JPH07308190A - トロンビンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、プロトロンビンからトロン
ビンへの転化を行うための原材料の入手が容易で、かつ
トロンビンを工業的規模で製造および精製できる方法を
提供することにある。 【構成】 本発明は、プロトロンビン含有水溶液を０〜
１５℃で、トロンボプラスチンおよび血漿の非存在下に
おいて、Ｃａ塩で処理することを特徴とするトロンビン
の製造方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はトロンビンの製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】トロンビンは分子量約３４０００、等電
点約７．１のセリンプロテアーゼであり、血液凝固過程
の最終段階に働く蛋白分解酵素である。すなわち、フィ
ブリノゲンに作用してフィブリンを生成することにより
血液凝固作用を生じる。このため、トロンビンは臨床的
には外科領域における局所止血剤として、また内科領域
における上部消化管出血などの止血剤として用いられて
いる。トロンビンは、生体内においては前駆物質である
プロトロンビンの形で存在しており、活性化Ｘ因子など
によって限定分解を受けて生成される。従来、トロンビ
ンの製造は、ヒトなどの血漿を原料として、まずプロト
ロンビンを抽出、精製し、得られた精製プロトロンビン
にトロンボプラスチンなどを作用させて行われている。
すなわち、トロンビンへの転化は精製されたプロトロン
ビンを対象にして行われているのである。

【０００３】このように、トロンビンの製造は、まず上
記の如く（１）プロトロンビンの精製からはじまり、
（２）プロトロンビンからトロンビンへの転化、（３）
トロンビンの精製などの各種の数工程を経て製造されて
いるのが現状である。また、この方法を基本として各種
の改良方法が報告されている。例えば、クエン酸処理し
た血漿を陰イオン交換体に接触させ、吸着したプロトロ
ンビンを当該交換体上でトロンビンに転化した後に溶出
・回収する方法（米国特許第５１４３８３８９号）、血
漿を低温エタノール処理後、陰イオン交換体処理するこ
とにより精製したプロトロンビンをトロンビンに転化
し、更に陽イオン交換体処理により精製する方法（特開
平３−１２８３９８号）などが知られている。このう
ち、トロンビンへの転化方法としては、上記のトロンボ
プラスチンを用いる以外にヘビ毒を用いる方法、高濃度
クエン酸塩を用いる方法（特開平４−３６５４８１）等
が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところで、このトロン
ボプラスチンは主にヒト胎盤から調製されたものが用い
られているが、原料の調達が困難であり、必ずしも充分
量が入手できるとは言えない。へビ毒を用いる場合も同
様である。一方、高濃度クエン酸塩による自然転化法は
未だ、研究室レベルの規模にとどまっており、大量生産
に応用できるような工業的製法としては確立されていな
い。

【０００５】そこで、本発明者らはこのような事情に鑑
み、トロンビンの工業的規模での製法の開発に取組み、
本発明を完成した。即ち、本発明の目的は、プロトロン
ビンからトロンビンへの転化を行うための原材料の入手
が容易で、かつトロンビンを工業的規模で製造および精
製できる方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、プロト
ロンビン含有水溶液を０〜１５℃で、トロンボプラスチ
ンおよび血漿の非存在下において、Ｃａ塩で処理するこ
とを特徴とするトロンビンの製造方法により達成でき
る。本発明のトロンビンの製造法は、より具体的には、
大別して（１）プロトロンビン含有水溶液の調製、
（２）プロトロンビンからトロンビンへの転化、（３）
トロンビンの精製からなる。

【０００７】（１）プロトロンビン含有水溶液の調製 本発明のプロトロンビン含有水溶液は血漿由来のプロト
ロンビンまたはプロトロンビン複合体、あるいはそれら
を含む画分であれば特に限定されない。本発明のプロト
ロンビン含有水溶液は血漿からクリオプレシピテートを
除いた上清（脱クリオ血漿）、コーンの第Ｉ＋II＋III
画分、第II＋III 画分、第III 画分等の出発原料を用い
て調製される。これらの出発原料から本願発明のプロト
ロンビン含有水溶液を調製する方法としては公知の手法
を用いればよい。例えば、無機塩に対する吸着性を利用
する方法、陰イオン交換体処理、アフィニティークロマ
ト処理等が例示される。

