DK147408B

DK147408B - Fremgangsmaade til udvinding af thrombinagtige enzymer fra slangegifte eller slangegiftfraktioner

Info

Publication number: DK147408B
Application number: DK364077AA
Authority: DK
Inventors: Kurt F Stocker
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1976-08-17
Filing date: 1977-08-16
Publication date: 1984-07-23
Also published as: DK364077A; SE433619B; AU2763377A; DE2734427B2; DE2734427C3; DK147408C; BE857876A; SE7709241L; CH626917A5; ES461549A1; ATA590477A; FR2362155B1; JPS5324095A; JPS5710718B2; GB1591333A; LU77957A1; US4137127A; FR2362155A1; NO147526C; SU946389A3

Description

147408

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af thrombinagtige proteolytiske enzymer ud fra giftene eller giftfraktioner fra slanger af familien Crotalidae, især fra slægterne Agkistrodon, Bothrops, Crotalus og Trimeresurus.

Thrombinagtige proteolytiske enzymer er proteaser, som f.eks. kan udvindes fra visse slangegifte, og som, ligesom thrombinet, fra fibrinogen spalter fibrinopeptid A og/eller f ibrinopeptid B, idet de dog adskiller sig fra thrombin derved, at de udviser en større substratspecifi^itet [se f.eks. D.L. Aronson i Thrombos. Haemostas. (Stuttg.), 1976, 2§r side 9 - 13, og 1976, ^5» side 477] .

Thrombinagtige slangegiftenzymer kan anvendes som reagenser til undersøgelse af blodstørkningsforløbet, som antihæmorrhagiske 2 147408 lægemidler og som midler til eksperimentel og terapeutisk defi-brinogenering og følgelig til antikoagulation.

I den nedenstående tabel er der for de thrombinagtige enzymer fra giften fra nogle slangearter angivet anvendelsen og de dertil hørende litteraturhenvisninger.

Tabel i

Gift fra arten: Anvendelse: Litteraturhenvisning:

Agkistrodon Blodundersø- Herzig, R.M. Ratnoff, O.D., og contortrix gelse Shainoff, Y.R.: Studies on a procoagulant fraction of Southern copperhead snake venom:

The preferential release of fi-brinopeptide B. J. Lab. and Clin.

Med. 76, 451 - 465 (1970)

Agkistrodon Defibrinoge- Sharp, A.A., Warren, B.A., Pax- rhodostoma nering ton, A.M. og Allington, M.J.:

Anticoagulant therapy with a pu-rified fraction from Malayan pit viper venom.

Lancet 1^, 493 - 499 (1968)

Bothrops Defibrinoge- Egberg, N.: Experimental and cli- atrox nering nical studies on the thrombin-like enzyme from the venom of Bothrops atrox. On the primary strueture of fragment E.

Acta phys. scand. Suppl. 400 (1973)

Blodstands- Berger, E., Laurent, A.J. og Sto- ning cker, K.F.: The prophylactic and therapeutic use of Reptilase.

Praxis 57, No. 17, 611 - 616 (1968)

Blodundersø- Funk, C., Gmur, J., Herold, R. og gelse Straub, P.W.: Reptilase-R. A new reagent in biood coagulation.

Brit.J. Haematol. 21, 43 - 52 (1971)

Bothrops Blodstands- Mauro, C.: Sulla azione emocoagu- jararaca ning lånte del veleno de Bothrops jara- raca.

Giorn.Ital. di Chirurgia 8, 448 (1949) 3 147408

Tabel I fortsat

Crotalus Defibrinoge- Markland, F.S. og Damus, P.S.: adamanteus nering Purification and properties of a thrombin-like enzyme from the venom of Crotalus adamanteus.

J. Biol. Chem. 246, 6460 - 6473 (1971)

Trimeresurus Defibrinoge- Ouyang, C. og Yang, F.Y.: Purifi- gramineus nering cation and properties of the throm bin-like enzyme from Trimeresurus gramineus venom.

Biochim. et Biophys. Acta, 351, 345 -363 (1974).

De ovenfor anførte proteolytiske enzymer er glycopeptider med mole-kylarvægte på 18000 - 55000; da de hæmmes af diisopropylfluorphos-phat, skal de indordnes i gruppen serinproteaser. Ligesom throm-bin bevirker de thrombinagtige slangegiftenzymer ved fibrinopeptidfra-spaltning omdannelsen fra fibrinogen til fibrin, men de adskiller sig dog fra thrombin i deres opførsel over for andre blodstørkningsfaktorer, over for thrombocyter og især derved, at deres koagulerende virkning over for plasma ikke hæmmes signifikant af thrombin-inhibitorer såsom heparin, hirudin og antithrombin III eller af hepa-rinoider [se D.L. Aronson i Thrombos. Haemostas. (Stuttg.), 1976, 36, side 9 - 13].

