CN108660126A - 一种冻干人凝血酶的制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种冻干人凝血酶的制备工艺，以去冷沉淀血浆为原料，在得到人凝血酶原后，再对人凝血酶原经激活得到人凝血酶粗溶液，再由人凝血酶粗溶液制备人凝血酶，人凝血酶原的激活条件为，按照人凝血酶原溶液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液，使得氯化钙终浓度为0.025mol/L~0.03mol/L，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，使其浓度为0.1~0.2%作为激活剂；缓慢搅拌溶液，在20℃~25℃下激活1~2小时后得到人凝血酶溶液。制备得到人凝血酶效价为400~700IU/ml，比活性在1000IU/mg蛋白以上，收得率在20IU/ml血浆以上的人凝血酶。本发明纯化效果好，回收率高，操作简单，有效的解决了凝血酶原的激活效果不佳、转化率低，收得率低下，激活时间过长以及会出现复溶后浑浊现象，长时间贮存效价降低的等情况。

Description

一种冻干人凝血酶的制备工艺
技术领域
本发明涉及一种人凝血酶的制备工艺，属于生物制药领域。
背景技术
早在19世纪末期，凝血酶就被一苏格兰的生理学家发现并命名，直到1951年凝血酶被纯化出来，并对其进行测序之后，人们对凝血酶的研究和了解才越来越深入。凝血酶的生理功能与其丝氨酸蛋白酶的活性有关，能裂解纤维蛋白原而形成纤维蛋白凝块，从而促进血液凝块的形成。
凝血酶是由凝血酶原活化变成的一种专一性很强的丝氨酸蛋白类水解酶，是机体凝血系统中的天然成分。凝血酶由308个氨基酸残基组成，分子质量为36KD，它是一双链分子，含有A链和B链，两链间由二硫键连接。其中A链含49个氨基酸残基，又称轻链；B链由259个氨基酸残基组成，又称重链。A链位于分子的背部，虽然不带有活性位点。但近来的研究表明，A链对凝血酶整体结构的完整功能性起稳定作用。而B链是其活性位点所在的部位,同时具有酶所有的功能结构域。
凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在凝血过程中，凝血酶原复合物将其激活而转变为有丝氨酸蛋白类水解活性的凝血酶。凝血酶的形成在凝血过程中起到了中心作用。凝血酶形成后，便可迅速启动以后阶段的止凝血过程，包括作为促凝剂激活血小板、内皮细胞，并激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ。进而通过α-凝血酶的激活来完成凝血反应的放大，同时，凝血的放大反应相又可促使生成更多的α-凝血酶，并在血管受损伤处形成稳定的血栓，从而终止血液丢失。另一方面，凝血酶能够激活蛋白C(PC)系统，通过α-凝血酶与血栓调节蛋白形成的复合物，即使PC变为APC，通过这一动力学抑制系统可灭活凝血酶原酶和内源性凝血酶成分，主要是辅因子蛋白如因子Ⅴa和Ⅷa的活性，与蛋白酶抑制剂AT-Ⅲ系统和组织因子途径抑制物(TFPI)系统共同参与终止血块的形成。此外，凝血酶能调控纤溶系统而间接的起到血块清除的作用。同时凝血酶是一种强有力的生长因子和趋化吸引剂，其对成纤维细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞有激活效应；α-凝血酶可激活血小板，使血小板释放血管活性物和生长因子，促进不同类型的细胞增殖和生长，因此凝血酶还具有修复损失组织、促进伤口愈合的功能。
凝血酶是局部止血的首选药物，常以干粉或生理盐水溶解后局部涂于伤处及手术处，在外伤和手术中能迅速达到止血目的。由于凝血因子异常所导致的牙龈、鼻腔出血等，在其他药物达不到止血效果时可改用凝血酶直接作用于出血处。目前，凝血酶在临床上的应用越来越广泛，对于发生急性消化道出血的患者可口服凝血酶使出血部位迅速止血；对难治性产后出血可采用液体喷洒或纱布按压的方式给予凝血酶止血治疗；在泌尿外科中可通过导尿管灌注凝血酶溶液和抗生素来治疗出血性膀胱炎，可同时达到止血和促进受损上皮组织再生修复的作用；在以往使医生感到头痛的耳鼻喉科疾病及相关手术出血的处理上，采用直接灌注凝血酶或用凝血酶液浸湿的明胶海绵敷贴出血处，可得到满意的止血效果，减轻病人痛苦。目前研究还表明，凝血酶不仅在脑出血、脑缺血中有重要作用，在中枢神经系统正常发育和损伤保护中也有重要作用。由于凝血酶所具有的止血快、无副作用的优点，其临床使用日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺，生产前景看好。
