CN108041385A - 一种复合益生菌药食同源植物发酵饮料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵饮料制备领域，具体涉及一种复合益生菌药食同源植物发酵饮料及其制备方法。该发酵饮料包括以下重量份数的发酵原料：复合益生菌0.001～0.1份，药食同源植物水提液30～60份，增殖因子0.5～10份；其中，所述复合益生菌为以下3种菌种任意比例的混合：保藏编号为CGMCC No.2106的嗜酸乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.1258的植物乳杆菌，保藏编号为CNCM I‑4458的干酪乳杆菌。该发酵饮料益生菌活菌总数大于109CFU/g，且在0℃～4℃冷藏条件下保存4个月时，活菌数仍有107CFU/ml，大大延长产品的保质期。

Description

一种复合益生菌药食同源植物发酵饮料及其制备方法
技术领域
本发明属于发酵饮料制备领域，具体涉及一种复合益生菌药食同源植物发酵饮料及其制备方法。
背景技术
近年来，将食品科学与预防医学相结合开展研究，使产品具有特殊的保健功能，是食品科学技术发展的方向。而随着生活节奏的不断加快，生存环境的恶化以及身体机能的衰退，越来越多的人处于易疲劳，活力、反应能力、适应力减退等亚健康状态。从而人体平衡常态被打破，机体自主调节功能失调。而同时随着人们不良生活方式的加剧，长期熬夜、吸烟、大量饮酒、工作压力大总处于紧张或焦虑的情绪中等更会导致免疫力低下及肠道菌群失衡。
益生菌发酵饮料属于营养保健品，能够补充肠道益生菌，恢复和保持肠道微生态平衡，调节宿主肠道菌群。目前市售活性乳酸菌饮料在0℃～4℃低温下冷链运输和保存，保质期一般为21～30天不等，保质期内的活菌数在1.0×106CFU/ml左右，且后期酸化比较严重，风味会发生变化，保质期相对较短，对远距离运输及销售也是一种限制。其主要原因是在低温下菌体仍然进行缓慢的生长代谢，某种营养物质的缺乏或某种特定发酵产物的积累(如乳酸)都会抑制菌体的增殖，导致产品的风味改变，同时菌体也会出现自溶现象而衰亡，导致活菌稳定性下降。益生菌活菌稳定性不仅与菌体自身的遗传特性有关，如生理生化特性耐酸、耐渗透压等，同时与其发酵性能、代谢路径等相关，此外还与发酵成分有关。目前低温下乳酸菌饮品保质期较短，活菌不稳定的问题，仍是本领域技术人员一直在致力解决的技术难题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高活菌数及稳定性强的益生菌药食同源植物发酵饮料及其制备方法。本发明选择发酵性能好、适应性强，最佳搭配的菌种组成复合发酵剂，并精选药食同源植物以及果蔬汁，经过科学处理后接种复合乳酸菌进行发酵。在获得丰富益生菌的同时结合了乳酸菌的发酵优势，制得的饮料酸甜可口风味独特，同时在低温条件下保质期较长，能够保持较高的活菌量。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种复合益生菌药食同源植物发酵饮料，包括以下重量份数的发酵原料：复合益生菌0.001～0.1份，药食同源植物水提液30～60份，增殖因子0.5～10份；
其中，所述复合益生菌为以下3种菌种任意比例的混合：保藏编号为CGMCCNo.2106的嗜酸乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.1258的植物乳杆菌，保藏编号为CNCM I-4458的干酪乳杆菌；
所述药食同源植物水提液的浓度以折光度计，在25℃下的折光度不低于15％。
优选的，所述发酵饮料发酵生产日时的益生菌活菌总数为8.0×108CFU/g～4.0×109CFU/g，0～4℃冷藏4个月后，益生菌活菌数不低于107CFU/g。
优选的，所述复合益生菌为冻干粉，所述冻干粉中益生菌的活菌数不低于1.0×1011CFU/g。
