CN110835626A - 一种凝血酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％，和/或将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，再在100±3℃的温度下进行水喷淋式干热处理。该制备方法不仅进一步降低了凝血酶产品中的杂质含量，并且显著地提高了凝血酶产品的效价和有效地去除了病毒，非常适合凝血酶产品的大规模工业生产。

Description

一种凝血酶的制备方法
技术领域
本发明属于生化制药领域，涉及一种凝血酶的制备方法，具体涉及一种能够提高效价、去除病毒和减少杂质，并且适合大规模工业生产的凝血酶的制备方法。
背景技术
凝血酶是一种广泛存在于人体和动物血液中的丝氨酸蛋白酶，它是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显示出促凝和抗凝特性。当循环的凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血块稳定，从而在血栓性疾病的引发和发展中发挥核心作用。由于凝血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原，促使其转变为纤维蛋白、加速血液的凝固而止血，因此临床上将其用于外伤、手术、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、妇产科、消化道出血的止血，特别是用于手术中不易结扎的小血管止血、消化道出血及外伤出血的止血等。
目前，临床上应用的凝血酶主要是由人血以及猪、牛等动物血分离提取的经凝血酶原激活物激活而得到的凝血酶的无菌冻干品，具有较高的专一性，是一种速效局部止血药，广泛应用于消化道出血和外科手术止血(宋宏新、马永征、李敏康，凝血酶分离纯化方法的研究进展，食品研究与开发，2004，25(6)：65-67)。其中，由于猪血来源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶产品都是由猪血制备的，少量的是由人血及牛血等血液制备的。猪凝血酶分子量约为35～39kDa，由两条多肽链通过一个二硫键连接而成，一条链分子量约为34kDa，另一条链分子量约为5kDa，等电点(pI)为5.0～5.5，IEF电泳显示二条带，pI分别为5.0和5.4(徐长法、王玉仙、刘德富等，猪凝血酶的分离纯化与鉴定，北京联合大学学报，1994，8(1)：44-49)。
猪凝血酶的分离纯化过程大致包括猪血浆的预处理、凝血酶原的提取、凝血酶原的激活及粗凝血酶的制备、凝血酶的纯化等步骤。由于凝血酶制品是从猪血提取制备而得的多组分生化药品，具有潜在的猪源性病毒污染的隐患，为提高该制品安全性，有必要开展凝血酶病毒灭活工艺研究。进一步地，不论是从动物血还是从人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在以下几个问题：(1)凝血酶产品效价不稳定；(2)产品杂质及杂蛋白浓度偏高；(3)存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患。
中国发明专利申请CN103160486公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括以下步骤：一、分离猪血浆；二、化学法病毒灭活；三、吸附凝血酶原；四、收集凝血酶原；五、纳米过滤；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的冻干保存。该专利申请并未公开用于病毒灭活的试剂和纳米膜的种类，而且所述方法得到的产品杂质含量偏高，其产品的效价也有待于进一步提高。
综上，当前对产品效价更高、生产成本更低、更安全可靠的凝血酶产品及其制备方法还存在着迫切的需求。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种新的凝血酶的制备方法，该方法使用S/D法(即采用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液)联合干热法进行病毒灭活，同时采用N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺作为酶激活剂，其不仅进一步降低了凝血酶产品中的杂质含量，并且显著地提高了凝血酶产品的效价和有效地去除了病毒，非常适合凝血酶产品的大规模工业生产。
一方面，本发明提供了一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％。
另一方面，本发明提供了另一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。
再一方面，本发明提供了另一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(2)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。