凝血酶的分离纯化主要包括凝血酶原的提取、凝血酶原的激活和凝血酶纯化几个步骤。制备凝血酶的原料主要有去冷沉淀血浆，Cohn组分I上清，Cohn组分III等。中国专利ZL201410591661.6介绍了一种猪源凝血酶的制备方法，将过滤除去杂志的猪血浆进行S/D病毒灭活，经DEAE-Sephadex A50吸附得到凝血酶原，经70mmol/L的氯化钙溶液、33～36℃激活，再经Sartobind Q SingleSep型囊式膜吸附得到凝血酶。中国专利ZL201510397110.0一种凝血酶的制备方法介绍利用壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入血浆中吸附凝血酶原，经0.1mol/L的氯化钙，25℃激活2小时，再采用肝素-壳聚糖亲和磁性微球进行亲和层析分离得到凝血酶，比活性最高可达1928.7IU/mg。中国专利ZL201510520812.3制备冻干人凝血酶的方法介绍以Cohn组分Ⅲ为原料，经等电点沉淀法制得人凝血酶原，经0.5mol/L氯化钙溶液10～30℃激活4～10小时得到人凝血酶粗品，再经S/D病毒灭活，SP-Sephadex-C50层析得到精制的人凝血酶，最后经纳米膜过滤，冻干干热步骤得到最终产品。中国专利ZL201510638083.1一种猪凝血酶冻干粉的制备方法介绍猪血浆经QAE-Sephadex A50凝胶吸附得到凝血酶原，经10mmol/L氯化钙溶液加兔脑粉激活得到凝血酶粗溶液，再经S/D病毒灭活，DEAE-Sepharose Fast Flow层析，收集洗脱液，加入甘露醇或右旋糖酐40保护剂，除菌过滤，分装，冻干，得猪凝血酶冻干品。
根据上述现有凝血酶的制备方法，都是凝血酶原提取、激活、凝血酶纯化方法的各种组合，但是现有的制备方法仍可能存在一些问题，比如，凝血酶很不稳定，在溶液状态很容易出现凝血酶效价降低，蛋白变性的情况；冻干产品若冻干工艺和冻干保护剂选择不恰当，会出现复溶后浑浊现象，长时间贮存效价降低的情况；凝血酶原的激活效果不佳、转化率低，导致凝血酶的收得率低下，激活时间过长的情况。这些都可能限制凝血酶产品的临床应用，造成一定的安全隐患。
发明内容
鉴于上述现有技术所存在的一些情况，本发明的目的在于提供一种冻干人凝血酶的制备方法，用于解决现有技术中的问题。
本发明以去冷沉淀血浆为原料，经DEAE Sephadex A50凝胶吸附，收集洗脱液得到人凝血酶原，该步骤人凝血酶原的收得率可达90％以上。
人凝血酶原的激活条件为，按照人凝血酶原溶液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液，使得氯化钙终浓度为0.025mol/L～0.03mol/L，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，使其浓度为0.1～0.2％作为激活剂；缓慢搅拌溶液，在20℃～25℃下激活1～2小时后得到人凝血酶溶液。该激活步骤转化率高，耗时短，每IU人凝血酶原可激活得到40IU以上的人凝血酶。
调节人凝血酶粗溶液pH值、电导，调节人凝血酶粗溶液pH值至6.0～6.5、电导率低于10ms/cm；使用SP Sephadex C50阳离子交换层析，凝血酶纯化效果好，回收率高，制得到高纯度的人凝血酶，其比活性在1000IU/mg蛋白质以上，最高达到1700IU/mg蛋白质。
再经稀配，加入0.5％的海藻糖和1.2％甘氨酸作为冻干保护剂，纳米膜过滤，除菌过滤、分装、冷冻干燥、99～100℃干热灭活30min得到人凝血酶冻干产品。
该发明中包括三步病毒灭活工艺，产品复溶后澄清，无可见异物，长期贮存产品质量稳定，效价无降低趋势，进一步提高了临床应用的安全性和有效性。
本发明是这样实现的，以健康人血浆为原料，经低温离心法去除冷沉淀，去冷沉淀血浆经DEAE Sephadex A50凝胶吸附，洗涤、洗脱步骤得到人凝血酶原；再进行超滤脱盐、激活、S/D法病毒灭活、去S/D试剂、SP Sephadex C50离子交换层析、超滤浓缩透析得到精制凝血酶；再经稀配、纳米膜过滤，除菌过滤、分装、冷冻干燥、99～100℃干热灭活30min、包装、入库；制备得到人凝血酶效价为400～700IU/ml，比活性在1000IU/mg蛋白以上，收得率在20IU/ml血浆以上的人凝血酶。
在获得人凝血酶原液后，依据人凝血酶的原液效价，使用C50洗脱液进行配制使最终制品人凝血酶效价不小于600IU/ml；根据稀配液重量，按最终浓度为0.5％的海藻糖和1.2％甘氨酸作为稳定剂，得到人凝血酶稀配液。
优选方案为：
(1)去冷沉淀血浆的制备
按《中国药典》2015年版三部要求采集，且经复检合格并通过检疫期检疫合格的原料血浆，在预融间，用75％乙醇消毒、再用低于35℃注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋。破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，及时停止热水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，取样送质检进行抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-HBs和微生物限度等检查；经过滤或离心，离心速度控制在4Kg/min/台，出液温度控制在0～4℃，分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产。去除冷沉淀的血浆取样进行蛋白含量、细菌内毒素检测。去冷沉淀血浆用20～30℃的循环水进行夹层循环加热，控制血浆温度在10～20℃。使用乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)调节血浆pH值为7.0±0.2