优选的，所述药食同源植物水提液为将药食同源植物按照蒸煮法得到的药食同源植物水提液，所述药食同源植物水提液的浓度以折光度计，在25℃下的折光度不低于15％。
优选的，所述药食同源植物原料为：山药、山楂、乌梅、木瓜、甘草、龙眼肉、决明子、百合、麦芽、沙棘、枣、罗汉果、金银花、枸杞子、姜、胖大海、茯苓、桑葚、荷叶、莲子、菊花、黄精、葛根、黑芝麻、蒲公英、薄荷、酸枣、覆盆子、人参、山银花和玫瑰花中的一种或多种。
更优选的，所述药食同源植物包括：人参15～25份，黄精80～100份，枸杞50～70份。
更优选的，所述药食同源植物包括：山楂80～100份，乌梅50～70份，山药100～140份，猴头菇150～170份，茯苓90～110份，甘草15～25份。
更优选的，所述药食同源植物包括：罗汉果90～110份，百合50～70份，薄荷15～25份，甘草10～20份。
优选的，所述增殖因子为蔗糖、菊粉、吐温、麦精、葡萄糖和低聚糖中的一种或者多种。
优选的，所述发酵原料中还包括果蔬汁10～20份。
优选的，所述发酵原料中还包括营养强化剂、调味剂和稳定剂中的任意一种或几种，所述营养强化剂添加的重量份为0.001～0.1份，所述调味剂添加的重量份为0.0001～5份，所述稳定剂添加的重量份为0.01～0.5份。
本发明还包括上述发酵饮料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述药食同源植物水提液、所述增殖因子与水混合，得到总固形物浓度为10％以上的发酵培养液，调整发酵培养液的pH值至5.5～7.5，灭菌；
(2)在步骤(1)灭菌后的发酵培养液中接种所述复合益生菌进行密闭静止发酵，发酵温度为36℃～42℃，当发酵液的pH值降至3.5～4.5时发酵结束，得到的发酵液即为所述复合益生菌药食同源植物发酵饮料。
优选的，步骤(2)中，所述接种的复合益生菌在所述发酵培养液中的总活菌数为1.0×105CFU/g～1.0×108CFU/g。
优选的，所述药食同源植物水提液的制备方法包括：将药食同源植物原料在水中浸泡后，在85℃～90℃下水煎浸提，过滤得到滤液，将所述滤液离心弃去下层不溶物，得到的提取液浓缩后即为药食同源植物水提液。
优选的，步骤(1)中，所述发酵培养液中还包括果蔬汁。
优选的，步骤(1)中，所述发酵培养液中还包括营养强化剂、调味剂和稳定剂中的一种或者多种。
本发明技术方案的技术效果如下：
本发明的发酵饮料采用三株发酵性能好、适应性强，高稳定性的最佳搭配益生菌作为发酵剂，产品配方中含有一种或者多种药食同源植物水提液，配以增殖因子，通过控制药食同源植物水提液、增殖因子的添加比例，保证发酵过程中菌体充分生长繁殖，能够达到较高的活菌数。当达到发酵终点时，发酵底物中含有丰富的酶解益生元物质及小分子物质。
本发明的发酵饮料中以药食同源植物水提液为发酵原料。药食同源植物中的益生元对益生菌的生长增殖具有促进作用，益生菌分泌到胞外的各种酶类如α-D-半乳糖苷酶、D-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶等能够分解利用药食同源物中的益生元，不仅能够清除过氧化物等代谢产物，同时也能提供糖类等营养物质，从而促进益生菌的生长繁殖。同时，药食同源植物中除了含有糖类，还包括黄酮类、激素类、氨基酸类、皂苷类、多种微量元素和生物碱类等化合物，其中许多成分能对益生菌的增殖以及代谢过程提供后续能源物质。在低温贮藏阶段时，后酸化现象减轻，在不改变产品风味的前提下延长饮料在低温条件下的保质期及维持高活菌数量。
本发明利用益生菌发酵法提取及转化药食同源植物中的天然产物活性成分，具有安全、高效、低成本、低耗能等优点。通过发酵，植物细胞组织受到微生物酶的作用而裂解，原料细胞中的功能性成分得以充分释放出来并经过微生物的分解利用变成小分子，从而使得人体组织更容易吸收利用。药食同源植物经过发酵转化进一步加强了其药效，如黄酮类物质通常是以糖苷的形式存在的，经过益生菌发酵后，糖基被水解后除去，皂苷元(配基)才更容易被人体吸收利用，因此提高了本发明发酵饮料的保健功效。
