CN112544981A - 一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法及其制备的沙棘益生菌微胶囊产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微胶囊，具体公开一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，步骤如下：1）向沙棘提取液中接种益生菌，发酵培养1～3d，得到沙棘益生菌发酵液；2）将海藻酸钠溶解在水中，配制成浓度为1%～10%的海藻酸钠溶液，将乳清分离蛋白用酸液溶解，配制成浓度为3%～12%的乳清分离蛋白溶液；3）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按比例混合均匀，得到混合液；4）将步骤3）得到的混合液逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定20～40min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊。本发明制备的沙棘益生菌微胶囊营养活性高，益生菌活菌数高，环境抗逆性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种微胶囊，具体涉及一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法及其制备的沙棘益生菌微胶囊产品。
背景技术
沙棘（学名：Hippophae rhamnoides Linn.），是一种药食两用的植物资源，沙棘的根、茎、叶、花、果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，富含维生素C、黄酮类化合物、多糖、氨基酸、不饱和脂肪酸和微量元素等。其中VC 含量十分丰富，素有维生素C之王的美称。沙棘果实入药具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效。现代药理学研究也发现了其中的有效成分黄酮具有抗疲劳、增强机体活力、降血脂和软化血管的作用。可以广泛应用于食品、医药、轻工、航天、农牧鱼业等国民经济的许多领域。沙棘中的活性成分在加工过程中极易破坏，导致活性成分得不到有效利用。
益生菌是人体肠道重要的生理菌，具有多种生理功能，包括改善人体肠道功能、减少肠道疾病、促进营养物质的吸收、缓解乳糖不耐症、降胆固醇、调节免疫系统、预防癌症等，正是因为益生菌存在许多有益人体健康的功能，使得它在食品中得到了越来越广泛的应用。益生菌想要发挥其益生功效，必须保证益生菌在产品和宿主中都保持活性和代谢稳定，当液态食品中活菌数达到一定数量（食品安全国家标准GB 19302-2010对乳酸菌数进行限量，具体为≥106CFU/g（mL），益生菌才能发挥益生作用。然而，液态食品在运输、销售和消费过程中，益生菌所含活菌数一直在下降，而且益生菌的抗逆性较差，在经过胃部到达肠道时受到强胃酸、胆汁、胃蛋白酶等物质的作用，所以很难确保益生菌到达肠道内定植并有足够数量的活菌数去发挥其益生作用。
针对沙棘中的活性成分在加工过程中极易破坏，导致活性成分得不到有效利用的问题和益生菌活性保持时间短的技术问题，开发一种贮存稳定性好，耐胃酸效果好，肠溶效果优异的益生菌制剂制备方法，是本技术领域亟待研究和解决的问题。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法及利用该制备方法制备的沙棘益生菌微胶囊产品。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法。所述沙棘益生菌微胶囊的制备方法包括以下步骤：
（1）向沙棘提取液中接种益生菌，发酵培养1～3d，得到沙棘益生菌发酵液；
（2）将海藻酸钠溶解在水中，配制成浓度为1%～10%的海藻酸钠溶液，将乳清分离蛋白用酸液溶解，配制成浓度为3%～12%的乳清分离蛋白溶液；
（3）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按质量比1: (4～6):(4～6)的比例混合均匀，得到混合液；
（4） 将步骤（3）得到的混合液逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定20～40min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊。
根据上述的制备方法，优选地，步骤（2）中所述的酸液为浓度为0.5%～2%的盐酸溶液。更加优选地，所述的酸液为浓度为1%的盐酸溶液。