(2)第一次吸附
按照血浆重量的约2.5％加入平衡后的DEAE Sephadex A50阴离子交换树脂至去冷沉淀血浆中，搅拌吸附30～60分钟，每10分钟测一次温度。收集吸附后的凝胶。
(3)第一次洗涤、洗脱
用约2±0.2倍凝胶体积的A50洗涤液洗涤凝胶3～5次，每次搅拌3～5分钟后抽干。用大约1±0.1倍凝胶体积的A50洗脱液洗脱凝胶2～3次，每次搅拌10～15分钟，收集A液。
(4)DEAE Sephadex A50凝胶的再生与保存
凝胶使用后，用约1±0.1倍凝胶体积的2mol/L氯化钠溶液洗涤一次放干。
加入适量注射用水，搅拌下用2mol/L的醋酸调节凝胶溶液pH值4.0以下，浸泡约10min后放干。
用注射用水洗涤凝胶2次放干。再用0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡凝胶二次后放干，每次约10min，最后用0.1mol/L氢氧化钠溶液保存凝胶或者用20％乙醇溶液长期保存凝胶。
(5)第一次过滤、超滤
A液经0.45μm滤芯过滤。采用10KD的超滤膜将过滤后A液预浓缩至起始体积的1/3～1/2。使用注射用水对浓缩液进行恒体积透析，直至透析后的蛋白液稀释5倍后电导率低于10ms/cm，收集透析后蛋白液，再使用稀释10倍后的pH4.0醋酸缓冲液调节pH至6.0～6.5。称重，得到B液。
(6)凝血酶原的激活
B液用注射用水稀释5～10倍后得C液，按照C液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液，使得氯化钙终浓度为0.025mol/L～0.03mol/L，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，使其浓度为0.1～0.2％。缓慢搅拌制品，在20℃～25℃下激活制品1～2小时后激活结束得D液。澄清过滤：D液经0.65μm滤芯过滤得到E液。
(7)S/D灭活
按照E液的1/10，搅拌下缓慢加入S/D溶液，使S/D溶液终浓度含1％的聚山梨酯80和0.3％的磷酸三丁酯。S/D溶液添加结束后，24～26℃保温6h，得到F液。
(8)第二次吸附
将F液调节pH至6.0～6.5，电导率低于10ms/cm，于搅拌下加入平衡后的SPSephadex C50凝胶(按照第一次吸附血浆重量的约2.5％计算)，温和搅拌吸附30～60分钟，收集凝胶。
(9)第二次洗涤、洗脱
每次使用1～2±0.2倍凝胶体积的C50洗涤液洗涤凝胶，搅拌3～5分钟，洗涤3～5次。用大约1±0.1倍凝胶C50洗脱液洗脱凝胶2～3次，每次搅拌10～15分钟，收集G液。
(10)SP Sephadex C50凝胶的再生与保存
凝胶使用后，用约1±0.1倍凝胶体积的2mol/L氯化钠溶液洗涤一次放干。
用约1±0.1倍凝胶体积稀释10倍的pH4.0醋酸缓冲液洗涤2次，每次搅拌5min，抽干后用注射用水洗涤凝胶2次放干。
用约1±0.1倍凝胶体积的0.1mol/L氢氧化钠溶液洗涤凝胶2次，搅拌5min。
最后用0.1mol/L氢氧化钠溶液保存凝胶或者用20％乙醇溶液长期保存凝胶。
(11)浓缩、配制、纳米膜过滤
G液经0.45μm滤芯过滤。再将过滤后G液用10KD超滤膜浓缩至效价为600IU/ml以上，即得人凝血酶原液。
依据人凝血酶原液效价，使用C50洗脱液进行配制使最终制品人凝血酶效价不小于600IU/ml。根据稀配液重量，按最终浓度为0.5％的海藻糖和1.2％甘氨酸作为稳定剂，经DV20纳米膜过滤去除病毒。
(12)分装及冻干
用0.22μm滤芯除菌、分装。每瓶分装2ml。规格为每瓶含人凝血酶1000IU；分装后的制品应立即冻结，冻干过程制品温度最高不得超过35℃，真空封口。
①制品常温进柜；
②隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
③隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
④开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
⑤2小时隔板升温到-25℃，保持2小时；
⑥3小时隔板升温到3℃，保持6小时；
⑦2小时隔板升温到32℃，保持6h；
⑧抽极限真空，32℃保持4小时；
⑨压盖出柜。
(13)干热灭活
采用水浴灭菌柜，进行99～100℃，30min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜。真空检测，放入待检品库。
其中①A50洗涤液的配制方法：0.12mol/L氯化钠溶液。②A50洗脱液配制方法：2mol/L氯化钠溶液。