在上述的凝血酶的制备方法中，所述水喷淋式干热处理可以为将包含凝血酶的冻干产物置于水喷淋净化箱中，温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下，持续以热水喷淋包含凝血酶的冻干产物30至60分钟。
优选地，在上述的凝血酶的制备方法中，所述包含凝血酶的提取液经过体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液的病毒灭活和去除处理。
优选地，在上述的凝血酶的制备方法中，所述包含凝血酶的提取液经过酶激活剂激活处理；优选地，所述酶激活剂为N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺聚乙二醇-胺。
优选地，本发明提供的凝血酶的制备方法包括以下步骤：
(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂；
(2)用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；
(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并进行透析；
(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，得到包含猪凝血酶的提取液；
(5)将包含猪凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(6)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100±3℃，优选100±1℃的温度下进行水喷淋式干热处理30分钟至60分钟。
更优选地，本发明提供的凝血酶的制备方法包括以下步骤：
(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂，搅拌并静置以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂，并抽滤吸附剂吸附的猪血浆，弃去滤液；
(2)用洗涤剂洗涤吸附剂，抽滤，弃去滤液，然后用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；
(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并使用透析液透析经过病毒灭活和去除处理的洗脱液；
(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，使透析液中的N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺的浓度为0.5～1mol/L，控制温度为33～36℃，充分搅拌10～30分钟，降温至1～7℃，优选4℃，静置30分钟至2小时，得到包含猪凝血酶的提取液；
(5)将包含猪凝血酶的提取液依次经过除杂、超滤和除菌后冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产品按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(6)将包含猪凝血酶的冻干产物的温度升高至103～105℃，再在100±1℃的温度下进行水喷淋式干热处理30分钟至60分钟。
优选地，在上述步骤(1)中，所述抗凝猪血浆的制备方法包括：向新鲜猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；
优选地，所述抗凝猪血浆的制备方法包括：按抗凝剂与新鲜猪血的体积比为1：9的比例向新鲜猪血加入抗凝剂，轻轻搅匀，在0～10℃下静置后，并于5～8小时内以19000r/min离心，离心温度为8～15℃，离心时间为15～20分钟，收集上层血浆；
更优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；
进一步优选地，所述抗凝猪血浆在0～10℃下保存0～6小时或者-18℃以下冰冻贮存一年以内备用；
优选地，所述除杂为采用70目、100目和200目的尼龙滤网逐级过滤。
优选地，所述吸附剂选自葡聚糖凝胶G10、15、25、50、75、100、150和200；A-25和50；Q-25和50；以及C-25和50；优选地，所述吸附剂为中粒度葡聚糖凝胶A-50；
优选地，所述抗凝猪血浆与吸附剂的质量比为1000：1～3，更优选为1000：2；
优选地，所述搅拌的时间为30～60分钟，更优选为45分钟；所述静置的时间为15～45分钟，更优选为30分钟。
优选地，在上述步骤(2)中，所述洗涤剂为包含11.7克/升氯化钠和3克/升柠檬酸三钠的水溶液；
优选地，所述洗涤剂与抗凝猪血浆的比例为100～200毫升：1000克，更优选为160毫升：1000克；
优选地，所述洗脱剂为包含117克/升氯化钠和3克/升柠檬酸三钠的水溶液；
优选地，所述洗脱剂与抗凝猪血浆的比例为10～30毫升：1000克，更优选为20毫升：1000克。
优选地，在上述步骤(3)中，所述对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理为使用体积比浓度0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液在22-26℃下处理猪凝血酶原洗脱液4～8小时；更优选地，在24℃下处理猪凝血酶原洗脱液6小时。