根据上述的制备方法，优选地，步骤（4）中所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为1%～8%。更加优选地，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为2%。
根据上述的制备方法，优选地，所述沙棘提取液的制备方法为：将沙棘鲜果加水浸泡后进行超声提取，将提取液过滤，浓缩，得到沙棘提取液。
根据上述的制备方法，优选地，所述沙棘鲜果与水的质量比为1：（1～5）；所述超声功率为400W～800W，超声提取的时间为10-60min。更加优选地，所述沙棘鲜果与水的质量比为1：3；所述超声功率为600W，超声提取的时间为30min。
根据上述的制备方法，优选地，步骤（1）中所述益生菌为保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌的混合菌液，混合菌液中保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌的浓度均为1010～1011CFU/mL。
根据上述的制备方法，优选地，步骤（1）中所述益生菌的接种量为3%～6%，所述发酵培养的温度为30℃～42℃。更加优选地，所述益生菌的接种量为3%，所述发酵培养的温度为36℃。
根据上述的制备方法，优选地，步骤（1）中向沙棘提取液中接种益生菌前，需要对益生菌进行活化处理；所述活化处理的具体操作为：将益生菌接种至半乳糖增殖培养基37℃厌氧培养48h，培养结束后离心收集菌体，将菌体用生理盐水重悬。
根据上述的制备方法，优选地，所述海藻酸钠溶液的浓度为3%，所述乳清分离蛋白溶液的浓度为10%。
根据上述的制备方法，优选地，所述半乳糖增殖培养基的成分组成为：所述半乳糖增殖培养基的成分组成为：蛋白胨 10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母膏4.0g/L，半乳糖20.0g/L，吐温-80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.05g/L，余量为水；所述半乳糖增殖培养基的pH 为6.2～6.4。
本发明第二方面提供了一种利用上述第一方面所述的制备方法制备的沙棘益生菌微胶囊产品，所述沙棘益生菌微胶囊产品的粒径为1.8-2mm。
根据上述的沙棘益生菌微胶囊产品，优选地，所述沙棘益生菌微胶囊产品采用0.9%的生理盐水进行保存。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
（1）本发明以海藻酸钠、乳清分离蛋白和氯化钙的混合物为壁材，采用微胶囊技术将沙棘益生菌发酵液进行包埋，制备得到了沙棘益生菌微胶囊，沙棘益生菌微胶囊在胃液中具有良好耐酸性，经过150min的模拟胃液处理后，仍然具有较高的存活率，存活率在60%以上；同时，沙棘益生菌微胶囊还具有良好的肠溶性，在模拟肠液处理中处理60min之后，益生菌就会被连续的释放出来；而且，沙棘益生菌微胶囊在4℃条件下贮存60d后，沙棘益生菌微胶囊中的活菌数仍然可以达到5.75×109CFU/mL，活菌含量高，存储稳定性好，能够延长沙棘益生菌产品的货架期，有助于解决益生菌不耐胃酸、不易保存的问题，使其益生功能得到有效的发挥。
（2）本发明通过超声提取方式制备沙棘提取液，并采用益生菌对沙棘提取液进行发酵，可保留沙棘中的营养物质和活性成分，将沙棘的营养保健作用与益生菌的益生功能相结合，产生更多对人体有益的物质。
（3）本发明在采用益生菌对沙棘提取液进行发酵前，采用半乳糖增殖培养基对益生菌进行活化处理，半乳糖增殖培养基对益生菌的增殖效果最佳，不仅能使肠道益生菌大量增殖，形成数量优势，造成酸性环境，从而抑制致病菌的生长；而且半乳糖可提高益生菌的生长速率，缩短活化处理时间。
（4）本发明制备的沙棘益生菌微胶囊的环境抗逆性强，能够抵御胃酸有害物质的渗透，穿过胃液的强酸环境进入肠道后释放微胶囊内部包埋的沙棘益生菌发酵液，因此，能够保留沙棘中的营养物质和活性成分，使沙棘中的营养活性成分充分被肠道吸收，同时也避免了益生菌直接与胃液接触，极大地提高了益生菌的存活率和稳定性，使益生菌能够在肠道充分释放，从而实现了沙棘的营养保健作用与益生菌的功能相结合，达到调节肠道菌群平衡，抑制腐败菌生长，增强人体免疫力的功效；也解决了益生菌抗逆性差，经过胃部到达肠道时受到胃液的作用易失活的问题，同时也解决了益生菌保存过程活菌数量下降迅速，效价损失严重的问题。
（5）本发明沙棘益生菌微胶囊的制备方法简单，易操作，制备的沙棘益生菌微胶囊营养活性高，益生菌活菌数高，环境抗逆性强，可以广泛的应用于食品领域，具有显著的经济效益。
附图说明
图1为不同培养基对益生菌活化过程菌体数量的影响结果图；
图2为半乳糖增殖培养基对益生菌生长的影响结果图；
图3为沙棘益生菌微胶囊在模拟胃液中的存活结果图；
图4为沙棘益生菌微胶囊在模拟长夜中的释放结果图；
