CN101092612A - 新的具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶 - Google Patents
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Abstract
本发明的类凝血酶涉及生物医药和酶学领域。具体地讲，涉及一种从尖吻蝮蛇蛇毒中提取的、具有止血活性酶的结构特征，纯化方法和医药领域用途。该酶全分子量为31KD(SDS－PAGE法)，有相近两个亚基16KD和15KD组成，其N端15个氨基酸残基的测序A亚基：DCSSGWSSYEEHQYY，B亚基：DSSGWSSYEGHEYYV。HPLC为单峰。该酶最适温度为35℃，最适pH 7.5，等电点为5.39。用酸水解测得该酶有18或20种氨基酸组成。血浆凝结试验在60±5秒，同时可使纤原凝结。该酶在体内使全血凝固时间显著缩短，不造成血栓形成，用于预防临床手术出血、治疗外伤出血、全身和局部止血及诊断某些临床凝血时间。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医药和蛋白质酶学领域。具体的讲，其涉及一种从尖吻蝮蛇(Agkisdroton acutus)蛇毒中提取的一种具有止血活性的类凝血酶(Agacutin)的结构特征，纯化方法和医药领域方面的用途。该止血效应的类凝血酶(Agacutin)通过激活纤维蛋白原而加强凝血，同时因不激活II和XIII因子，不会引起血栓形成。在临床前研究中得出了高效极低毒性效果。
背景知识：
尖吻蝮蛇又称五步蛇或蕲蛇，分布在华南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性较低，无神经毒和激肽释放酶活性。在其组份中，有几种以纤维蛋白原为底物的酶在体外能使人血浆或牛纤原凝结，但在体内却引起各种不同的生理效应如降纤抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。F.Kornalic将以纤维蛋白原为底物的蛇毒酶按其作用方式不同分成三类：I类是类凝血酶(Thrombin-likeenzyme)或凝血蛋白酶(Thrombic protease)，它仅分解纤维蛋白原的α链和/或β链的N端肽链，释放A肽(α链)和/或B肽(β链)，使血液凝固。II类是纤维蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme)，它直接从纤维蛋白原三条肽链(α，β和γ)的C端水解，将纤原分解成碎片，血液不被凝固。III类是纤溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen)，它是纤维蛋白溶解的间接或直接激活剂，它通过激活纤溶酶原产生纤溶酶，来裂解纤维蛋白或纤维蛋白原。本发明属第I类。
尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组份，并经动物实验验证，它们均有不同程度抗凝作用。肖昌华等从1988年起和管锦华等从1992年起，多次偿试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离使动物凝血时间缩短的组份，但都因无法提纯，对其结构无法准确定性和定量，未成功。国外相似的产品有Hemocoagulase、Bothropase和Reptilase，Hemocoagulase它是Klobusitzky和Konig等1936年从Bothrops jararaca蛇毒中部分纯化的一个局部和非胃肠使用的安全止血剂，Bothropase由米兰Ravizzo公司从Bothrops jararaca蛇毒中提取，Reptilase由Basle Pentapharm公司从Bothrops atrox蛇毒中提取。这些产品仅有立止血(Reptilase)的品种在国内由深圳建安医药公司代理销售。立止血疗效确切，付作用小，临床适应症广，优于其它止血药等特点，于1996年进入中国国家基本药物目录。
自从Reptilase进入中国以来，国内许多研究者都尝试寻找过类似的止血成分，如中科院上海生化所戚正武曾申请国家863计划，未找到。自1993年起，我们开始研究尖吻蝮蛇蛇毒中的类凝血酶组分。经三年的努力，在提取类凝血酶溶栓药-降纤酶的同时，我们获得了三个新的类凝血酶。以后的研究证实，其中之一具有止血活性，并取名Agacutin。目前由山东北大高科华泰制药有限公司生产和辽宁诺康医药有限公司总代理的注射用巴曲亭(立止血的国内产品)和邦停(仿立止血)，于2001年被SFDA批准上市。
发明内容：
1 本发明的类凝血酶(Agacutin)作用方式与Reptilase相似，它通过切除纤原分子中的酸性A肽，能使人血浆和牛纤维蛋白原在体外凝固，因不激活XIII和II因子，产生可溶性非交联纤维蛋白单体，在伤口处，该单体与其它凝血因子相互作用加速止血效应，在完整血管内，该单体有几分钟半衰期，可迅速被纤溶酶降解清除。该类凝血酶(Agacutin)在体外使柠檬酸化血浆凝固，在体内可使出凝血时间显著缩短，同时又不造成血栓形成，达到伤口部位的止血或预防出血之目的。
