CN111569143B - 一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，采用柱层析法将具有凝血活性的蛇毒凝血酶原激活物提取出来，通过改变层析条件和调节技术参数实现准确分离，并且可在常温下进行操作，对实验条件要求简单，容易放大生产，由于选择的层析柱可以反复使用，因此具有成本低、收率高和产品纯度高的优点，本发明的基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，能够最大限度的保持蛇毒凝血酶原激活物的活性和稳定性；安全无毒副作用，既能快速止血又能防止二次出血和感染，可以用于事故急救、手术止血和战时创伤止血时，尤其适用于动脉大出血，能够快速止血，并且不会产生二次创伤。

Description

一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速 止血材料

技术领域

本发明涉及止血材料技术领域，具体说是一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

背景技术

目前的止血材料有三类：第一类是通过材料的物理或化学作用，吸收伤口附近血液中的水分，使伤口处血液的凝血成分浓缩，聚集，从而加速凝血；或通过材料表面电荷与血细胞之间的静电作用，提高红细胞或血小板的粘附和聚集能力，增加血块粘性促进凝血，如沸石类，高岭土类，淀粉类，明胶类和海藻酸盐类等；第二类是利用材料对组织很强的粘着力直接封闭创面，从而实现止血。这类止血材料主要是人工合成高分子，比如：α-氰基丙烯酸酯类、PEG 类等合成高分子，它们遇到血液后能迅速形成粘性很强的胶体，迅速封堵血管，从而止血；第三类是直接或间接提高具有止血活性的物质，止血材料通过表面有效化学或生物成分与血液成分进行反应，启动或提高内源性和外源性凝血途径，进而加速凝血。纤维蛋白胶、短肽类、凝血酶等类型的止血材料都是依靠快速启动血液的内源性止血系统来促进血液凝固，从而止血。

沸石类止血时水合放热，对皮肤等软组织易造成损伤；高岭土类应用后不能完全从伤口处移除，可引起异物肉芽肿或脓肿形成；淀粉类对于难以控制的大出血，止血效果有限；明胶类需要机体的凝血因子参与才能止血，并且容易增加伤口感染，尤其是污染的伤口，并且黏附性差、易脱落，用于内脏止血需要丝线固定；壳聚糖类止血材料的止血机理是壳聚糖表面带正电荷，使得带负电的红细胞容易聚集在其表面，也可以激活血液中的补体系统，对血小板也有聚集作用，但是对于广泛的出血创面，壳聚糖的止血效果有限。

第二类的止血材料可导致血管栓塞并且在降解过程中释放出氰和甲醛等有毒物质，可诱导注射部位周边产生炎症和组织坏死。 氰基丙烯酸酯黏合剂对黏合组织的表面要求较高，在使用时必须保证干燥、洁净，不能有血液和消化液等存在。

纤维蛋白胶已应用于临床肿瘤摘除后创面的广泛出血和肝、肾等实质脏器术中的出血等。但是，由于其具有黏合性和促凝作用，严禁应用于血管内以防止形成血栓阻塞血管。纤维蛋白胶的黏附力不好，易从伤口处脱落。目前常使用的纤维蛋白胶是由冻干粉和溶剂组成，使用时要先溶解，不适用突发情况，也不方便储存和运输，且纤维蛋白胶成本较高，种种原因限制了其使用。

综上以上止血材料均存在一定的缺陷，首先对内脏大出血，尤其是动脉出血的直接止血作用有限，并没有有效的止血材料，因此，开发新的凝血酶原激活物，并将其应用到止血材料中达到有效止血，是目前亟待解决的。

另外，蛇毒中含有多种促进血液凝固从而发挥止血作用的蛋白酶和活性多肽，比如目前临床上广泛使用的止血药立止血是从巴西洞蝮蛇的毒液中分离、提纯得到的高纯度蛇毒凝血毒素制剂，蛇毒中含有的凝血物质活性很高，但是目前的提纯方法对设备的要求高，提纯成本高，限制了新蛇毒凝血酶原激活物的开发，目前还没有蛇毒凝血酶原激活物被开发上市为止血试剂，因此，止血性能好，安全性好的蛇毒凝血酶原激活物类止血产品具有广阔的应用前景。

综上，为了克服现有蛇毒止血物质和常用止血材料中存在的缺陷，如蛇毒止血物质制备流程复杂，制备成本高，止血材料对内脏大出血，尤其是动脉出血的直接止血作用有限。开发有效的蛇毒凝血酶原激活物并将其制备成止血时间短、止血性能好，尤其适合大动脉止血的材料具有重大的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种蛇毒凝血酶原激活物，通过以下步骤制备得到：

