulta efectivo para
inactivar los viriones con cubierta, no resultan inactivados por
este procedimiento los viriones sin cubierta, tales como los
parvovirus, y cualquiera de estos viriones en el material de partida
podría pasar por el procedimiento de purificación y seguir activo en
el producto final de trombina, comportando un riesgo clínico. Aunque
se ha reconocido la existencia de este problema, ha resultado ser de
difícil resolución, debido a que otros procedimientos estándar para
la inactivación vírica, tales como el tratamiento térmico o de rayos
UV, también inactivan la trombina, con pérdidas de trombina activa
que resultan inaceptables para las aplicaciones comerciales.
El procedimiento de la invención de acuerdo con
lo expuesto anteriormente proporciona un buen rendimiento de
concentrado de trombina de grado terapéutico de almacenamiento
estable de elevada actividad específica y baja pirogenicidad, y que
se encuentra sustancialmente purificado con respecto a viriones. El
procedimiento de purificación incluye las etapas de: 1) incubación
del material de partida de trombina cruda con una composición
viricida con el fin de inactivar los viriones con cubierta que
contienen lípidos; 2) cromatografía secuencial de intercambio iónico
del material, que ha sido incubado en un único medio de intercambio
catiónico, utilizando concentraciones crecientes de solución salina
y un medio de polisacárido sulfalquil-activado, tal
como agarosa, dextrano o celulosa de elevada afinidad, que sea
selectivo por la trombina, con la recuperación de un eluido final
que comprende una solución salina de trombina altamente purificada
con respecto a contaminantes, entre ellos otras proteínas
sanguíneas, toxinas, viriones con cubierta que contienen lípidos, y
residuo de viricida; 3) intercambio del tampón fosfato
cromatográfico del eluido final con formulación de tampón
fisiológicamente compatible con el fin de proporcionar una
formulación de solución de trombina altamente purificada; 4)
filtración de la formulación de solución de trombina por un filtro
vírico con el fin de eliminar los viriones que no contienen lípidos;
y 5) tratamiento opcional de calor seco de la trombina filtrada y
liofilizada con el fin de garantizar la inactivación de cualquier
virión posiblemente remanente (materiales víricos infectivos). Son
ejemplares las formulaciones de solución acuosa salina de tampón con
un pH de entre 7,2 y 7,4 que comprenden una sal de ácido cítrico y
1) albúmina bovina para la trombina bovina prevista para
aplicaciones veterinarias, o 2) albúmina humana para la trombina
bovina y humana prevista para aplicaciones en el ser humano. Las
soluciones de formulación de la invención (descritas con mayor
detalle posteriormente) contribuyen en términos generales, inter
alia, a la estabilización de la actividad enzimática de la
trombina durante el tratamiento posterior a la cromatografía y
durante el almacenamiento; la formulación utilizada también
estabiliza la trombina frente a la pérdida de actividad durante el
tratamiento antivírico de calor seco según la etapa (5).
El producto es una trombina de grado terapéutico
de almacenamiento estable de elevada seguridad vírica y actividad
específica para el uso clínico general, incluyendo el uso
veterinario. La elevada actividad específica, junto con un buen
rendimiento de producto, refleja la eficiencia del procedimiento
para la purificación de la trombina cruda con respecto a proteínas
contaminantes, otros componentes de material de partida extraños y
potencialmente tóxicos, residuos de viricida, y viriones, sin que se
produzca ninguna pérdida o inactivación sustancial de la trombina de
partida. Típicamente se obtiene menos de aproximadamente 15 ppm de
residuos de viricida. Se ha obtenido una estabilidad del producto
frente a una pérdida significativa de actividad durante por lo menos
un año bajo almacenamiento a aproximadamente 4ºC. El procedimiento
resulta aplicable a trombina procedente de cualquier fuente útil,
particularmente humana y bovina, y resulta particularmente útil para
la producción a gran escala de trombina de grado terapéutico. Para
las aplicaciones en las que no se requiera una seguridad vírica
sustancialmente completa del producto, o en el caso en que la
seguridad vírica no se considere un problema, pueden omitirse la
filtración vírica y el tratamiento térmico (etapas 4 y 5).