2本发明的目的是提供具有预防临床手术出血、治疗外伤出血及全身和局部止血效应的尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)，确定其准确的物理化学性质、结构特征和药学效果。
3本发明的目的是提供该尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)的两条肽链的N端15个氨基酸残基序列，用于与其它类凝血酶的结构区别。
4本发明的目的是提供该尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)的止血活性不受肝素的影响，故可发展成诊断试剂，用于临床测定某些使用肝素患者的出、凝血时间。
5本发明的目的还在于提供纯化具有止血效应的尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)的方法，尤其是纯化工艺的全面布局和层析条件。
6一种具有防治出血的蛇毒类凝血酶(Agacutin)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法测得其全分子量为31KDa，有相近两个亚基组成，亚基分子量16Da和15Da(见图2B)，该酶最适温度为35℃(见图4A))，最适pH7.5(见图4B)，等电点为5.39(见图5A&B)，根据文献和我们的试验结果证实，该类凝血酶(Agacutin)结构与立止血完全不同。
7用反相液相色谱法(C-18柱)测该类凝血酶(Agacutin)氨基酸组成为(％)：Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93和NH32.68(NH3的含量代表Gln和/或Asn的量)。
8该止血效应的蛇毒类凝血酶(Agacutin)的纯化方法，包括尖吻蝮蛇蛇毒的溶解，Sephedex G75凝胶过滤，两次DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换和透析构成。其特征在于：该蛇毒类凝血酶(Agacutin)采用DEAE-Sepharose FastFlow色谱填料进行快速纯化，流速40ml/min，流动相A：10mM磷酸盐缓冲液(pH6.9)，B液为含有0.065M氯化钠的A液，线性洗脱梯度0-0.065M的氯化钠。
9具体制备该酶的方法是：取验证了的尖吻蝮蛇蛇毒，加缓冲液溶解后离心，取上清液上Sephadaex G-75层析柱(见图1A)，活性峰上DEAE-Sepharose FastFlow层析柱(见图1B)，DEAE-Sepharose FF活性峰经透析后再上第二次DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(见图2A)，收集活性峰，即为纯品。
10纯化后的类凝血酶(Agacutin)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法测定的全分子量为31KD，有16KD和15KD两条多肽链组成(见图2B)。反相HPLC(C-4柱)(见图3B)和正相HPLC测定为单一峰(见图3A)，PAGE为单一带(见图3C)，在体外能使新鲜人血浆和牛纤原凝固。N端15个氨基酸残基的测序结果：A亚基：DCSSGWSSYEEHQYY；B亚基：DSSGWSSYEGHEYYV。
11 体内药效学验证：纯化后的尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)经新西兰白兔耳静脉和臀部肌注注射，实验采用三个剂量组[0.01，0.025，0.05(U/kg)]，结果均使全血凝固时间(表1)明显缩短，并使药效维持24小时。各实验剂量组静脉注射使血纤维蛋白原含量(表2)和血液粘度(表10)有不同程度的减少。对家兔凝血活酶时间(表3)、血小板数量(表4)和质量(表5&6)无明显影响。对优球蛋白凝固时间(表7)无影响，而对优球蛋白溶解时间(表8)，大剂量可时其缩短，中小剂量无明显影响。本品耳静脉注射10分钟内起效，30分钟达高峰，试验设立立止血阳性对照组和生理盐水阴性对照组，不论肌注还是静注，相同剂量的本品与立止血对照组比较，两者药效相近，但优于生理盐水组对照组。实验小鼠尾静脉剪断出血实验(表9)，该品(0.5、1.0、2.0U/Kg)腹腔注射，各剂量组小鼠尾静脉出血时间与生理盐水组和立止血组相比，均有不同程度的缩短，其中0.5u/kg剂量组与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。
12常用适用途径有肌肉注射，静脉注射，可局部或全身使用等。
13药效学见表1～8。
表1尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对新西兰兔全血凝固时问的影响(
n＝7)
| 组别(U/kg) | 药前 | 静注给药前后全血凝圃时间(分) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| Agacutin 0.05 | 590±258 | 382±83* | 294±203* | 368±120* | 369±133* | 286±163* | 479±122 | 540±145 |
