JPH04365481A - トロンビンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト血漿由来のトロンビ
ンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来技術】トロンビンは分子量約３９０００のセリン
プロテアーゼで、血液凝固過程の最終段階に働く蛋白分
解酵素である。即ち、フィブリノゲンに作用してフィブ
リンを生成することにより血液凝固作用を生じる蛋白分
解酵素である。

【０００３】このため、トロンビンは臨床的には外科領
域における局所止血剤として、また、内科領域における
上部消化管出血などの止血剤として用いられている。と
ころで、このトロンビンは、ヒト由来の血漿から抽出し
たプロトロンビンにＣａイオン存在下にトロンボプラス
チンを作用させて調製し、滅菌、凍結乾燥などの処理に
付して製剤化されている。

【０００４】トロンビンは、通常（Ｉ）プロトロンビン
の精製、（ＩＩ）プロトロンビンからトロンビンへの転
化、（ＩＩＩ）トロンビンの精製の各工程を経て製造さ
れる。

【０００５】このうち、（Ｉ）のプロトロンビンの精製
については、無機塩に対する吸着性を利用する方法、陰
イオン交換体を用いる方法、アフィニティクロマトグラ
フィーを用いる方法等が、たとえば下記の刊行物によっ
て知られている。 ・〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１７４，５６５（１９
５４） ・Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７２，７３１（１９
５３） ・生化学，４０（１２），８９０〜９０１（１９６８）
・特公昭５８−５０２０２号公報 ・Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，２８５７（１９
５９） ところで、従来法においては出発原料として、ヒト血漿
そのもの、またはコーンの画分ＩＩＩ（特表昭５６−５
００５６９号）あるいは第Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ画分（特開
平２−１９４００）等が用いられてきた。

【０００６】また、トロンビンへの転化方法としては、
上記のトロンボプラスチンを用いる以外にヘビ毒を用い
る方法、高濃度クエン酸塩を用いる方法等が挙げられる
。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところで、このトロン
ボプラスチンは主にヒト胎盤から調製されたものが用い
られているが、原料の調達が困難であり、必ずしも充分
量が入手できるとは言えない。ヘビ毒を用いる場合も同
様である。

【０００８】一方、高濃度クエン酸塩による自然転化法
は未だ、研究室レベルの規模にとどまっており、大量生
産に応用できるような工業的製法としては確立されてい
ない。

【０００９】そこで、本発明者らはこのような事情に鑑
み、トロンビンの工業的規模での製法の開発に取組み、
本発明を完成した。即ち、本発明の目的は、トロンビン
原材料の入手が容易で、かつトロンビンを工業的規模で
製造および精製できる方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、（ｉ）
コーンの第ＩＩ＋ＩＩＩ画分または該ＩＩＩ画分を０．
０１Ｍ以下の水性溶媒で少なくともプロトロンビンを抽
出する （ｉｉ）少なくともプロトロンビンを含む（ｉ）の抽出
画分を０．０１〜０．１Ｍクエン酸塩、リン酸塩または
塩化ナトリウムおよび０．１〜５（ｗ／ｖ）％ポリエチ
レングリコール含有溶液で少なくともプロトロンビンを
抽出する （ｉｉｉ）（ｉｉ）の抽出画分を陰イオン交換体で処理
し、吸着したプロトロンビンを０．１〜１Ｍクエン酸塩
、０．０１〜０．１Ｍリン酸塩または０．１〜１Ｍ塩化
ナトリウムを含有する溶液を用いてプロトロンビンを溶
出する （ｉｖ）１０〜４０（ｗ／ｖ）％クエン酸塩含有溶液を
用いて２０〜４０℃で１〜１０日間処理し、プロトロン
ビンをトロンビンに転化する （ｖ）（ｉｖ）で得た粗トロンビンを陽イオン交換体で
処理し、吸着したトロンビンを０．０５〜０．５Ｍクエ
ン酸塩、０．０１〜１Ｍリン酸塩または０．０５〜０．
５Ｍ塩化ナトリウムを含有する溶液を用いて吸着したト
ロンビンを溶出する ことからなるトロンビンの製造法により達成できる。

【００１１】即ち、本発明のトロンビンの製造法は、よ
り具体的には、大別して（１）プロトロンビンの精製．
（ＩＩ）プロトロンビンからトロンビンへの転化．（Ｉ
ＩＩ）トロンビンの精製からなる。 （Ｉ）プロトロンビンの精製 （１）出発原料 出発原料として、ヒト血漿由来のコーンの第ＩＩ＋ＩＩ
Ｉ画分または第ＩＩＩ画分を用いる。 （２）水性溶媒による抽出 （１）の画分に、ｐＨ５〜８、塩濃度０．０１Ｍ以下の
適当な水性溶媒（例えば、水、塩化ナトリウム、等）を
添加し、プロトロンビンを抽出する。溶媒の添加量は当
該画分１ｋｇ当たり１〜２０リットル程度である。