本发明制备得到的发酵饮料活菌总数为8.0×108CFU/g～4.0×109CFU/g，本发明的发酵饮料低温贮藏保质期较长，根据配方不同在0℃～4℃贮藏时，保质期内活菌数不低于1.0×107CFU/g，具有高活性菌稳定性。且保质期内pH值下降不超过0.5。
保藏说明
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA11-Onlly，于2007年07月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.2106。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP-Onlly，于2004年12月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.1258。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC18，于2011年03月28日保藏在法国国家微生物菌种保藏中心，地址为25Rue du Docteur Roux，F-75724Paris Cedex 15，巴斯德研究所，生物保藏编号为CNCM I-4458。
具体实施方式
针对目前低温下乳酸菌饮品保质期较短，活菌数不稳定的问题，本发明从发酵菌种、原料等方面进行选择，开发出一种高活菌数、稳定性强以及营养丰富的益生菌药食同源植物发酵饮料。通过发酵使益生菌菌体充分生长繁殖，达到较高的活菌数，同时实现了在低温贮藏时，减轻发酵饮料后酸化现象，使菌体在低温贮藏时的生长增殖仍具有促进作用，从而保证了发酵饮料的高活菌稳定性，在不改变产品风味的前提下有效延长发酵饮料在低温条件下的保质期。
本发明的复合益生菌药食同源植物发酵饮料，包括以下重量份数的发酵原料：复合益生菌0.001～0.1份，药食同源植物水提液30～60份，增殖因子0.5～10份；
其中，所述复合益生菌为以下3种菌种任意比例的混合：保藏编号为CGMCCNo.2106的嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，保藏编号为CGMCC No.1258的植物乳杆菌LP-Onlly，保藏编号为CNCM I-4458的干酪乳杆菌LC18。该三种菌种均分离自健康婴儿，具有发酵性能好、适应性强的特点，三种乳酸菌联合进行发酵，发酵饮料中活菌总数高，稳定性强。且发酵过程中能够充分利用药食同源植物水提液中的有益元素，将其中含有的大分子物质分解成小分子的有利于吸收的物质，提高发酵乳的营养保健功效。本发明中，以重量份计，所述复合益生菌的添加量优选为0.01～0.09份，更优选为0.04～0.08份。
本发明的复合益生菌优选为益生菌粉，即为上述3种益生菌的冷冻干燥活菌粉。本发明所述复合益生菌粉中，优选活菌数不低于1.0×1011CFU/g，更优选为2.0～9.0×1011CFU/g。
本发明对益生菌粉的制备方法没有特殊限制，采用本领域中的常规制备方法制备即可。在本发明中，优选益生菌粉采用以下方法进行制备：
1)将上述3种益生菌分别在MRS培养液或改良MRS培养液中培养发酵，获得含有益生菌的发酵液；
2)离心：将上述得到的3种益生菌发酵液分别离心分离获得菌泥；
3)冷冻干燥：将所述菌泥与水和冻干载体混合，得到的混合物料冷冻干燥制成冻干活菌粉。
本发明中，所述MRS培养液的配方为:每升培养液中含蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g,培养液的pH值为6.2-6.6。所述改良MRS培养液的配方为:每升培养液中含蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g,L-半胱氨酸0.5g,培养液的pH值为6.2-6.6。