For at udvinde de thrombinagtige enzymer fra slangegiftene, som består af blandinger af op til over 20 forskellige farmakologisk aktive polypeptider, udfældes ballaststofferne ifølge Deutsch (Deutsch, E.: Blutgerinnungsfaktoren, Verlag Deuticke, Wien 1955) ved syre- og varm,efældning fra den opløste rågift, og fra den tilbageværende flydende fase vindes de thrombinagtige enzymer ved opløsningsmiddel- eller saltfældning i form af berigede fraktioner.

Banerjee et al. beskriver en 30 ganges opkoncentrering af det thrombin-agtige enzym af Bothrops-jararaca-gift ved fældning med ammoniumsulfat fra en 0,5%'s rågiftopløsning, varmebehandling af det opløste bundfald ved 65°C, adskillelse fra de udfældede ballaststoffer ved centrifugering, adsorption af det thrombinagtige enzym på en calciumphosphatgel, eluering med natriumphosphatpuffer ved en pH-værdi på 7,2, fornyet fraktioneret ammoniumsulfatfældning og til slut dialyse mod "veronal"-puffer [se Banerjee, E. Devi, A., Sarkar, , 147408 4 N.: Isolation and purification of a coagulant from snake venom of the species Bothrops jararaca and the study of its properties. Thromb. Diath. Haem. jj, 296 - 303 (1960)]. I de britiske patentskrifter nr. 1094301 og 1177506 beskrives udvindingen af thrombin-agtige enzymer af giften fra Agkistrodon rhodostoma ved chromato-grafi på triethylaminoethylcellulose med efterfølgende oprensning ved gelchromatografi; således chromatograferes 2 g rå Agkistrodon rhodostomagift på en kolonne på 35 x 3,9 cm med TEAE-cellulose (= 417 ml) og derpå på en kolonne på 97 x 6 cm med "Sephadex'® G-100 (= 2826 ml). Bonilla [Thromb. Res. 6, 151 - 169 (1975)] beskriver udvindingen af det thrombinagtige enzym af giften fra Crotalus horridus ved chromatografi af 20 g rågift på en kolonne med 1766 ml "Sephadex'® G-100, efterfulgt af chromatografi af den aktive fraktion på en kolonne med 883 ml diaminoethylcellulose, efterfulgt af chromatografi på 883 ml carboxymethylcellulose og en sidste rensning ved chromatografi på en kolonne på 2,5 x 36 cm (176 ml) DEAE-cellulose under anvendelse af en lineært voksende pufferkoncentrationsgradient og efterfulgt af chromatografi på en kolonne på 2,5 x 33 cm med "Sephadex”'®' G-200. Ved de nævnte, under anvendelse af ionbytter- og gelchromatografi udførte fremgangsmåder åbnes der ganske vist mulighed for at opnå en langt højere renhed end ved den ovenfor beskrevne adsorptionsfremgangsmåde, men de er dog tidskrævende og uøkonomiske, da der kun kan chromatograferes ringe mængder rågift på relativt store kolonner. Det aktive eluat indeholder yderligere kun en relativt ringe mængde enzym i et stort væskevolumen, og det må derfor koncentreres enten ved ultrafiltering eller vakuumdestillation. Ifølge USA patentskrift nr. 3849252 vindes det thrombinagtige enzym fra Bothrops-atrox-gift derved, at ballaststoffer udfældes fra 20 g rågift ved syrning, hvorpå enzymet bringes til udfældning ved dannelse af et tungtopløseligt com-plex med phenol eller et phenolderivat, dette complex sønderdeles, og det således berigede enzym chromatograferes på en kolonne med 200 ml DEAE-"Sephadex'®, hvorpå det renses på en kolonne på 1,8 x 92 cm (233 ml) med "Sephadex'® G-100. Ved den ved denne fremgangsmåde anvendte fældning af det thrombinagtige enzym som phenol- eller phenolderivat-complex bliver de chromatografiske rensningstrin ganske vist betydeligt mere effektive end ved direkte chromatografi af rågiften, men denne fremgangsmådes mange trin kræver alligevel en betydelig arbejdsindsats, og der fås et produkt med util- 5 147408 strækkelig renhed, hvilket med prothrombinfrit plasma i nærværelse af calcium danner en i monochloreddikesyre uopløselig koaguleret masse og derfor aktiverer faktor XIII. Hollemann og Weiss [J. Biol. Chem. 251, 1663 - 1669 (1976)] har isoleret og renset det thrombinagtige enzym af Bothrops-atrox-gift ved affinitets-chromatografi af 2 g rågift på en kolonne af 2,5 x 56 cm (274 ml) p-aminobenzamidin-succinyl-diaminodipropylamino-agarose ved 4°C under anvendelse af 0,15M benzamidin i natriumcitrat/NaCl-puffer med pH-værdi 9,0 og efterfølgende fjernelse af benzamidinet fra eluatet ved dialyse. De fik på denne måde et produkt, som ikke aktiverer faktor XIII. Ved denne fremgangsmåde fås ganske vist i kun få trin et produkt med en tilstrækkelig renhed, men der kræves en forholdsvis stor kolonne af et adsorberende middel, som er kompliceret at fremstille, og desuden behøves til elueringen benzamidin, som på grund af sine UV-absorberende egenskaber gør det umuligt at anvende UV-fotome-trisk overvågning af chromatografiforløbet, og som, da det har en betydelig toxicitet, må fjernes fuldstændigt fra eluaterne, hvilket igen kræver en tidsrøvende dialyse.