Más específicamente, la presente invención
proporciona un procedimiento para la producción a gran escala de una
composición de trombina de grado terapéutico de almacenamiento
estable sustancialmente libre de virus, que comprende:
- a)
- obtener protrombina cruda a partir de plasma,
- b)
- convertir la protrombina en trombina, obteniendo de esta manera trombina cruda,
- c)
- incubar trombina cruda con un viricida para virus que contienen lípidos, en cantidad suficiente para inactivar estos virus si se encuentran presentes,
- d)
- purificar el material incubado mediante cromatografía secuencial de intercambio iónico utilizando un medio de intercambio catiónico de polisacárido sulfalquil-activado de elevada selectividad para la trombina, e incrementar las concentraciones de una solución salina acuosa que actúa de agente de elución,
- e)
- recuperar el eluido correspondiente al pico de trombina de la cromatografía e intercambiar la solución salina del eluido por una formulación tampón estabilizadora fisiológicamente compatible para estabilizar la trombina recuperada y recuperar una formulación de solución tampón de la trombina, en la que la formulación de solución tampón comprende una solución acuosa de sal citrato, cloruro sódico, Tris-HCl y albúmina sérica a un pH de aproximadamente 7,3, en cantidades suficientes para estabilizar la trombina frente a la pérdida sustancial de actividad durante el tratamiento térmico,
- f)
- filtrar la solución tampón de formulación de trombina sobre una membrana de fibra hueca de celulosa cuproamoniacal con el fin de eliminar por filtración los viriones presentes en la formulación de solución tampón y recuperar una formulación de solución tampón de la trombina sustancialmente libre de viriones, y
- g)
- someter la formulación de solución tampón de la trombina liofilizada a tratamiento térmico a 100ºC durante 1 a 2 horas con el fin de inactivar cualquier virión remanente sin desnaturalizar la trombina recuperada, de manera que se inactiven los virus tanto con cubierta como sin cubierta.
En una forma de realización, la solución salina
acuosa en la etapa d) consiste en una solución tampón acuosa que
comprende KH_{2}PO_{4} y la sal de sodio o de potasio de
HPO_{4}^{=} y presenta un pH de aproximadamente 6,5.
En una forma de realización, las concentraciones
crecientes de una solución salina acuosa de la etapa d) consisten en
concentraciones crecientes de tampón aproximadamente 0,025 M, 0,35 M
y 0,4 M para la trombina bovina y concentraciones crecientes de
tampón aproximadamente 0,025 M, 0,15 M, 0,20 y 0,25 M para la
trombina humana.
En una forma de realización, el medio único de
polisacárido sulfalquil-activado de intercambio
catiónico se selecciona de entre el grupo constituido por
poliagarosa sulfalquil-activada, un polidextrano
sulfalquil-activado y un medio compuesto no
comprimible de dextrano sulfalquil-activado y
partículas de sílice.
En una forma de realización, el medio de
intercambio catiónico es un medio compuesto sustancialmente no
comprimible de dextrano sulfalquil-activado y
partículas de sílice.
En una forma de realización, el medio de
intercambio catiónico es un medio compuesto sustancialmente no
comprimible de dextrano sulfopropil-activado y
partículas de sílice.
En una forma de realización, la solución tampón
de formulación estabilizadora fisiológicamente compatible comprende
una solución acuosa de citrato sódico aproximadamente al 0,25%,
cloruro sódico al 0,45%, Tris-HCl al 0,25%, todos en
p/v, albúmina sérica en una cantidad igual a aproximadamente 20
veces la cantidad total de proteínas en el eluido del pico de
trombina y ajustada antes de la liofilización al 2% p/v y que
presenta un pH de aproximadamente 7,3.
En una forma de realización, la albúmina sérica
es albúmina sérica humana cuando la trombina está prevista para
aplicaciones en el ser humano, y la albúmina sérica es albúmina
sérica bovina cuando la trombina está prevista para aplicaciones
veterinarias.
En una forma de realización, la etapa d) se lleva
a cabo a 12ºC.
En una forma de realización, la trombina cruda es
trombina bovina, y el producto de trombina presenta una actividad
específica de por lo menos aproximadamente 2.000 unidades NIH/mg de
proteína nativa y menos de 15 ppm de residuo viricida.
En una forma de realización, la trombina cruda es
trombina humana, y el producto de trombina presenta una actividad
específica de por lo menos aproximadamente 1.000 unidades NIH/mg de
proteína nativa y menos de 15 ppm de residuo viricida.
En una forma de realización ejemplar de la
invención para la utilización clínica en el ser humano, en primer
lugar se incuba una preparación de trombina humana cruda con un
viricida que altera los lípidos, inactivando los viriones que
contienen lípidos. A continuación, la preparación tratada se
purifica secuencialmente mediante cromatografía de intercambio
iónico utilizando sulfopropil-Spherodex® como único
medio de adsorción y concentraciones crecientes de solución salina
en cada elución con el fin de obtener un eluido final que comprende
una solución concentrada de trombina sustancialmente purificada con
respecto a los viriones que contienen lípidos, proteínas
contaminantes y residuos de viricida. A la solución recolectada del
pico de trombina se añade albúmina estabilizadora y después se
intercambia el tampón de cromatografía por una formulación de
solución tampón mediante diafiltración. La formulación de solución
de trombina resultante, que comprende los componentes de formulación
tampón, albúmina, agua y trombina purificada, a continuación se
filtra con el fin de eliminar los viriones que contienen lípidos.
Después, la trombina purificada de virus se diluye a la
concentración requerida en formulación tampón, se ajusta la
concentración final de albúmina estabilizadora al 2% y la solución
se esteriliza por filtración, se liofiliza y se almacena a
aproximadamente 4ºC. Con el fin de garantizar la obtención de un
producto libre de viriones, la trombina liofilizada que se ha
filtrado para eliminar los virus se somete a un tratamiento de calor
seco a aproximadamente 100ºC con el fin de inactivar cualquier
virus remanente.
