CN105440127A - 一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及血液制品制药领域，特别是涉及一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法。本发明提供一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法，包括如下步骤：1）组分III的溶解；2）加入沉淀剂并离心；3）病毒灭活；4）凝胶吸附；5）凝胶的洗涤和洗脱；6）浓缩与换液；7）FEIBA的生成。

Description

一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法

技术领域

本发明涉及血液制品制药领域，特别是涉及一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA(FactorEightinhibitorbypassingactivity)的制备方法。所述制备方法以人血浆Cohn法乙醇级分组分III为原料，制备获得了抗凝血因子抑制物的药物FEIBA。

背景技术

凝血因子的缺乏是导致血友病人止血障碍的根本原因。机体内源性凝血途径启动之后，活化的凝血因子九(FIXa)与其辅助因子凝血因子八(FVIII)结合，使得FIXa催化凝血因子十(FX)的活性增强了约100,000～1000,000倍，这是凝血系统产生大量的凝血酶(FIIa)从而迅速达到了止血的目的关键步骤之一。血友病人由于遗传缺陷，其体内的凝血因子往往活性不足或者缺失。对于A型血友病人，其缺乏的是FVIII，而B型血友病人则是FIX缺乏。无论是FVIII缺乏还是FIX缺乏，都将使得凝血系统的链式反应受到阻断而造成止血障碍，病人因此受到失血的危险。

通过药物替代疗法，即向病人体内输入所缺乏的凝血因子治疗血友病，已经取得了较为满意的疗效。目前，因凝血因子一般被制备成浓缩制剂，对血友病的治疗显得尤其方便和高效。但是，长期以来，对血友病人的治疗仍然面临着另外一个严重的问题，具体来说，病人体内会产生抑制凝血因子活性的抗体，即“抑制物”的产生。约有15％～25％的病人，在药物治疗的过程中，其体内会产生这种抗体。并且随着病情的发展，用药剂量的上升，抑制物的滴度也随之大幅提高。抑制物的产生降低或中和了药物替代疗法的效果，是血友病治疗过程中无法回避的严重问题。

长期以来，基本没有可靠有效的医疗手段能够针对性地治疗产生抑制物的病人，直到上个世纪70年代，人们发现，以人血浆制备的凝血酶原复合物能够比较有效地治疗产生抑制物的病人。通过深入研究，Baxter公司首先开发出部分活化的凝血酶原复合物的药物：“Autoplex”和“FEIBA”。这两种药物的上市，使得产生抑制物的血友病人第一次有了可靠的治疗手段。其后，在上世纪80年代，在对FEIBA药物作用机理的研究基础上，NovoNordiskA/S又推出了药物"NovoSeven"，即活化的凝血因子VII，用以治疗产生FVIII或FIX抑制物，或者其他出血紊乱的症状。

对于FEIBA(FactorEightinhibitorbypassingactivity)的产生和治疗机理，研究者进行了深入研究并取得了很大进展，但至今还没有最终的结论。一般认为FEIBA具有矫正凝血系统的作用，即FEIBA具有在FVIII或FIX缺乏的情况下，矫正凝血系统，使之发挥正常的凝血功能。此外，研究者对FEIBA的各种生成工艺方法也进行了大量研究并有报道。USPATENT4260025报道，以新鲜血浆或冷沉淀上清为原料，在无钙离子的条件下，加入硅胶或高岭土等无机物混合并经过低温透析过程后可制得FEIBA。通过离子交换的方式，FEIBA和其他维生素K依赖蛋白一起被富集回收。专利还对FEIBA的计量单位进行了规定，一个单位的FEIBA：能够缩短高滴度FVIII抑制物血浆的APTT至空白值的一半的FEIBA的量。根据其研究结果，作者认为FEIBA可能是一种不同于凝血因子II，VII,FIX,X的物质，分子量在10KD大小。另外一篇专利US4364861发现，将组分I上清与阴离子树脂混合，在一定的条件下洗涤洗脱后，添加或者不添加钙离子进行孵育，也能够大量产生FEIBA，并且不产生过量的凝血酶。作者还认为FEIBA可能是几种凝血因子的复合物。专利US4459288则以血浆组分VI-1为原料，以磷酸钙吸附后洗脱，然后以硅胶进行活化，最后以PEG进行沉淀富集得到FEIBA制品，其凝血酶的含量小于0.003unit/ml，同时还添加了不高于1.5units/ml肝素。大量的研究工作显示，FEIBA与凝血酶原复合物中的II，VII,FIX,X等凝血因子密切相关，很可能是多种凝血因子的活化或酶原的复合物，其矫正凝血系统的功能尚待人们进一步的研究阐明。