图5为沙棘益生菌微胶囊在4℃的存储稳定性结果图；
图6为沙棘益生菌微胶囊在不同温度下的存活结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：益生菌菌种的活化增殖
为了研究不同的培养基对益生菌活化的影响，本发明采用不同培养基对益生菌进行活化，具体内容如下。
实施例1-1：活化培养基的选择
分别配制25mL葡萄糖基础培养基、半乳糖增殖培养基、蔗糖增殖培养基；每种培养基中碳源浓度均设置0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%六个浓度梯度，培养基配制完成后于121℃下灭菌20min。
葡萄糖基础培养基的成分组成为：蛋白胨 10.0g/L，牛肉膏粉5.0g/L，酵母膏粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温-80 1.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.05g/L，余量为水；葡萄糖基础培养基的pH为 6.2-6.4。
半乳糖增殖培养基的成分组成为：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏粉5.0g/L，酵母膏粉4.0g/L，半乳糖20.0g/L，吐温-80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.05g/L，余量为水；半乳糖增殖培养基的pH 为6.2-6.4。
蔗糖增殖培养基的成分组成为：蛋白胨 10.0g/L，牛肉膏粉5.0g/L，酵母膏粉4.0g/L，蔗糖20.0g/L，吐温-80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.05g/L，余量为水；蔗糖增殖培养基的pH为 6.2-6.4。
向灭菌后的每一个培养基中均接入保存的保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌，37℃厌氧培养48h，在600nm下测定各培养基的吸光度。吸光度的测定结果如图1所示。
由图1可知，在半乳糖增殖培养基中，半乳糖浓度为2%时，益生菌OD600 nm达到最大值1.98±0.03；在葡萄糖基础培养基中，葡萄糖浓度为2%，益生菌OD600 nm达到最大值1.65±0.01；在蔗糖增殖培养基中，蔗糖浓度为1%时，益生菌OD600 nm达到最大值1.18±0.05。在各培养基碳源浓度浓度相同时，半乳糖培养基中的益生菌OD600 nm值最高，说明半乳糖增殖培养基对益生菌的增殖效果最佳。
实施例1-2：半乳糖增殖培养基对益生菌生长过程的影响
分别配制25mL葡萄糖基础培养基（葡萄糖培养基中葡萄糖的浓度为2%）、半乳糖增殖培养基（半乳糖增殖培养基中半乳糖的浓度为2%），培养基配制完成后于121℃下灭菌20min。向灭菌后的每一个培养基中均接入保存的保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌，37℃厌氧培养48h。每隔4h去菌液在600nm下测定吸光度。吸光度的测定结果如图2所示。
由图2可以看出，益生菌在半乳糖增殖培养基中培养8h后进入对数生长期，而在葡萄糖基础培养基中培养12h后才进入对数生长期，而且，培养12h后半乳糖增殖培养基的OD600 nm值显著高于葡萄糖基础培养基。与葡萄糖基础培养基相比，半乳糖增殖培养基缩短了益生菌的延滞期，提高益生菌的生长速率。
因此，选取半乳糖增殖培养基作为益生菌的活化培养基，对益生菌进行活化培养。
实施例2：沙棘益生菌微胶囊的制备
一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）将保存的保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌接入半乳糖增殖培养基（半乳糖增殖培养基中半乳糖的浓度为2%），37℃厌氧培养48h，然后将菌液在4000r/min离心10min，离心后收集菌体，将菌体用生理盐水重悬，得到活化的益生菌，活化的益生菌中保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌的浓度均为1010CFU/mL；其中，所述半乳糖增殖培养基的成分组成为：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏粉5.0g/L，酵母膏粉4.0g/L，半乳糖20.0g/L，吐温-80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.05g/L，余量为水；半乳糖增殖培养基的pH 为6.2-6.4。