本发明中，步骤1)优选发酵温度独立地为37～39℃，更优选为38℃；优选发酵时间独立地为14～29小时，更优选为18～24小时。本发明中，优选获得的各发酵液中活菌数大于10亿个/毫升，更优选为大于20亿个/毫升。
本发明中，所述离心优选在10万级洁净车间进行离心。本发明对离心的参数没有特殊限定，能够将发酵液中的活菌离心沉淀出的所有离心操作均在本发明的保护范围之内。
本发明中，菌泥与水的重量比优选为1：6～15:，更优选为1:8～12。菌泥与冻干载体的重量为优选为1：0.1～5，更优选为1：1。
本发明所述冻干载体优选为脱脂奶粉、淀粉和麦芽糊精中的一种或几种。同时，脱脂奶粉还具有保护益生菌活性的作用。本发明对冷冻干燥的参数没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的冷冻干燥方法即可。冷冻干燥后得到益生菌冻干活菌粉。
本发明中，所述药食同源植物原料优选为：山药、山楂、乌梅、木瓜、甘草、龙眼肉、决明子、百合、麦芽、沙棘、枣、罗汉果、金银花、枸杞子、姜、胖大海、茯苓、桑葚、荷叶、莲子、菊花、黄精、葛根、黑芝麻、蒲公英、薄荷、酸枣、覆盆子、人参、山银花、玫瑰花中的一种或多种。本领域技术人员可以根据发酵饮料的功效及口感对药食同源植物进行合理选择及配伍。如药食同源配方A：人参15～25份，黄精80～100份，枸杞50～70份；药食同源配方B：山楂80～100份，乌梅50～70份，山药100～140份，猴头菇150～170份，茯苓90～110份，甘草15～25份；药食同源配方C：罗汉果90～110份，百合50～70份，薄荷15～25份，甘草10～20份。
本发明发酵原料中，以重量份计，药食同源植物水提液的添加量优选为35～55份，更优选为40～50份。本发明中，所述药食同源植物水提液为将药食同源植物按照蒸煮法得到的药食同源植物水提液，所述蒸煮法优选为药典中记载的蒸煮法。本发明所述药食同源植物水提液的浓度以折光度计，优选为在25℃下的折光度不低于15％，更优选为20～35％。
本发明中，所述药食同源植物水提液的制备方法优选包括以下步骤：将药食同源植物原料在水中浸泡后，在85℃～90℃下水煎浸提，过滤得到滤液，将所述滤液离心弃去下层不溶物，得到的提取液浓缩后即为药食同源植物水提液。
本发明中，优选药食同源植物原料在水中浸泡的加水量以能够浸没药食同源植物原料为原则，浸泡时间优选为1～2h。将浸泡后的药食同源植物进行水煎浸提。本发明对水煎浸提的次数没有特殊限定，优选进行2～3次浸提。首次浸提的料液比优选为1:7～12，更优选为1:10；首次浸提的时间优选为1h～2h；再次浸提的料液比优选为1:4～6，浸提时间优选为1h～2h。此处所指的再次浸提为首次浸提之后的所有浸提，包括第二次浸提、第三次浸提等。合并每次浸提所得的滤液。本发明所述离心的转速优选为3000～8000r/min，优选为5000～6000r/min。本发明对浓缩的方式没有特殊限定，优选采用真空浓缩，所述真空浓缩的温度优选不高于80℃。浓缩后得到药食同源植物水提液。
本发明的发酵原料中，以重量份计，增殖因子的添加量优选为1～9份，更优选为4～7份。本发明所述增殖因子包括蔗糖、菊粉、吐温、麦精、葡萄糖和低聚糖中的一种或者多种；其中，所述低聚糖包括低聚异麦芽糖、低聚果糖和低聚木糖中的一种或者几种。本发明所述增殖因子作为能源物质能够促进益生菌在发酵过程中的迅速增殖。本发明对增殖因子的来源没有特殊限制，采用本领域中所熟知的上述市售增殖因子即可。
本发明的发酵原料中优选还包括果蔬汁。以重量份计，所述果蔬汁的添加量优选为12～18份，更优选为15～16份。本发明对果蔬汁的种类没有特殊限制，采用本领域中的常规果蔬汁均可，如番茄汁、胡萝卜汁、柠檬汁、橘子汁、草莓汁等，主要是用于调节发酵饮料的口感以及增加发酵饮料的营养需求，本领域技术人员可以根据发酵饮料的营养或口感需求选择添加。本发明中，所述果蔬汁指的是果蔬原浆。