| Agacutin 0.025 | 600±200 | 346±143* | 342±103* | 287±134* | 411±104* | 329±91* | 351±121* | 413±100* |
| Agacutin 0.01 | 593±189 | 377±113* | 412±244* | 425±150* | 293±249* | 345±214* | 455±165 | 580±179 |
| Reptilase 0.025 | 620±149 | 423±230* | 365±174* | 386±135* | 546±162* | 555±162 | 573±134 | 640±120 |
*P＜0.05给药前后的t检验
表2尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)新西兰白兔纤维蛋白原含量的影响(
n＝7)
| 组别(U/kg) | 药前 | 静注血纤维蛋白原浓度(mg/dl) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| Agacatin 0.05 | 256.0±32.1 | 188.0±21.6* | 186.2±20.9* | 174.3±27.2* | 178.1±23.7* | 209.9±19.9 | 254.2±20.2 | 412.5±23.0 |
| Agacutin 0.025 | 222.1±47.4 | 210.7±44.4 | 204.3±60.2 | 206.6±53.9 | 209.0±53.1 | 219.0±58.6 | 299.8±37.5 | 318.0±56.6 |
| Agacutin 0.01 | 254.0±56.1 | 247.3±55.7 | 213.7±107.0 | 249.0±57.7 | 218.2±42.9* | 221.8±83.7 | 316.5±33.4 | 370.7±43.3 |
| Reptilase 0.025 | 265.3±34.9 | 219.8±31.3* | 216.5±25.9* | 220.7±24.4* | 221.5±38.5* | 212.5±24.7* | 245.2±21.5 | 332.2±34.0 |
*P＜0.05，**P＜0.01给药前后的t检验
表3尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对新西兰白兔APTT的影响(
n＝7)
| 组荆(U/kg) | 药前 | 静注APTTs(Sec) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| Agacutin 0.05 | 66.10±17.9 | 77.40±21.7 | 76.57±25.9 | 67.58±17.9 | 81.98±15.7 | 60.43±8.6 | 62.03±15.6 | 68.35±15.7 |
| Agacutin 0.025 | 84.52±14.7 | 77.48±14.9 | 72.28±16.8 | 72.33±15.6 | 73.45±11.9 | 83.92±12.4 | 66.66±13.4 | 79.08±13.8 |
| Agacutin 0.01 | 75.35±15.2 | 76.20±16.4 | 78.70±19.1 | 72.68±13.4 | 56.03±17.0 | 56.95±14.0* | 62.35±11.5 | 60.87±14.4 |
| Reptilase 0.025 | 69.38±5.60 | 79.82±15.6 | 73.53±10.9 | 79.13+16.0 | 66.10±15.6 | 63.75±12.3 | 71.02±12.7 | 70.34±14.5 |
*P＜0.05，**P＜0.01给药前后的t检验
表4尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对血小板数量的影响(
n＝7)
| 组别 | 剂量/U·kg-1 | 血小板数量(×109·L-1) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| ControlAgacutinAgacutinAgacutinRetilase | ----0.050.0250.010.025 | 319±72272±78288±79339±88267±74 | 321±81260±68278±55335±84289±76 | 318±80226±46*255±60331±89306±81 | 237±90272±29233±13238±70269±62 | 303±77268±56257±50289±77281±70 | 288±86266±56268±47325±76278±69 | 301±67278±60278±66399±71270±80 |
*P＜0.05与生理盐水组相比