③C50洗涤液的配制方法：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液+0.12mol/L氯化钠溶液，调节pH值为6.8～7.2。④C50洗脱液的配制方法：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液+1mol/L氯化钠溶液，调节pH值为6.8～7.2。
以上百分比处特别说明，其余均为重量百分比。
所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99％冰乙酸和65.6g乙酸钠。
本发明相比现有技术凝血酶原的制备工艺，创新点在于：
1、本发明以去冷沉淀血浆为原料，采用DEAE Sephadex A50凝胶吸附得到人凝血酶原，经激活得到人凝血酶粗溶液，再采用SP Sephadex C50凝胶吸附得到人凝血酶。本发明根据工艺的特点和产品的属性，提出了一种经两步离子交换层析获得人凝血酶的组合方式。去冷沉淀血浆经A50凝胶吸附得到人凝血酶原，该步骤操作简单，适合大生产，收得率高，人凝血酶原的收得率可达90％以上。人凝血酶粗溶液经C50凝胶吸附得到人凝血酶，该步骤纯化效果好，回收率高，操作简单。与ZL201410591661.6采用DEAE-Sephadex A50加Sartobind Q SingleSep型囊式膜的组合方式；专利ZL201510397110.0采用壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加肝素-壳聚糖亲和磁性微球的组合方式；专利ZL201510520812.3以Cohn组分Ⅲ为原料，经等电点沉淀法加SP-Sephadex-C50的组合方式；专利ZL201510638083.1QAE-Sephadex A50加DEAE-Sepharose Fast Flow的组合方式技术相对比创造性比较明显。
2、本发明在人凝血酶原的激活步骤，采用我公司科研人员经多次试验筛选优化得到的激活条件，按照人凝血酶原溶液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液，使得氯化钙终浓度为0.025mol/L～0.03mol/L，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，使其浓度为0.1～0.2％作为激活剂。缓慢搅拌溶液，在20℃～25℃下激活1～2小时后得到人凝血酶溶液。该激活步骤耗时短，激活剂来源广泛，转化率高，每IU人凝血酶原可激活得到40IU以上的人凝血酶。相比于专利ZL201510520812.3凝血酶原激活需要4～10小时，专利ZL201510638083.1凝血酶原激活需要加入兔脑粉，有突出的技术进步。有效的解决了凝血酶原的激活效果不佳、转化率低，导致凝血酶的收得率低下，激活时间过长的情况。
3、人凝血酶的纯化步骤采用SP Sephadex C50阳离子交换层析，在层析之前调节人凝血酶粗溶液pH值至6.0～6.5、电导率低于10ms/cm。凝血酶纯化效果好，回收率高，制得到高纯度的人凝血酶，其比活性在1000IU/mg蛋白质以上，最高达到1700IU/mg蛋白质。相比于专利ZL201510397110.0中凝血酶的纯化采用肝素-壳聚糖亲和磁性微球进行亲和层析，存在凝血酶收得率偏低，凝胶使用量大，价格昂贵，工业化生产受限的情况；专利ZL201510638083.1中凝血酶的纯化采用DEAE-Sepharose Fast Flow层析，为阴离子交换层析，因凝血酶在中性条件下带正电荷，可能会导致产品杂质偏高，纯化效果不好的情况。
4、在获得人凝血酶原液后，稀配过程中，加入经试验优化的0.5％的海藻糖和1.2％甘氨酸作为冻干保护剂。另制品在冷冻干燥过程中，预冻步骤采用先将制品温度快速降至-9℃保持1小时，此时制品尚未结冰，保持了一定的过冷度。再快速降温至-45℃以下，制品均一性好，有利于制品形成细小的晶体，保持制品原有属性，减少预冻机械应力对制品的破坏。有利于最终产品复溶后澄清，无可见异物，长期贮存产品质量稳定，效价无降低趋势；通过试验确定升华温度，大大提高升华效率，减少冻干时间，使得1000IU/瓶的制品整个冷冻干燥时间不超过30h。解决了大部分凝血酶制备技术中存在的凝血酶很不稳定，在溶液状态很容易出现凝血酶效价降低，蛋白变性的情况；冻干产品若冻干工艺和冻干保护剂选择不恰当，会出现复溶后浑浊现象，长时间贮存效价降低的情况。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
实施例1：以250升血浆为例，具体制备工艺如下：
(1)去冷沉淀血浆的制备