本发明的发酵原料中优选还包括营养强化剂、调味剂和稳定剂中的任意一种或几种。所述营养强化剂优选为维生素，牛磺酸和矿物元素中的一种或者几种，按重量份计，所述营养强化剂的添加量优选为0.001～0.1份，优选为0.01～0.09份，更优选为0.04～0.07份。所述营养强化剂主要用于强化维生素、矿物质以及牛磺酸，以提高产品的营养功能。所述调味剂优选为蜂蜜、蔗糖、和L-精氨酸等物质中的一种或者多种，按重量份计，其添加量优选为0.0001～5份，更优选为0.001～4份，更优选为0.01～2份。本发明所述调味剂用于调节产品风味，适宜所有人群食用。所述稳定剂为琼脂、果胶、明胶及羧甲基纤维素钠中的一种或者多种，按重量份计，其添加量优选为0.01～0.5份，更优选为0.05～0.3份，进一步优选为0.1～0.2份。本发明所述稳定剂以强化产品性状的稳定，保证保质期内外观的一致性。本领域技术人员可以根据发酵饮料的品质需求对上述3类物质选择性添加。
本发明所述发酵饮料发酵生产日时的益生菌活菌总数为8.0×108CFU/g～4.0×109CFU/g，更优选为1.0×109CFU/g～3.0×109CFU/g。0～4℃冷藏4个月后，益生菌活菌数不低于107CFU/g，更优选为3.0×107CFU/g～6.0×107CFU/g，远大于活菌产品1.0×106CFU/g作为判断保质期的标准。
本发明还提供了一种上述发酵原料制备发酵饮料的方法，包括以下步骤：
(1)将所述药食同源植物水提液、所述增殖因子与水混合，得到总固形物浓度为10％以上的发酵培养液，调整发酵培养液的pH值至5.5～7.5，灭菌；
(2)在步骤(1)灭菌后的发酵培养液中接种所述复合益生菌进行密闭静止发酵，发酵温度为36℃～42℃，当发酵液的pH值降至3.5～4.5时发酵结束，得到的发酵液即为所述复合益生菌药食同源植物发酵饮料。
本发明将上述技术方案中所述的药食同源植物水提液、增殖因子与水按照比例混合，得到发酵培养液。所述发酵培养液中总固形物浓度为10％以上，更优选为15％以上。
本发明的发酵培养液中含有药食同源植物水提液。药食同源植物水提液中含有多种成分能对益生菌的增殖以及代谢过程提供后续能源物质。本发明药食同源植物水提液优选按照前述方法进行制备，在此不再赘述。
本发明的发酵培养液中优选还可加入果蔬汁。本发明对果蔬汁的种类及制备方法没有特殊限制，只要能够得到新鲜果蔬汁的方法均能够应用于本发明中。本发明中，优选果蔬汁为新鲜压榨的果蔬原浆。
本发明的发酵培养液中优选还可加入营养强化剂、调味剂和稳定剂中的任意一种或几种。所述营养强化剂、调味剂和稳定剂的种类及添加量参照前述技术方案所述，在此不再赘述。本领域技术人员可以根据发酵饮料的品质需求在发酵培养液中选择性添加上述3种物质。
本发明中，优选用碳酸氢钠调节发酵培养液的pH值，优选碳酸钠为食品级碳酸钠，也可以用本领域中的其他食品级化合物调节pH值。本发明调节发酵液pH值的范围为5.5～7.5，更优选为6.0～6.5，以适应益生菌发酵所需的条件。
本发明中，对灭菌方式没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的灭菌方式即可。在本发明具体实施例中，优选灭菌方式采用高压蒸汽灭菌，灭菌温度优选为105℃～121℃，灭菌时间优选为10～30min。
本发明在发酵培养液中接种复合益生菌。本发明接种的复合益生菌为保藏编号为CGMCC No.2106的嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，保藏编号为CGMCC No.1258的植物乳杆菌LP-Onlly及保藏编号为CNCM I-4458的干酪乳杆菌LC18，该三种菌种发酵性能好、适应性强。本发明中优选接种上述益生菌的复合益生菌粉进行发酵。优选复合益生菌粉的活菌数不低于1.0×1011CFU/g，更优选为2.0～9.0×1011CFU/g。本发明的复合益生菌粉优选按照上述技术方案所述方法进行制备，在此不再赘述。