Puede utilizarse como material de partida para el
procedimiento de la invención cualquier preparación adecuada que
contenga trombina, incluyendo las preparaciones obtenidas
comercialmente. La presente invención convierte en practicable la
utilización segura de plasma humano como fuente de trombina, y para
la utilización clínica en el ser humano, de acuerdo con ello resulta
generalmente preferido el plasma humano, debido a que ello reduce el
riesgo de reacciones alérgicas en el receptor. El plasma bovino es
un material de partida generalmente preferido para los productos de
trombina según la invención para uso veterinario. Como es conocido
de la técnica, la trombina cruda puede obtenerse a partir de plasma
fresco acidificado, sobrenadante de crioprecipitado, sobrenadante de
precipitación con sal, o cualquier otra fracción del plasma que
contenga esta proteína. Un procedimiento ejemplar para la
preparación de un material de trombina cruda de partida que resulte
útil en la presente invención se describe en Ann. pharmaceutique
française 48(parte 3):129-1, 1990. En
términos generales, el procedimiento que se da a conocer comprende
la dilución del plasma o de la fracción de plasma de partida con
ajuste del pH de la solución diluida a aproximadamente 5,3; la
centrifugación de la solución con el fin de obtener un precipitado
que contenga protrombina cruda; la disolución del precipitado en
solución de NaCl con ajuste del pH a aproximadamente 7,0; y la
adición de iones de calcio a la solución resultante con incubación
durante por lo menos aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente
con el fin de convertir la protrombina en trombina. A continuación,
la solución de trombina se centrifuga con el fin de proporcionar un
sobrenadante que contenga trombina cruda adecuada para su
utilización como material de partida para la invención; a
continuación, el sobrenadante se mezcla con viricida, tal como se
describe posteriormente, y el precipitado se descarta. En una forma
de realización preferida particularmente útil para la producción a
gran escala de trombina, el procedimiento anteriormente descrito se
mejora según la presente invención mediante la utilización de la
diafiltración, especialmente la diafiltración con una solución de
NaCl aproximadamente 0,015 M en lugar de agua como tampón de
rellenado, con el fin de reducir la concentración salina del plasma
de partida, conservando simultáneamente un volumen aproximadamente
igual al original; la diafiltración puede comprenden la
ultrafiltración de volumen constante con adición continua de tampón
fresco, o la ultrafiltración repetida con adición de tampón fresco
tras cada ciclo de concentración. Ello reduce efectivamente la
concentración salina del plasma de partida hasta el nivel deseado,
evitando asimismo el incremento muy grande de volumen del material
que debe centrifugarse con el fin de obtener un precipitado de
protrombina cruda resultante de la dilución según la técnica
anterior.
Puede utilizarse cualquier viricida adecuado para
la inactivación de virus que contienen lípidos conocido de la
técnica; actualmente se recomiendan las composiciones que comprenden
un detergente no iónico, tal como un detergente
polioxietilenosorbitán de la serie Tween® o Span® y/o un disolvente
orgánico, tal como un dialquilfosfato o trialquilfosfato que altere
los lípidos víricos e inactive los viriones que contienen lípidos
sin desnaturalización significativa de la trombina. Se hace
referencia a estas composiciones viricidas en la presente memoria
como composiciones "disolvente-detergente" o
composiciones DD. Son ejemplares las composiciones DD que comprenden
un dialquilfosfato o trialquilfosfato opcionalmente en combinación
con un detergente no iónico como agente humectante y/o alcohol o
éter, incubadas con la proteína contaminada, tal como se describe en
la patente US nº 4.540.573, publicada el 10 de septiembre de 1985,
de Neurath et al. De acuerdo con el procedimiento de la
presente invención, la composición de disolvente/detergente
seleccionada se incuba con el material de partida de trombina cruda
previamente a la cromatografía, con la eliminación durante la
cromatografía (posteriormente) de los residuos de viricida y
contaminantes, particularmente otros factores de coagulación,
contenidos en el material de partida. Una composición DD no
desnaturalizante preferente para la utilización de acuerdo con la
invención se basa en un
C_{2}-C_{10}-trialquilfosfato,
tal como tri-n-butilfosfato y un
derivado polioxialquileno de un sorbitol/éster parcial de ácido
graso, tal como Tween 80® (monooleato de polioxietilenosorbitán) a
pH fisiológico.