优选地，所述透析液为2.94克/升柠檬酸三钠水溶液；
优选地，所述透析液与抗凝猪血浆的比例为2500～3500毫升：1000克，更优选为3000毫升：1000克；
优选地，所述透析的时间为4～6小时，更优选为5小时；
优选地，所述透析的温度为0～20℃。
优选地，在上述步骤(5)中，所述除杂包括：将包含猪凝血酶的提取液用1M的冰乙酸调至pH为5.2～5.6，于4℃下静置30分钟，离心收集上清液，将上清液用饱和碳酸氢钠调至pH为6.0～6.5，于4℃下静置30分钟，离心，收集上清液。
优选地，所述超滤为使用分子量为8000的超滤柱超滤；
优选地，所述除菌为依次过孔径为0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤除菌，再过0.22μm的滤芯过滤除菌。
本发明还提供了上述的凝血酶的制备方法制备的凝血酶。
根据本发明的一个具体技术方案，所述凝血酶的制备方法包括以下步骤：
1)收集猪血并制备抗凝猪血浆，将抗凝猪血浆吸入到高位贮存罐内，经罐体下排阀流入到管式离心机，开启管式离心机离心，并逐级经70目、100目、200目滤网过滤除杂；
2)将已过滤完毕的猪血浆，按照猪血浆与吸附剂的质量比为1000：2的比例加入预先处理好的吸附剂，搅拌45分钟，静置30分钟，以吸附猪凝血酶原，使用200目的尼龙滤布过滤吸附完毕的猪血浆及沉淀下来的吸附剂，并抽滤吸附剂中的猪血浆，弃滤液；
3)使用包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤吸附剂，其中洗涤剂与猪血浆的比例为160毫升：1000克，抽滤，弃滤液，然后将包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液加入滤干的吸附剂中，其中洗脱剂与猪血浆的比例为20毫升：1000克，于室温浸泡30分钟，抽滤并收集滤液，然后将新的包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液加入滤干的吸附剂中，其中洗脱剂与猪血浆的比例为20毫升：1000克，于室温浸泡20分钟，抽滤，收集滤液，并合并滤液，得到猪凝血酶原洗脱液；
4)在24℃下，使用体积比浓度0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对步骤3)得到猪凝血酶原洗脱液处理6小时；
5)将步骤4)进行病毒灭活/去除后的洗脱液装入分子量7000的透析袋内，使用2.94克/升柠檬酸三钠水溶液透析5小时，透析液温度应控制在0～20℃，得透析液；其中，透析液与猪血浆的比例为3000毫升：1000克；
6)向步骤5)得到的透析液中加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，即DSPE-PEG-Amine，使DSPE-PEG-Amine的终浓度为0.8mol/L，控制温度为35℃，充分搅拌20分钟，降温至4℃，静置2小时，得到猪凝血酶的提取液；
7)将步骤6)得到的猪凝血酶的提取液用1M的冰乙酸调至pH5.4，于4℃下静置30分钟，离心收集上清液，将上清液用饱和碳酸氢钠调至pH6.3，于4℃下静置30分钟，离心，收集上清液，将上清液使用8000分子量的超滤柱超滤；将超滤后的提取液依次过孔径为0.8μm、0.45μm、0.22μm的除菌滤膜，再选择0.22μm的滤芯过滤，收集上清液并制备猪凝血酶的冻干品；
8)使用干热法处理步骤7)得到的猪凝血酶冻干品，包装即得凝血酶冻干品成品；
其中，所述干热法条件为：将温度提升至103～105℃，再在100±1℃下进行水喷淋式干热处理30分钟至60分钟。
与现有技术相比，本发明至少提供了以下优势：
1.本发明的目的之一在于提高凝血酶产品效价，而研究表明控制冻干参数条件成为实现这一目的的重点手段。干热法可去除凝血酶产品中的脂包膜病毒和非脂包膜病毒，但由于干热法使用的处理温度较高(80℃或100℃)，会影响蛋白的稳定性，导致凝血酶产品的效价降低。本申请的发明人惊奇地发现，通过将冻干产物的水分含量控制到3％重量以下，可以使得蛋白在干热法处理过程中不变性，进而达到效价稳定可控的效果。此方法非常符合生产工艺的要求和工业化生产的需要。
2.此外，本申请的发明人还发现在干热法处理过程中采用先将冻干产物的温度提升至101～107℃，能够保证热传导的稳定性以及受热均匀性，再持续保证在100±3℃温度下进行干热处理30分钟至60分钟，且干热方式采用水喷淋式干热法，较传统的干热箱法受热更均匀，对病毒去除/灭活的效果更佳。
3.本申请的发明人长期以来一直致力于凝血酶制备方法的研究和开发，在之前研发的凝血酶的制备方法(参见发明名称为“一种凝血酶的制备方法”的中国发明专利ZL201410591661.6)中，使用S/D法联合膜过滤法进行病毒灭活/去除，其中膜过滤法可有效截留大于滤膜孔径的病毒，而不破坏有效成分的结构，而且对样品的温度、pH等要求宽泛，适用性和选择性好。但是，膜过滤法生产成本较高，生产效率低。本申请使用S/D法联合干热法灭活/去除病毒，重点控制冻干参数条件，其中S/D法生产成本和可操作性较好，处理温度为24℃，对产品造成的影响小，处理时间长短适宜，而且该法已得到广泛的应用，技术成熟度和认可度高。