虽然有研究者声称，富含维生素K依赖蛋白的Cohn组分I+II+III,I,IIIII,III-0,IV-1和IV-4等均有可能作为制备FEIBA的原料，但目前仅有组分I上清和IV-1为原料成功制备出FEIBA的报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法，包括如下步骤：

1)组分III的溶解：将人血浆Cohn组分III加入柠檬酸钠和氯化钠的水溶液中，搅拌溶解并调节pH至7.0～7.5；

具体的，所述人血浆Cohn组分III的制备方法可参照JAMChemSoc,1946；68:459，JAMChemSoc,1949；71:541。

在本发明一实施例中，所述人血浆Cohn组分III为血浆Cohn6+9改良法制备获得的人血浆Cohn组分III。

所述人血浆Cohn组分III，更具体为血浆Cohn6+9改良法制备获得的人血浆Cohn组分III的制备方法具体可参照JAMChemSoc,1946；68:459，JAMChemSoc,1949；71:541。

所述柠檬酸钠和氯化钠的水溶液具体指该水溶液中同时包括柠檬酸钠和氯化钠两种溶质。

优选的，所述步骤1中，人血浆Cohn组分III与柠檬酸钠和氯化钠的水溶液的重量比为1：4～5。

优选的，所述步骤1中，柠檬酸钠和氯化钠的水溶液中，柠檬酸钠的浓度为0.01～0.02mol/L，氯化钠的浓度为0.05～0.15mol/L。

优选的，所述步骤1中，调节pH时使用NaHCO₃水溶液和/或NaOH水溶液和/或HCl水溶液进行调节。

所述步骤1中，本领域技术人员可根据实际情况选择合适种类和浓度的溶剂对溶液的pH值进行调节，在本发明一实施例中，使用NaHCO₃水溶液、NaOH水溶液、HCl水溶液等进行pH值的调节。

优选的，所述步骤1中，在2～26℃下将人血浆Cohn组分III加入柠檬酸钠和氯化钠的水溶液中。

2)加入沉淀剂并离心：向步骤1所得混合液中加入沉淀剂，至终浓度为4.8～5.2wt％，在1～4℃下搅拌20～40分钟，再在1～4℃条件下将悬浮液进行离心，分离出上清液；

所述沉淀剂能够促进蛋白分子聚集。

优选的，所述步骤2中，沉淀剂选自PEG4000、PEG2000、PEG3350等中的一种或多种的组合。

更优选的，所述步骤2中，沉淀剂为PEG4000的水溶液。

所述步骤2中，本领域技术人员可根据实际情况调整PEG4000水溶液的浓度，在本发明一实施例中，所述PEG4000水溶液的浓度为39-41wt％。

3)病毒灭活：将步骤2所得上清液澄清处理后进行病毒灭活；

优选的，所述步骤3中，所述澄清处理具体为经过滤膜过滤。

优选的，所述步骤3中，病毒灭活的具体方法为S/D法病毒灭活。

本领域技术人员可选择合适孔径的滤膜对病毒灭活前的处理液进行澄清处理，在本发明一实施例中，上清液经过0.45um～0.22um滤膜过滤，以对S/D病毒灭活前的处理液进行澄清处理。

本领域技术人员可选择适当的S/D法病毒灭活条件进行灭活，在本发明一实施例中，所述S/D法病毒灭活的条件为：TNBP0.3wt％+Tween-801wt％，室温，5-6小时。上述条件具体指在反应体系中添加TNBP和Tween80至终浓度分别为0.3％和1％，并在室温，保温5-6小时进行SD病毒灭活。