①将蛇毒冻干粉溶于0.05 mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为Sephadex G-200，先用第一流动相洗脱5~8小时；再用第二流动相洗脱3~5小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；

蛇毒冻干粉和0.05 mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1：10~20；

②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAE Sepharose FF，先用第一流动相洗脱5~8小时，再用第二流动相洗脱3~5小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；

其中第一流动相为浓度0.05 mol/L、pH6.0~7.0的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度1~3%的硫酸铵；

第二流动相为浓度0.20 mol/L、pH6.0~7.0的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度2~4%的硫酸铵；

洗脱时的流速均为1~3 ml/分钟。

优选的，第一流动相中硫酸铵的质量浓度为2%；第二流动相中硫酸铵的质量浓度为3%。

本发明还包括一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.01~0.5份，氧化石墨烯5~10份，聚乳酸80~100份，改性壳聚糖3~8份，氯化钙8~10份，纳米二氧化钛2~6份和聚乙烯吡咯烷酮1~5份；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将二元羧酸加入到浓度为0.4~0.6 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在0~30 ℃下搅拌反应0.5~3小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在20~60 ℃下搅拌反应12~36小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

二元羧酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1~2：50~100：2~4：2~4：10~20；

所述二元羧酸为丁二酸、戊二酸或己二酸；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由1~2份壳聚糖分散在18~22份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.4~0.6 mol/L。

优选的，以重量份计，由以下组分组成：蛇毒凝血酶原激活物0.3~0.5份，氧化石墨烯5~8份，聚乳酸80~90份，改性壳聚糖4~6份，氯化钙8~9份，纳米二氧化钛3~5份和聚乙烯吡咯烷酮1~3份。

优选的，聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮K30。

优选的，二元羧酸为戊二酸。

本发明还包括一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：

⑴以重量份计，将80~100份聚乳酸加入到800~1000份有机溶剂中，加入氯化钙8~10份，纳米二氧化钛2~6份，改性壳聚糖3~8份，聚乙烯吡咯烷酮1~5份和氧化石墨烯4.5~9份，搅拌8~10小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比7~9：1组成；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.01~0.5份和氧化石墨烯0.5~1份加入到20~40份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附4~6小时，干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

优选的，干燥为冷冻干燥。

优选的，静电纺丝成型的参数设置为电压20~24kV，流速0.4~0.8mL/h，接收距离为13~17cm。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明的蛇毒凝血酶原激活物的提取方法以常规的层析技术为主，通过改变层析条件和调节技术参数实现准确分离，并且可在常温下进行操作，对实验条件要求简单，容易放大生产，由于选择的层析柱可以反复使用，因此具有成本低、收率高和产品纯度高的优点，可以用于制备止血类产品，具有广阔的应用前景。本发明的蛇毒凝血酶原激活物，安全无毒，能够迅速激活凝血酶原，并进一步形成稳定的血纤蛋白，从而达到快速止血的目的；本发明的蛇毒凝血酶原激活物凝血时间短，凝血性能高，对动脉大出血的止血效果显著。

本发明的基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以聚乙烯吡咯烷酮和聚乳酸等为基底材料，通过非共价键的方式将基底材料、蛇毒凝血酶原激活物与改性壳聚糖结合，能够最大限度的保持蛇毒凝血酶原激活物的活性和稳定性；安全无毒副作用，既能快速止血又能防止二次出血和感染，可以用于事故急救、手术止血和战时创伤止血时，尤其适用于动脉大出血，能够快速止血，并且不会产生二次创伤。本发明的基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料由于含有蛇毒凝血酶原激活物，能够直接激活凝血酶原形成凝血酶，具有广阔的应用前景。

聚乳酸中添加了特定重量份数的聚乙烯吡咯烷酮、氧化石墨烯、改性壳聚糖、氯化钙和纳米二氧化钛材料作为基底材料，首先，聚乳酸和聚乙烯吡咯烷酮均为生物相容性极好的亲水材料，聚乙烯吡咯烷酮通过静电纺丝的形式掺杂到聚乳酸中，能够在出血点迅速吸附大量的血液，并且在蛇毒凝血酶原激活物的作用下加速血液凝固；其次，聚乙烯吡咯烷酮能够将其余材料均匀分散在聚乳酸中；聚乳酸为氯化钙和纳米二氧化钛提供附着点，氯化钙和纳米二氧化钛能够增加聚乳酸的韧性和吸水率；最后，通过聚乳酸中添加特定重量份数的改性壳聚糖和氧化石墨烯，一方面，能够作为相容性材料促进各组分的均匀混合，避免基底材料和蛇毒凝血酶原激活物的物理分离，另一方面，当止血材料贴合在伤口上时，能够从伤口表面有效吸收各个分子量的有害物质，并且在伤口上形成类似胶状的薄膜，保持创面湿润，减少创面的炎症反应，促进创面愈合和修复。