Det har nu vist sig, at thrombinagtige slangegiftenzymer, endskønt deres blodstørkningsaktivitet ved de pH-værdier, ionstyrker og temperaturbetingelser, der er sædvanlige ved blodstørkningstests, ikke hæmmes af heparin, overraskende har en udtalt affinitet til et ved binding til en bærer insolubiliseret heparin og derfor kan isoleres fra rågift fra slanger, eller fra fraktioner deraf, og renses ved affinitetschromatografi på insolubiliseret heparin.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til udvinding af thrombinagtige proteolytiske enzymer fra slangegifte eller slangegiftfraktioner, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at slangegiften eller slangegiftfraktionen i opløsning i et vandigt medium bringes i berøring med et ved binding til en i vand uopløselig bærer insolubiliseret heparin til binding af det thrombinagtige enzym til den insolubiliserede heparin, de uønskede led-sagestoffer fra slangegiften fjernes, og det thrombinagtige enzym med et vandigt medium spaltes fra det insolubiliserede heparin.

Som udgangsmaterialer til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen egner sig på den ene side klarfiltrerede eller centrifugerede vandige opløsninger af den rå gift fra slanger af familien Crotalidae, især slægterne Agkistrodon, Bothrops, Crotalus og Trimeresurus. Som 6 147408 udgangsmaterialer egner sig på den anden side også klarfiltrerede eller centrifugerede slangegiftfraktioner, der indeholder det throm-binagtige enzym opkoncentreret, og fra hvilke ballaststoffer er fjernet ved syre- eller varmefældninger. Som udgangsmaterialer egner sig endvidere rå præparater af de thrombinagtige slangegiftenzymer, som f.eks. er fremstillet ud fra rågift efter den i USA patentskrift nr. 3.849.252 beskrevne fremgangsmåde ved fældning med phe-nol eller et phenolderivat.

Insolubiliseret heparin kan fremstilles ved, at heparin på i og for sig kendt måde via sine aminogrupper bringes til at reagere med de reaktive grupper i en polymer vanduopløselig bærer og derved bindes covalent til bæreren. Det insolubiliserede heparin kan f.eks. fremstilles ved en af de af Schmer beskrevne fremgangsmåder ved binding af heparin til agarose ved cyanogenbromidmeto-den, ved binding til putrescinagarose ved thiophosgenmetoden eller ved binding til epsilonaminocaproylagarose ved carbodiimidmetoden [se G. Schmer: The biological activity of covalently immobilized heparin, Trans. Am. Soc. Artificial Int. Org. 18, 321 - 323 (1972)].

Som bæremateriale kan ligeledes anvendes cellulose og de tilsvarende derivater, dvs. putrescincellulose og epsilonaminocapro-ylcellulose. Insolubiliseret heparin kan hensigtsmæssigt også fremstilles ved omsætning af heparin med som handelvare tilgængeligt tværbundet cyanogenbromidagarose i form af størrelsesnormerede perler (f.eks. CNBr-Sepharose 4B fra firmaet AB Pharmacia, Uppsala, Sverige).

Behandlingen af udgangsmaterialet med det insolubiliserede heparin (dvs. bindingen af det thrombinagtige slangegiftenzym til heparinet) og fraspaltningen af enzymet fra det insolubiliserede heparin kan ske charge-vis ved udrøring af udgangsmaterialet, som er opløst i en vandig pufferopløsning, i en vandig elektrolyt-opløsning uden eller højst med svag puffervirkning eller i en vandig opløsning, der foruden en puffer også indeholder et neutralt salt, f.eks. natriumchlorid, sammen med affinitetsadsorbensen (dvs. det insolubiliserede heparin), hvorefter der filtreres, eller fortrinsvis ved affinitetschromatografi på en kolonne.

Som elektrolytter er uorganiske og organiske salte, f.eks. natriumchlorid, ammoniumchlorid, magnesiumsulfat, ammoniumsulfat, calcium-chlorid, ammoniumbicarbonat, ammoniumformiat, natriumacetat eller triethylamin-hydrochlorid; organiske syrer, f.eks. eddikesyre, vin- 147408 syre eller citronsyre; eller baser, f.eks. ammoniumhydroxid, tri-methylamin eller triethylamin egnede. Ved affinitetschromatografi hældes det insolubiliserede heparin på en kolonne, hvis tværsnit udgør ca. en tiendedel af dens højde, og der ækvilibreres med det samme vandige medium, som udgangsmaterialet er opløst i. Kolonnens udløb er hensigtsmæssigt forbundet med et gennemløbsfotometer, som måler og automatisk registrerer den optiske densitet af det udflydende eluat ved en hensigtsmæssig bølgelængde (sædvanligvis 280 nm eller 254 nm). Fortrinsvis inddeles eluaterne i fraktioner og samles ved hjælp af en automatisk fraktionssamler.