4)凝胶吸附：在步骤3所得混合液中加入凝胶，充分搅拌后过滤收集凝胶；

优选的，所述步骤4中，所述凝胶为阴离子交换凝胶，具体为带阴离子基团的凝胶介质。

更优选的，所述步骤4中，所述凝胶选自DEAESephadexA50凝胶、DEAESepharoseFF凝胶、QSepharoseFF凝胶、QSepharoseXL凝胶、CaptoDEAE凝胶、CaptoQ凝胶、Q凝胶、EMDTMAE凝胶、EMDDEAE凝胶等中的一种或多种的组合，进一步优选为预洗后的凝胶，本领域技术人员可根据凝胶的种类确定凝胶的预洗方法，一般在凝胶产品说明书中均记载有推荐的凝胶预洗方法。

所述步骤4中，本领域技术人员可根据经验确定凝胶的加入量和加入凝胶以后的搅拌时间，在本发明一实施例中，优选的凝胶加入量为0.5～1.5g/L，搅拌时间为0.5～1.0小时。

5)凝胶的洗涤和洗脱：先分别以0.1～0.2mol/L的碳酸氢铵水溶液、0.2～0.4mol/L的碳酸氢铵水溶液、0.1～0.3mol/L的氯化钠水溶液对步骤4所得凝胶进行洗涤，再以1.0～2.0mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，收集洗脱液；

优选的，所述步骤5中，各洗涤步骤中，所用的洗涤液的体积约为步骤3S/D法病毒灭活后上清液的1/10～1/20；洗脱步骤中，所用的洗脱液的体积约为步骤3S/D法病毒灭活后上清液的1/10～1/20。

所述步骤5中，各洗涤步骤可充分去除凝胶上的FEIBA生成抑制因子，但又不至将凝血因子洗脱下来。

6)浓缩与换液：将步骤5所得的洗脱液进行浓缩，并进行缓冲液置换；

优选的，所述步骤6中，浓缩的方法为：采用5KD～20KD的超滤膜进行浓缩。

优选的，所述步骤6中，将洗脱液浓缩至紫外光谱吸收值A280nm＝40～80。

优选的，所述缓冲液置换为恒体积缓冲液置换。在本发明一实施例中，所述恒体积缓冲液置换具体指缓冲液置换后溶液的体积与步骤5所得的洗脱液进行浓缩后的体积相同。

优选的，所述缓冲液置换中所使用的缓冲液为0.05～0.2mol/LTris-HCl、0.1～0.2mol/L氯化钠水溶液，pH7.0～8.0。

所述0.05～0.2mol/LTris-HCl、0.1～0.2mol/L氯化钠水溶液具体指该水溶液中同时包括Tris-HCl和氯化钠。

7)FEIBA的生成：将步骤6所得产物置于4℃～15℃静置10～30小时，孵育生成FEIBA。

优选的，所述步骤7中，将步骤6所得产物置于8℃～12℃下。

优选的，所述步骤7中，静置20～30小时。

优选的，所述步骤7中，在步骤6所得产物中加入钙离子，再进行静置过程，静置生成FEIBA后再加入金属离子螯合剂，去除游离钙离子。

更优选的，加入钙离子至反应体系中钙离子浓度为0.1～1mmol/L。

本领域技术人员可选择合适的方法调整体系中钙离子的浓度，并在反应后通过适当的方式去除游离钙离子。在本发明一实施例中，通过在体系中添加氯化钙的方法调整钙离子的浓度，并在反应后通过金属离子螯合的方法去除游离钙离子。

更优选的，所述金属螯合剂选自ChelaxR100、EDTA、柠檬酸钠、酒石酸、氨基三乙酸等中的一种或多种的组合。

检测步骤7所得产物的FEIBA含量以及凝血酶的含量，可知反应产物中的FEIBA活性大于60U/ml，凝血酶含量低于0.003IU/ml。

本领域技术人员可选择合适的方法对步骤7所得产物进行后处理，具体举例来说，对步骤七的产物，后期可以选择采用20nm膜对产物进行二次除病毒步骤；或为了增加产品的安全边际，可向产物中添加终浓度为0.5U～1.5U/ml的肝素；也可以根据步骤7的检测结果，采用超滤浓缩或者稀释的方法，对产物进行浓度调整；也可以同时向产物中添加或者以超滤换液的方式，添加适当浓度的甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，组氨酸，等蛋白保护剂，以及山梨醇，甘露醇，海藻糖等冻干赋形剂，用于后期冻干；也可以在冻干结束后，采用干热除病毒的方法，比如100℃、30min，对产物进行二次除病毒步骤。