De acuerdo con la invención, el material de
partida de trombina cruda tratado con viricida se purifica mediante
cromatografía secuencial de columna con un único medio de adsorción
con concentraciones crecientes de tampón en cada serie. Son bien
conocidos de la técnica los parámetros útiles para la cromatografía;
un procedimiento mejorado de acuerdo con la presente invención
comprende realizar la separación cromatográfica a una temperatura de
aproximadamente 12ºC, y no convencionalmente a temperatura ambiente
(aproximadamente 20ºC), lo que incrementa significativamente el
rendimiento. La purificación cromatográfica de la trombina a partir
del material de partida de trombina cruda incubada con viricida se
describe en la presente memoria en términos de cromatografía de
columna; sin embargo, puede utilizarse cualquier otra disposición
física comparable, tal como cartuchos, para poner en contacto el
medio de adsorción con la preparación de trombina. Mediante el
procedimiento de la invención, el procedimiento de purificación por
intercambio iónico proporciona un producto de trombina de elevada
actividad específica y buen rendimiento, reflejando la purificación
altamente eficiente y efectiva de la trombina cruda con respecto a
los materiales extraños en la preparación cruda, particularmente
otras proteínas sanguíneas o toxinas bacterias, y residuos de
viricida.
Puede utilizarse cualquier medio de adsorción de
intercambio catiónico adecuado para la separación de la trombina del
material de partida crudo tratado con viricida con el fin de
proporcionar un producto de grado terapéutico, especialmente medios
altamente selectivos para la trombina, tal como Sepharose® o
SP-Sephadex®, disponibles comercialmente de Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA. En una forma de realización de la
presente invención que resulta particularmente preferente para la
producción a gran escala, se utiliza gel de
sulfopropil-Spherodex® (disponible de Sepracor Inc.,
Marlborough, MA, USA) como el medio de intercambio iónico. Este
medio es un gel compuesto rígido no compresible que comprende
partículas de sílice cubiertas uniformemente con el dextrano
sulfopropil-activado, que presenta tanto una elevada
capacidad para la adsorción de la trombina, como excelentes
propiedades de flujo, permitiendo una purificación rápida y
eficiente. Además, el medio se renueva rápida y convenientemente
tras la utilización mediante lavado con, por ejemplo, solución de
hidróxido sódico, para el saneamiento y la eliminación de las
proteínas u otros materiales presentes en la columna. En general, no
se recomiendan para la purificación a gran escala de la trombina de
acuerdo con la presente invención los geles no rígidos, tales como
SP-Sephadex y geles comparables, debido a que se ha
observado que las tasas de flujo significativamente reducidas
durante la purificación de la trombina de acuerdo con la invención
están provocadas por la compresión de la columna debido a la
flexibilidad que presentan estos medios. Cuando se realiza la
separación cromatográfica a 12ºC, el eluido cromatográfico final
comprende una composición de trombina bovina con una actividad
específica de por lo menos 2.000 unidades NIH por mg de proteína
nativa, es decir, sin incluir ninguna proteína añadida, tal como
albúmina sérica estabilizadora, ver posteriormente), a un
rendimiento de por lo menos el 70%, hasta aproximadamente el 90% de
trombina bovina (aproximadamente 265.000 unidades NIH de trombina
bovina, hasta aproximadamente 340.000 unidades, partiendo de 6
gramos de trombina cruda comercial de actividad específica 100
NIH/mg) o una composición de trombina humana con una actividad
específica de por lo menos aproximadamente 1.000 unidades NIH por mg
de proteína nativa (es decir, sin incluir ninguna proteína añadida,
tal como albúmina sérica estabilizadora, ver posteriormente) a un
rendimiento de por lo menos aproximadamente el 70%, hasta
aproximadamente el 90% de trombina humana (por lo menos
aproximadamente 150.000 unidades NIH de trombina humana, hasta
aproximadamente 180.000 unidades, partiendo de 5 litros de
sobrenadante de plasma de precipitación salina. Cuando se realiza la
separación cromatográfica a 20ºC, la actividad específica de la
trombina humana es de por lo menos aproximadamente 400 unidades NIH
por mg de proteína nativa. Se incluye el % de pérdida de actividad
durante el tratamiento de DD y las variaciones entre lotes en el
intervalo con las unidades proporcionadas).
El tampón de cromatografía puede comprender una
solución acuosa de fosfato que comprende
KH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} (para la trombina bovina) y
KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} (para la trombina humana); los
componentes de las soluciones tampón individuales se mezclan con
agua (preferentemente destilada) en proporciones sustancialmente
equimolares y después se mezclan soluciones de fosfato monobásico y
dibásico en proporciones que proporcionan una solución tampón final
con un pH de sustancialmente 6,5. En primer lugar, la columna se
equilibra con una concentración baja de tampón fosfato
(aproximadamente 0,025 M) y se lava con concentraciones crecientes
del mismo tampón hasta que se ha eluido todo el material absorbente
de UV. El eluido final (solución del pico de la trombina) se
recupera y se trata con viricida, tal como se describe
posteriormente, para la seguridad vírica según resulte apropiado
para la aplicación pretendida. Para la trombina bovina, la columna
se lava preferentemente con tres concentraciones crecientes del
tampón (aproximadamente 0,025 M, 0,35 M y 0,4 M); el tercer lavado
con tampón 0,4 M eluye la solución del pico de la trombina.