Affinitetschromatografien kan i enkeltheder udføres som følger:

Udgangsmaterialet (slangerågiftén eller slangegiftfraktionen) opløses i en vandig pufferopløsning eller i en vandig elek-trolytopløsning, f.eks. i natriumchloridopløsning, eller i en vandig opløsning, der indeholder både en puffer og et neutralt salt såsom natriumchlorid. Opløsningen filtreres til klarhed eller centrifugeres og hældes derpå på chromatografikolonnen. Kolonnen vaskes derpå i så lang tid med det samme vandige medium, som udgangsmaterialet er opløst i, at der ikke længere i det udløbende eluat kan påvises nogen UV-absorberende stoffer. Derpå vaskes kolonnen med et vandigt elueringsmiddel, f.eks. med en pufferopløsning eller en elek-trolytopløsning eller en opløsning, der indeholder såvel en puffer som et neutralt salt såsom natriumchlorid, hvorhos koncentrationen er større end i det vandige medium, hvori udgangsmaterialet er opløst, for at spalte det thrombinagtige slangegiftenzym fra det insolubiliserede heparin. Der vaskes så længe, at der ikke mere elueres noget UV-absorberende materiale. Til slut eftervaskes kolonnen med en pufferopløsning eller med en elektrolytopløsning eller med en opløsning, der indeholder såvel en puffer som et neutralt salt såsom natriumchlorid, med en så høj koncentration, at også stoffer, som er bundet stærkere til det insolubiliserede heparin end de'thrombinagtige enzymer, fuldstændigt kan fjernes fra kolonnen, så at det affinitetsabsorberende middel efter ækvilibre-ring med det samme ækvilibreringsmiddel atter regenereres og dermed er klar til en ny arbejdsgang.

Vandige opløsninger af salte af uorganiske eller organiske baser med uorganiske eller organiske syrer eller salte af amfotere stoffer med uorganiske eller organiske syrer eller baser, der 8 147408 udfolder en puffervirkning ved en pH-værdi inden for området 4-10, er egnede som pufferopløsninger. Særlig egnede er ikke-toxiske stoffer eller stofblandinger, som ikke udviser aromatiske grupper, og som derfor ikke absorberer lys med en bølgelængde på 280 eller 254 nm og altså ikke forstyrrer den UV-fotometriske overvågning af chromatografiforløbet, især glycin/NaOH-, eddikesyre/NaOH-, citronsyr e/NaOH-, triethanolamin/HCl-, lysin/HCl-, glycylglycin/HCl- og natriumphosphatpuffer samt også vakuumflygtige puffersystemer . såsom ammoniumformiat-, ammoniumacetat- og ethylendiamintetraace-tatpuffer. I det charge-vise arbejde egner sig yderligere natrium-hydrogencarbonat- og ammoniumhydrogencarbonatpuffere, som dog på grund af CO£-udvikling er ubrugelige ved den chromatografiske fremgangsmåde. De thrombinagtige enzymer fra forskellige slangegifte har en forskellig affinitet over for det til en uopløselig bærer bundne, insolubiliserede heparin; derfor må også sammensætningen af puffere af biologisk oprindelse tilpasses til de enzymer, der skal isoleres. Jo ringere koncentrationen af puffer- eller elektrolytopløsningen eller af opløsningen af puffer og neutralsalt er, jo bedre bindes enzymet til det insolubiliserede heparin. Da hepa-rins uspecifikke bindingsevne over for proteiner også er størst ved ringe koncentration, må der vælges sådanne koncentrationer, ved hvilke det thrombinagtige enzym bindes, medens andre proteiner løber uhindret igennem kolonnen. For hver gift kan de optimale koncentrationsbetingelser bestemmes ved enkle forforsøg. Bindingen af alle de undersøgte thrombinagtige slangegiftenzymer sker ved koncentrationer af pufferopløsninger, af elektrolytopløsninger eller af opløsninger af puffere og neutralt salt, som, alt efter giftarten, ligger i et koncentrationsområde på fra 0,01M til 0,5M, og ved en pH-værdi i området 4-10. Til fraspaltningen af de til det insolubiliserede heparin bundne thrombinagtige slangegiftenzymer anvendes pufferopløsninger eller elektrolytopløsninger eller opløsninger af puffere og neutralt salt, som har en højere koncentration end den opløsning, der anvendes til at binde enzymet til det insolubiliserede heparin. Fortrinsvis anvendes den samme pufferopløsning som den, som er anvendt til enzymets binding til det insolubiliserede heparin, idet dens koncentration dog hæves ved tilsætning af et stærkt dissocierende neutralsalt, fortrinsvis natrium-chlorid, således, at det bundne enzym spaltes fra den insolubiliserede heparin. Da der i nogle slangegifte også findes andre stoffer med affinitet over for insolubiliseret heparin, indstilles kon Q 147408 9 centrationen af den opløsning, der anvendes ved elueringen, fortrinsvis således, at det thrombinagtige enzym spaltes fra, medens andre stoffer med højere affinitet forbliver bundne til det insolu-biliserede heparin. Fraspaltningen af alle til insolubiliseret he-parin bundne thrombinagtige slangegiftenzymer sker fortrinsvis ved koncentrationer, som ligger i området 0,1 - 2 M og ved en pH-værdi i området 4-10. Den fuldstændige fjernelse af alle til insolubiliseret heparin bundne giftbestanddele med en heparinaffinitet, som er større end den, som de thrombinagtige enzymer har, udføres hensigtsmæssigt med pufferopløsninger eller elektrolytopløsninger eller opløsninger af puffere og neutralt salt, hvilke opløsninger har en pH-værdi i området 4 - 10 og en molær koncentration i området 0,5 - 2. Fortrinsvis bliver den første pufferopløsning, som er anvendt til bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin, ved tilsætning af et neutralt salt, fortrinsvis natriumchlorid, igen bragt op på den ønskede koncentration. Affinitetsabsorbensen kan nu ved vask med den første pufferopløsning, som tjente til binding af enzymet til det insolubiliserede heparin, atter omsættes til den brugsklare tilstand.