上述所例举的一些后处理工艺都是现有技术中已经被本领域技术人员熟练使用的常规性工艺方法，本领域技术人员可根据实际需要，选择合适的工艺方法对步骤7所得产物进行进一步处理。此外，如研究背景所述，FEIBA的具体成分在目前并无确切定论，可以确定的是，FEIBA包含多种凝血因子成分，可能是多种凝血因子活化或者非活化的复合物，通过FEIBA特定的生理功能设计的检测方法，可以对某种工艺生成的FEIBA进行检测，也可以对其含量进行标定。

本发明进一步提供所述以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法在FEIBA制备领域的用途。

本发明发明人结合以往FEIBA研制经验，以血浆Cohn6+9改良法制备的组分III为原料制备获得FEIBA。人血浆Cohn组分III富含维生素K依赖的凝血因子，是制备凝血酶原复合物的传统原料之一。目前大多数血制品公司的凝血酶原复合物的实际生产工艺，以组分I上清为原料实际生产凝血酶原复合物并不多见。原因在于，在组分I上清中加入必要的离子交换凝胶，将导致原下游整体工艺面临重大改变，对血制品企业的主导产品得率也将造成不利的影响。因此选择组分I为原料进行凝血酶原复合物的生产，对血制品企业并无吸引力。因此，如果以组分I上清为原料生产FEIBA产品，将面临同样的问题，要么损失这一部分组分，要么申请对工艺参数变更进行备案，并且面临主导产品得率的下降的结果。而以组分III为原料生产FEIBA，则不会遇到这个难题。因为，在工艺路线上，这既不影响以组分III生产人凝血酶原复合物的工艺，也不会改变其他血制品产品的生产工艺，对企业来讲，能够更加有效的利用组分III。利用本发明提供的FEIBA研制工艺，能够得到较高FEIBA活性的产品，而凝血酶含量非常微弱。这对开发FEIBA大规模制备工艺，节约血浆资源，提高血液制品的综合利用率，以及满足血友病人的用药需求有现实意义。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

本发明实施例中所使用的检测方法如下：

1)微量凝血酶的定量检测：

微量凝血酶的定量检测是本发明实施的重要基础。不同于大剂量凝血酶的检测，本发明需要面临的检测问题是对微量凝血酶活性的检测。一些对微量凝血酶的检测方法并不适合本发明，如凝血酶特异性的发色底物法等。本发明实施例中采用了一种微量凝血酶的检测方法，其检测的凝血酶含量的下限可达0.0075IU/ml，甚至更低，具体方法如下：

1、注射用水复溶凝血酶国家标准品(GB20021105，5IU/via)后，以稀释液(0.7wt％柠檬酸钠+0.7wt％NaCl的水溶液)进行倍比稀释，得到2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031、0.015和0.0075IU/ml梯度浓度的凝血酶溶液。

2、以注射用水复溶人纤维蛋白原制品(FNG)，如上海RAAS公司生产的HFNG(201202H2A0)，再以步骤1的稀释液(0.7wt％柠檬酸钠+0.7wt％NaCl的水溶液)进一步稀释成5mg/ml～15mg/ml浓度的FNG溶液，实施例中所使用的FNG溶液的浓度为10mg/ml。