4.为了减少了带入新病毒的风险，本发明的制备方法使用的酶激活剂为DSPE-PEG-Amine。申请号为201510638083.1的中国发明专利申请提供了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，其使用兔脑粉作为动物源酶激活剂，相当于又引入了一个新的动物源物质。而根据《多组分生化药注射剂基本技术要求》，多组分生化药的工艺控制应该直接从源头开始，原料的控制应包括动物饲养环境、疾控情况、原料的采集方法、必要的病毒控制等全面的信息。申请号为201710319423.3的中国发明专利申请所提供的猪凝血酶的制备方法及其生产系统以及其他专利文献则选择了卵磷脂，但现阶段实际生产过程所选择的卵磷脂均为从蛋黄提取的卵磷脂，这也存在带入新的动物源病毒风险。而本申请采用的N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺(DSPE-PEG-Amine)为纯化学合成的酶激活剂，不会带入新的动物源新病毒风险。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1猪凝血酶冻干产品的制备
1)收集猪血并制备抗凝猪血浆，将抗凝猪血浆吸入到高位贮存罐内，经罐体下排阀流入到管式离心机，开启管式离心机离心。具体地，按抗凝剂与新鲜猪血的体积比为1：9的比例向新鲜猪血加入抗凝剂，轻轻搅匀，在10℃下静置后，并于5～8小时内以19000r/min离心，离心温度为10℃，离心时间为15分钟，收集上层血浆。所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液。并逐级经70目、100目、200目滤网过滤除杂；
2)将已过滤完毕的猪血浆，按照猪血浆与吸附剂(中粒度葡聚糖凝胶A-50)的质量比为1000：2的比例加入预先处理好的吸附剂，搅拌45分钟，静置30分钟，以吸附猪凝血酶原，使用200目的尼龙滤布过滤吸附完毕的猪血浆及沉淀下来的吸附剂，并抽滤吸附剂中的猪血浆，弃滤液；
3)使用包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤吸附剂，其中洗涤剂与猪血浆的比例为160毫升：1000克，抽滤，弃滤液，然后将包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液加入滤干的吸附剂中，其中洗脱剂与猪血浆的比例为20毫升：1000克，于室温浸泡30分钟，抽滤并收集滤液，然后将新的包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液加入滤干的吸附剂中，其中洗脱剂与猪血浆的比例为20毫升：1000克，于室温浸泡20分钟，抽滤，收集滤液，并合并滤液，得到猪凝血酶原洗脱液；
4)在24℃下，使用体积比浓度0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对步骤3)得到猪凝血酶原洗脱液处理6小时；
5)将步骤4)进行病毒灭活/去除后的洗脱液装入分子量7000的透析袋内，使用2.94克/升柠檬酸三钠水溶液透析5小时，透析液温度应控制在0～20℃，得透析液；其中，透析液与猪血浆的比例为3000毫升：1000克；
6)向步骤5)得到的透析液中加DSPE-PEG-Amine，使DSPE-PEG-Amine的终浓度为0.8mol/L，控制温度为35℃，充分搅拌20分钟，降温至4℃，静置2小时，得到猪凝血酶的提取液；
7)将步骤6)得到的猪凝血酶的提取液用1M的冰乙酸调至pH5.4，于4℃下静置30分钟，离心收集上清液，将上清液用饱和碳酸氢钠调至pH6.3，于4℃下静置30分钟，离心，收集上清液，将上清液使用8000分子量的超滤柱超滤；将超滤后的提取液依次过孔径为0.8μm、0.45μm、0.22μm的除菌滤膜，再选择0.22μm的滤芯过滤，收集上清液并制备猪凝血酶的冻干产物，使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％；
8)使用干热法处理步骤7)得到的猪凝血酶冻干品，包装即得凝血酶冻干品成品；
其中，所述干热法条件为：将温度提升至103～105℃，再在100±1℃下进行水喷淋式干热处理45分钟。
猪凝血酶半成品溶液的贮存方法：
半成品溶液应于4℃密闭、避光贮存，并应于72小时内进行冻干，若因故无法冻干，则应于-18℃以下冰冻贮存。
其中，在所述猪凝血酶的制备中，还应注意的是：
1.新接收的血浆应在0～10℃下保存，并于6小时内离心；
2.血浆处理后原料应在-18℃冰箱保存，最长贮存期限：2年；
3.使用溶胀好的吸附剂，并在115℃灭菌30分钟；
4.冻血浆解冻温度不应高于35℃；
5.吸附剂中的血浆用抽滤方法抽尽；
6.吸附剂再生时控制OD280＜0.0015，OD260＜0.0015；
7.调酸时pH值为3，调碱时pH值为11；
8.灭完菌的吸附剂4℃下保存。
实施例2：不同病毒灭活和去除方法对猪凝血酶冻干产品的效价的影响