（2）取沙棘鲜果，将沙棘鲜果加水浸泡1.5h，超声提取3次，合并提取液，将提取液过滤，浓缩，得到沙棘提取液；其中，沙棘鲜果与水的质量比为1:3，超声功率为600W，每次超声提取的时间为15min。
（3）将步骤（1）得到的活化益生菌按体积比3%的比例接种至沙棘提取液中，36℃发酵培养2d，得到沙棘益生菌发酵液。
（4）将海藻酸钠粉末加入水中，70℃水浴加热至完全溶解，配制成质量百分比浓度为3%的海藻酸钠溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，备用；将乳清分离蛋白加入浓度为1%（w/ w）的盐酸中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10%的乳清分离蛋白溶液，备用；将氯化钙溶于水中，配制成质量百分比浓度为2%的氯化钙溶液，将氯化钙溶液在121℃高压灭菌15min，备用。
（5）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按质量比1:5:5比例混合均匀 ，得到混合液。
（6） 将步骤（5）得到的混合液用2.5ml注射器逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定30min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊，将沙棘益生菌胶囊用蒸馏水冲洗3次，出去多余的钙离子和未被包埋的菌体，悬浮保存在0.9%生理盐水中。所述沙棘益生菌微胶囊的粒径为1.8-2.0mm。
实施例3：沙棘益生菌微胶囊的制备
一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）将保存的保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌接入半乳糖增殖培养基（半乳糖增殖培养基中半乳糖的浓度为2%），37℃厌氧培养48h，然后将菌液在4000r/min离心10min，离心后收集菌体，将菌体用生理盐水重悬，得到活化的益生菌，活化的益生菌中保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌的浓度均为1010CFU/mL。
（2）取沙棘鲜果，将沙棘鲜果加水浸泡1.5h，超声提取3次，合并提取液，将提取液过滤，浓缩，得到沙棘提取液；其中，沙棘鲜果与水的质量比为1:1，超声功率为800W，每次超声提取的时间为10min。
（3）将步骤（1）得到的活化益生菌按体积比6%的比例接种至沙棘提取液中，36℃发酵培养1d，得到沙棘益生菌发酵液。
（4）将海藻酸钠粉末加入水中，70℃水浴加热至完全溶解，配制成质量百分比浓度为1%的海藻酸钠溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，备用；将乳清分离蛋白加入浓度为1%（w/ w）的盐酸中，搅拌至完全溶解，得到浓度为3%的乳清分离蛋白溶液，备用；将氯化钙溶于水中，配制成质量百分比浓度为1%的氯化钙溶液，将氯化钙溶液在121℃高压灭菌15min，备用。
（5）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按质量比1:4:6比例混合均匀 ，得到混合液。
（6） 将步骤（5）得到的混合液用2.5ml注射器逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定30min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊，将沙棘益生菌胶囊用蒸馏水冲洗3次，出去多余的钙离子和未被包埋的菌体，悬浮保存在0.9%生理盐水中。所述沙棘益生菌微胶囊的粒径为1.8-2.0mm。
实施例４：沙棘益生菌微胶囊的制备
一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）将保存的保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌接入半乳糖增殖培养基（半乳糖增殖培养基中半乳糖的浓度为2%），37℃厌氧培养48h，然后将菌液在4000r/min离心10min，离心后收集菌体，将菌体用生理盐水重悬，得到活化的益生菌，活化的益生菌中保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌的浓度均为1010CFU/mL。
（2）取沙棘鲜果，将沙棘鲜果加水浸泡1.5h，超声提取3次，合并提取液，将提取液过滤，浓缩，得到沙棘提取液；其中，沙棘鲜果与水的质量比为1:５，超声功率为400W，每次超声提取的时间为20min。