3、在37℃温育下，将待测样品以及不同浓度的上述梯度浓度的凝血酶溶液分别与FNG溶液混合(待测样品与各梯度浓度的凝血酶溶液的体积相同)，观察并记录凝固反应时间。

4、对浓度和凝固反应时间取双对数线性回归，得到凝血酶反应标准曲线，通过标准曲线及样品的凝固反应时间，可以计算得到样品的浓度。

2)FEIBA活性的检测

目前FEIBA活性检测的标准方法是，通过APTT方式，检测样品与标准高滴度FVIII抑制物血浆的凝固时间来计算其FEIBA活性含量。一个单位的FEIBA的定义是，能够缩短高滴度FVIII抑制物参照品血浆的APTT至空白值的一半的FEIBA的量。实验显示，FEIBA同样也能够缩短乏FVIII基质血浆的空白APTT值。本发明采用英国国家生物标准和控制研究所(NIBSC)提供的FEIBA标准品，通过实验验证，一个单位的FEIBA缩短乏FVIII基质血浆空白APTT的值，基本是乏FVIII基质血浆空白APTT的一半。据此制作的FEIBA标准品APTT标准曲线，其APTT值与FEIBA含量高度相关。本发明采用乏FVIII基质血浆代替高滴度抑制物血浆进行体外FEIBA含量测定，对监视FEIBA的生成工艺中其含量的变化非常有效(在此需要说明的是，本发明仅提供对FEIBA含量进行监测的方法，对FEIBA含量的精确测定仍需要采用标准FVIII抑制物标准血浆)。本发明对FEIBA活性的检测步骤如下：

1、仪器为Stago全自动血凝仪，选择APTT模式及配套试剂。FEIBA工作标准品是NIBSC的第二代FEIBA工作标准品，为24.1U/via。稀释缓冲液：0.06MTris-HCl+0.09M氯化钠，pH7.40±0.05，使用时加入终浓度为0.5％的HSA。

2、复溶FEIBA参考品后，以稀释液(0.06MTris-HCl+0.09M氯化钠，pH7.40±0.05，使用时加入终浓度为0.5％的HSA)进行梯度稀释，目标浓度如下：5.02.51.250.6250.31250.1563UFEIBA/ml。

3、将标准品或样品放入仪器中，启用APTT模式进行凝固反应，记录各个凝固时间。

4、对参考品的凝固时间和浓度分别取对数，绘制标准曲线，样品FEIBA的浓度可由样品的凝固反应时间对应标准曲线计算得出。

3)凝血因子的含量检测

利用Stago全自动血凝仪及配套的试剂，可以对样品中的II，VII，IX，X因子分别检测，计算其含量。

4)样品浓度的检测

利用岛津UV-1800，调整波长至280，可以测定样品在280nm的吸收值(A280)。

实施例1

由组分III制备FEIBA生成原料

1、称取血浆Cohn组分III沉淀3kg，按照1:4的比例，投入到12kg的复溶缓冲液中(缓冲液为0.01M的柠檬酸钠+0.1M的氯化钠水溶液，pH7.5)。在25±1℃的温度环境下搅拌，以1.0M的碳酸氢钠水溶液调整pH至7.0～7.5，继续搅拌至沉淀完全溶解。

2、向上述组分III复溶液中添加PEG4000水溶液(40wt％)至终浓度为5％，并降低温度至1～4℃，继续搅拌30分钟，此时溶液PH约为7.0～7.4。

3、将组分III复溶液进行低温离心分离沉淀和上清。离心转速约10000g，在1～4℃的温度下离心10分钟。收集离心后上清液，以0.45um滤膜进行澄清过滤。收集滤出液，称重得到约15kg的过滤澄清液。向其中添加TNBP和Tween80至终浓度分别为0.3％和1％，并在25℃保温6小时进行S/D病毒灭活。此S/D后料液可用于后续FEIBA制备。

4、利用stago全自动血凝仪对上步SD料液中的II，VII，IX，X凝血因子以及凝血酶活性进行检测，并检测料液280nm吸收值(A280)。测量结果如表1所列：

表1

N.D：NoneDetected(未检出)

实施例2

1、将酸碱处理好的并经过121℃高温灭菌后的A50凝胶浸入pH7.5，0.075M氯化钠+0.1M柠檬酸钠的水溶液中平衡。按1g/L的比例量取平衡好的A50凝胶，投入到实施例1制备的2Kg料液中去。

2、搅拌吸附1小时后，过滤收集凝胶，用pH7.5，0.1M氯化钠+0.01M柠檬酸钠水溶液连续洗涤三次，弃滤出液。最后以pH7.5，1M氯化钠+0.01M柠檬酸钠水溶液洗脱，收集洗脱液。此步骤操作均在常温下进行。