按《中国药典》2015年版三部要求采集，且经复检合格并通过检疫期检疫合格的原料血浆，在预融间，用75％乙醇消毒、再用低于35℃注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋。破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，及时停止热水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，取样送质检进行抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-HBs和微生物限度等检查；经过滤或离心，离心速度控制在4Kg/min/台，出液温度控制在0～4℃，分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产。去除冷沉淀的血浆取样进行蛋白含量、细菌内毒素检测。去冷沉淀血浆用20～30℃的循环水进行夹层循环加热，控制血浆温度在10～20℃。使用乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)调节血浆pH值为7.0±0.2
(2)第一次吸附
加入平衡后的DEAE Sephadex A50阴离子交换树脂6kg至去冷沉淀血浆中，搅拌吸附50分钟，每10分钟测一次温度。收集吸附后的凝胶。
(3)第一次洗涤、洗脱
用约2±0.2倍凝胶体积的A50洗涤液洗涤凝胶4次，每次搅拌5分钟后抽干。用大约1±0.1倍凝胶体积的A50洗脱液洗脱凝胶3次，每次搅拌10～15分钟，收集A液20kg。
(4)DEAE Sephadex A50凝胶的再生与保存
凝胶使用后，用约1±0.1倍凝胶体积的2mol/L氯化钠溶液洗涤一次放干。
加入适量注射用水，搅拌下用2mol/L的醋酸调节凝胶溶液pH值4.0以下，浸泡约10min后放干。
用注射用水洗涤凝胶2次放干。再用0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡凝胶二次后放干，每次约10min，最后用0.1mol/L氢氧化钠溶液保存凝胶。
(5)第一次过滤、超滤
A液经0.45μm滤芯过滤。采用10KD的超滤膜将过滤后A液预浓缩至10kg。使用注射用水对浓缩液进行恒体积透析，透析后的蛋白液稀释5倍后电导率6.8ms/cm，收集透析后蛋白液，再使用稀释10倍后的pH4.0醋酸缓冲液调节pH至6.1。称重，得到B液7.5kg。
(6)凝血酶原的激活
B液用注射用水稀释5倍后得C液，按照C液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液3.7kg，再加入大豆磷脂，使其浓度为0.15％。缓慢搅拌制品，在20℃～25℃下激活制品1小时后激活结束得D液42kg。澄清过滤：D液经0.65μm滤芯过滤得到E液42.5kg。
(7)S/D灭活
按E液体积的1/10，搅拌下缓慢加入S/D溶液4.25kg，使S/D溶液终浓度含1％的聚山梨酯80和0.3％的磷酸三丁酯。S/D溶液添加结束后，24～26℃保温6h，得到F液。
(8)第二次吸附
将F液调节pH至6.0～6.5，电导率低于10ms/cm，于搅拌下加入平衡后的SPSephadex C50凝胶7kg，温和搅拌吸附40分钟，收集凝胶。
(9)第二次洗涤、洗脱
每次使用1～2±0.2倍凝胶体积的C50洗涤液洗涤凝胶，搅拌3～5分钟，洗涤5次。用大约1±0.1倍凝胶C50洗脱液洗脱凝胶2次，每次搅拌10～15分钟，收集G液17kg。
(10)SP Sephadex C50凝胶的再生与保存
凝胶使用后，用约1±0.1倍凝胶体积的2mol/L氯化钠溶液洗涤一次放干。
用约1±0.1倍凝胶体积稀释10倍的pH4.0醋酸缓冲液洗涤2次，每次搅拌5min，抽干后用注射用水洗涤凝胶2次放干。
用约1±0.1倍凝胶体积的0.1mol/L氢氧化钠溶液洗涤凝胶2次，搅拌5min。
最后用0.1mol/L氢氧化钠溶液保存凝胶或者用20％乙醇溶液长期保存凝胶。
(11)浓缩、配制、纳米膜过滤
G液经0.45μm滤芯过滤。再将过滤后G液用10KD超滤膜浓缩至效价为810IU/ml，即得人凝血酶原液6.4kg。
依据人凝血酶原液效价，使用C50洗脱液进行配制使最终制品人凝血酶效价为650IU/ml。稀配液重量8.0kg，加入海藻糖40g和甘氨酸96g作为稳定剂，经DV20纳米膜过滤去除病毒。
(12)分装及冻干
用0.22μm滤芯除菌、分装。每瓶分装2ml。分装3530瓶；分装后的制品应立即冻结，冻干过程制品温度最高不得超过35℃，真空封口。
①制品常温进柜；
②隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
③隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
④开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
⑤2小时隔板升温到-25℃，保持2小时；
⑥3小时隔板升温到3℃，保持6小时；
⑦2小时隔板升温到32℃，保持6h；
⑧抽极限真空，32℃保持4小时；
⑨压盖出柜。
(13)干热灭活