表5尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对血小板释放活性的影响(
n＝7)
| 组别 | 剂 量/U·kg-1 | 血小板TXB2(pg·ml-1) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| ControlAgacutinAgacutinAgacutinReptilase | ----0.050.0250.010.025 | 320±139307±259330±271420±239260±123 | 317±140329±266320±268389±245289±120 | 282±266474±124414±238395±212334±140 | 430±245362±272694±293626±227462±194 | 323±177368±159457±250479±277291±170 | 390±187365±286368±247428±276298±168 | 341±267380±160380±265400±271370±180 |
表6尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对血小板体外聚集率的影响(
n＝7)
| 组别 | 剂量/U·kg-1 | 血小板体外聚集率(％) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| ControlAgacutinAgacutinAgacutinReptilsae | ----0.050.0250.010.025 | 25.3±6.324.1±5.825.0±4.027.6±15.718.8±12.5 | 28.4±7.931.5±6.828.4±8.925.3±1326.7±10.8 | 45.6±18.036.5±21.327.4±10.721.5±11.228.1±11.3 | 41.3±28.823.6±5.939.6±9.627.3±13.738.0±12.1 | 32.3±16.536.9±9.426.7±6.324.0±7.129.7±7.1 | 38.5±18.235.0±9.336.0±6.527.6±6.428.0±11.0 | 34.9±7.337.0±16.037.8±8.328.8±7.526.5±10.1 |
*P＜0 05，**P＜0.01，***P＜0.001与生理盐水组相比
表7尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对优球蛋白凝固时间(ECT)的影响(
n＝7)
| 组别 | 剂 量(U·kg-1) | 优球蛋白凝固时间(ECT)(h) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| ControlAgacutinAgacutinAgacutinReptilase | ----0.050.0250.010.025 | 42±1154±2536±2429±1513±7** | 40±2354±2432±2330±1240±22 | 37±5753±4039±1731±839±13 | 36±4850±2120±1251±2637±17 | 39±4054±3336±2432±838±8 | 41±2451±3239±1637±1441±21 | 38±1651±1435±1033±839±14 |
**P＜0.01与生理盐水组相比
表8尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对优球蛋白溶解时间(ELT)的影响(
n＝7)
| 组别 | 剂量(U·kg-1) | 优球蛋白溶解时间(ELT)(min) | ||||||
| 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| ControlAgacutinAgacutinAgacutinReptilase | ----0.050.0250.010.025 | 246±8169±97134±7**85±28**211±86 | 235±6155±7*135±11*75±6**202±77 | 225±76156±4142±35*75±28**139±86 | 191±4151±4**235±8136±7**286±90* | 202±5160±6*168±12*121±6**233±46 | 198±14163±24*189±786±10**201±88 | 257±55178±6*246±35129±12**268±90 |
*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组相比
表9尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对小鼠剪尾出血时间的影响
| 组别 | 剂量(U/kg) | Administration | n | Bleeding time(min) |