Se eliminan los residuos de viricida y las proteínas contaminantes
durante los dos primeros lavados. Para la trombina humana, la
columna preferentemente se lava con cuatro concentraciones
crecientes de tampón (aproximadamente 0,025 M, 0,15 M, 0,20 M y 0,25
M); el cuarto lavado con tampón 0,25 M eluye la solución del pico de
trombina. Se eliminan los residuos de viricida y las proteínas
contaminantes durante los tres primeros lavados.
Alternativamente, la cromatografía puede llevarse
a cabo con un gradiente lineal de concentración creciente de
solución de cloruro sódico. La purificación de la trombina humana se
consigue utilizando una columna que se equilibra en 80 mM de NaCl y
se lava con un gradiente lineal de solución de NaCl de molaridad
creciente (80 a 150 mM). La trombina se eluye en solución 400 mM de
NaCl. Este experimento se llevó a cabo a 20ºC y la actividad
específica era comparable (500 NIH) a la obtenida a la misma
temperatura utilizando el gradiente secuencial de tampón fosfato
(>400 NIH). Por lo tanto, la solución tampón o salina utilizada
durante la purificación cromatográfica no resulta crítica, con la
condición de que resulte adecuada para la purificación de la
trombina con respecto a fuerza iónica y pH. Por lo tanto, el experto
en la materia podría encontrar fácilmente equivalentes a las
soluciones tampón y salina utilizadas anteriormente para conseguir
una purificación similar.
La solución del pico de trombina recuperada
anteriormente se diafiltra o se trata de otra manera de acuerdo con
procedimientos conocidos con el fin de intercambiar la solución
tampón de cromatografía por la formulación de solución tampón. Puede
utilizarse cualquier formulación de solución tampón en la que sea
soluble la trombina y que estabilice la solución de trombina frente
a las etapas de procedimiento descritas posteriormente para la
aplicación pretendida, especialmente las soluciones de
Tris-HCl (aproximadamente 0,20 a 0,30% p/p de la
composición total) en solución salina acuosa (aproximadamente 0,40 a
aproximadamente 0,50% p/p de NaCl de la composición total). Se
obtienen resultados particularmente buenos de acuerdo con la
presente invención para estabilizar la trombina frente al
tratamiento viricida posterior a la cromatografía y frente a la
degradación en el almacenamiento por ejemplo utilizando una
formulación de solución tampón que comprende una solución acuosa de
citrato sódico aproximadamente al 0,25%, cloruro sódico al 0,45%,
Tris-HCl al 0,25% (todos en % p/v); pH 7,3.
Para los mejores resultados, se añade
preliminarmente albúmina de suero bovino o humano (según el uso
pretendido) a la solución del pico de trombina antes del intercambio
del tampón de cromatografía por la solución tampón de formulación,
en una cantidad de aproximadamente 20 veces la cantidad total de
proteína en la solución (es decir, las "proteínas nativas") en
% en peso. La concentración final de albúmina se incrementa hasta el
2% (p/v) tras diluir la solución de trombina a la concentración
requerida al final del procedimiento inmediatamente antes del
rellenado. Con el fin de intercambiar los tampones, la solución del
pico de trombina recuperada preferentemente se somete a
diafiltración utilizando, por ejemplo, un volumen de tampón de
formulación igual a aproximadamente 8 veces el volumen de la
solución del pico de trombina y una membrana de nivel de corte
30.000 de pm u otra membrana conveniente que retenga la trombina
(pm: 36.000, con ligeras variaciones según la fuente) y la albúmina
(pm: 66.000, con ligeras variaciones según la fuente), pero no las
proteínas de menores dimensiones. Aunque pueden obtenerse resultados
mejorados mediante la adición de la albúmina (o, menos
preferentemente en la actualidad, cualquier otra proteína
estabilizadora) en cualquier momento antes del almacenamiento,
resulta preferente que la albúmina se incluya en la solución de
formulación antes de intercambiarse por la solución tampón de
cromatografía, debido a que la albúmina contribuye a estabilizar la
trombina durante todas las etapas posteriores a la cromatografía.
Tal como se ha descrito anteriormente, resulta más preferente que la
albúmina se añada a la solución del pico de trombina antes de la
etapa de intercambio de tampones. La albúmina sérica adecuada para
la utilización en la puesta en práctica de la invención se encuentra
generalmente disponible comercialmente; por ejemplo, una albúmina
sérica humana útil comprende Plasbumin-257 (Miles
Canada Inc., Etobicoke, Ontario, Canadá), que comprende una solución
de albúmina al 25% USP, que contiene adicionalmente dos
estabilizadores: acetiltriptófano 0,02 M y caprilato sódico 0,02 M,
sin conservantes, preparada a partir de plasma venoso humano
agrupado utilizando el procedimiento de fraccionamiento con etanol
frío de Cohn y tratado térmicamente a 60ºC durante 10 horas frente a
la posibilidad de transmisión de virus de la hepatitis. En una etapa
preferente de acuerdo con la presente solicitud, en primer lugar se
añaden aproximadamente 10 ml de solución de albúmina a
aproximadamente 500 ml de solución de pico de trombina, seguido de
la diafiltración de la solución de pico modificada con albúmina con
aproximadamente 8 veces el volumen de tampón de formulación para el
intercambio de tampones. Mediante esta etapa, se intercambia por lo
menos aproximadamente el 99%, más habitualmente aproximadamente el
99,99%, de los contaminantes de bajo peso molecular por el tampón de
formulación, dejando las proteínas de dimensiones superiores a la
capacidad de corte según peso molecular de la membrana de
diafiltración. Preferentemente, se utiliza albúmina de suero humano
para trombina tanto humana como bovina prevista para aplicaciones
humanas y se utiliza albúmina sérica bovina para la trombina bovina
prevista para aplicaciones veterinarias.