本发明的基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，流程少，易操作，便于实现大规模工业化生产。

附图说明

图1为蛇毒凝血酶原激活物用考马斯亮蓝染色液染色并脱色后的结果示意图；

图2为凝血酶原激活物的分子量的检测结果示意图；

图3为斑马鱼血栓形成结果图；

图4为斑马鱼血栓形成中各组的血栓面积示意图；

图5为蛇毒凝血酶原激活物对血清的凝固结果图；

附图标记：1 蛇毒凝血酶原激活物组，2 Celox 颗粒组，3 云南白药组。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，通过以下技术方案实现：

一种蛇毒凝血酶原激活物，通过以下步骤制备得到：

①将蛇毒冻干粉溶于0.05 mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为Sephadex G-200，先用第一流动相洗脱5~8小时；再用第二流动相洗脱3~5小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；

蛇毒冻干粉和0.05 mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1：10~20；

②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAE Sepharose FF，先用第一流动相洗脱5~8小时，再用第二流动相洗脱3~5小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；

其中第一流动相为浓度0.05 mol/L、pH6.0~7.0的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度1~3%的硫酸铵；

第二流动相为浓度0.20 mol/L、pH6.0~7.0的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度2~4%的硫酸铵；

洗脱时的流速均为1~3 ml/分钟。

优选的，第一流动相中硫酸铵的质量浓度为2%；第二流动相中硫酸铵的质量浓度为3%。

本发明的一种蛇毒凝血酶原激活物的制备方法，每10g蛇毒冻干粉能够得到70~100mg蛇毒凝血酶原激活物。

本发明还包括一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.01~0.5份，氧化石墨烯5~10份，聚乳酸80~100份，改性壳聚糖3~8份，氯化钙8~10份，纳米二氧化钛2~6份和聚乙烯吡咯烷酮1~5份；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将二元羧酸加入到浓度为0.4~0.6 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在0~30℃下搅拌反应0.5~3小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在20~60℃下搅拌反应12~36小时，用分子量3500的透析袋透析，去除小分子交联产物，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

二元羧酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1~2：50~100：2~4：2~4：10~20；

所述二元羧酸为丁二酸、戊二酸或己二酸；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由1~2份壳聚糖分散在18~22份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.4~0.6 mol/L。

其中改性壳聚糖为壳聚糖上的两个氨基和二元羧酸的两个羧基进行交联得到，内部为蜂窝状的结构，具有较大的比表面积，因而具有超强的吸附作用，能够从伤口表面有效吸收各个分子量的有害物质，包括蛋白质水解和热变性产物、生物胺、炎性介质和细菌霉素等，能够减少炎症反应和伤口愈合时间；

优选的，以重量份计，由以下组分组成：蛇毒凝血酶原激活物0.3~0.5份，氧化石墨烯5~8份，聚乳酸80~90份，改性壳聚糖4~6份，氯化钙8~9份，纳米二氧化钛3~5份和聚乙烯吡咯烷酮1~3份。

优选的，聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮K30。

优选的，二元羧酸为戊二酸。

本发明还包括一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：

⑴以重量份计，将80~100份聚乳酸加入到800~1000份有机溶剂中，加入氯化钙8~10份，纳米二氧化钛2~6份，改性壳聚糖3~8份，聚乙烯吡咯烷酮1~5份和氧化石墨烯4.5~9份，搅拌8~10小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比7~9：1组成；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.01~0.5份和氧化石墨烯0.5~1份加入到20~40份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附4~6小时，干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

本发明的止血材料的制备方法，将约90%重量份数的氧化石墨烯先纺织在医用无纺布中，由于氧化石墨烯结构中含有很多亲水羧基，能够快速吸收血液，并且在伤口上形成类似胶状的薄膜，保持创面湿润，减少创面的炎症反应，促进创面愈合和修复；并且由于氧化石墨烯在水中具有优异的分散性，剩余的氧化石墨烯能够将含量较低的蛇毒凝血酶原激活物分散到医用无纺布中，最大发挥其止血作用。