【０００８】本発明においてはプロトロンビン複合体を
用いることが好ましい。ここで用いられるプロトロンビ
ン複合体は、血液凝固因子の１つであるプロトロンビン
（血液凝固第II因子）と共にその他の血液凝固に関係す
る因子を含んだものである。プロトロンビンと共に含ま
れる成分としては、例えば血液凝固第VII因子、第IX因
子、第Ｘ因子などが挙げられる。またこれは、高純度精
製品である必要はなく粗製品であってもよい。粗製品を
使用する場合の利点としては、トロンビンへの転化処理
前において完全にプロトロンビンを精製する必要がない
ので、精製工程が簡易になりコストが削減される。ま
た、プロトロンビン複合体の由来は特に制限されない。
例えばウシ由来のもの、ヒト由来のもの等が挙げられる
が、好ましくはヒト由来のものである。

【０００９】プロトロンビン複合体（含有水溶液）の調
製方法としては、公知の手段が用いられる。例えば、特
開昭６２−１００１９号公報および特開平３−１２８３
９８号公報に記載の方法が使用できる。具体的には、血
漿を陰イオン交換体で処理してプロトロンビン複合体を
調製する方法、血漿からクリオプレシピテートを除いた
脱クリオ血漿を用いてプロトロンビン複合体を調製する
方法等が挙げられる。陰イオン交換体としては、ＤＥＡ
Ｅ系（例えばＤＥＡＥ−アガロース、ＤＥＡＥ−デキス
トラン、ＤＥＡＥ−セルロースなど）、ＱＡＥ系（例え
ば、ＱＡＥ−アガロース、ＱＡＥ−デキストランなど）
等が挙げられる。上記の手段で得られたプロトロンビン
複合体は、その複合体の状態でトロンビンへの転化処理
に付すことができる。

【００１０】（２）プロトロンビンからトロンビンへの
転化 （１）のプロトロンビン含有水溶液を０〜１５℃で、
トロンボプラスチンおよび血漿の非存在下において、Ｃ
ａ塩で処理する。Ｃａ塩としては塩化カルシウム、水酸
化カルシウム、酢酸カルシウム等が例示される。その濃
度は１０〜５０ｍＭ程度である。その際のプロトロンビ
ン量としては１〜１００単位／ｍｌ程度が例示される。
処理温度は０〜１０℃が好適である。処理時間は１〜５
日程度である。また、溶液のｐＨとしては６〜９程度が
例示される。 さらに必要に応じて、公知のトロンビン転化方法を組
合せて行ってもよい。好適にはのＣａ塩処理液を高濃
度クエン酸塩溶液中で自触媒反応を行わせ、トロンビン
へ自然転化させる。転化条件は温度２０〜４０℃、１〜
１０日間程度である。クエン酸塩としてはクエン酸ナト
リウム等が例示される。その濃度は１０〜４０（ｗ／
ｖ）％程度である。また、溶液のｐＨとしては６〜９程
度が例示される。

【００１１】（３）トロンビンの精製等 （２）で得たトロンビンを公知の方法により精製する。
精製方法としては陽イオン交換体処理、硫安分画処理、
アフィニティークロマト処理（例えば、固定化アルギニ
ルメチルエステルあるいは固定化ヘパリンを用いた処
理）等が例示される。なお、透析、限外濾過、ゲル濾過
等の公知の手段により、さらに精製することもできる。
上記の処理により、夾雑する各種蛋白（例えば、フィブ
リノゲン、フィブリン、α₁グロブリン、α₂グロブリ
ン、βグロブリン、γグロブリン、プロテアーゼ等）は
実質的に除去されている。かかる精製トロンビンの比活
性は５００〜１５００単位／Ａ₂₈₀程度となる。

【００１２】なお、トロンビンの活性は通常の測定方法
により求めることができる。好ましくはヒト血漿をフィ
ブリノーゲン源として、ＢＢＬフィブロメーターなどに
より凝固時間を測定することにより求める方法である。
具体的には、生理食塩液にて様々な割合で希釈された検
体０．１ｍｌを３７℃に２分間保ち、次いで３７℃に保
たれていた血漿０．２ｍｌを加え、凝固時間を測定する
ことによって求めることができる。当該トロンビンは自
体公知の手法により製剤化される。即ち、賦形剤の添
加、加熱、滅菌、除菌濾過、分注小分、凍結乾燥などの
処理が必要に応じて行われ、また、例えば、乾熱処理
（特開昭６２−８１３２７）、液状加熱（特開昭６３−
２４３０３２）、トリアルキルホスフェートによる処理
（ＥＰ公開３７８２０８）を必要に応じて行うことがで
きる。