3、取40ml洗脱液，以10KD超滤离心管，在5000g，4℃条件下进行超滤浓缩换液至9.3ml，置换缓冲液为0.05MTris-Hcl，0.15MNaCl，pH7.0，A280为54.8。

4、将步骤3的浓缩液静置于12℃环境下，孵育27小时后，检测样品的FEIBA生成情况，并检测凝血酶(TB)含量，结果如表2：

表2

实施例2的特点在于，洗涤阶段通过氯化钠溶液洗涤A50凝胶，孵育产生了较多的凝血酶。而高浓度的凝血酶输入对人体会产生致命的危险。氯化钠溶液的洗涤可能在去除杂蛋白的同时，将一些抑制凝血酶原活化的因子洗涤出A50凝胶，导致洗脱液在后续的孵育过程中凝血酶原容易被激活。在检测FEIBA活性过程中，如果样品TB含量大于0.5IU/ml，FEIBA活性检测会受到非常大的干扰，测量值表现虚高而失去意义，因此表2未对实施例2样品的FEIBA含量进行测定。实施例2仅作为实施例3中洗涤步骤效果的对比。

实施例3

1、取实施例1制备的2kgS/D后料液，按1g/L的比例，将预处理好的A50凝胶投入其中，常温搅拌1小时，过滤收集凝胶。

2、分别对步骤1的凝胶以pH7.6的0.1mol/LNH₄HCO₃水溶液洗涤约200ml，PH7.6的0.2mol/LNH₄HCO₃水溶液洗涤约150ml，以及0.15mol/L的NaCl水溶液洗涤约200ml，弃滤出液。最后以1mol/L的NaCl水溶液洗脱凝胶所吸附的蛋白，收集得到约150ml洗脱液。

3、在4℃条件下，以置换缓冲液(pH7.0，0.05MTris-HCl+0.15MNaCl的水溶液)进行超滤浓缩换液，超滤膜孔径为10KD。最终150ml洗脱液浓缩到约30ml。

4、取一部分浓缩液置于12℃环境下，孵育27小时后，检测样品的FEIBA生成情况，并检测凝血酶含量，结果如表3-A：

表3-A

N.D：NoneDetected(未检出)

5、另取一部分浓缩液，加入氯化钙至终浓度0.2mM，同样置于12℃环境下，孵育27小时，按10％(W/V)的比例加入介质。搅拌30min去除游离钙离子后，以0.45um滤膜过滤去除此介质。检测孵育液中FEIBA的生成情况，如表3-B：

表3-B

N.D：NoneDetected(未检出)

实施例3的特点是，通过一定浓度的碳酸氢铵溶液对吸附凝血因子的A50凝胶进行了两次洗涤，所得到的洗脱液经过浓缩与孵育，产生的凝血酶低于本发明采用的微量凝血酶检测方法的下限而无法检出。即使添加钙离子进行孵育后，也完全检测不到凝血酶的含量。因此实施例3所采用的工艺条件，既能够大量生成FEIBA(大于70U/ml)，又能够在FEIBA生成过程中，有效的控制凝血酶原的活化。

实施例4

由组分III制备FEIBA

1、称取血浆Cohn组分III沉淀3kg，按照1:5的比例，投入到15kg的复溶缓冲液中(缓冲液为0.02M的柠檬酸钠+0.05M的氯化钠水溶液，pH7.5)。在5±1℃的温度环境下搅拌，以1.0M的碳酸氢钠水溶液调整pH至7.0～7.5，继续搅拌至沉淀完全溶解。

2、向上述组分III复溶液中添加PEG4000水溶液(40wt％)至终浓度为4.8％，并降低温度至1～4℃，继续搅拌30分钟，此时溶液PH约为7.0～7.4。

3、将组分III复溶液进行低温离心分离沉淀和上清。离心转速约10000g，在1～4℃的温度下离心10分钟。收集离心后上清液，以0.22um滤膜进行澄清过滤。收集滤出液，称重得到约18kg的过滤澄清液。向其中添加TNBP和Tween80至终浓度分别为0.3％和1％，并在25℃保温5小时进行S/D病毒灭活。