优选的，干燥为冷冻干燥，冷冻干燥能够最大限度的保证蛇毒凝血酶原激活物的活性。

优选的，静电纺丝成型的参数设置为电压20~24kV，流速0.4~0.8mL/h，接收距离为13~17cm。

本发明中的蛇毒冻干粉是指大陆虎蛇的蛇毒冻干粉，大陆虎蛇的蛇毒冻干粉作为原料，其来源非常广泛，可以直接在市场上购买，或者采用现有的方法进行蛇毒提取和加工。

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种蛇毒凝血酶原激活物，通过以下步骤制备得到：

①将蛇毒冻干粉溶于0.05 mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为Sephadex G-200，先用第一流动相洗脱5小时；再用第二流动相洗脱3小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；

蛇毒冻干粉和0.05 mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1：10；

②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAE Sepharose FF，先用第一流动相洗脱5小时，再用第二流动相洗脱3小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；

其中第一流动相为浓度0.05 mol/L、pH6.0的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度1%的硫酸铵；

第二流动相为浓度0.20 mol/L、pH6.0的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度2%的硫酸铵；

洗脱时的流速均为1 ml/分钟。

实施例2

一种蛇毒凝血酶原激活物，通过以下步骤制备得到：

①将蛇毒冻干粉溶于0.05 mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为Sephadex G-200，先用第一流动相洗脱8小时；再用第二流动相洗脱5小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；

蛇毒冻干粉和0.05 mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1：20；

②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAE Sepharose FF，先用第一流动相洗脱8小时，再用第二流动相洗脱5小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；

其中第一流动相为浓度0.05 mol/L、pH7.0的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度3%的硫酸铵；

第二流动相为浓度0.20 mol/L、pH7.0的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度4%的硫酸铵；

洗脱时的流速均为3 ml/分钟。

实施例3

一种蛇毒凝血酶原激活物，通过以下步骤制备得到：

①将蛇毒冻干粉溶于0.05 mol/L的PBS缓冲溶液中，过滤，所得滤液用凝胶柱分离纯化，填料为Sephadex G-200，先用第一流动相洗脱6小时；再用第二流动相洗脱4小时；以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐得到浓缩液；

蛇毒冻干粉和0.05 mol/L的PBS缓冲溶液的质量比为1：15；

②将步骤①所得浓缩液进行凝胶柱层析，填料为DEAE Sepharose FF，先用第一流动相洗脱6小时，再用第二流动相洗脱4小时，以紫外光谱检测洗脱液，检测波长为280 nm，收集有紫外吸收的部分，以分子量为5000的超滤膜浓缩、脱盐、冻干得到蛇毒凝血酶原激活物；

其中第一流动相为浓度0.05 mol/L、pH6.5的PBS缓冲溶液，第一流动相中还包含质量浓度2%的硫酸铵；

第二流动相为浓度0.20 mol/L、pH6.5的PBS缓冲溶液，第二流动相中还包含质量浓度3%的硫酸铵；

洗脱时的流速均为2 ml/分钟。

实施例4

一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.01份，氧化石墨烯5份，聚乳酸80份，改性壳聚糖3份，氯化钙8份，纳米二氧化钛2份和聚乙烯吡咯烷酮1份；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将丁二酸加入到浓度为0.4 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在0℃下搅拌反应3小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在20℃下搅拌反应36小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

其中丁二酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1：50：2：2：10；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由1份壳聚糖分散在19份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.4 mol/L。

实施例5

一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.5份，氧化石墨烯10份，聚乳酸100份，改性壳聚糖8份，氯化钙10份，纳米二氧化钛6份和聚乙烯吡咯烷酮5份；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将己二酸加入到浓度为0.6 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基丁二酰亚胺，在30℃下搅拌反应0.5小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在60℃下搅拌反应12小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

其中己二酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1：100：4：4：20；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由2份壳聚糖分散在18份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.6 mol/L。

实施例6

一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.3份，氧化石墨烯8份，聚乳酸80份，改性壳聚糖4份，氯化钙8份，纳米二氧化钛3份和聚乙烯吡咯烷酮1份；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将戊二酸加入到浓度为0.5 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在10℃下搅拌反应2小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在30℃下搅拌反应20小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

戊二酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为2：50：2：2：20；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由1份壳聚糖分散在22份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.5 mol/L。

实施例7

一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.5份，氧化石墨烯5份，聚乳酸90份，改性壳聚糖6份，氯化钙9份，纳米二氧化钛5份和聚乙烯吡咯烷酮K30 3份；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将戊二酸加入到浓度为0.5 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在20℃下搅拌反应2小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在50℃下搅拌反应30小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

戊二酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1：60：3：3：15；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由2份壳聚糖分散在18份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.5 mol/L。

