WO2009132575A1

WO2009132575A1 - 纳豆激酶(nk)超高活性粉末及其制备方法

Info

Publication number: WO2009132575A1
Application number: PCT/CN2009/071516
Authority: WO
Inventors: 高柱虎; 郑光南; 李现光
Original assignee: 赖文育
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2009-11-05
Also published as: CN101570747A

Description

纳豆激酶 (NK)超高活性粉末及其制备方法技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用枯草杆菌（Baci l lus subti l i s ) 生产纳豆激酶（Nattokinase，NK) 的方法和用途。

背景技术

当前，在抢救血栓病人的用药中，比较广泛地选用链激酶（SK)，尿激酶（UK)和组织纤溶酶原激活剂（t-PA)等。但这些药物在实际应用中表现出许多缺陷，例如，有血栓易复发，在血液中的半衰期短，以及总使用剂量大，治疗费用高和在体内作用单一等缺点 (参见；《生物工程进展》 2002 , Vol . 22 , Νο. 1)。

1980年在美国芝加哥大学医学院做研究的日本须见博士偶然发现的纳豆激酶，在体内作用时间最长可达 12小时，而尿激酶只有短短的 4一 20分钟，相差 60倍， 100克纳豆的溶栓能力，相当于 20万日元（约合人民币 15000元）的尿激酶（参见； H. Sumi et al ; Acta

Haematologica, 1990， 84， 139-143)。

1996年朝鲜高柱虎博士发现一种多功能性的纳豆激酶类纤溶酶，该酶具有比较高的纤维蛋白溶解能力和在机体内抗蛋白质氧化的功會^ 减少了机体内过氧化物的量增加给机体带来的伤害 (参见； KoJuHo et al： J. KIMILSUNG Uni , 1996, 4, KoJuHo et al : J. Biochem. Mol. Biol. 2005， 5)。

波兰和日本心肺血管疾病专家 Martin和 Konhei两位博士说，对心血管疾病和肺疾病专家-他们的一生研究中，纳豆和纳豆激酶是用于预防和治疗心脑血管及相关疾病的最有效的溶栓剂，且安全、无毒副作用（参见； Al lergy Rsearch Group ; "FOCUS " ， 2003， January) 。国际血栓联合会（ITA)确信：长期食用纳豆是日本人长寿的主要原因之一。美国联邦食品药监督署 (FDA)则充分肯定了纳豆对心脏病的预防、康复效果。

因此有关纳豆激酶的研究引起科学界极大关注，截至 2006年，各国科学家、学者发表有关纳豆激酶的研究论文、实验报告，已多达 5万余篇。目前国内生产纳豆激酶的方式上，已有采用固体发酵方式，例如中国专利 CN1131720. 5公开了一种纳豆激酶生产方法，该方法中采用固体发酵法和细胞破壁技术生产纳豆激酶并制取片剂、冲剂、硬胶囊、软胶囊等激酶溶栓药物。

按照传统方法的纳豆制造方法生产工艺复杂，不能提高纳豆激酶的活性，而且利用这些方法所得的纳豆发酵物具有很强的粘贴力和臭香味，消费者觉得味道难以接收。一般食品特别是药品的初歩要求就是无菌，纳豆激酶在高温下容易失去活性，所以不能用高压高温灭菌不得不利用 0. 22um的除菌过滤膜实现产品的无菌化，但纳豆发酵物的粘贴力非常大，难以过滤。在纳豆激酶的分离纯化工艺上，目前为止已有离子交换层析法（CN200410025769. 5) 和反胶团法 (CN200410037391. 0)及磁性微球分离纯化法（CN200510075057. 9 )等方法已获得专利。

发明内容

本发明的一个目的，在利用发酵罐的液体培养方法，用该方法能把纳豆激酶的活性提高到传统方法的十几倍，能实现无菌化。本发明的另一个目的，在于公开利用羊毛纤维的一种独特的纳豆激酶选择性吸附纯化方法，该方法能一次处理提高纳豆激酶的纯度、活性、无臭程度，而且实现低成本高效率。

为实现上述的目的，本发明的技术方案是：一种纳豆激酶制造方法，包括以下歩骤：

即，本发明提供纳豆激酶制造方法包括以下歩骤：

(1)、纳豆菌发酵罐规模液体培养：

(2)、利用羊毛纤维选择性吸附

(3)、利用自来水洗涤非吸附的各种物质包括细菌、剩下的培养成分、杂蛋白等；

(4)、利用碱性溶液洗脱纳豆激酶；

(5)、洗脱液经透析后离心、除菌过滤、冻干得到纳豆激酶粉末。其中：

歩骤（1) 所述的纳豆菌为枯草杆菌（Bacillus subtilis) ，所述的纳豆菌发酵罐规模液体培养包括两歩：

①、种菌培养：将纳豆菌（Bacillus subtilis) 用 LB培养液在 37°C进行培养 12-24h。 LB培养液（每 100ml当中）：胰蛋白胨 0.5_3g、酵母膏 0. l_lg、氯化钠 0. l_lg。