4、取步骤3制备的2kgS/D后料液，按1g/L的比例，将预处理好的DEAESephadexA50凝胶投入其中，常温搅拌1小时，过滤收集凝胶。

5、分别对步骤4所得的凝胶以pH7.6的0.1mol/LNH₄HCO₃水溶液洗涤约200ml，pH7.6的0.3mol/LNH₄HCO₃水溶液洗涤约150ml，以及0.1mol/L的NaCl水溶液洗涤约200ml，弃滤出液。最后以2mol/L的NaCl水溶液洗脱凝胶所吸附的蛋白，收集得到约150ml洗脱液。

6、在4℃条件下，以置换缓冲液(pH7.0，0.2MTris-HCl+0.1MNaCl的水溶液)进行超滤浓缩换液，超滤膜孔径为20KD。最终150ml洗脱液浓缩到约30ml。

7、取一部分浓缩液置于8℃环境下，孵育30小时后，检测样品的FEIBA生成情况，并检测凝血酶含量，FEIBA活性和TB含量与实施例3第四部分中制备获得的样品相近。

8、另取一部分浓缩液，加入氯化钙至终浓度0.5mM，同样置于8℃环境下，孵育24小时，按10％(W/V)的比例加入柠檬酸钠。搅拌30min后去除游离钙离子的螯合物。检测孵育液中FEIBA的生成情况，并检测凝血酶含量，FEIBA活性和TB含量与实施例3第五部分中制备获得的样品相近。

实施例5

由组分III制备FEIBA

1、称取血浆Cohn组分III沉淀3kg，按照1:5的比例，投入到15kg的复溶缓冲液中(缓冲液为0.01M的柠檬酸钠+0.15M的氯化钠水溶液，pH7.5)。在10±1℃的温度环境下搅拌，以1.0M的碳酸氢钠水溶液调整pH至7.0～7.5，继续搅拌至沉淀完全溶解。

2、向上述组分III复溶液中添加PEG4000水溶液(40wt％)至终浓度为5.2％，并降低温度至1～4℃，继续搅拌30分钟，此时溶液PH约为7.0～7.4。

3、将组分III复溶液进行低温离心分离沉淀和上清。离心转速约10000g，在1～4℃的温度下离心10分钟。收集离心后上清液，以0.45um滤膜进行澄清过滤。收集滤出液，称重得到约18kg的过滤澄清液。向其中添加TNBP和Tween80至终浓度分别为0.3％和1％，并在25℃保温6小时进行S/D病毒灭活。

4、取步骤3制备的2kgS/D后料液，按1g/L的比例，将预处理好的DEAESepharoseA50凝胶投入其中，常温搅拌1小时，过滤收集凝胶。

5、分别对步骤4所得的凝胶以pH7.6的0.2mol/LNH₄HCO₃水溶液洗涤约200ml，pH7.6的0.4mol/LNH₄HCO₃水溶液洗涤约150ml，以及0.3mol/L的NaCl水溶液洗涤约200ml，弃滤出液。最后以1mol/L的NaCl水溶液洗脱凝胶所吸附的蛋白，收集得到约150ml洗脱液。

6、在4℃条件下，以置换缓冲液(pH7.0，0.05MTris-HCl+0.2MNaCl的水溶液)进行超滤浓缩换液，超滤膜孔径为5KD。最终150ml洗脱液浓缩到约30ml。

7、取一部分浓缩液置于12℃环境下，孵育20小时后，检测样品的FEIBA生成情况，并检测凝血酶含量，FEIBA活性和TB含量与实施例3第四部分中制备获得的样品相近。

8、另取一部分浓缩液，加入氯化钙至终浓度0.2mM，同样置于12℃环境下，孵育27小时，按10％(W/V)的比例EDTA。搅拌30min后去除游离钙离子的螯合物。检测孵育液中FEIBA的生成情况，并检测凝血酶含量，FEIBA活性和TB含量与实施例3第五部分中制备获得的样品相近。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法，包括如下步骤：