在该实施例的各种制备方法中，病毒灭活和去除方法分别采用S/D法联合膜过滤法(具体方法参见ZL201410591661.6中国发明专利)和S/D法联合干热法(具体方法参考本申请实施例1)，猪凝血酶冻干产品的制备方法采用的其余条件均同实施例1。具体地，干热法控制冻干产物水分在2％重量以内，干热法采用先将温度提升至105℃，再持续控制温度在100±1℃下进行干热处理45分钟，干热方式采用水喷淋式。各种制备方法生产三批产品，比较其对产品质量的影响，其中膜过滤法批号为A，干热法批号为B。
表1产品效价对比
Figure BDA0002302389900000101
实施例3：不同干热法对猪凝血酶冻干产品的病毒灭活的影响
在该实施例的制备方法中分别采用以下干热法进行病毒灭活：
(1)水喷淋式干热法：采用先将温度提升至104℃，再持续控制温度在100±1℃下进行干热处理30分钟，干热方式采用水喷淋式干热法，生产三批，批号为B。猪凝血酶冻干产品的其余制备条件均同实施例1。
(2)采用干热箱干热法，温度直接控制在100±1℃下进行干热处理30分钟，生产三批，批号为C。猪凝血酶冻干产品的其余制备条件均同实施例1。
表2两种干热法处理灭活呼肠孤病毒3型结果的对比
批号 残余指示病毒滴定-lgTCID50/0.1mL
水喷淋式干热法B20190701 6.13
水喷淋式干热法B20190702 6.25
水喷淋式干热法B20190703 6.13
干热箱C 20190704 3.95
干热箱C 20190705 4.63
干热箱C 20190706 4.25
检测结果显示，样品经处理后使Reo3的滴度下降值，水喷淋式干热法均能达到大于4logs，而干热箱有一批样品没有达到大于4logs，不符合病毒去除/灭活的效果要求。
实施例4：含水量对水喷淋式干热法获得的猪凝血酶冻干产品效价的影响
在该实施例中，冻干水分含量控制分别为2％、2.5％、3％、4.5％(均在5％以内)，均采用水喷淋式干热法，即先将温度提升至105℃，再持续控制温度在100±1℃。猪凝血酶冻干产品的其余制备条件均同实施例1。
表3产品效价对比
批号 水分％重量 效价(标示量％)
Y20140901 4.5 56.8
Y20150502 4.5 54
Y20150503 4 60.4
Y20150901 4 60.6
Y20150902 3 78.6
Y20150903 3 80.2
Y20150904 2.5 94.2
Y20151003 2.5 98.0
Y20151004 2 114.0
Y20151101 2 106.7
Y20151102 2 106.2
由上表可知，冻干产物的含水量控制在3％以下时，猪凝血酶冻干产品的效价均可保持在较高的水平，其中在2.5％时较佳，在2％时最佳。
以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案，而并非对其的限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在本发明的精神和构思下对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明的权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％。
2.一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。
3.一种凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将包含凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(2)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下进行水喷淋式干热处理。
4.根据权利要求2或3所述的凝血酶的制备方法，其中所述水喷淋式干热处理为将包含凝血酶的冻干产物置于水喷淋净化箱中，温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下，持续以热水喷淋包含凝血酶的冻干产物30至60分钟。
5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的凝血酶的制备方法，其中所述包含凝血酶的提取液经过体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液的病毒灭活和去除处理。
6.根据权利要求1、3至5中任一项所述的凝血酶的制备方法，其中所述包含凝血酶的提取液经过酶激活剂激活处理；优选地，所述酶激活剂为N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂；
(2)用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；
(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并进行透析；
(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，得到包含猪凝血酶的提取液；