②、母发酵液的接种：接种量 0.1-0.8%，培养温度 35-40°C，转速 200rpm-250rpm，培养时间 10_15h。

发酵罐培养液成分为（每 100ml当中）：胰蛋白胨 l_5g、淀粉水解物 l_5g、食盐 0. l_2g、磷酸氢二钠 0. l_2g，白明胶 0.01-0. lg。

所用的发酵罐规模为 50_100L。

歩骤（2)所述的羊毛选择性吸附为：培养液：羊毛纤维 =40-60: 1(重量比），吸附温度为 4°C，吸附时间为 7-9h，搅拌速度 60_100rpm。所述的羊毛纤维可以是以下的一种，但不以此为限：长度在

5. 5-9cm范围内的细羊毛，长度 7-15cm的半细毛，长度 6_40cm的粗羊毛，或是以上三种经剪碎的羊毛。

歩骤（3 ) 所述的洗涤为：利用 4°C自来水洗 3 次，每次离心 6000rpm, 5min。去上清液，保留吸附有纳豆激酶的羊毛。

歩骤（4)所述的碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化铵（氨水），其浓度： 0. 05-0. 15N, 最佳为 0. INo洗涤温度： 4°C ; 洗涤时间 100_150s。

歩骤（5 ) 所述的透析可使用一般销售的透析袋（孔直径小于 5000kDa)。透析溶液：双蒸水 15-25 倍，透析温度 4°C，透析时间 15- 25h。

透析后离心： lOOOOrpm, 5min, 4°C。

除菌过滤采用过滤膜，其孔直径为 0. 22um,

纳豆激酶冻干后水分含量 8%以下。

本发明的有益效果在于：

1、本发明采用了液体发酵。固体发酵虽然投资较小，生产成本低，便于推广，但其缺点是劳动强度大、易受杂菌污染、发酵过程不易控制，特别是固体培养液粘度太大而有独特的臭味，因此纯化过程复杂、消费者不习惯等。而液体发酵虽然投资大，但生产条件易于控制，产品稳定性好，随着规模的扩大，成本大幅度下降。因此本发明的方法适于大规模工业化生产。

2、本发明采用羊毛纤维作为吸附剂，其对纳豆激酶具有很强的独特性选择吸附作用，该方法能一次处理提高纳豆激酶的纯度、活性、无臭程度。因此，采用本发明减少了纯化的操作歩骤，实现低成本高效率，而且制备所得的纳豆激酶粉末无异味，作为产品易为消费者接 3、普通生产方法所得到的纳豆激酶粉末，其活性一般 <20, 000FU/g,而本发明所得的纳豆激酶粉末活性可高达 253， 000FU/g (见表一），因此采用本发明的制备方法所得的纳豆激酶粉末极适合作为药品、保健食品、食品添加剂，用于预防而治疗心脑血栓、动脉硬化、衰老、冠心病等。

附图说明

图 1就是纳豆激酶粉 FU单位决定标准曲线。

具体实施方式

下面就本发明的上述各歩骤中的具体操作作详细说明。

实施例 1，纳豆激酶生产

首先，进行发酵罐液体培养，具体操作如下：

(1)种菌培养：将纳豆菌 Bacillus subtil is用 LB培养液在 37 进行培养 12-24小时。

LB培养液：胰化（蛋白）胨 1%，酵母膏 0. 5%，氯化钠 0. 5%

(2)母发酵液的接种：取上述种菌培养液 0. 1-1. 0L，种于在发酵罐里已灭好的下述母发酵液 50-100L 当中而在 30-40 °C进行培养 10-15小时。

母发酵液：

蛋白胨 1%，淀粉分解物 2%，食盐 0. 5%, 磷酸氢二钠 0. 5%, 白明胶 0. 05%

用羊毛纤维处理培养液，具体操作如下：

(1)培养液离心

离心条件： 6000rpm, 10 min, 4°C

(2)利用毛纤维选择性吸附纳豆激酶吸附条件：

培养液：毛纤维 = 50： 1 (重量比），吸附温度； 4°C，吸附时间； 8小时，搅拌速度； 80rpm

(3)非吸附的物质洗涤

洗涤条件：

利用 4°C自然水洗 3次，每次离心 6000rpm， 5分

(1)纳豆激酶的洗脱

洗脱条件：

洗脱溶液；氢氧化钠 0. IN, 洗涤温度； 4°C，洗涤时间； 120s (2)洗脱液的透析

透析条件：

透析溶液：双蒸水 20倍，透析温度 4°C，透析时间 18小时透析后离心： lOOOOrpm, 5分

(3)除菌过滤而冻干

过滤膜： 0. 22um，冻干后水分含量 8%以下

实施例 2，对本发明所得的纳豆激酶粉末活性的定性鉴定参照 KoJuHo et al : J. KIMILSUNG Uni , 1996， 26， 4， 100-104，用血纤维块分解时间法对欣绿源纳豆激酶粉末的纤溶酶活性进行定性鉴定。 SP，将上述的纳豆激酶粉末用 0. 85%食盐水作适当稀释，加到由 25ul兔血浆形成的血凝块包含的试管内。加入了上述纳豆激酶粉末样品的血凝块在 60分钟内全溶解，而加入了作为对照的 0. 85% 食盐水的血凝块不溶解。

