CN107929719A - 一种冻干人血浆活化凝血因子vii浓制剂的大规模生产制备方法 - Google Patents
一种冻干人血浆活化凝血因子vii浓制剂的大规模生产制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，它包括有以下工艺步骤：以人血浆低温乙醇分步分离法得到的组分III为原料进行溶解、PEG沉淀纯化、表面活性剂/清洁剂（S/D）病毒灭活、阴离子交换树脂吸附层析纯化、超滤脱盐、特定途径孵育活性物质——活化凝血因子VII、除菌过滤分装、冻干、100℃30分钟干热灭活病毒。本发明采用了特定途径孵育活化凝血因子VII并经过S/D、100℃30分钟干热两步病毒灭活方法，填补了国内无此类产品生产的空白，且本制品在临床使用中更加安全有效。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药血液制品领域，特别是涉及以人血浆低温乙醇分步分离法得到的组分III为原料进行冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法。
背景技术
目前，血友病患者的治疗面临着一个严重的问题，有超过20%的患者长期输注凝血因子类药品后，对凝血因子VIII或凝血因子FIX产生自身免疫抗体，也就是产生凝血因子抑制物。抑制物的出现加剧了治疗的挑战性，这类血友病患者出现并发症的风险也较正常为高。
上世纪70年代临床治疗发现，以人血浆制备的凝血酶原复合物（PCC）能够治疗产生抑制物的患者。随后Baxter公司开发出治疗该类患者的药物：Autoplex® 和FEIBA®，，这二种药物的上市，使得产生抑制物的血友病患者第一次有了可靠治疗手段。在上世纪80年代，Novo NordiskA/S推出了重组活化的凝血第七因子rFVIIa，用以治疗产生凝血因子VIII或凝血因子FIX 抑制物或者其他难治性出血和出血紊乱症状的患者。
以人血浆为原料大规模生产制备活化凝血因子VII浓制剂的难点在于对孵育活化步骤的条件控制。合理的活化凝血第七因子且不能产生凝血酶活性是整个生产制备工艺的关键。目前中国国内还没有厂家可以生产类似药物。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法。它包括有以下工艺步骤：
1)以人血浆低温乙醇分步分离法得到的组分III为原料进行溶解；
2)PEG沉淀纯化；
3)表面活性剂/清洁剂（S/D）病毒灭活；
4)阴离子交换树脂吸附层析纯化；
5)超滤脱盐；
6)特定途径孵育；
7)除菌过滤分装；
8)冻干；
9)100℃30分钟干热病毒灭活。
本发明填补了国内无此类产品生产的空白，且本发明所涉及的冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂和2013年经FDA批准在美国上市的Baxter FEIBA NF商品相比较，在活化的凝血第七因子FVIIa活性上大大高于Baxter同类产品，凝血酶活性则低于Baxter同类产品。产品生产工艺全过程中经过两步病毒灭活处理，确保其临床应用更高效、更安全。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
本发明实施例中所使用的检测方法如下：
1)微量凝血酶的定量检测：
微量凝血酶的定量检测是本发明实施的重要基础。不同于大剂量凝血酶的检测，本发明 需要面临的检测问题是对微量凝血酶活性的检测。一些对微量凝血酶的检测方法并不适合本 发明，如凝血酶特异性的发色底物法等。本发明实施例中采用了一种微量凝血酶的检测方法， 其检测的凝血酶含量的下限可达0.0075IU/ml，甚至更低，具体方法如下：
1、注射用水复溶凝血酶国家标准品(GB20021105，5IU/via)后，以稀释液(0.7wt％柠檬酸钠+0.7wt％NaCl的水溶液)进行倍比稀释，得到2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031、0.015和0.0075IU/ml梯度浓度的凝血酶溶液；
2、以注射用水复溶人纤维蛋白原制品(FNG)，如上海RAAS公司生产的HFNG(201202H2A0)，再以步骤1的稀释液(0.7wt％柠檬酸钠+0.7wt％NaCl的水溶液)进一步稀释成5mg/ml～15mg/ml浓度的FNG溶液，实施例中所使用的FNG溶液的浓度为10mg/ml；
3、在37℃温育下，将待测样品以及不同浓度的上述梯度浓度的凝血酶溶液分别与FNG溶液混合(待测样品与各梯度浓度的凝血酶溶液的体积相同)，观察并记录凝固反应时间；
4、对浓度和凝固反应时间取双对数线性回归，得到凝血酶反应标准曲线，通过标准曲线 及样品的凝固反应时间，可以计算得到样品的浓度。
2)活化的凝血因子VII活性的检测：