采用水浴灭菌柜，进行99～100℃，30min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜。真空检测，放入待检品库。
其中①A50洗涤液的配制方法：0.12mol/L氯化钠溶液。②A50洗脱液配制方法：2mol/L氯化钠溶液。
③C50洗涤液的配制方法：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液+0.12mol/L氯化钠溶液，调节pH值为6.8～7.2。④C50洗脱液的配制方法：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液+1mol/L氯化钠溶液，调节pH值为6.8～7.2。
以上百分比处特别说明，其余均为重量百分比。
所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99％冰乙酸和65.6g乙酸钠。
经本实施例制备的产品在关键项目的情况如下表。
项目 本实施例
收得率 ＞20IU/ml血浆
比活性 ≥1000IU/mg蛋白质
蛋白质含量(g/ml) ＜0.05％
外观 无色澄明溶液
产品合格率 99％以上
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，制备工艺采用两步离子交换层析获得人凝血酶；即以去冷沉淀血浆为原料，采用DEAE Sephadex A50凝胶吸附得到人凝血酶原，人凝血酶原经激活得到人凝血酶粗溶液，再采用SP Sephadex C50凝胶吸附得到人凝血酶。
2.一种冻干人凝血酶的制备工艺，以去冷沉淀血浆为原料，在得到人凝血酶原后，再对人凝血酶原经激活得到人凝血酶粗溶液，再由人凝血酶粗溶液制备人凝血酶，其特征在于，人凝血酶原的激活条件为，按照人凝血酶原溶液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液，使得氯化钙终浓度为0.025mol/L～0.03mol/L，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，使其浓度为0.1～0.2％作为激活剂；缓慢搅拌溶液，在20℃～25℃下激活1～2小时后得到人凝血酶溶液。
3.一种冻干人凝血酶的制备工艺，人凝血酶原经激活得到人凝血酶粗溶液，其特征在于，人凝血酶的纯化步骤采用SP Sephadex C50阳离子交换层析，在层析之前调节人凝血酶粗溶液pH值至6.0～6.5、电导率低于10ms/cm；制得到高纯度的人凝血酶，其比活性在1000IU/mg—1700IU/mg蛋白质。
4.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，人凝血酶原的激活条件为，按照人凝血酶原溶液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液，使得氯化钙终浓度为0.025mol/L～0.03mol/L，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，使其浓度为0.1～0.2％作为激活剂；缓慢搅拌溶液，在20℃～25℃下激活1～2小时后得到人凝血酶溶液。
5.根据权利要求1或4所述的一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，以健康人血浆为原料，经低温离心法去除冷沉淀，去冷沉淀血浆经DEAE Sephadex A50凝胶吸附，洗涤、洗脱步骤得到人凝血酶原；再进行超滤脱盐、激活、S/D法病毒灭活、去S/D试剂、SPSephadex C50离子交换层析、超滤浓缩透析得到精制凝血酶；再经稀配、纳米膜过滤，除菌过滤、分装、冷冻干燥、99～100℃干热灭活30min、包装、入库；制备得到人凝血酶效价为400～700IU/ml，比活性在1000IU/mg蛋白以上，收得率在20IU/ml血浆以上的人凝血酶。
6.根据权利要求5所述的一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，在获得人凝血酶原液后，依据人凝血酶的原液效价，使用C50洗脱液进行配制使最终制品人凝血酶效价不小于600IU/ml；根据稀配液重量，按最终浓度为0.5％的海藻糖和1.2％甘氨酸作为稳定剂，得到人凝血酶稀配液。
7.根据权利要求5所述的一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，制品在冷冻干燥过程中采用如下冻干方法：
(1)制品常温进柜；
(2)隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
(3)隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
(4)开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
(5)2小时隔板升温到-25℃，保持2小时；