Dependiendo del uso pretendido, el producto de
trombina purificado en formulación tampón obtenido anteriormente
puede utilizarse sin modificación adicional tras la formulación
final, esterilización por filtración y liofilización,
particularmente la trombina bovina purificada para uso veterinario.
Para las aplicaciones en el ser humano, el producto preferentemente
se somete a purificación vírica adicional de la manera
siguiente.
Con el fin de purificar adicionalmente la
trombina con respecto a los virus que no contienen lípidos, la
trombina recuperada en tampón de formulación, que incluye
preferentemente albúmina sérica u otra proteína estabilizadora, se
filtra por una membrana de fibras huecas, tal como membrana
microporosa BMM (Bemberg Microporous Hembrane Development, Asahi
Chemical Industries) que comprende una fibra de celulosa regenerada
con cuproamonio con un tamaño de poro de aproximadamente 15 nm, del
tipo manufacturado por Asahi Chemical Industries, Tokyo, Japón, y
comercializado bajo la marca comercial Panova BMM. Esta técnica
elimina sustancialmente los viriones que no contienen lípidos que no
pueden inactivarse mediante el tratamiento de DD del procedimiento.
El filtro resulta particularmente adecuado para la purificación de
la trombina, debido a que puede soportar una concentración elevada
de trombina en un volumen reducido de solución: por ejemplo,
partiendo de 5 litros de plasma humano, se filtró un volumen de
aproximadamente 125 ml de solución de trombina purificada obtenida
(600 a 800 NIH/ml) utilizando 0,01 m^{2} de filtro Planova BMM de
15 nm. Bajo estas condiciones, la tasa ensayada de eliminación del
virus pequeño de la polio era de 7 logs.
Aunque el tratamiento de DD descrito elimina
típicamente entre 4 y 6 logs de virus con cubierta que contiene
lípidos, y la diafiltración vírica con membrana de 15 nm elimina
entre 4 y 8 logs de cualquier virus pequeño superviviente al
tratamiento de DD, con el fin de garantizar la seguridad vírica, las
preparaciones de trombina liofilizadas en viales pueden someterse
adicionalmente a un tratamiento de calor seco a aproximadamente
100ºC durante aproximadamente 1 a 2 horas. El bajo contenido de
humedad del producto durante el tratamiento resulta importante para
evitar una desactivación innecesaria de la trombina.
Se disolvieron seis gramos de trombina bovina
comercial cruda (obtenida de GenTrac, Inc., Middleton, WI, USA) con
una actividad específica de 100 NIH, en 75 ml de tampón acuoso que
contenía Tris-HCl al 1% y citrato sódico al 1,62%
(todos en % en p/v), pH 7,0. Se añadieron 75 ml de solución acuosa
de disolvente-detergente (Tris-HCl
al 1%, citrato sódico al 1,62%, Tween 80® al 2%,
tri-n-butilfosfato (TnBP) al 0,6%,
todos en % en p/v; pH 7,0) y la mezcla se agitó durante 6 horas a
25ºC.