目前通常通过凝固法检测活化的凝血因子VII活性。重组的可溶性组织因子（rsTF）具有凝血因子VIIa辅因子的特殊功能。在凝血因子VIIa存在的情况下，rsTF，磷脂和二价钙离子使血浆凝固。在该试验系统中，观察到的凝集时间和待检血浆中原先存在的凝血因子VIIa浓度水平呈负相关。rsTF不能将凝血因子VII激活为VIIa；因此，该试验中血浆里的凝血因子VII对该试验没有干扰。本发明采用Stago公司活化的凝血因子VII凝集试验测定试剂盒（STACLO®，VIIa-rTF）定量检测活化的凝血因子VII。仪器为Stago全自动血凝仪。具体步骤可参见Stago公司试剂盒说明书。
3)样品浓度的检测：
利用岛津UV-1800，调整波长至280，可以测定样品在280nm的吸收值(A280)。
实施例1：
（1） 取组分III 80公斤，用320公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶解，缓冲液含肝素0.1 IU/ml。
（2） 在溶液中加入PEG（分子量4000），溶液PEG浓度为5%（W/V），搅拌、离心，沉淀弃。
（3） 在上清液中加入Tween—80、TNBP，25℃缓慢搅拌6小时，此为第一步S/D病毒灭活，溶液455.5公斤。
（4） 上述溶液加入预先溶胀经缓冲液平衡过的DEAE-Sephadex-A50进行离子交换纯化步骤。DEAE-Sephadex-A50加入量为1.5克（干）/L溶液。
（5） 用75公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，用15公斤0.01mol柠檬酸钠—2.0mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，得洗脱液19.88公斤，浓缩后用20公斤缓冲液进行脱盐。
（6） 特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII，包含以下内容：
1）孵育温度控制在10℃；
2）溶液pH控制在7.71；
3）溶液A280调整为82.0；
4）孵育时间控制为34小时；
5）加入稳定剂肝素42100单位；
6）在最后阶段加入甘氨酸，浓度为1.2% （W/V）。
（7） 在完成特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII的工序后，得到产品溶液15.6公斤。
（8） 除菌过滤，进行分装，冻干。得到冻干品1269瓶。（10ml/瓶灌装）。
（9） 对冻干品第二步病毒灭活100℃30分钟干热处理。
表1：实施例1产品主要技术指标
| 样品编号 | A280 | 凝血酶活性（IU/ml） | FVIIa（IU/ml） |
| 20160619 | 32 | 0.023 | 261 |
注：以国家标准品20021105测定凝血酶活性；A280的数据表示蛋白浓度的高低。
实施例2：
（1）取组分III 80公斤，用320公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶解，缓冲液含肝素0.1 IU/ml。
（2）在溶液中加入PEG（分子量4000），溶液PEG浓度为5%（W/V），搅拌、离心，沉淀弃。
（3）在上清液中加入Tween—80、TNBP，25℃缓慢搅拌6小时，此为第一步S/D病毒灭活。
（4）上述溶液加入预先溶胀经缓冲液平衡过的DEAE-Sephadex-A50进行离子交换纯化步骤。
（5）用75公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，用15公斤0.01mol柠檬酸钠—2.0mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，得洗脱液，浓缩后用20公斤缓冲液进行脱盐。
（6）特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII，包含以下内容：
1）孵育温度控制在10℃；
2）溶液pH控制在7.59；
3）溶液A280调整为81.6；
4）孵育时间控制为95小时；
5）加入稳定剂肝素42100单位；
6）在最后阶段加入甘氨酸，浓度为1.2% （W/V）。
（7）在完成特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII的工序后，得到产品溶液。
（8）除菌过滤，进行分装，冻干。得到冻干品（10ml/瓶灌装）。
（9）对冻干品第二步病毒灭活100℃30分钟干热处理。
表2：实施例2产品主要技术指标
| 样品编号 | A280 | 凝血酶活性（IU/ml） | FVIIa（IU/ml） |
| 20170721 | 27.0 | 0.063 | 265 |
注：以国家标准品20021105测定凝血酶活性；A280的数据表示蛋白浓度的高低。
实施例3：