实施例8

一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.4份，氧化石墨烯6份，聚乳酸85份，改性壳聚糖5份，氯化钙8.5份，纳米二氧化钛4份和聚乙烯吡咯烷酮2份；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将二元羧酸加入到浓度为0.5 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在15℃下搅拌反应1小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在40℃下搅拌反应20小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

二元羧酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1.5：80：3：3：15；

所述二元羧酸为戊二酸；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由1.5份壳聚糖分散在18.5份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.5 mol/L。

实施例9

实施例4所述基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：

⑴以重量份计，将80份聚乳酸加入到1000份有机溶剂中，加入氯化钙8份，纳米二氧化钛2份，改性壳聚糖3份，聚乙烯吡咯烷酮1份和氧化石墨烯4.5份，在20~25℃下搅拌8小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比9：1组成；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.01份和氧化石墨烯0.5份加入到20份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附4小时，干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

实施例10

实施例5所述基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：

⑴以重量份计，将100份聚乳酸加入到800份有机溶剂中，加入氯化钙10份，纳米二氧化钛6份，改性壳聚糖8份，聚乙烯吡咯烷酮5份和氧化石墨烯9份，在25~30℃下搅拌10小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比7：1组成；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.5份和氧化石墨烯1份加入到40份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附6小时，干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

实施例11

实施例6所述基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：

⑴以重量份计，将80份聚乳酸加入到720份有机溶剂中，加入氯化钙8份，纳米二氧化钛3份，改性壳聚糖4份，聚乙烯吡咯烷酮1份和氧化石墨烯7.2份，在25~30℃下搅拌9小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比8：1组成；

纺丝液经静电纺丝成型的参数为电压22kV，流速0.5mL/h，接收距离为15cm；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.3份和氧化石墨烯0.8份加入到30份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附5小时，冷冻干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

实施例12

实施例7所述基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：

⑴以重量份计，将90份聚乳酸加入到700份有机溶剂中，加入氯化钙9份，纳米二氧化钛5份，改性壳聚糖6份，聚乙烯吡咯烷酮K30 3份和氧化石墨烯4.5份，在25~30℃下搅拌8.5小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比9：1组成；

纺丝液经静电纺丝成型的参数为电压24kV，流速0.8mL/h，接收距离为17cm；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.5份和氧化石墨烯0.5份加入到25份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附4.5小时，干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

实施例13

实施例8所述基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，包括以下步骤：

⑴以重量份计，将85份聚乳酸加入到900份有机溶剂中，加入氯化钙8.5份，纳米二氧化钛4份，改性壳聚糖5份，聚乙烯吡咯烷酮2份和氧化石墨烯5.4份，搅拌9.5小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比8：1组成；

纺丝液经静电纺丝成型的参数为电压20kV，流速0.4mL/h，接收距离为13cm；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.4份和氧化石墨烯0.6份加入到35份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附5.5小时，干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料。

纯化后蛇毒凝血酶原激活物分子量测定

取采用实施例1~3方法所得的蛇毒凝血酶原激活物1 mg用0.1 M的PBS缓冲溶液（100 μL），取溶解后的蛇毒凝血酶原激活物溶液10 μL，加入2 μL SDS-PAGE上样缓冲液（5×）混合，100 ℃5分钟，上样。缓冲室含有700 mL SDS电泳缓冲液（1×），设置电压为80 V，并关注Marker条带（Thermal蛋白标记物，货号26614），在其进入分离胶并出现红线时，将电压升至120 V，跑1小时。用考马斯亮蓝染色液染色（考马斯亮蓝染色套装，Solarbio货号P1305），并用考马斯亮蓝脱色液脱色（考马斯亮蓝染色套装，Solarbio货号P1305），显影仪下观察，如图1所示，蛇毒凝血酶原激活物主要含一种蛋白，其分子量约为50 kD。进一步的，我们在岛津MALDI-TOF质谱仪(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪)上测定了凝血酶原激活物的分子量，具体分子量为51941，如图2所示。