La mezcla se aplicó directamente a una columna de
sulfopropil-Spherodex (2,5 cm x 13 cm, Pharmacia)
equilibrada con KH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 0,025 M en
solución acuosa (preparada tal como se ha descrito anteriormente), a
pH 6,5. La columna se lavó con tres concentraciones crecientes de
este tampón (0,025 M, 0,35 M y 0,4 M, todos a pH 6,5) hasta eluir la
totalidad del material absorbente de rayos UV. El material eluido
con los tampones 0,025 M y 0,35 M contenía componentes de mezcla de
DD y proteínas contaminantes, y se descartó. La tercera elución con
tampón 0,4 M contenía trombina bovina purificada tratada con
disolvente-detergente antivírico, de actividad
específica superior a 2.000 unidades NIH por mg de proteína, con un
rendimiento de entre el 70% y el 90%. La purificación se llevó a
cabo a 12ºC. Se añadió albúmina de suero bovino a la solución de
pico de trombina recogida en una cantidad igual a 20 veces la
cantidad total de proteína, y la solución resultante se sometió a
diafiltración con 8 veces el volumen utilizando una membrana de
corte de peso molecular 30.000 (membrana Amicon YM 30, Amicon
Division, W.R. Grace & Co.-Conn., Beverly, Massachusetts, USA),
con intercambio del tampón de cromatografía por la siguiente
formulación tampón: citrato sódico al 0,25%, cloruro sódico al
0,45%, Tris-HCl al 0,25% (hidrocloruro de
tris(hidroximetil)aminometano) (todas las cantidades
en % en p/v) en solución acuosa a pH 7,3. Tras la diafiltración, la
solución de trombina se diluyó hasta una concentración de 220 NIH/ml
con el mismo tampón de formulación, se incrementó el contenido de
albúmina sérica bovina hasta el 2% y la solución se esterilizó por
filtración, se introdujo en viales y se liofilizó. Los viales se
almacenaron a 4ºC. Previamente a la adición de albúmina sérica, la
actividad específica de la trombina era superior a 2.000 NIH/mg de
proteína. El residuo de DD presente en el producto final
reconstituido en 1 ml de agua era de: Tween 80 < 15 ppm; TnBP
< 15 ppm. Cada uno de los viales se rellenó con 220 unidades NIH
de la trombina bovina. Los estudios de estabilidad acelerada a 37ºC
durante 2 meses (correspondientes a 6 meses a 4ºC) demostraron una
falta de pérdida significativa de actividad de trombina.
Se procesaron de acuerdo con el procedimiento
descrito en Ann. Pharmaceutique française, op. cit., supra,
cinco litros de fracción de plasma humano remanente tras la
precipitación con sal de proteínas de coagulación utilizadas en la
producción de sellante de fibrina, utilizando una etapa de
diafiltración y no el procedimiento de dilución informado, tal como
se ha descrito anteriormente. La fracción de partida de plasma se
diafiltró con una concentración de solución acuosa de NaCl de 0,015
M, hasta aproximadamente el 10% de la concentración original en
plasma fresco, y el pH se ajustó a 5,3 con ácido acético al 2% y la
mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. A
continuación, el material se centrifugó durante 20 minutos a 4.200
rpm y el precipitado resultante se disolvió en 250 ml de NaCl al
0,9% por litro de plasma, ajustando el pH a 7,0 con carbonato
sódico. La protrombina se convirtió en trombina mediante la adición
de cloruro de calcio con el fin de obtener una concentración final
de 21 mM, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 2
horas y centrifugación a 4.200 rpm durante 20 minutos. Se obtuvieron
200.000-250.000 unidades NIH de trombina cruda a
partir de 5 litros de fracción de plasma de partida.
La concentración de proteína de la preparación de
trombina cruda se ajustó a aproximadamente 10-15
mg/ml y la solución se sometió a tratamiento antivírico con
disolvente-detergente mediante la adición de un
volumen igual de la siguiente composición DD: solución acuosa al 1%
de Tris-HCl, citrato sódico al 1,62%, Tween 80® al
2% (Sigma Chemical Co.) y
tri-n-butilfosfato al 0,6% (todos en
% en p/v) bajo agitación durante 6 horas a 25ºC.
Tras la incubación, el material de trombina cruda
se aplicó directamente a una columna de
sulfopropil-Spherodex (5 cm x 13 cm, Pharmacia)
equilibrada con tampón fosfato 0,025 M tal como en el Ejemplo 1. La
columna se lavó con cuatro concentraciones crecientes de tampón
fosfato (posteriormente) hasta la elución total del material
absorbente de UV.
El material eluido con los tres primeros tampones
(0,025 M, 0,15 M y 0,20 M) contenía componentes de la mezcla de DD y
proteínas contaminantes, y se descartó. La cuarta elución con tampón
0,25 M contenía trombina humana purificada tratada con antivírico
DD, de actividad específica de 1.200 unidades NIH por mg de
proteína, obtenida con un rendimiento del 90%. La cromatografía se
llevó a cabo a 12ºC. A la solución del pico de trombina recolectada
se añadió una solución de albúmina sérica humana autorizada para el
uso en el ser humano (Plasbumin-25)® en una cantidad
igual a 20 veces (en peso) la cantidad total de proteínas presentes
en la solución del pico de tormbina, y la solución se sometió a
diafiltración con 8 veces el volumen utilizando una membrana de
corte de peso molecular de 30.000 y la siguiente tampón de
formulación estéril: citrato sódico al 0,25%, cloruro sódico al
0,45%, Tris-HCl al 0,25% (todos en % en p/v) en
solución acuosa, pH 7,3.
A continuación, la solución de trombina se filtró
como tratamiento antivírico utilizando 0,01 m^{2} (área de
filtración) de filtro Planova BMM (Asahi Chemical Co., ver
anteriormente) de 15 nm (tamaño de poro) y 10 psi de presión. La
trombina filtrada se diluyó hasta la concentración requerida (en
este caso 220 NIH/ml) con el mismo tampón de formulación estéril, la
concentración de albúmina humana se incrementó hasta el 2%, la
solución se esterilizó por filtración, se introdujo en viales, se
liofilizó y se almacenó a 4ºC. Los viales se rellenaron con 200
unidades NIH de trombina humana y se realizaron estudios de
estabilidad acelerada a 37ºC durante 2 meses, correspondiente a 6
meses a 4ºC. No se observó ninguna pérdida significativa de
actividad de trombina (según medición mediante procedimientos
estándares de coagulación). Por lo tanto, se mantuvo la actividad
específica del producto durante el almace-
namiento.
namiento.