【００１２】こうして得られた抽出画分はそのまま（３
）で処理してもよいが、好ましくは、当該抽出画分から
グロブリンを単離した後の残渣画分を（３）で処理する
ことが好ましい。 （３）クエン酸塩、リン酸塩または塩化ナトリウムおよ
びポリエチレングリコール含有溶液による抽出さらにク
エン酸塩、リン酸塩または塩化ナトリウムおよびポリエ
チレングリコール含有溶液を添加してプロトロンビンを
抽出する。

【００１３】クエン酸塩としてはクエン酸ナトリウムが
例示される。その添加量としては０．０１〜０．１Ｍ程
度である。リン酸塩としては、リン酸水素二ナトリウム
、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リ
ン酸二水素カリウム等が例示される。その添加量は０．
０１〜０．１Ｍ程度である。塩化ナトリウムの添加量と
しては０．０１〜０．１Ｍ程度である。また、ポリエチ
レングリコールとしては分子量１０００〜２００００の
ものが例示される。その添加量としては０．１〜５（ｗ
／ｖ）％程度である。 （４）陰イオン交換体処理 （３）の抽出画分を陰イオン交換体と接触させ吸着した
プロトロンビンを溶出する。

【００１４】陰イオン交換体としては、ＤＥＡＥ系（た
とえば、ＤＥＡＥ−アガロース、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン、ＤＥＡＥ−セルロースなど）、ＱＡＥ系（ＱＡＥ−
アガロース、ＱＡＥ−デキストランなど）などが挙げら
れる。

【００１５】接触条件は、ｐＨ６〜１０、塩濃度０．０
０１〜０．１Ｍ程度である。具体的には０．０１Ｍクエ
ン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８）、０．０２５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ９）等が挙げられる。

【００１６】溶出条件は、ｐＨ６〜１０程度であり塩濃
度として０．１〜１Ｍクエン酸塩、０．０１〜０．１Ｍ
リン酸塩または０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム等が例示さ
れる。具体的には０．３Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７）、０．２Ｍ塩化ナトリウム加０．０２５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ９）等が挙げられる。

【００１７】さらに必要に応じて、公知のプロトロンビ
ンの精製法を用いてもよい。例えば、塩析法、吸着法、
分画法・アフィニティクロマト等が挙げられる。 （ＩＩ）プロトロンビンからトロンビンへの転化前記（
Ｉ）で得られたプロトロンビンを高濃度クエン酸塩溶液
中で自触媒反応を行わせ、トロンビンへ自然転化させる
。

【００１８】転化条件は温度２０〜４０℃、１〜１０日
間程度である。クエン酸塩としてはクエン酸ナトリウム
等が例示される。その濃度は１０〜４０（ｗ／ｖ）％程
度である。また、溶液のｐＨとしては６〜９程度が例示
される。 （ＩＩＩ）トロンビンの精製 （ＩＩ）で得たトロンビンを陽イオン交換体により処理
する。

【００１９】陽イオン交換体としては、アンバーライト
ＩＲＣ５０、スルホエチル系（スルホエチル−デキスト
ラン等）、スルホプロピル系（スルホプロピル−デキス
トラン、スルホプロピル−アガロース等）、カルボキシ
メチル系（カルボキシメチル−セルロース等）が例示さ
れる。

【００２０】接触条件は、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１
〜０．１Ｍ程度である。具体的には０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．５）、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム溶液
等が挙げられる。

【００２１】溶出条件は、ｐＨ６〜８程度であり、塩濃
度としては、０．０５〜０．５Ｍクエン酸塩、０．０１
〜０．１Ｍリン酸塩、０．０５〜０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム等が例示される。具体的には０．１Ｍクエン酸ナトリ
ウム溶液等が挙げられる。

【００２２】トロンビンを精製するには公知の方法を用
いてもよい。即ち、硫安分画処理、アフィニティクロマ
トグラフィー処理などが挙げられる。アフィニティクロ
マトグラフィー処理としては、たとえばポリスチレンに
スルホネートおよびアルギニルメチルエステルを結合し
た担体、ヘパリンＮａをリガンドとした吸着体などを使
用する処理法などが挙げられる〔Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ−ｔ
ｏｇｒａｐｈｙ，３６３，９５−１００（１９８６）、
ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１１，７９９
−８０８（１９７７）参照〕。

【００２３】なお、透析、限外濾過、ゲル濾過などの公
知の手段により、さらに精製を行うこともできる。こう
して得られた精製トロンビンの比活性としては１００〜
１０００単位／Ａ２８０　程度であることが好ましい。

【００２４】かくして得られたトロンビンは、コーンの
画分ＩＩ＋ＩＩＩに夾雑する各種蛋白（たとえば、フィ
ブリノゲン、フィブリン、α１　グロブリン、α２　グ
ロブリン、βグロブリン、γグロブリン、プロテアーゼ
など）は実質的に除去されている。