凝血酶原激活物的蛋白质序列经测序公司测定后为SEQ ID NO：1所示。

蛇毒凝血酶原激活物的细胞毒性测试

选取小鼠表皮成纤维细胞（上海研谨生物科技有限公司），采用MTT法测试凝血酶原激活物的毒性。将上小鼠表皮成纤维细胞悬液接种至96孔板中，每孔200 μL培养液，细胞浓度为10⁵个/孔，在二氧化碳培养箱中培养，培养基为DMEM高糖培养基，含10%灭活的FBS，100 μg/mL的青霉素/链霉素，培养温度37℃，二氧化碳浓度5％。培养24小时后，弃去原培养基，加入新鲜的培养基，加入不同浓度的（625，125，25，10，5和1 μM）凝血酶原激活物，每个浓度设置6个复孔，将细胞在恒温培养箱中培养48 h，向每孔中加入20 μL浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液，培养4小时，吸出培养基，加入100 μL DMSO，振荡混匀，在酶标仪上测定每孔的吸光度OD值，测试波长为570 nm。OD值正比于细胞数量，评价本申请得到的蛇毒凝血酶原激活物对细胞增殖能力的影响。表1的结果表明，蛇毒凝血酶原激活物的细胞存活率均在97%以上，因此可以判断，本申请的蛇毒凝血酶原激活物对细胞增殖能力没有影响，为无毒物质。

表1 细胞毒性实验结果

凝血活性测试

一、斑马鱼血栓形成试验

将受精后4小时（hour post fertilization，hpf）的AB系斑马鱼置于体视显微镜下，挑选发育正常的胚胎在28 ℃培养箱中孵化培养至72 hpf，期间每天及时剔除死胚。

将72 hpf斑马鱼转移至24孔培养板中，每孔10条。设置空白对照组，80 μM 花生四烯酸阳性对照组，不同浓度（0.125 μM 、0.25 μM、0.5 μM）蛇毒凝血酶原激活因子处理组。分别加药后，在培养箱中培养1 h后取出，用1 mg/mL的邻联茴香胺染色液（邻联茴香胺50mg﹑醋酸纳41 mg、35％的过氧化氢溶液1.1 mL用40％的乙醇定容至50 mL）染色10 min。养鱼水洗3次，观察拍照，如图3所示。用imagine pro plus 5.1图像处理软件进行定量分析心脏红细胞染色面积。使用Graphpad prism 7.0软件对实验结果进行one-way ANOVA检验，并以Mean±SEM表示（P＜0.05表示数据具有统计学意义），结果如图4所示。

与空白对照组比较，阳性对照组斑马鱼心脏红细胞染色面积明显增加，说明其促进血栓的形成，具有凝血作用。类似地，0.25 μM和0.5 μM的蛇毒凝血酶原激活因子处理组的斑马鱼心脏红细胞染色面积显著增加，说明其具有凝血功能。

斑马鱼血栓形成是本申请的蛇毒凝血酶原激活物具有凝血功能的一个体现，可以看出，本申请的蛇毒凝血酶原激活物可以促进斑马鱼血栓的形成，具有凝血作用。

二、蛇毒凝血酶原激活物对血清的凝固作用

1.研究对象：

a.实施例3的蛇毒凝血酶原激活物：白色冻干粉末，取0.7 mg粉末溶于1 mL PBS中，配成浓度为0.7 mg/mL的溶液；

b.Celox 颗粒：浅灰色粉末，取10 mg粉末与1 mL PBS混合，涡旋，配成浓度为10mg/mL的混合液；

c.云南白药：棕色粉末，取10 mg粉末与1 mL PBS混合，涡旋，配成浓度为10 mg/mL的混合液；

2.试剂

a. 人体正常血清：冻干粉末，溶于1 mL PBS；

b. 显色底物S2238：冻干粉末，取2.5 mg 溶于1.3 mL PBS；

3.实验过程

3.1比较实施例1的蛇毒凝血酶原激活物、Celox 颗粒和云南白药对人体正常血清的凝固作用

0.1 mL正常人体血浆中，分别加入0.1 mL蛇毒凝血酶原激活物（0.7 mg/mL）、0.01mL云南白药(10 mg/mL)+0.09 mL PBS、0.01 mL Celox(10 mg/mL) + 0.09 mL PBS，反应体系为0.2 mL，反应一段时间，将试管倾斜放置后观察血浆凝固情况，再将试管竖起后观察血清的流淌情况，结果如图5所示，实施例3的蛇毒凝血酶原激活物，10秒内即可观察到血清凝固，但Celox、云南白药均没有血清凝固现象（试管倾斜后血清流淌），继续增加用量，最后也未观察到凝固现象，可以得出，蛇毒凝血酶原激活物对人体正常血清具有很好的凝固作用。