(6)3小时隔板升温到3℃，保持6小时；
(7)2小时隔板升温到32℃，保持6小时；
(8)抽极限真空，32℃保持4h；
(9)压盖出柜。
冻干后制品采用水浴灭菌柜，进行99～100℃，30min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜；真空检测，放入待检品库。
8.根据权利要求5所述的一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，健康人血浆融化后，低温离心，收集去冷沉淀血浆；去冷沉淀血浆用20～30℃的循环水进行夹层循环加热，控制血浆温度在10～20℃；使用pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液调节血浆pH值为7.0±0.2；
进一步，按照血浆重量的约2.5％加入平衡后的DEAE Sephadex A50阴离子交换树脂至去冷沉淀血浆中，搅拌吸附30～60分钟，每10分钟测一次温度，收集吸附后的凝胶，凝胶经重生步骤可重复使用；
进一步，A50凝胶的洗涤、洗脱，用约2±0.2倍凝胶体积的A50洗涤液洗涤凝胶3～5次，每次搅拌3～5分钟后抽干，用1±0.1倍凝胶体积的A50洗脱液洗脱凝胶2～3次，每次搅拌10～15分钟，收集A液；
进一步，所述的A液经0.45μm滤芯过滤，采用10KD的超滤膜将过滤后A液预浓缩至起始体积的1/3～1/2，使用注射用水对浓缩液进行恒体积透析，直至透析后的蛋白液稀释5倍后电导率低于10ms/cm，收集透析后蛋白液，再使用稀释10倍后的pH4.0醋酸缓冲液调节pH至6.0～6.5，称重，得到B液。
进一步，人凝血酶原的激活，将所述的B液用注射用水稀释5～10倍后得C液，按照C液体积的十分之一加入0.3mol/L氯化钙溶液，使得氯化钙终浓度为0.025mol/L～0.03mol/L，再加入大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，使其浓度为0.1～0.2％；缓慢搅拌制品，在20℃～25℃下激活制品1～2小时后得到D液；澄清过滤：D液经0.65μm滤芯过滤得到E液；E液经24～26℃S/D灭活6h，收集得到F液，进行第二次吸附。
9.根据权利要求8所述的一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，将F液调节pH至6.0～6.5，电导率低于10ms/cm，于搅拌下加入平衡后的SP Sephadex C50凝胶(按照第一次吸附血浆重量的约2.5％计算，该凝胶经重生步骤可重复使用)，温和搅拌吸附30～60分钟，收集凝胶。每次使用1～2±0.2倍凝胶体积的C50洗涤液洗涤凝胶，搅拌3～5分钟，洗涤3～5次。用大约1±0.1倍凝胶C50洗脱液洗脱凝胶2～3次，每次搅拌10～15分钟，收集G液。G液经0.45μm滤芯过滤。再将过滤后G液用10KD超滤膜浓缩至效价为600IU/ml以上，即得人凝血酶原液。
依据人凝血酶原液效价，使用C50洗脱液进行配制使最终制品人凝血酶效价不小于600IU/ml。根据稀配液重量，按最终浓度为0.5％的海藻糖和1.2％甘氨酸作为稳定剂，经DV20纳米膜过滤去除病毒；
用0.22μm滤芯除菌、分装。每瓶分装2ml；规格为每瓶含人凝血酶1000IU；并按下述工艺进行冻干：
(1)制品常温进柜；
(2)隔板2分钟从常温降至-9℃，保持1小时；
(3)隔板2分钟降到-45℃以下，保持2小时；
(4)开启真空泵，使真空度达到0.2mbar；
(5)2小时隔板升温到-25℃，保持2小时；
(6)3小时隔板升温到3℃，保持6小时；
(7)2小时隔板升温到32℃，保持6小时；
(8)抽极限真空，32℃保持4h；
(9)压盖出柜；
冻干后制品采用水浴灭菌柜，进行99～100℃，30min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜；真空检测，放入待检品库。
10.根据权利要求9所述的一种冻干人凝血酶的制备工艺，其特征在于，
所述的A50洗涤液的配制方法：0.12mol/L氯化钠溶液。A50洗脱液配制方法：2mol/L氯化钠溶液；
进一步，所述的C50洗涤液的配制方法：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液+0.12mol/L氯化钠溶液，调节pH值为6.8～7.2；C50洗脱液的配制方法：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液+1mol/L氯化钠溶液，调节pH值为6.8～7.2；
进一步，所述的pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99％冰乙酸和65.6g乙酸钠；
以上百分比除特别说明，其余均为重量百分比。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110835626A (zh) * 2019-12-04 2020-02-25 长春雷允上药业有限公司 一种凝血酶的制备方法