【００２５】当該トロンビンは自体公知の手法により製
剤化される。即ち、賦形剤の添加、加熱、滅菌、除菌濾
過、分注小分、凍結乾燥などの処理が必要に応じて行わ
れ、また、例えば、乾熱処理（特開昭６２−８１３２７
）、液状加熱（特開昭６３−２４３０３２）、トリアル
キルホスフェートによる処理（ＥＰ公開３７８２０８）
を必要に応じて行うことができる。

【００２６】

【実施例】以下に本発明をより詳細に説明するために実
施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定され
るものではない。 実施例１ コーンの第ＩＩ＋ＩＩＩ画分１ｋｇを水１０リットルで
抽出し、グロブリンを回収した後の残渣画分３００ｇに
０．０４Ｍクエン酸３ナトリウムおよび２（ｗ／ｖ）％
ポリエチレングリコール（分子量６０００）含有溶液１
８００ｍｌを添加してプロトロンビンを抽出した。遠心
分離および濾過を行った後に、０．０１Ｍクエン酸３ナ
トリウム溶液（ｐＨ８）で平衡化したＤＥＡＥ−アガロ
ース（ＤＥＡＥ−セファロース、ファルマシア社）に吸
着させ、０．３Ｍクエン酸３ナトリウム溶液を（ｐＨ７
）を用いて吸着したプロトロンビンを溶出した。この溶
出画分にクエン酸３ナトリウム溶液を２５（ｗ／ｖ）％
となるように添加し、ｐＨ７．５で２５℃、３日間処理
を行い、プロトロンビンをトロンビンに転化した。さら
に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した
スルホプロピル−アガロース（Ｓ−セファロース、ファ
ルマシア社）に吸着させ、０．１Ｍクエン酸３ナトリウ
ム溶液で溶出し、トロンビンを回収した。 実施例２ 実施例１で得たトロンビンは以下のような性質を有して
いた。 （１）精製効率 精製効率を表１および２に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【表２】

【００２９】（２）純度 セルロースアセテート膜電気泳動法により測定したとこ
ろ、γ画分５．９％、β画分（トロンビンに相当）８４
．２％、α画分９．９％であった。 （３）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法で測定したところ、非還元
下で３４０００であった。 実施例２ 実施例１のトロンビン溶出液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／
ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃、６時
間以上のウィルス不活化処理を行う。ウィルス不活化処
理後トロンビンを再度ＳＰ−セファデックスまたはヘパ
リン−ゲルに吸着させ、よく洗浄して、ＴＮＢＰ、Ｔｗ
ｅｅｎ８０を除去した後、ゲルよりトロンビンを溶出す
る。こうして得られたトロンビンは、イオン強度、力価
を調整し、小分けされ、凍結乾燥した後、６０℃、７２
時間以上の乾燥加熱処理を行う。 実施例３ 陰イオン交換体処理によるプロトロンビンの精製におい
て、平衡化を０．０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９）、溶
出を０．２Ｍ塩化ナトリウム加０．０２５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ９）を用いる以外は実施例１に準じて行った。

【００３０】この場合のプロトロンビンの精製効率を表
３に示す。

【００３１】

【表３】

【００３２】

【発明の効果】本発明の製造方法により、トロンビンを
原材料の入手が容易であり、簡便な操作で効率よく精製
することができ、コストも充分に軽減できる。

【００３３】従って、本発明の方法は、工業的規模に適
した有用な方法である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ｉ）コーンの第ＩＩ＋ＩＩＩ画分または該ＩＩＩ画分
   を０．０１Ｍ以下の水性溶媒で少なくともプロトロンビ
   ンを抽出する （ｉｉ）少なくともプロトロンビンを含む（ｉ）の抽出
   画分を０．０１〜０．１Ｍクエン酸塩、リン酸塩または
   塩化ナトリウムおよび０．１〜５（ｗ／ｖ）％ポリエチ
   レングリコール含有溶液で少なくともプロトロンビンを
   抽出する （ｉｉｉ）（ｉｉ）の抽出画分を陰イオン交換体で処理
   し、吸着したプロトロンビンを０．１〜１Ｍクエン酸塩
   、０．０１〜０．１Ｍリン酸塩または０．１〜１Ｍ塩化
   ナトリウムを含有する溶液を用いてプロトロンビンを溶
   出する （ｉｖ）１０〜４０（ｗ／ｖ）％クエン酸塩含有溶液を
   用いて２０〜４０℃で１〜１０日間処理し、プロトロン
   ビンをトロンビンに転化する （ｖ）（ｉｖ）で得た粗トロンビンを陽イオン交換体で
   処理し、吸着したトロンビンを０．０５〜０．５Ｍクエ
   ン酸塩、０．０１〜１Ｍリン酸塩または０．０５〜０．
   ５Ｍ塩化ナトリウムを含有する溶液を用いて吸着したト
   ロンビンを溶出する ことからなるトロンビンの製造法。