三、兔子体外止血实验

将新西兰白兔（体重2.5~3 kg）15只，随机分三组，每组5只，按40 mg/kg剂量静脉缓慢注射戊巴比妥钠溶液麻醉动物后，将其中央耳动脉区域备皮，消毒，沿耳动脉方向切开皮肤，钝性分离出耳动脉、静脉和神经，再用手术刀横向切断动脉，待血液涌出10秒后用本发明实施例8的止血材料或云南白药贴敷于伤口表面，空白对照组只是用常用纱布进行贴敷，三组均用推拉力计施加3N的压力，每隔10秒观察止血情况，观察伤口的流血情况，用滤纸条轻轻蘸吸直至血液不再渗出，即滤纸条上不再沾有血液为止，记录所需时间即为有效止血时间，止血完成后称量取下带血纱布或止血材料的重量，并计算出血量；

完全止血后实验组继续用本发明实施例8所得的止血材料进行包扎，阳性对照组采用含云南白药的纱布进行包扎，空白对照组只是用平常纱布进行包扎，记录兔子的止血时间和出血量，并观察兔子包扎后的状态，1周和2周后，分别将包扎材料拆开，观察伤口的愈合情况，结果如表2所示。

表2 兔子体外止血实验结果表

四、猪股动脉出血的止血

步骤为：选取实验用成年巴马小型猪（20 kg±1 kg）15只，雌雄不限，随机分配成3组，分别为空白对照组、实验组（使用实施例8的止血材料）和阳性对照组（云南白药）。实验前禁食24 h，不禁水，使用戊巴比妥钠静脉注射麻醉。麻醉后将小型猪仰卧位固定在手术台上，左下肢腹股沟局部75%乙醇消毒，游离股动脉5 cm，注意不要损伤临近的股静脉和股神经。动脉插管，放置传感器检测血压变化。右下肢腹股沟局部75%乙醇消毒，游离股动脉5cm，注意不要损伤临近的股静脉和股神经。测量动脉直径，穿线，结扎远心端，使用血管夹夹闭股动脉近心端，使用眼科剪做一切口( 1/2血管)，放开血管夹，自由喷血25 s后，收集流出的血液（以备后续称重）；然后迅速用空白纱布、止血材料或将带有云南白药的纱布在伤口进行压迫止血。压迫止血2 min，观察止血情况，若没有止血继续压迫，观察2 min，仍无法止血时更换纱布继续行压迫止血。若10 min未止血，则代表止血失败，试验结束称量取下带血纱布的重量，并计算出血量，止血时间和出血量如表3所示。

表3 猪股动脉出血的止血时间和出血量

	空白对照组	实验组	阳性对照组
				出血时间/min	止血失败	＜2min	小于5min
25s失血量/g	45.34±12.56	45.65±12.48	46.25±14.16
				止血过程失血量/g	39.04±6.24	1.20±1.24	5.18±5.06

试验结束，将实验组和阳性对照组的小型猪用医用纱布进行包扎，试验结束3天，小猪的状态均良好，阳性对照组小猪中有2头出现二次出血的现象，实验组的小猪无二次出血情况。由上述材料可以看出，本发明的基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的出血量少，适合大动脉出血，能够快速止血，并且无二次出血的情况发生。

序列表

<110> 山东省科学院生物研究所

<120> 一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料

<130> 20200514A-2

<141> 2020-05-14

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 455

<212> PRT

<213> 虎蛇(Notechis scutatus)

<400> 1

Met Ala Pro Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ile Leu Cys Phe Leu Trp Ser

1 5 10 15

Leu Pro Glu Ala Glu Ser Asn Val Phe Leu Lys Ser Lys Val Ala Asn

20 25 30

Arg Phe Leu Gln Arg Thr Lys Arg Ala Asn Ser Leu Phe Glu Glu Phe

35 40 45

Lys Ala Gly Asn Ile Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Arg Cys Ser Lys

50 55 60

Glu Glu Ala Arg Glu Ala Phe Glu Asp Asn Glu Lys Thr Glu Thr Phe

65 70 75 80

Trp Asn Val Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Ser Ser Asn Pro Cys His

85 90 95

Tyr Gly Gly Thr Cys Lys Asp Gly Ile Gly Ser Tyr Thr Cys Thr Cys

100 105 110

Leu Ala Gly Tyr Glu Gly Lys Asn Cys Gln Tyr Val Leu Tyr Gln Ser

115 120 125

Cys Arg Val Asp Asn Gly Asn Cys Trp His Phe Cys Lys Pro Val Gln

130 135 140

Asn Glu Ile Gln Cys Ser Cys Ala Glu Ser Tyr Leu Leu Gly Asp Asp

145 150 155 160

Gly His Ser Cys Val Ala Gly Gly Asp Phe Ser Cys Gly Arg Asn Ile

165 170 175

Lys Ala Arg Asn Lys Val Glu Ala Ser Leu Pro Asp Phe Arg Gln Ser

180 185 190

Gln Asn Ala Thr Leu Leu Lys Lys Ser Asp Asn Pro Ser Pro Asp Ile

195 200 205

Arg Val Val Asn Gly Thr Asp Cys Lys Leu Gly Glu Cys Pro Trp Gln

210 215 220

Ala Leu Leu Ile Asn Asp Gln Gly Asp Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile

225 230 235 240

Leu Ser Pro Ile Tyr Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Asn Gln Thr

245 250 255

Lys Tyr Ile Arg Val Val Val Gly Glu Ile Asp Ile Ser Arg Lys Glu

260 265 270

Thr Arg Arg Leu Leu Ser Val Asp Lys Ile Tyr Val His Thr Lys Phe

275 280 285

Val Pro Pro Asn Tyr Tyr Tyr Val His Gln Asn Phe Asp Arg Val Ala

290 295 300

Tyr Asp Tyr Asp Ile Ala Ile Ile Arg Met Lys Thr Pro Ile Gln Phe

305 310 315 320

Ser Glu Asn Val Val Pro Ala Cys Leu Pro Thr Ala Asp Phe Ala Asn

325 330 335

Glu Val Leu Met Lys Gln Asp Ser Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg

340 345 350

Ile Arg Phe Lys Glu Pro Thr Ser Asn Thr Leu Lys Val Ile Thr Val

355 360 365

Pro Tyr Val Asp Arg His Thr Cys Met Leu Ser Ser Asp Phe Arg Ile

370 375 380

Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Leu Pro Gln Asp Ala

385 390 395 400

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ile Thr Ala Tyr Arg Asp Thr

405 410 415

His Phe Ile Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys

420 425 430

Gly Lys Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Phe Ile Pro Trp Ile

435 440 445

Lys Lys Ile Met Ser Leu Lys

450 455

Claims (5)

1.一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，其特征在于：以重量份计，由以下原料组成：蛇毒凝血酶原激活物0.01~0.5份，氧化石墨烯5~10份，聚乳酸80~100份，改性壳聚糖3~8份，氯化钙8~10份，纳米二氧化钛2~6份和聚乙烯吡咯烷酮1~5份；

所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮K30；

所述改性壳聚糖按照以下步骤制备得到：

将二元羧酸加入到浓度为0.4~0.6 mol/L氯化钠水溶液中，开启搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，在0~30℃下搅拌反应0.5~3小时，得到反应液；向所得反应液中加入壳聚糖的氯化钠水溶液中，在20~60℃下搅拌反应12~36小时，用分子量3500的透析袋透析，冷冻干燥，得到改性壳聚糖；

二元羧酸、氯化钠水溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和壳聚糖的氯化钠水溶液质量比为1~2：50~100：2~4：2~4：10~20；

所述二元羧酸为戊二酸；

所述壳聚糖的氯化钠水溶液由1~2份壳聚糖分散在18~22份氯化钠水溶液中得到，其中氯化钠水溶液的摩尔浓度0.4~0.6 mol/L；

所述凝血酶原激活物的蛋白质序列为SEQ ID NO：1。

2.根据权利要求1所述的一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料，其特征在于：以重量份计，由以下组分组成：蛇毒凝血酶原激活物0.3~0.5份，氧化石墨烯5~8份，聚乳酸80~90份，改性壳聚糖4~6份，氯化钙8~9份，纳米二氧化钛3~5份和聚乙烯吡咯烷酮1~3份。

3.权利要求1所述的一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴以重量份计，将80~100份聚乳酸加入到800~1000份有机溶剂中，加入氯化钙8~10份，纳米二氧化钛2~6份，改性壳聚糖3~8份，聚乙烯吡咯烷酮1~5份和氧化石墨烯4.5~9份，搅拌8~10小时，得到纺丝液，经静电纺丝成型，得到医用无纺布；

其中有机溶剂由二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺按照质量比7~9：1组成；

⑵将蛇毒凝血酶原激活物0.01~0.5份和氧化石墨烯0.5~1份加入到20~40份水中，搅拌分散均匀得到混合液，将步骤⑴所得医用无纺布浸入到混合液中，超声吸附4~6小时，干燥后得到基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料；

所述凝血酶原激活物的蛋白质序列为SEQ ID NO：1。

4.根据权利要求3所述的一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，其特征在于：干燥为冷冻干燥。

5.根据权利要求3所述的一种基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料的制备方法，其特征在于：静电纺丝成型的参数设置为电压20~24kV，流速0.4~0.8mL/h，接收距离为13~17cm。

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