| SalineAgacutinAgacutinAgacutinReptilase | ---0.51.02.00.5 | IPIPIPIPIP | 1010111210 | 34.11±11.1319.69±7.52**26.94±11.9825.95±18.0428.67±17.12 |
**P＜0.01，与生理盐水组相比
表10尖吻蝮蛇类凝血酶(Agacutin)对新西兰兔全血粘度(mPaS)的影响(
n＝7)
| 组别 | 剂量(U·kg-1) | 不同切变速的血粘度(mPaS)(200s/30s/5s/1s) | |||||||
| 药前 | 0.17h | 0.5h | 1h | 3h | 6h | 12h | 24h | ||
| AgacutinAgacutinAgacutinReptilase | 0.050.0250.010.025 | 3.0±1.0/4.1±1.4/9.1±4.2/17.5±7.32.8±1.0/3.9±1.4/7.4±2.7/18.2±6.72.8±0.6/3.7±0.5/7.0±0.8/16.8±1.62.8±0.3/3.9±0.4/7.4±0.8/18.2±2.5 | 2.8±1.3/3.5±0.4/7.7±3.3/15.2±4.22.6±1.0/4.1±1.7/8.1±3.5/21.0±9.82.6±0.3/3.7±0.5/6.8±1.5/18.6±2.62.1±0.3/3.6±0.4/6.8±1.3/15.9±2.9 | 2.5±0.2/3.9±1.8/8.6±4.2/17.5±7.82.7±1.1/3.9±1.6/7.9±3.8/20.7±112.7±0.4/3.4±0.4/5.7±1.1/13.3±4.72.6±0.3/3.0±0.4/5.8±0.6/14.6±1.7 | 2.7±1.3/3.8±2.0/8.2±4.2/17.7±111.9±0.2*/2.8±0.4/5.6±1.0/14.5±3.42.6±0.3/3.5±0.5/6.2±1.6/18.4±7.62.6±0.7/3.6±0.8/7.1±2.4/18.7±7.3 | 2.2±0.5*/3.3±0.6/8.2±5.4/16.4±3.72.1±0.6/3.0±0.8/6.2±2.0/14.4±3.92.2±0.2/3.1±0.3/5.9±0.5/14.8±1.72.4±0.9/3.4±1.3/6.1±2.2/14.6±5.0 | 2.4±0.7/3.5±0.9/8.2±2.6/18.2±4.71.8±0.4*/2.7±0.6/5.9±1.6/16.5±5.52.3±0.2/3.2±0.3/6.1±0.7/14.9±2.41.9±0.5*/2.8±0.6/5.3±0.8/13.3±1.2 | 2.0±0.4*/2.9±0.5/7.4±2.5/16.4±6.51.7±0.2*/2.7±0.6/5.8±2.6/16.3±112.1±0.2/3.1±0.7/6.7±2.4/18.4±9.21.9±0.4*/2.7±0.4/5.1±0.6/12.7±1.8 | 2.3±0.4*/3.3±0.5/6.4±0.8/16.0±1.91.9±0.2*/2.8±0.3/5.6±1.0/14.4±3.42.1±0.2/3.0±0.4/5.7±0.8/14.8±2.81.9±0.4*/2.7±0.5/5.0±0.8/12.3±2.0 |
*P＜0.05给药前后的t检验
附图说明：
图1A：粗毒的SephadexG-75凝胶色谱分离。实验条件：4.5×100cm色谱柱、0.01M浓度的磷酸盐缓冲液(pH6.9)洗脱液和6ml/min流速。B：对SephadexG-75洗脱2号活性峰的第一次DEAE-Sepharose FF离子交换分离。实验条件：梯度杯2000ml×2、平衡缓冲液0.01M磷酸液缓冲液(pH6.9)、0-0.065M NaCI线性梯度(pH6.9)、3×20cm色谱柱和15ml/min流速。
图2A：第二次DEAE-Sepharose FF柱色谱。实验条件：重复第一次DEAE-Sepharose FF线性洗脱条件。B：类凝学酶Agacutin的SDS-PAGE分析(T∶C＝12∶5.84)。Lane1和2∶10和20μg样品，Lane3：分子量标准蛋白(14.4-97.4kDa)。
图3A：类凝血酶(Agacutin)凝胶HPLC分析。实验条件：色谱柱(BIOSEPSEC-S2000，Pharmacia-LKB Co.，2.6×150mm)、0.2 M磷酸盐缓冲液(pH6.9)和1ml/min流速。B：类凝血酶(Agacutin)的反相HPLC分析。实验条件：C4柱(Hypersil C4，2.6×40mm)、1ml/min流速、0.1％三氟乙酸水溶液和乙晴梯度。C：类凝血酶(Agacutin)的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(T∶C＝7.5∶5.84)。Lane1和2∶10和20μg样品。
图4A：温度-活性曲线。B：pH-活性曲线。凝结实验条件：0.2ml人拘橼酸化血浆+0.2mlAgacutin酶溶液(0.2U)，37℃保温测活。
图5类凝血酶(Agacutin)的等电聚焦电泳。A：聚丙烯酰胺等电聚焦图。Lane1：标准等电点蛋白和Lane2：Agacutin酶。B：pH值与凝胶长度关系曲线。
具体实施方式：