实施例 3，对本发明所得的纳豆激酶粉末活性的定量鉴定参照 Takano et al : Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2006, 47, 5， 2075 - 2076, 用血纤维分解分析法（日本健康食品监督局在 2003年 1月 15日正式决定该方法作为纳豆激酶活性测定方法，单位 FU ; ) 对本发明的纳豆激酶粉末的纤溶酶活性进行定量鉴定。即，将 0. 72%人血纤维蛋白源（Fibrinogen, Solarbio Co. Ltd) 0. 4ml和 50mM硼酸缓冲液（pH 8. 5， 0. 9% NaCl) 1. 4ml加入到直径 1. 5cm的试管里后放置在 37°C， 5min。然后将 20U/ml 凝血酶 (Sigma Co. Ltd) 0. lml加入到试管里混合后再放置在 37°C， lOmin, lOmin后将适合稀释的纳豆激酶溶液 0. lml加入到试管里，混合后放置在 37°C，以后每 20min后混合一次。放 37°C， 60min后将 200mM 三氯乙酸溶液 2ml加到试管里，混合后在 37°C放 20min。然后将试管里溶液在 15000rpm， lOmin 离心后取 lml 的上清液测定 0D 值 (275nm) .

对照实验如下：上述的过程当中纳豆激酶加入之前先加入 200mM 三氯乙酸溶液 2ml，然后加纳豆激酶后以下操作同样。

把日本 NABI0 CO LTD的纳豆激酶粉末（22000FU/g)作为标准品。标准曲线见图 1。

在上述本发明的纳豆激酶粉末的纤溶酶活性的定性、定量实验中，使用了不同批次的三批本发明的纳豆激酶粉末作为样品。具体结果见表 1。表中， GPB-NK No00000f 000003为本发明所得到的纳豆激酶， NABIO-NK Sample为日本 NABI0公司的纳豆激酶样品。

实施例 4: 本发明所得的纳豆激酶粉末的应用

在药品、保健食品中加入含有 2000FU-10000FU/g采用本发明的方法生产的纳豆激酶，用于预防或治疗血栓类心脑血栓疾病。

上面是对本发明的具体说明，但这些说明不应认为是对本发明的限定。本领域的技术人员知道，根据上面对本发明的说明，可对本发明的具体实施方式作各种修改和变更而不偏离本发明的实质和由附具的权利要求书所决定的保护范围。表 1. 各种单位的纳豆激酶粉末 (GPB-NK)活性定量结果

Claims

权利要求

1.一种纳豆激酶的生产方法，其特征在于，包括以下歩骤：

( 1 )、纳豆菌用发酵罐规模液体培养；

( 2 )、利用羊毛纤维选择性吸附；

( 3 )、利用自来水洗涤非吸附的各种物质包括细菌、剩下的一样成分、杂蛋白等；

( 4)、利用碱性溶液洗脱纳豆激酶；

( 5 )、洗脱液经透析、除菌过滤、冻干得到纳豆激酶粉末。

2.如权利要求 1所述的纳豆激酶的生产方法，其特征于：所述的纳豆菌发酵罐规模液体培养条件为：种菌培养 12_24h，接种量 0. 1-0. 8% (体积比），培养温度 35-40 °C , 转速 200-250rpm,培养时间 10-15h_; 培养液组成成分；蛋白胨 10-50g、淀粉分解物 10-50g、食盐 l-2g、磷酸氢二钠 l_2g，白明胶 0. l-lg，用水调到 1L。

3.如权利要求 1所述的纳豆激酶生产方法，其特征于：所述的利用羊毛纤维选择性吸附为：培养液：羊毛纤维 =40-60: 1 (重量比），吸附温度为 4°C ; 吸附时间为 7-9h，搅拌速度为 60-100rpm。

4.如权利要求 1所述的纳豆激酶生产方法，其特征于：所述的碱性溶液为 0. 05N-0. 15N的氢氧化钠或氢氧化铵（氨水）溶液。

5.—种含纳豆激酶的药物，其特征在于所述的片剂、冲剂、胶囊或口服液中加 2000-10000FU/g权利要求广 4所述的方法生产的纳豆激酶。

6.—种纳豆激酶的保健食品、食品添加剂，其特征在于所述的产品中包括 2000-10000FU/g权利要求广 4所述的方法生产的纳豆激酶。