Affiniteten af det insolubiliserede heparin over for de thrombinagtige slangegiftenzymer er størst ved lav temperatur og aftager ved stigende temperatur. Dette fænomen kan udnyttes til at fremkalde bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin ved lav temperatur, f.eks. i en kolonne, der er afkølet med isvand, og at fremkalde fraspaltningen af enzymet ved forhøjelse af temperaturen i kolonnens køle- eller varmekappe, f.eks. til 40°C, under anvendelse af en enkelt pufferopløsning med konstant koncentration og konstant pH-værdi.

Fraspaltningen af enzymet fra det insolubiliserede heparin kan yderligere ved konstant koncentration af det vandige medium af puffer og/eller neutralt salt udføres ved en hævning eller en sænkning af pH-værdien til over eller under den værdi, ved hvilken bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin har fundet sted. Det velegnede pH-værdiområde for hvert enzym bestemmes ved enkle forforsøg.

Indholdet af thrombinagtigt slangegiftenzym i eluatet fra kolonne-chromatografien kan undersøges ved en størkningstest, fortrinsvis på fibrinogen. Som størkningstest er f.eks. målingen af størknings- 10 imoe tiden i sekunder efter tilsætning af 0,2 ml fortyndet eluat til 0,2 ml 0,4%'s oksefibrinogen ved en pH-værdi på 7,4 og en temperatur på 37°C egnet. Den enkle størkningstidbestemmelse er velegnet til konstruktion af en aktivitetsprofil i de chromatografiske elue-ringskurver (se den vedlagte tegning). Af en kalibreringskurve, der er fremstillet ved udnyttelse af den samme teknik under anvendelse af et thrombinstandardpræparat (f.eks. US-Standard Throm-bin, National Institute of Health, Bethesda, Md.) eller under anvendelse af et standardpræparat af det pågældende thrombinagtige slangegiftenzym (f.eks. Ancrod-Standard fra verdenssundshédsorga-nisationen eller Batroxobin moojeni Standard, First British Standard) , kan aktiviteten aflæses kvantitativt i NIH-thrombinenheder eller i Ancrodenheder eller i Batroxobinenheder ud fra størkningstiden. Indholdet af thrombinagtigt enzym kan også bestemmes i enzymenheder ved en fotometrisk test under anvendelse af et syntetisk chromogent thrombinsubstrat såsom Tos-Gly-Pro-Arg-pNA,HCl. En enhed (U) er da den mængde enzym, som under testbetingelserne spalter 1yUmol substrat i løbet af 1 minut.

Fra de forenede aktive fraktioner kan uønskede pufferstoffer og salte fjernes helt eller delvis ved dialyse. Samtidig afsaltning og koncentrering af de forenede aktive fraktioner kan udføres ved ultrafiltrering, f.eks. gennem en Diaflo-Membran UM-2 (Amicon, Oosterhout, Holland). Om den fraktion, som indeholder det thrombinagtige slangegiftenzym, skal afsaltes og koncentreres, afhænger af arten af den anvendte puffer, af den chromatograferede stofmængde og af produktets anvendelsesformål. Ved anvendelse af ikke-tohci-ske puffersysterner, f.eks. glycin/NaOH/NaCl, til udvinding af thrombinagtige enzympræparater til eksperimentel og/eller terapeutisk defibrinogenering skal der ikke eller kun delvis afsaltes, for at der ud fra eluatets forenede aktive fraktioner ved sædvanlige fremgangsmåder kan fremstilles en isotonisk, steril, pyro-genfri opløsning. Partiel afsaltning er også tilstrækkelig i de tilfælde, hvor det vundne thrombinagtige slangegiftenzym, der foreligger i et eluat, skal rechromatograferes til yderligere rensning; det er da tilstrækkeligt at reducere eluatets puffereller saltkoncentration til den lavere værdi, som kræves af hensyn til affinitetsbindingen, for på ny at kunne binde enzymet til den insolubiliserede heparin.