1类凝血酶Agacutin.的纯化和活性：10g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(购自广西医科大学蛇毒研究所和昆明龙津药业有限公司)溶解在80ml 0.01M磷酸盐缓冲液中(pH 6.9)，6000rpm离心20min。上清液上Sephadex G-75凝胶柱(7×100cm层析柱)。洗脱用0.01M磷酸盐缓冲液(pH6.9)。收集的有效峰上DEAE-SepharoseFast Flow柱色谱(3×20cm层析柱)，洗脱条件用含有0-0.065M NaCI的磷酸盐缓冲液(pH6.9)洗脱，梯度杯2000ml×2。在有效峰经0.01M磷酸盐缓冲液(pH6.9)透析24h后，透析样再上DEAE-Sepharose FF柱，重复第一次DEAE-Sepharose FF柱色谱洗脱条件。将纯化的样品经Sephadex G-25柱脱盐和冻干后，实验完成。纯化过程见图1A&B和2B。纯度结果(见图3A、B&C)：凝胶正相和C-4反相HPLC为单一峰，PAGE电泳位但一条带。每支含1单位类凝血酶(1单位的类凝血酶Agacutin是指：在37℃保温条件下，使0.2ml人新鲜血浆在60±5秒凝结的酶量)。每支成品含1单位Agacutin和1％位分子右旋糖苷(购自中检所)。纯化过程总结如下表：
| 分离过程 | 总蛋白t(mg) | 总活性单位 | 比活(U/mg)** | 重量收率(％) |
| 粗毒蛇毒预处理G-751stDEAE-Sepharose F.F2stDEAE-Sepharose F.F.G-25 | 100009000471056010388 | --*--------1760±200 | ----------19.7±3.6 | 1009047.15.61.030.88 |
*中间体由于受其它类凝血酶活性的干扰，其活性和比活无法获得。
2结构特征：用以上制备工艺和活性的类凝血酶Agacutin测其亚基分子量(SDS-PAGE法)为16224Da和14736Da，全分子量30960Da；等点电5.39；最使温度35℃；最适pH7.5-8.0。N端15个氨基酸残基的测序：A亚基：DCSSGWSSYEEHQYY，B亚基：DSSGWSSYEGHEYYV。实验结果见图2-5。
3体内药效学研究：用以上工艺和结构特征的Agacutin制剂成品[1单位/瓶，冻干粉剂，内含1％微分子右旋糖酐敷料(敷料由中国药品鉴定所提供)]进行了新西兰白兔和小鼠体内进行了完整的药学评估。阳性对照品立止血(Reptilase)，批号770604，市售，1单位/瓶，瑞士巴塞尔素高大药厂生产。两种冻干粉针临用前用灭菌注射用水注入瓶，轻轻振摇，速溶。小白鼠，17-22g，雌雄兼有；新西兰白兔，2-3kg体重，雌雄兼有，由南方医科大学动物中心提供，由耳静脉给药，直接心脏取全血。实验结果见表1-8。
Claims (10)
1.一种防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutin)，其特征在于：其全分子量31KD，有16KD和15KD两条多肽链组成，等电点5.39。
2.根据权利要求1所述的止血类凝血酶，其特征在于N端15个氨基酸残基的测序A亚基：DCSSGWSSYEEHQYY；B亚基：DSSGWSSYEGHEYYV。
3.根据权利要求1和2所述的止血类凝血酶，其特征在于：氨基酸组成为(％)：Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH22.68。
4.根据权利要求1和2所述的止血类凝血酶，其特征在于：在体外，促进人枸橼酸化血浆凝固和能使牛纤维蛋白原凝固，在体内使凝血时间缩短。
5.一种防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的纯化方法：包括取验证了的尖吻蝮蛇蛇毒，加缓冲液溶解后离心，取上清液上Sephdaex G-75层析柱，活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，活性峰经透析后再上DEAE-SepharoseFast Flow层析柱，收集活性峰，即为纯品。
6.包括权利要求5所述的该类凝血酶的纯化方法，其特征在于：该蛇毒类凝血酶采用FPLC DEAE-Sepharose Fast Flow色谱填料进行纯化，流速40ml/min。流动相A：10mmol/L磷酸盐缓冲液PH6.9，B液为含有0.065mol/L氯化钠的A液。洗脱梯度呈线性0-0.065mol/L的氯化钠。
7.根据权利要求1和2所述的止血类凝血酶，其特征在于可预防临床手术出血，治疗外伤出血及全身和局部止血。
8.根据权利要求7所述的止血类凝血酶，其特征在于不仅可肌肉注射，还可静脉注射和静脉滴注，不仅全身，还可局部使用。
9.根据权利要求1和7所述的止血类凝血酶，其特征在于该酶分子对血液的凝固不受肝素的影响，故可以制成诊断试剂用于临床上测定某些使用肝素患者的出凝血时间。
10.据权利要求7和8所述的止血类凝血酶，其特征在于该酶分子可通过血脑屏障，治疗颅出血。
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