（3）将步骤（1）得到的活化益生菌按体积比4%的比例接种至沙棘提取液中，42℃发酵培养1d，得到沙棘益生菌发酵液。
（4）将海藻酸钠粉末加入水中，70℃水浴加热至完全溶解，配制成质量百分比浓度为10%的海藻酸钠溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，备用；将乳清分离蛋白加入浓度为1%（w/w）的盐酸中，搅拌至完全溶解，得到浓度为12%的乳清分离蛋白溶液，备用；将氯化钙溶于水中，配制成质量百分比浓度为8%的氯化钙溶液，将氯化钙溶液在121℃高压灭菌15min，备用。
（5）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按质量比1:6:6混合均匀，得到混合液。
（6） 将步骤（5）得到的混合液用2.5ml注射器逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定30min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊，将沙棘益生菌胶囊用蒸馏水冲洗3次，出去多余的钙离子和未被包埋的菌体，悬浮保存在0.9%生理盐水中。所述沙棘益生菌微胶囊的粒径为1.8-2.0mm。
实施例5：沙棘益生菌微胶囊的制备
一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）将保存的保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌接入半乳糖增殖培养基（半乳糖增殖培养基中半乳糖的浓度为2%），37℃厌氧培养48h，然后将菌液在4000r/min离心10min，离心后收集菌体，将菌体用生理盐水重悬，得到活化的益生菌，活化的益生菌中保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌的浓度均为1010CFU/mL。
（2）取沙棘鲜果，将沙棘鲜果加水浸泡1.5h，超声提取3次，合并提取液，将提取液过滤，浓缩，得到沙棘提取液；其中，沙棘鲜果与水的质量比为1:3，超声功率为500W，每次超声提取的时间为20min。
（3）将步骤（1）得到的活化益生菌按体积比4%的比例接种至沙棘提取液中，30℃发酵培养2d，得到沙棘益生菌发酵液。
（4）将海藻酸钠粉末加入水中，70℃水浴加热至完全溶解，配制成质量百分比浓度为10%的海藻酸钠溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，备用；将乳清分离蛋白加入浓度为6%（w/w）的盐酸中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8%的乳清分离蛋白溶液，备用；将氯化钙溶于水中，配制成质量百分比浓度为5%的氯化钙溶液，将氯化钙溶液在121℃高压灭菌15min，备用。
（5）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按质量比1:5:6比例混合均匀，得到混合液。
（6） 将步骤（5）得到的混合液用2.5ml注射器逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定30min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊，将沙棘益生菌胶囊用蒸馏水冲洗3次，出去多余的钙离子和未被包埋的菌体，悬浮保存在0.9%生理盐水中。所述沙棘益生菌微胶囊的粒径为1.8-2.0mm。
实施例6：沙棘益生菌微胶囊的制备
一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
（1）将保存的保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌接入半乳糖增殖培养基（半乳糖增殖培养基中半乳糖的浓度为2%），37℃厌氧培养48h，然后将菌液在4000r/min离心10min，离心后收集菌体，将菌体用生理盐水重悬，得到活化的益生菌，活化的益生菌中保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌的浓度均为1010CFU/mL。
（2）取沙棘鲜果，将沙棘鲜果加水浸泡1.5h，超声提取3次，合并提取液，将提取液过滤，浓缩，得到沙棘提取液；其中，沙棘鲜果与水的质量比为1:3，超声功率为500W，每次超声提取的时间为20min。
（3）将步骤（1）得到的活化益生菌按体积比4%的比例接种至沙棘提取液中，30℃发酵培养2d，得到沙棘益生菌发酵液。