(5)将包含猪凝血酶的提取液冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产物按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(6)将包含凝血酶的冻干产物的温度升高至101～107℃，优选103～105℃，再在100+3℃，优选100+1℃的温度下进行水喷淋式干热处理30分钟至60分钟。
8.根据权利要求7所述的凝血酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)向除杂的抗凝猪血浆加入吸附剂，搅拌并静置以吸附猪凝血酶原，过滤吸附剂，并抽滤吸附剂吸附的猪血浆，弃去滤液；
(2)用洗涤剂洗涤吸附剂，抽滤，弃去滤液，然后用洗脱剂洗脱吸附剂，得到猪凝血酶原洗脱液；
(3)使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理，并使用透析液透析经过病毒灭活和去除处理的洗脱液；
(4)向透析液加入N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺，使透析液中的N-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇胺的浓度为0.5～1mol/L，控制温度为33～36℃，充分搅拌10～30分钟，降温至1～7℃，优选4℃，静置30分钟至2小时，得到包含猪凝血酶的提取液；
(5)将包含猪凝血酶的提取液依次经过除杂、超滤和除菌后冻干，并且使得包含凝血酶的冻干产品按重量计的含水量不高于3％，优选不高于2.5％，更优选不高于2％；
(6)将包含猪凝血酶的冻干产物的温度升高至103～105℃，再在100+1℃的温度下进行水喷淋式干热处理30分钟至60分钟。
9.根据权利要求8所述的凝血酶的制备方法，其中在步骤1)中，所述抗凝猪血浆的制备方法包括：向新鲜猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；
优选地，所述抗凝猪血浆的制备方法包括：按抗凝剂与新鲜猪血的体积比为1：9的比例向新鲜猪血加入抗凝剂，轻轻搅匀，在0～10℃下静置后，并于5～8小时内以19000r/min离心，离心温度为8～15℃，离心时间为15～20分钟，收集上层血浆；
更优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；
进一步优选地，所述抗凝猪血浆在0～10℃下保存0～6小时或者-18℃以下冰冻贮存一年以内备用；
优选地，所述除杂为采用70目、100目和200目的尼龙滤网逐级过滤；
优选地，所述吸附剂选自葡聚糖凝胶G10、15、25、50、75、100、150和200；A-25和50；Q-25和50；以及C-25和50；优选地，所述吸附剂为中粒度葡聚糖凝胶A-50；
优选地，所述抗凝猪血浆与吸附剂的质量比为1000：1～3，更优选为1000：2；
优选地，所述搅拌的时间为30～60分钟，更优选为45分钟；所述静置的时间为15～45分钟，更优选为30分钟。
10.根据权利要求8或9所述的凝血酶的制备方法，其中在步骤(2)中，所述洗涤剂为包含11.7克/升氯化钠和3克/升柠檬酸三钠的水溶液；
优选地，所述洗涤剂与抗凝猪血浆的比例为100～200毫升：1000克，更优选为160毫升：1000克；
优选地，所述洗脱剂为包含117克/升氯化钠和3克/升柠檬酸三钠的水溶液；
优选地，所述洗脱剂与抗凝猪血浆的比例为10～30毫升：1000克，更优选为20毫升：1000克。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的凝血酶的制备方法，其中在步骤(3)中，所述对猪凝血酶原洗脱液进行病毒灭活和去除处理为使用体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯的水溶液和重量比浓度为1％的TritonX-100的水溶液在22-26℃下处理猪凝血酶原洗脱液4～8小时；更优选地，在24℃下处理猪凝血酶原洗脱液6小时；
优选地，所述透析液为2.94克/升柠檬酸三钠水溶液；
优选地，所述透析液与抗凝猪血浆的比例为2500～3500毫升：1000克，更优选为3000毫升：1000克；
优选地，所述透析的时间为4～6小时，更优选为5小时；
优选地，所述透析的温度为0～20℃。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的凝血酶的制备方法，其中在步骤(5)中，所述除杂包括：将包含猪凝血酶的提取液用1M的冰乙酸调至pH为5.2～5.6，于4℃下静置30分钟，离心收集上清液，将上清液用饱和碳酸氢钠水溶液调至pH为6.0～6.5，于4℃下静置30分钟，离心，收集上清液；
优选地，所述超滤为使用分子量为8000的超滤柱超滤；
优选地，所述除菌为依次过孔径为0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤除菌，再过0.22μm的滤芯过滤除菌。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的凝血酶的制备方法制备的凝血酶。
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