1)组分III的溶解：将人血浆Cohn组分III加入柠檬酸钠和氯化钠的水溶液中，搅拌溶解并调节pH至7.0～7.5；

2)加入沉淀剂并离心：向步骤1所得混合液中加入沉淀剂，至终浓度为4.8～5.2wt％，在1～4℃下搅拌20～40分钟，再在1℃～4℃条件下将悬浮液进行离心，分离出上清液；

3)病毒灭活：将步骤2所得上清液澄清处理后进行病毒灭活；

4)凝胶吸附：在步骤3所得混合液中加入凝胶，充分搅拌后过滤收集凝胶；

5)凝胶的洗涤和洗脱：先分别以0.1～0.2mol/L的碳酸氢铵水溶液、0.2～0.4mol/L的碳酸氢铵水溶液、0.1～0.3mol/L的氯化钠水溶液对步骤4所得凝胶进行洗涤，再以1.0～2.0mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，收集洗脱液；

6)浓缩与换液：将步骤5所得的洗脱液进行浓缩，并进行缓冲液置换；

7)FEIBA的生成：将步骤6所得产物置于4℃～15℃静置10～30小时，生成FEIBA。

2.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述人血浆Cohn组分III为血浆Cohn6+9改良法制备获得的人血浆Cohn组分III。

3.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，柠檬酸钠和氯化钠的水溶液中，柠檬酸钠的浓度为0.01～0.02mol/L，氯化钠的浓度为0.05～0.15mol/L；

和/或，所述步骤1中，调节pH时使用NaHCO₃水溶液和/或NaOH水溶液和/或HCl水溶液进行调节；

和/或，所述步骤1中，在2～26℃下将人血浆Cohn组分III加入柠檬酸钠和氯化钠的水溶液中；

和/或，所述步骤1中，人血浆Cohn组分III与柠檬酸钠和氯化钠的水溶液的重量比为1：4～5。

4.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，沉淀剂选自PEG4000、PEG2000、PEG3350等中的一种或多种的组合；

和/或，所述步骤2中，沉淀剂为PEG4000的水溶液。

5.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述澄清处理具体为经过滤膜过滤；

和/或，所述步骤3中，病毒灭活的具体方法为S/D法病毒灭活。

6.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述凝胶为阴离子交换凝胶；

和/或，所述凝胶选自DEAESephadexA50凝胶、DEAESepharoseFF凝胶、QSepharoseFF凝胶、QSepharoseXL凝胶、CaptoDEAE凝胶、CaptoQ凝胶、Q凝胶、EMDTMAE凝胶、EMDDEAE凝胶等中的一种或多种的组合；

和/或，所述凝胶为预洗后的凝胶；

和/或，所述凝胶加入量为0.5～1.5g/L，搅拌时间为0.5～1.0小时。

7.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述步骤5中，各洗涤步骤中，所用的洗涤液的体积约为步骤3S/D法病毒灭活后上清液的1/10～1/20；洗脱步骤中，所用的洗脱液的体积约为步骤3S/D法病毒灭活后上清液的1/10～1/20。

8.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述步骤6中，浓缩的方法为：采用5KD～20KD的超滤膜进行浓缩；

和/或，所述步骤6中，将洗脱液浓缩至紫外光谱吸收值A280nm＝40～80；

和/或，所述缓冲液置换为恒体积缓冲液置换；

和/或，所述缓冲液置换中所使用的缓冲液为0.05～0.2mol/LTris-HCl、0.1～0.2mol/L氯化钠水溶液，pH7.0～8.0。

9.如权利要求1所述的FEIBA的制备方法，其特征在于，所述步骤7中，将步骤6所得产物置于8℃～12℃下；

和/或，所述步骤7中，静置20～30小时；

和/或，所述步骤7中，在步骤6所得产物中加入钙离子，再进行静置过程，静置生成FEIBA后再加入金属离子螯合剂，去除游离钙离子；加入钙离子至反应体系中时，钙离子的浓度优选为0.1～1mmol/L；所述金属螯合剂优选为ChelaxR100、EDTA、柠檬酸钠、酒石酸、氨基三乙酸等中的一种或多种的组合。