（4）将海藻酸钠粉末加入水中，70℃水浴加热至完全溶解，配制成质量百分比浓度为10%的海藻酸钠溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，备用；将乳清分离蛋白加入浓度为6%（w/w）的盐酸中，搅拌至完全溶解，得到浓度为8%的乳清分离蛋白溶液，备用；将氯化钙溶于水中，配制成质量百分比浓度为5%的氯化钙溶液，将氯化钙溶液在121℃高压灭菌15min，备用。
（5）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按质量比1:4:5比例混合均匀，得到混合液。
（6） 将步骤（5）得到的混合液用2.5ml注射器逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定30min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊，将沙棘益生菌胶囊用蒸馏水冲洗3次，出去多余的钙离子和未被包埋的菌体，悬浮保存在0.9%生理盐水中。所述沙棘益生菌微胶囊的粒径为1.8-2.0mm。
本发明制备的沙棘益生菌微胶囊的性能测试：
以实施例2制备的沙棘益生菌微胶囊为例，对沙棘益生菌微胶囊的耐酸性、肠溶性和存储稳定性进行测试。同时，为了与本发明制备的沙棘益生菌微胶囊进行对比，本发明以实施例2步骤（3）制备的沙棘益生菌发酵液作为对照，对沙棘益生菌发酵液同步进行耐酸性、肠溶性和存储稳定性对比实验。
（1）沙棘益生菌微胶囊的耐酸性研究
益生菌进入人体后，首先必须能够抵御胃酸环境对其产生的不利影响。且由于食物成分、进食量等的差异，人体胃液的pH通常在0.9-3.0之间波动。因此，本实验采用pH为2.0的模拟胃液来模拟胃酸环境，研究沙棘益生菌微胶囊的耐酸性。
胃内消化食物，需经过4个阶段，约2-3h，在这段时间内，微胶囊应不溶解于胃液中，以保障有足够数量的益生菌能够耐受胃环境的低pH值及消化酶的伤害，从而顺利到达肠道中发挥益生作用。因此，实验选择微胶囊在模拟胃液中的处理时间为2.5h。
模拟胃液的配制：取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL，调PH到2.0，加胃蛋白酶10 g，搅匀后加水定容至1000mL即可。
耐酸性测试的具体实验操作为：
A）、沙棘益生菌微胶囊的耐酸性测试：取0.5g沙棘益生菌微胶囊加入到模拟胃液（4.5mL）中，充分混匀15s，在37℃条件下，以200r/min的速度在摇床中震荡处理30、60、90、120、150min，震荡处理结束后，离心，弃上清液，收集沉淀物；向沉淀物中加入4.5 mLpH值为7.4的PBS缓冲液（所述PBS缓冲液的成分组成为：8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na2HPO4、240mgKH2PO4，将上成分加水定容至1升）中，37℃下震荡至沉淀物中的沙棘益生菌微胶囊完全崩解，得到菌悬液，然后对菌悬液进行活菌计数。
B）、沙棘益生菌发酵液的耐酸性测试：取0.5mL沙棘益生菌发酵液加入到模拟胃液（4.5mL）中，充分混匀15s，在37℃条件下，以200r/min的速度在摇床中震荡处理30、60、90、120、150min，震荡处理结束后，离心，弃上清液，收集沉淀物；向沉淀物中加入4.5mL pH值为7.4的PBS缓冲液（所述PBS缓冲液的成分组成为：8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na2HPO4、240mgKH2PO4，将上成分加水定容至1升）中，37℃下震荡混合均匀，得到菌悬液，然后对菌悬液进行活菌计数。
根据活菌计数结果，计算益生菌的存活率。所述益生菌存活率的计算公式为：存活率=A/B×100%；A表示模拟胃液处理后样品中的活菌数，单位：CFU/mL；B表示模拟胃液处理前样品中的活菌数，单位：CFU/mL。实验结果如图3所示。
由图3可知，随着在模拟胃液中处理时间的延长，不经包埋处理的沙棘益生菌发酵液中益生菌的存活率迅速下降；当处理时间达到120min时，存活率降至25%；当处理时间达到150min时，存活率仅为5%。由此可见，模拟胃液对未包埋的沙棘益生菌发酵液中的益生菌具有很强的杀伤力，益生菌不能通过胃部到达肠道，因而也无法得到预期的益生效果。本发明制备的沙棘益生菌微胶囊在模拟胃液中经过150min的处理后，益生菌的存活率仍为61%，远高于未包埋的沙棘益生菌发酵液；由此说明，本发明制备的沙棘益生菌微胶囊的壁材对益生菌菌株起到了良好的保护作用，有效的保护了益生菌抵抗胃部的恶劣条件顺利到达肠道。
（2）沙棘益生菌微胶囊的肠溶性研究
模拟肠液的配制：取磷酸二氢钾6.8 g，加水500mL溶解，然后用0.4%的氢氧化钠溶液调节pH至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL即可。