Los viales que contenían trombina humana
liofilizada se sometieron a calentamiento a 100ºC durante 1 a 2
horas. No se observó ninguna pérdida de actividad de trombina.
Los procedimientos ejemplificados en los Ejemplos
I, II y III se escalan fácilmente para la producción comercial.
Claims (11)
1. Procedimiento para la producción a gran escala
de una composición de trombina de grado terapéutico de
almacenamiento estable sustancialmente libre de virus, que
comprende:
- a)
- obtener protrombina cruda a partir de plasma,
- b)
- convertir la protrombina en trombina, obteniendo de esta manera trombina cruda,
- c)
- incubar la trombina cruda con un viricida para virus que contienen lípidos, en una cantidad suficiente para inactivar estos virus si se encuentran presentes,
- d)
- purificar el material incubado mediante cromatografía secuencial de intercambio iónico utilizando un único medio de polisacárido sulfalquil-activado de intercambio catiónico con una elevada selectividad para la trombina, y concentraciones crecientes de una solución salina acuosa como agente eluyente,
- e)
- recuperar el eluido del pico de trombina de la cromatografía e intercambiar la solución salina del eluido por un tampón de formulación estabilizadora fisiológicamente compatible para estabilizar la trombina recuperada y recuperar una formulación de solución tampón de la trombina, en la que la formulación de solución tampón comprende una solución acuosa de sal citrato, cloruro sódico, Tris-HCl y albúmina sérica a un pH de aproximadamente 7,3, en cantidades suficientes para estabilizar la trombina frente a una pérdida sustancial de actividad durante el tratamiento térmico,
- f)
- filtrar la formulación de solución tampón de la trombina por una membrana de fibra hueca de celulosa cuproamoniacal con el fin de separar por filtración los viriones presentes en la solución tampón de formulación, y recuperar una solución tampón de formulación de trombina sustancialmente libre de viriones, y
- g)
- someter la solución tampón de formulación de trombina liofilizada a tratamiento térmico a 100ºC durante 1 a 2 horas con el fin de inactivar cualquier virión remanente sin desnaturalizar la trombina recuperada, de manera que se inactiven los virus tanto con cubierta como sin ella.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que dicha solución salina acuosa en la etapa d) consiste en una
solución tampón acuosa que comprende KH_{2}PO_{4} y la sal
sódica o potásica de HPO_{4}^{-}, y que presenta un pH de
aproximadamente 6,5.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que las concentraciones crecientes de una solución salina
acuosa en la etapa d) consisten en concentraciones crecientes de
tampón aproximadamente 0,025 M, 0,35 M y 0,4 M para la trombina
bovina y en concentraciones crecientes de tampón aproximadamente
0,025 M, 0,15 M, 0,20 M y 0,25 M para la trombina humana.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el único medio de polisacárido
sulfalquil-activado de intercambio catiónico se
selecciona de entre el grupo constituido por una poliagarosa
sulfalquil-activada, un polidextrano
sulfalquil-activado y un medio compuesto no
compresible de dextrano sulfalquil-activado y
partículas de sílice.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que el medio de intercambio catiónico es un medio compuesto
sustancialmente no compresible de dextrano
sulfoalquil-activado y partículas de sílice.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que el medio de intercambio catiónico es un medio compuesto
sustancialmente no compresible de dextrano
sulfopropil-activado y partículas de sílice.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la formulación de solución tampón estabilizadora
fisiológicamente compatible comprende una solución acuosa de citrato
sódico al aproximadamente 0,25%, cloruro sódico al 0,45%,
Tris-HCl al 0,25%, todos en p/v, albúmina sérica en
una cantidad igual a aproximadamente 20 veces la cantidad total de
proteínas en el eluido del pico de trombina y ajustada previamente a
la liofilización al 2% p/v, y que presenta un pH de aproximadamente
7,3.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el
que la albúmina sérica es albúmina sérica humana cuando la trombina
está prevista para aplicaciones en humanos, y la albúmina sérica es
albúmina sérica bovina cuando la trombina está prevista para
aplicaciones veterinarias.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa d) se lleva a cabo a
12ºC.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la trombina cruda es trombina
bovina, y el producto de trombina presenta una actividad específica
de por lo menos aproximadamente 2.000 unidades NIH/mg de proteína
nativa y un residuo de viricida inferior a aproximadamente 15
ppm.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la trombina cruda es trombina
humana, y el producto de tormbina presenta una actividad específica
de por lo menos aproximadamente 1.000 unidades NIH/mg de proteína
nativa y un residuo de viricida inferior a aproximadamente 15
ppm.
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