χι 147408

Arten af bindingen mellem det insolubiliserede heparin og de throm-binagtige enzymer er ikke blevet afklaret nøjagtigt. Det er meget sandsynligt, at denne binding er analog til den kemiske binding, der optræder mellem enzymer og substrater samt mellem enzymer og inhibitorer ved reversibel hæmning (se S.M. Rapoport: "Medizinische Biochemie", VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin, 1975, S. 133 -155) .

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har flere betydelige fordele i forhold til de kendte fremgangsmåder til udvinding af thrombinagtige slangegiftenzymer. Det insolubiliserede heparins bindingsevne for thrombinagtige slangegiftenzymer er så stor, at der på en chromatografikolonne med kun 20 ml's indhold kan adskilles mere end 4 g rågift eller en ækvivalent mængde forrenset enzymfraktion, hvorved det thrombinagtige enzym fås med en høj renhedsgrad. Dette svarer til en ca. 40 gange højere effektivitet end ved ionbytterchromatografi på celluloseionbyttere, ca. 400 gange højere effektivitet end ved gelchromatografi og ca. 25 gange højere effektivitet end ved affinitetschromatografi på p-aminobenzamidin--succinyl-diaminodipropylaminoagarose. Denne store bindingsevne af det insolubiliserede heparin forhøjer ikke blot adskillelseskapaciteten i et relativt lille chromatografiapparatur, men bevirker også, at eluatets aktive fraktioner indeholder enzymet i væsentlig højere koncentrationer, end det er tilfældet ved ionbytter- og gelchromatograf i, hvorved der skal præsteres langt mindre arbejdsindsats til koncentrering og afsaltning af eluaterne. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vindes de thrombinagtige slangegiftenzymer ved få, let udførlige og i vidt omfang automatiserbare, godt registrerbare arbejdstrin. Anvendelse af toxiske elueringsmidler er ikke nødvendig.

Det er overraskende, at thrombinagtige enzymer kan isoleres fra slangegifte ved binding til insolubiliseret heparin. Det er ganske vist kendt [se I. Danishefsky et al., Thrombosis Research (3, 134 (1976)] at rense thrombin ved affinitetschromatograf! på ved binding til Sepharose uopløseliggjort heparin. Ved denne fremgangsmåde udnyttes det, at heparin hæmmer thrombin, dvs. udviser en høj affinitet eller bindingsevne over for thrombin. Opdagelsen af den 12 147408 kendsgerning, at også thrombinagtige proteolytiske slangegiftenzymer, der som sådan ikke hæmmes af heparin, dvs. ikke udviser nogen kendelig affinitet eller bindingsevne over for opløst heparin, eller sagt på en anden måde, ikke bindes af opløst heparin, kan bindes med insolubiliseret heparin og derfor kan isoleres og renses ved affinitetschromatografi på insolubiliseret heparin, er derfor meget overraskende og kunne ikke forudses.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel 1.

9 g heparin-natrium med en specifik biologisk aktivitet på 162 internationale enheder pr. mg opløses i 1 liter 0,1 molær natriumbi-carbonatpuffer, der indeholder 0,5 mol/liter natriumchlorid, og som har en pH-værdi på 8,3. Til opløsningen sættes 45 g CNBr-"Sepharo-se"® 4B (AB Pharmacia, Uppsala, Sverige), som i forvejen er opkvæl-det og vasket i 0,001N saltsyre. Blandingen omrøres i 2 timer. Efter afslutningen af reaktionen filtreres blandingen gennem en glas-filternutsch G-3, og den frafiltrerede Sepharose-heparin vaskes 5 gange, hver gang med 300 ml natriumbicarbonatpuffer med den ovenfor angivne sammensætning. Til blokering af eventuelt endnu tilstedeværende reaktive CNBr-grupper omrøres Sepharose-heparinet i 2 timer sammen med 1 liter 0,5%'s ethanolamin i natriumbicarbonatpuffer med den ovenfor angivne sammensætning. Sepharose-heparinet samles atter på en glasfilternutsch og vaskes endnu 3 gange, hver gang med 300 ml natriumbicarbonatpuffer. Sepharose-heparinet eftervaskes derpå så længe med 0,1 molær natriumacetatpuffer med pH-værdi 4,0, at pH-værdien i filtratet er 4,0. Til slut vaskes det insolubili-serede heparin med flere portioner 0,1 molær glycin/natriumhydroxid--puffer med pH-værdi 8,5, den fyldes i en kolonne med en diameter på 26 mm, og der ækvilibreres med den samme glycin/natriumhydroxid--puffer. Kolonnen, som har en højde på 29 cm og dermed indeholder ca. 153 ml insolubiliseret heparin, indstilles derpå til nedadgående chromatografi. Kolonneudløbet forbindes via et til måling ved 280 nm indstillet gennemstrømningsfotometer, som er udrustet med automatisk skriver, til en fraktionssamler, som er indstillet til opsamling af fraktioner på hver 350 dråber.