肠溶性实验的具体实验操作为：
A）、沙棘益生菌微胶囊的肠溶性实验：取0.5g沙棘益生菌微胶囊加入到模拟肠液（4.5mL）中，充分混匀15s，在37℃条件下，以200r/min在摇床中震荡处理30、60、90、120、150min，震荡处理结束后，离心，弃上清液，收集沉淀物，向沉淀物中加入4.5mL pH值为7.4的PBS缓冲液（所述PBS缓冲液的成分组成为：8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na2HPO4、240mgKH2PO4，将上成分加水定容至1升）中，37℃下震荡至沉淀物中的沙棘益生菌微胶囊完全崩解，得到菌悬液，然后对菌悬液进行活菌计数。
B）、沙棘益生菌发酵液的肠溶性实验：取0.5mL沙棘益生菌发酵液加入到加入到模拟肠液（4.5mL）中，充分混匀15s，在37℃条件下，以200r/min在摇床中震荡处理30、60、90、120、150min，震荡处理结束后，离心，弃上清液，收集沉淀物；向沉淀物中加入4.5mL pH值为7.4的PBS缓冲液（所述PBS缓冲液的成分组成为：8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na2HPO4、240mgKH2PO4，将上成分加水定容至1升）中，37℃下震荡混合均匀，得到菌悬液，然后对菌悬液进行活菌计数。
所述益生菌存活率的计算公式为：存活率=A/B×100%；A表示模拟胃液处理后样品中的活菌数，单位：CFU/mL；B表示模拟胃液处理前样品中的活菌数，单位：CFU/mL。实验结果如图4所示。
由图4可知，随着模拟肠液处理的时间延长，沙棘微胶囊包埋的益生菌会连续的释放，在模拟肠液中处理60min之后，活菌数在109 CFU/mL左右，益生菌就会被连续的释放出来；由此说明本发明制备的沙棘益生菌微胶囊肠溶性较好，这主要由于海藻酸钠可依赖Ca2+形成可逆性凝胶，当外界环境中存在与Ca2+结合能力更强的磷酸根离子时，将引起凝胶结构破裂，进而释放出益生菌。微胶囊在肠液中的溶胀性明显要大于在胃液中的溶胀性，在胃液中，微胶囊呈收缩趋势，能有效保护益生菌免受酸性损伤。
（3）沙棘益生菌微胶囊的存储稳定性研究
存储稳定性实验的具体操作为：
A）、4℃存储稳定性研究：
将制备好的沙棘益生菌微胶囊置于4℃条件下进行保藏，分别于0d、15d、30d、45d、60d取样后进行活菌计数，然后根据活菌计数结果计算益生菌存活率，同时以未被包埋的沙棘益生菌发酵液作为对照。实验结果如图5所示。
沙棘益生菌活菌计数的具体测定过程为：取0.5g沙棘益生菌微胶囊，向沙棘益生菌微胶囊中加入4.5mL pH值为7.4的PBS缓冲液（所述PBS缓冲液的成分组成为：8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na2HPO4、240mg KH2PO4，将上成分加水定容至1升）中，37℃下震荡至沉淀物中的沙棘益生菌微胶囊完全崩解，得到菌悬液，然后对菌悬液进行活菌计数。
沙棘益生菌发酵液进行活菌技术的具体测定过程为：取0.5ml沙棘益生菌发酵液，向沙棘益生菌发酵液中加入4.5mL pH值为7.4的PBS缓冲液（所述PBS缓冲液的成分组成为：8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na2HPO4、240mg KH2PO4，将上成分加水定容至1升）中，37℃下震荡混匀，得到菌悬液，然后对菌悬液进行活菌计数。
由图5可知，在4℃存储条件下，未包埋的沙棘益生菌发酵液中益生菌的存活率下降较快，贮存60d后，未包埋的沙棘益生菌发酵液中益生菌存活率不到10%；本发明制备的沙棘益生菌微胶囊在4℃存储条件下存活率下降较慢，存储60d后，益生菌的存活率仍能达到60%以上，存活率较高。由此说明，本发明制备的沙棘益生菌微胶囊能提高益生菌的存储稳定性。
B）、不同温度和时间下的沙棘益生菌微胶囊存储稳定性：
良好的微胶囊活菌制剂应该具有较长的保藏时间，以利于延长产品的货架期，因此贮存期的长短可以作为判断益生菌沙棘微胶囊性能的一个重要指标。活菌制剂的另一个重要缺陷，就是在常温保藏时活菌数下降过快。了解常温条件保藏下制剂中的活菌数变化情况，对于产品的生产具有重要意义。因此，为了提高存活率，贮存期的温度选择也是至关重要的。
本实验选择在-20℃、4℃、20℃及37℃四种温度下，通过测定沙棘益生菌微胶囊在0d、15d、30d、45d、60d后的活菌数，以此来考察所制得微胶囊的贮存稳定性能。具体实验操作为：将制备好的沙棘益生菌微胶囊放入若干个小玻璃瓶中，密封，遮光，于-20℃、4℃、20℃以及37℃条件下放置，分别于0d、15d、30d、45d、60d测其活菌数。活菌数的具体测定过程为：取0.5g沙棘益生菌微胶囊，向沙棘益生菌微胶囊中加入4.5mL pH值为7.4的PBS缓冲液（所述PBS缓冲液的成分组成为：8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na2HPO4、240mg KH2PO4，将上成分加水定容至1升）中，37℃下震荡至沉淀物中的沙棘益生菌微胶囊完全崩解，得到菌悬液，然后对菌悬液进行活菌计数。具体实验结果如图6所示。