（1）取组分III 80公斤，用320公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶解，缓冲液含肝素0.1 IU/ml。
（2）在溶液中加入PEG（分子量4000），溶液PEG浓度为5%（W/V），搅拌、离心，沉淀弃。
（3）在上清液中加入Tween—80、TNBP，25℃缓慢搅拌6小时，此为第一步S/D病毒灭活。
（4）上述溶液加入预先溶胀经缓冲液平衡过的DEAE-Sephadex-A50进行离子交换纯化步骤。
（5）用75公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，用15公斤0.01mol柠檬酸钠—2.0mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，得洗脱液，浓缩后用20公斤缓冲液进行脱盐。
（6）特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII，包含以下内容：
1）孵育温度控制在10℃；
2）溶液pH控制在7.72；
3）溶液A280调整为88.6；
4）孵育时间控制为22小时；
5）加入稳定剂肝素42100单位；
6）在最后阶段加入甘氨酸，浓度为1.2% （W/V）。
（7）在完成特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII的工序后，得到产品溶液。
（8）除菌过滤，进行分装，冻干。得到冻干品（10ml/瓶灌装）。
（9）对冻干品第二步病毒灭活100℃30分钟干热处理。
表3：实施例3产品主要技术指标
| 样品编号 | A280 | 凝血酶活性（IU/ml） | FVIIa（IU/ml） |
| 20170725 | 29.8 | 0.023 | 186 |
注：以国家标准品20021105测定凝血酶活性；A280的数据表示蛋白浓度的高低。
实施例4：
（1）取组分III 80公斤，用320公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶解，缓冲液含肝素0.1 IU/ml。
（2）在溶液中加入PEG（分子量4000），溶液PEG浓度为5%（W/V），搅拌、离心，沉淀弃。
（3）在上清液中加入Tween—80、TNBP，25℃缓慢搅拌6小时，此为第一步S/D病毒灭活。
（4）上述溶液加入预先溶胀经缓冲液平衡过的DEAE-Sephadex-A50进行离子交换纯化步骤。
（5）用75公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，用15公斤0.01mol柠檬酸钠—2.0mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，得洗脱液，浓缩后用20公斤缓冲液进行脱盐。
（6）特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII，包含以下内容：
1）孵育温度控制在10℃；
2）溶液pH控制在7.71；
3）溶液A280调整为78.7；
4）孵育时间控制为72小时；
5）加入稳定剂肝素42100单位；
6）在最后阶段加入甘氨酸，浓度为1.2% （W/V）。
（7）在完成特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII的工序后，得到产品溶液。
（8）除菌过滤，进行分装，冻干。得到冻干品（10ml/瓶灌装）。
（9）对冻干品第二步病毒灭活100℃30分钟干热处理。
表4：实施例4产品主要技术指标
| 样品编号 | A280 | 凝血酶活性（IU/ml） | FVIIa（IU/ml） |
| 20170814 | 29.0 | 0.046 | 233 |
注：以国家标准品20021105测定凝血酶活性；A280的数据表示蛋白浓度的高低。
实施例5：
（1）取组分III 80公斤，用320公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶解，缓冲液含肝素0.1 IU/ml。
（2）在溶液中加入PEG（分子量4000），溶液PEG浓度为5%（W/V），搅拌、离心，沉淀弃。
（3）在上清液中加入Tween—80、TNBP，25℃缓慢搅拌6小时，此为第一步S/D病毒灭活。
（4）上述溶液加入预先溶胀经缓冲液平衡过的DEAE-Sephadex-A50进行离子交换纯化步骤。
（5）用75公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，用15公斤0.01mol柠檬酸钠—2.0mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，得洗脱液，浓缩后用20公斤缓冲液进行脱盐。
（6）特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII，包含以下内容：