13 147408 30 g Bothrops-atroxgift (Bothrops moojeni efter Hoge) opløses i 600 ml destilleret vand. Opløsningens pH-værdi indstilles ved hjælp af IN saltsyre på 3,0 og efter 1 times inkubationstid med IN natriumhydroxid til 7,3. Det derved dannede fnuggede produkt skilles fra ved centrifugering og kasseres. Til supernatan-ten sættes en opløsning af 15 g natriumsalicylat i 300 ml destilleret vand. Opløsningens pH-værdi indstilles med IN saltsyre til 3,0. Efter 60 minutter fracentrifugeres det dannede bundfald, det optages i 200 ml 0,1 molær glycin/natriumhydroxid-puffer med pH--værdi 8,5 og vaskes så længe på et ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) med den samme puffer, at en prøve af filtratet ved tilsætning af jern(III)chlorid ikke giver violet farvning og derfor er fri for salicylsyre. Det over filteret stående koncentrat på ca. 30 ml indstilles med 0,1 molær glycin/natriumhydroxid-puffer med pH-værdi 8,5 til et volumen på 50 ml. Det indeholder så 2240 Batroxobinenheder (BU) pr. ml og hældes på den klargjorte sepharose--heparinkolonne. Ved skylning med 750 ml 0,1 molær glycin/natriumhydroxid-puffer med pH-værdi 8,5 (puffer I) elueres ballaststoffer.

Herpå elueres kolonnen med 0,1 molær glycin/natriumhydroxid-puf-fer, som indeholder 0,1 mol/liter natriumchlorid, med en pH-værdi på 8,5 (puffer II), indtil der er løbet 1120 ml igennem, hvorved der atter elueres ballaststoffer. Derefter opsamles det thrombin-agtige enzym i form af 2 UV-absorberende og fibrinogenkoagulerende zoner ved eluering med 0,1 molær glycin/natriumhydroxid-puffer, som indeholder 0,25 mol/liter natriumchlorid, med en pH-værdi på 8,5 (puffer III), indtil der er et gennemløbsvolumen på 900 ml. Til slut fjernes de stoffer, som er forblevet bundne til sepharose-he-parinen, ved eluering med 600 ml glycin/natriumhydroxid-puffer, som indeholder 1 mol/liter natriumchlorid, med en pH-værdi på 8,5 (puffer (IV). Chromatografiforløbet er fremstillet skematisk på tegningen.

Tegningen er en grafisk gengivelse, hvor der på den ene side er anført UV-absorptionen (Abs) ved 280 nanometer og på den anden side de med eluatprøver i en fortynding på 1:10 opnåede fibrinogenstørk-ningstider (Gz) i sekunder som funktioner af de opsamlede væskevolumener i ml. Absorptionen gengives ved den optrukne kurve, medens størkningsaktiviteten gengives ved den punkterede profil.

Den sammentrængte optegnelse af væskevolumenerne er antydet ved punkterede afbrydelser i absorptionskurven.

147408 1¾

Det thrombinagtige enzym (Batroxobin) findes i 800 ml eluat i en koncentration på 100 batroxobinenheder pr. ml. Udbyttet udgør dermed 71,4%, beregnet på grundlag af anvendte 112000 BU. Eluatet koncentreres på et ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) til 80 ml og anvendes som batroxobinkoncentrat til fremstillingen af et farmaceutisk præparat med et batroxobinindhold på 22 batroxobinenheder pr. ml til terapeutisk defibrinogenering.

Eksempel 2.

0,1 g gift fra slangearten Agkistrodon contortrix opløses i 1,5 ml vandig 0,1 molær glycin/natriumhydroxid-puffer med pH-værdi 6,0. Opløsningen hældes på en kolonne (17 x 70 mm; 16 ml) med heparin--sepharose. Kolonnen eftervaskes så længe med den samme puffer, at den udflydende vaskevæske ikke længere viser nogen lysabsorption ved 280 nm. Kolonnen skylles derpå med en 0,1 molær glycinpuffer med pH-værdi 6,0, med et natriumchloridindhold på 0,75 mol pr. liter, indtil der ikke længere udvaskes mere UV-absorberende materiale fra kolonnen. Dette eluat indeholdende ballastmateriale kasseres- Derpå isoleres det thrombinagtige enzym ved eluering med 0,1 molær glycinpuffer med pH-værdi 6,0 og et natriumchloridindhold på 1,0 mol pr. liter. Der fås 22 ml eluat med størkningsaktivitet over for fibrinogen. Aktiviteten bestemmes ved måling på det syntetiske chromogene substrat benzoyl-pro-phe-arg-p-nitroanilid til totalt 6996 mE (millienheder). Det totale proteinindhold i det aktive e-luat er 6,2 mg. Det på denne måde rensede thrombinagtige enzym fra Agkistrodon-contortrixgift udviser én enkelt zone ved elektro foresen på en polyacrylamidgel i nærværelse af natriumdodecylsulfat, og det viser sig ved test på den ikke-opvarmede fibrinplade (P.