由图6可知，随着贮存时间的延长，沙棘益生菌微胶囊中的活菌数量逐渐下降。在储存时间相同的条件下，随着贮存温度的降低，沙棘益生菌微胶囊中的活菌数量逐渐提高。在4℃贮存60d后，沙棘益生菌微胶囊中的活菌数量仍然可以达到5.75×109CFU/g，活菌数较高。相比较20℃和37℃，显然在4℃条件下，微胶囊具有更优良的贮存稳定性。20℃贮存60d后，活菌数下降程度比较明显，并不具备很好的稳定性。而37℃贮存60d后，微胶囊中的活菌数量大大减少，该条件不利于菌体的存活。可见，贮存温度越低，微胶囊的长期贮存稳定性能越好。
益生菌沙棘微胶囊在低温贮存时稳定性较高的原因可能是由于活菌在低温条件下处于休眠状态，且经过微胶囊化处理后，益生菌外面包覆了一层高分子囊膜，可作为一种物理屏障，令其与外界环境隔离，增强了菌体对不利环境的抵抗力，故菌体存活率较高，微胶囊的低温贮存稳定性较好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种沙棘益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取沙棘提取液，向沙棘提取液中接种益生菌，发酵培养1～3d，得到沙棘益生菌发酵液；
（2）将海藻酸钠溶解在水中，配制成浓度为1%～10%的海藻酸钠溶液，将乳清分离蛋白用酸液溶解，配制成浓度为3%～12%的乳清分离蛋白溶液；
（3）将沙棘益生菌发酵液、海藻酸钠溶液、乳清分离蛋白溶液按质量比1: (4～6): (4～6)混合均匀，得到混合液；
（4） 将步骤（3）得到的混合液逐滴加入氯化钙溶液中，室温下固定20～40min，过滤，除去水相，即得沙棘益生菌微胶囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的酸液为浓度为0.5%～2%的盐酸溶液；步骤（4）中所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为1%～8%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述沙棘提取液的制备方法为：将沙棘鲜果加水浸泡后进行超声提取，将提取液过滤，浓缩，得到沙棘提取液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述沙棘鲜果与水的质量比为1：（1～5）；所述超声功率为400W～800W。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述益生菌为保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌的混合菌液，混合菌液中保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌的浓度均为1010～1011 CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述益生菌的接种量为3%～6%，所述发酵培养的温度为30℃～42℃。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中向沙棘提取液中接种益生菌前，需要对益生菌进行活化处理；所述活化处理的具体操作为：将益生菌接种至半乳糖增殖培养基，37℃厌氧培养48h，培养结束后离心收集菌体，将菌体用生理盐水重悬。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述半乳糖增殖培养基的成分组成为：蛋白胨 10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母膏4.0g/L，半乳糖20.0g/L，吐温-80 1.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.05g/L，余量为水；所述半乳糖增殖培养基的pH 为6.2～6.4。
9.一种利用权利要求1～8任一所述制备方法制备的沙棘益生菌微胶囊产品，其特征在于，所述沙棘益生菌微胶囊产品的粒径为1.8～2mm。
10.根据权利要求9所述的沙棘益生菌微胶囊产品，其特征在于，所述沙棘益生菌微胶囊产品采用0.9%的生理盐水进行保存。
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