【００１３】

【発明の効果】本発明の製造方法により、プロトロンビ
ンからトロンビンへの転化を行うための原材料の入手が
容易であり、簡便な操作で効率よく調製することがで
き、コストと労力も充分に軽減できる。また、Ｃａ塩処
理後に、公知の高濃度クエン酸塩を用いて処理（特開平
４−３６５４８１号公報）することにより、プロトロン
ビンからトロンビンへの転化効率を低下させることな
く、処理時間（Ｃａ塩処理あるいはクエン酸塩処理を含
む）を短縮することができる。高濃度クエン酸塩を用い
ての処理条件としては、クエン酸塩濃度１０〜４０（ｗ
／ｖ）％、２０〜４０℃で１〜１０日間程度が例示され
る。また、プロトロンビンとしてプロトロンビン複合体
を使用することにより、プロトロンビンまでに完全に精
製する労力も省くことができる。また、Ｃａ塩処理を０
〜１０℃で行うことによってもトロンビンへの転化効率
をさらに向上させることができる。 従って、本発明の
方法は工業的規模に適した有用な方法である。

【００１４】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。 実施例１ プロトロンビン、トロンビンの調製 ヒト血漿を凍結融解して得た脱クリオ血漿２リットル
を、０．０７５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍクエ
ン酸ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した
ＤＥＡＥ−デキストラン（商品名ＤＥＡＥ−セファデッ
クス、Ａ−５０、ファルマシア社製）に接触させて、プ
ロトロンビン複合体を０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび
０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ
７）で洗浄後に、１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍ
クエン酸ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７）で溶出し
た。溶出液を透析後に３％塩化カルシウム１／１０量添
加して５℃で３日間処理した。

【００１５】ｐＨを７に調整し、トリ−Ｎ−ブチルホス
フェート（ＴＮＢＰ）、Ｔｗｅｅｎ８０およびイプシロ
ン・アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を各々、最終濃度で
０．３％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）および４％（ｗ／
ｖ）となるように添加し、３０℃で６時間加温した。次
に、上記反応液をｐＨを６．７に調整し、０．０４Ｍ塩
化ナトリウムおよび０．０２Ｍクエン酸ナトリウムから
なる緩衝液（ｐＨ６．７）で平衡化したスルホプロピル
−デキストラン（商品名ＳＰ−セファデックス Ｃ−５
０、ファルマシア社製）に接触させて、トロンビンのみ
を吸着させた。かかるカラムを０．０４Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．０２Ｍクエン酸ナトリウムからなる緩衝液
（ｐＨ６．７）、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．
５）、次いで０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ
７）溶液で洗浄後、吸着させたトロンビンを０．１Ｍク
エン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７）で溶出・単離した。溶
出液をペリコン（分画分子量１万：ミリポア社製）にて
濃縮し、除菌濾過して精製トロンビン（比活性１０００
単位／Ａ₂₈₀）を調製した。

【００１６】実施例２ 塩化カルシウム存在下に５℃で３日間処理する代わり
に、塩化カルシウム存在下に５℃で１日間処理した後
に、クエン酸３ナトリウムを３５（ｗ／ｖ）％となるよ
うに添加し、ｐＨ８で３７℃、２日間処理してプロトロ
ンビンをトロンビンに転化する以外は実施例１と同様に
処理した。 実験例１ 塩化カルシウム処理時の温度条件とトロンビン転化効率
の関係を調べた。実施例１において温度条件を５〜３７
℃に設定して、各々の条件下でトロンビン転化効率を測
定した。なお、転化処理時にトロンボプラスチン１／１
０量をさらに添加して、１５℃で３時間処理した時のト
ロンビン転化効率を１００％とした。結果を表１に示
す。

【００１７】

【表１】

【００１８】実験例２ Ｃａ塩処理のみを行った場合とＣａ塩処理および高濃度
クエン酸塩処理を組合せた場合とで、トロンビン転化効
率に与える影響を調べた。結果を表２に示す。なお、転
化効率の基準は実験例１と同じである。

【００１９】

【表２】

【００２０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三宅 正一 大阪府大阪市都島区都島中通３丁目５番44 号 株式会社ミドリ十字都島工場内 (72)発明者 松本 勇彦 大阪府大阪市都島区都島中通３丁目５番44 号 株式会社ミドリ十字都島工場内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロトロンビン含有水溶液を０〜１５℃
   で、トロンボプラスチンおよび血漿の非存在下におい
   て、Ｃａ塩で処理することを特徴とするトロンビンの製
   造方法。
2. 【請求項２】 上記のＣａ塩処理液をさらに、２０〜４
   ０℃で１〜１０日間、１０〜４０（ｗ／ｖ）％のクエン
   酸塩で処理する請求項１のトロンビンの製造方法。
3. 【請求項３】 プロトロンビンがプロトロンビン複合体
   の態様である請求項１のトロンビンの製造方法。
4. 【請求項４】 Ｃａ塩での処理を０〜１０℃で行う請求
   項１のトロンビンの製造方法。
5. 【請求項５】 Ｃａ塩での処理を１〜５日間行う請求項
   １のトロンビンの製造方法。