Brakman og T. Astrup i: Thrombosis and Bleeding Disorders, udgivet af N. U. Bang, F. K. Beller, E. Deutsch og E. Mammen, Thieme og Academic Press, Stuttgart, New York, London, 1971, side 332) at være fri for fibrinolytisk aktivitet. Eluatet koncentreres på et ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon, Oosterhout, Holland) til 1 - 2 ml. Til koncentratet sættes 150 mg lactose, der fortyndes med destilleret vand til 30 ml, det fyldes i flasker på hver 1,0 ml og frysetørres. Der fås således 30 flasker med hver 200 mE enzym i stabil, øjeblikkelig opløselig form. I denne form egner præparatet sig til undersøgelse af fibrinogen-fibrinomdannelsen under fysiologiske og patologiske betingelser.

15 147408

Eksempel 3.

0,1 g gift fra slangearten Agkistrodon rhodostoma (10500 Aneroden-heder) opløses i 1,5 ml vandig 0,01 molær glycinpuffer med pH-værdi 6,0. Opløsningen hældes på en med den samme puffer ækvilibreret kolonne (17 x 70 mm; 16 ml) med heparin-sepharose. Kolonnen efter-vaskes så længe med den samme puffer, at der ikke mere kan eftervises UV-absorberende materiale i eluatet ved hjælp af et gennemstrømningsfotometer. Derpå vaskes kolonnen med 0,01 molær glycinpuffer med pH-værdi 6,0 og et natriumchloridindhold på 0,1 mol pr. liter for at fjerne ballastmateriale. Til slut elueres det throm-binagtige enzym (Anerod) med 0,01 molær glycinpuffer med pH-værdi 6,0 og med et natriumchloridindhold på 0,25 mol pr. liter. Der fås 120 ml af en opløsning med 27 Ancrodenheder pr. ml. Dette produkt udviser en enkelt zone ved elektroforese på polyaerylamidgel i nærværelse af natriumdodecylsulfat.

Claims

16 147408

1. Fremgangsmåde til udvinding af thrombinagtige proteolytiske enzymer fra slangegifte eller slangegiftfraktioner stammende fra slanger af familien crotalidae, kendetegnet ved, at slangegiften eller slangegiftfraktionen i opløsning i et vandigt medium bringes i berøring med et ved binding til en i vand uopløselig bærer insolubiliseret heparin til binding af det thrombinagtige enzym til den insolubiliserede heparin, de uønskede ledsagestoffer fra slangegiften fjernes, og det thrombinagtige enzym med et vandigt medium spaltes fra det insolubiliserede heparin.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det ved bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin anvendte vandige medium er en 0,01 - 0,5 molær pufferopløsning med en pH-værdi i området 4 - 10.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det ved bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin anvendte vandige medium er en vandig 0,01 -0,5 molær elektrolytopløsning uden, eller højst med svag, puffervirkning og med en pH-værdi i området 4-10.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at elektrolytopløsningen er en vandig natr iumchloridopløs ning.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det ved bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin anvendte vandige medium er en vandig opløsning, der indeholder både en puffer og et neutralt salt, med en totalkoncentration i området 0,01 - 0,5 mol/liter og en pH-vær-di i området 4-10. g. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som insolubiliseret heparin anvendes et ved binding af heparin via dets aminogrupper til de reaktive grupper i en polymer vanduopløselig bærersubstans fremstillet produkt. 147408

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der til fraspaltningen af enzymet fra det insolubiliserede heparin anvendes en vandig pufferopløsning, som har en molær koncentration, som er højere end koncentrationen af den opløsning, der anvendes ved bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin og ligger i området 0,1 - 1 mol pr. liter, og som har en pH-værdi i området 4-10.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 7, kendetegnet ved, at den anvendte pufferopløsning indeholder 0,1-1 mol pr. liter af et neutralt salt såsom natriumchlorid og har en totalkoncentration i området 0,2 -2 mol pr. liter.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fraspaltningen af enzymet fra det insolubiliserede heparin udføres ved en temperatur, som ligger over den temperatur, ved hvilken enzymet bindes til det insolubiliserede heparin.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fraspaltningen af enzymet fra det insolubiliserede heparin udføres ved hjælp af den samme pufferopløsning eller opløsning af puffer og neutralt salt, som anvendes ved bindingen af enzymet til det insolubiliserede heparin, dog ved en pH-værdi, som ligger under eller over den pH-værdi, ved hvilken enzymet bindes til det insolubiliserede heparin.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den udføres charge-vis, idet slangegiften eller slangegiftfraktionen sammen med det insolubiliserede heparin omrøres i det til bindingen af enzymet til heparinet bestemte vandige medium, det vundne reaktionsprodukt filtreres fra, og det omrøres med det til fraspaltningen af enzymet fra det insolubiliserede heparin bestemte vandige medium til frigørelse af enzymet. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den udføres ved chromatografi, idet en opløsning af slangegiften eller af slangegiftfraktionen i det ved bindingen af enzymet til heparinet bestemte vandige medium hæl-