CN113652414A (zh) * 2021-09-12 2021-11-16 广东双林生物制药有限公司 一种高纯人凝血酶的制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143838A (en) * 1988-12-22 1992-09-01 Biotest Pharma Gmbh Method of producing thrombin from factor ii using calcium ions for the conversion on an anion exchanger
CN101974070A (zh) * 2010-11-08 2011-02-16 江西博雅生物制药股份有限公司 一种人凝血酶原复合物的制备工艺
CN104450656A (zh) * 2014-09-09 2015-03-25 青岛康大食品有限公司 兔血中凝血酶的纯化制备方法
CN105039295A (zh) * 2015-09-15 2015-11-11 上海洲跃生物科技有限公司 一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法
CN105624134A (zh) * 2016-02-26 2016-06-01 福建华灿制药有限公司 限制性凝血酶的制备方法
CN106011116A (zh) * 2016-07-29 2016-10-12 上海莱士血液制品股份有限公司 一种人凝血酶的制备方法
CN106497903A (zh) * 2016-09-26 2017-03-15 河北大安制药有限公司 一种用于纯化凝血酶原复合物的工艺
CN107058270A (zh) * 2017-05-08 2017-08-18 湖南格制药有限公司 猪凝血酶的制备方法及其生产系统

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143838A (en) * 1988-12-22 1992-09-01 Biotest Pharma Gmbh Method of producing thrombin from factor ii using calcium ions for the conversion on an anion exchanger
CN101974070A (zh) * 2010-11-08 2011-02-16 江西博雅生物制药股份有限公司 一种人凝血酶原复合物的制备工艺
CN104450656A (zh) * 2014-09-09 2015-03-25 青岛康大食品有限公司 兔血中凝血酶的纯化制备方法
CN105039295A (zh) * 2015-09-15 2015-11-11 上海洲跃生物科技有限公司 一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法
CN105624134A (zh) * 2016-02-26 2016-06-01 福建华灿制药有限公司 限制性凝血酶的制备方法
CN106011116A (zh) * 2016-07-29 2016-10-12 上海莱士血液制品股份有限公司 一种人凝血酶的制备方法
CN106497903A (zh) * 2016-09-26 2017-03-15 河北大安制药有限公司 一种用于纯化凝血酶原复合物的工艺
CN107058270A (zh) * 2017-05-08 2017-08-18 湖南格制药有限公司 猪凝血酶的制备方法及其生产系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T. SUZUKI ET AL.,: ""PURIFICATION OF TWOTHROMBIN-LIKE ENZYMES FROM THE VENOMOFAGKISTRODONCALIGINOSUS"", 《TOXHCON》 *
马中良等: ""猪凝血酶的分离纯化和部分性质研究"", 《江苏农学院学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110835626A (zh) * 2019-12-04 2020-02-25 长春雷允上药业有限公司 一种凝血酶的制备方法
CN110835626B (zh) * 2019-12-04 2021-12-21 长春雷允上药业有限公司 一种凝血酶的制备方法
CN113652414A (zh) * 2021-09-12 2021-11-16 广东双林生物制药有限公司 一种高纯人凝血酶的制备方法
CN113652414B (zh) * 2021-09-12 2023-06-30 广东双林生物制药有限公司 一种高纯人凝血酶的制备方法

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