1）孵育温度控制在24℃；
2）溶液pH控制在8.03；
3）溶液A280调整为62.0；
4）孵育时间控制为24小时；
5）加入稳定剂肝素42100单位；
6）在最后阶段加入甘氨酸，浓度为1.2% （W/V）。
（7）在完成特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII的工序后，得到产品溶液。
（8）除菌过滤，进行分装，冻干。得到冻干品（10ml/瓶灌装）。
（9）对冻干品第二步病毒灭活100℃30分钟干热处理。
表5：实施例5产品主要技术指标
| 样品编号 | A280 | 凝血酶活性（IU/ml） | FVIIa（IU/ml） |
| 20161108 | 31.0 | 0.015 | 221 |
注：以国家标准品20021105测定凝血酶活性；A280的数据表示蛋白浓度的高低。
实施例6：
（1）取组分III 80公斤，用320公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶解，缓冲液含肝素0.1 IU/ml。
（2）在溶液中加入PEG（分子量4000），溶液PEG浓度为5%（W/V），搅拌、离心，沉淀弃。
（3）在上清液中加入Tween—80、TNBP，25℃缓慢搅拌6小时，此为第一步S/D病毒灭活。
（4）上述溶液加入预先溶胀经缓冲液平衡过的DEAE-Sephadex-A50进行离子交换纯化步骤。
（5）用75公斤0.01mol柠檬酸钠—0.15mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，用15公斤0.01mol柠檬酸钠—2.0mol氯化钠缓冲液溶洗涤凝胶，得洗脱液，浓缩后用20公斤缓冲液进行脱盐。
（6）特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII，包含以下内容：
1）孵育温度控制在10℃；
2）溶液pH控制在8.48；
3）溶液A280调整为92.4；
4）孵育时间控制为48小时；
5）加入稳定剂肝素42100单位；
6）在最后阶段加入甘氨酸，浓度为1.2% （W/V）。
（7）在完成特定途径孵育活性物质—活化凝血因子VII的工序后，得到产品溶液。
（8）除菌过滤，进行分装，冻干。得到冻干品（10ml/瓶灌装）。
（9）对冻干品第二步病毒灭活100℃30分钟干热处理。
表6：实施例6产品主要技术指标
| 样品编号 | A280 | 凝血酶活性（IU/ml） | FVIIa（IU/ml） |
| 20171106 | 32.4 | 0.007 | 179 |
注：以国家标准品20021105测定凝血酶活性；A280的数据表示蛋白浓度的高低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述生产制备方法包括以下工艺步骤：
（1）以人血浆低温乙醇分步分离法得到的组分III为原料进行溶解；
（2）PEG沉淀纯化；
（3）表面活性剂/清洁剂（S/D）病毒灭活；
（4）阴离子交换树脂吸附层析纯化；
（5）超滤脱盐；
（6）孵育活化凝血因子VII；
（7）除菌过滤分装；
（8）冻干；
（9）干热病毒灭活。
2.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中孵育所用缓冲溶液中柠檬酸钠的浓度为0.01～0.02M/L，氯化钠的浓度为0.05～0.2M/L。
3.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中孵育温度为0℃—25℃。
4.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中孵育时间为5—100小时。
5.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中孵育pH值为6.50—9.50。
6.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中孵育时溶液蛋白浓度A280范围为10—100。
7.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中孵育时的稳定剂为肝素，浓度为1-30IU/ml。
8.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中孵育时保护剂为甘氨酸或精氨酸的一种或几种，浓度为0.35%-5.0%（W/V）。
9.根据权利要求1所述的一种冻干人血浆活化凝血因子VII浓制剂的大规模生产制备方法，其特征在于，所述制备方法包含：表面活性剂/清洁剂（S/D）和干热100℃30分钟两步病毒灭活。
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