本发明将复合益生菌接种于发酵培养液中进行发酵，优选发酵在发酵罐中进行。本发明中，优选接种后所述复合益生菌在所述发酵液中的总活菌数为1.0×105CFU/g～1.0×108CFU/g，更优选为1.0×106CFU/g～1.0×107CFU/g。
本发明复合益生菌发酵方式为密封发酵，发酵温度控制在为36℃～42℃，优选为38～40℃，发酵过程中尽可能避免加热现象。发酵过程中静止培养，罐压优选维持在0.001～0.01Mpa，更优选为0.004～0.008Mpa。
发酵开始后，定期监测发酵液的pH值，当发酵液的pH值降至3.5～4.5时结束发酵。优选监测频率为：在发酵开始后每隔1～2h测定一次pH值，当发酵液的pH值接近5.0时临近发酵终点，每隔半小时测定一次pH值。本发明中，发酵结束时的发酵时间优选为12h～48h，更优选为24～36h。发酵完成时，发酵液中的益生菌活菌总数优选为8.0×108CFU/g～4.0×109CFU/g，更优选为1.0×109CFU/g～3.0×109CFU/g。
在发酵过程中菌体充分生长繁殖，能够达到较高的活菌数。制备出的发酵饮料在低温贮藏阶段时，后酸化现象减轻，在不改变产品风味的前提下延长饮料在低温条件下的保质期及维持高活菌数量。本发明的发酵饮料根据配方不同在0℃～4℃贮藏时，保质期内活菌数能够达到不低于1.0×107CFU/g，且保质期内pH值下降不超过0.5。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明下述实施例中，发酵菌种为保藏编号为CGMCC No.1258的植物乳杆菌LP-Onlly，保藏编号为CGMCC No.2106的嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，保藏编号为CNCM I-4458的干酪乳杆菌LC18，以上三种菌组合成的复合菌种。所述益生菌发酵剂均是由菌株经高密度发酵、冻干后获得，稳定性高，活菌数可达1.0×1011CFU/g。
实施例1
植物乳杆菌LP-Onlly的生理生化特征
本发明中的植物乳杆菌LP-Onlly于1989年分离自健康婴儿，原菌株代号为8901，其16S rRNA基因部分序列于GeneBank的登录号为AY590777。该菌于2004年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)保藏，保藏登记号分别为CGMCCNO.1258。菌体为杆状，缺乏鞭毛，但能运动。革兰氏阳性，不生芽孢，兼性厌氧。并经耐酸、耐胆盐性能分析确定的一独特菌株，其高氨肽酶活、高β-半乳糖苷酶活和高葡萄糖苷酶活使其发酵性能及遗传稳定较好，续传代15代后，基因组DNA指纹图谱及代谢产物HPLC指纹图谱与原代保持一致。其可利用乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、L-阿拉伯糖、山梨醇、蜜二糖、D-松二糖、D-阿糖醇、葡萄糖酸钠、α-甲基-D-甘露糖苷进行发酵。
实施例2
嗜酸乳杆菌LA11-Onlly的生理生化特征
本发明中的嗜酸乳杆菌LA11-Onlly直接自健康婴儿粪便中分离获得，于2007年07月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2106。具有独特的耐酸、耐胆盐性能及很好的抗氧化特性。其形态为杆状，革兰氏染色阳性，不形成芽孢，产生乳酸，兼性厌氧。它能利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、龙胆二糖等进行发酵。
实施例3
干酪乳杆菌LC18的生理生化特征
本发明中的干酪乳杆菌LC18分离自健康婴儿肠道，于2011年3月28日保藏于法国微生物菌种保藏中心(Collection Nationale De Cultures De Microorganisms,CNCM)，保藏编号为CNCM I-4458。其安全可靠，具有很好的耐酸、耐胆盐性能及抗氧化特性。菌体长短不一，两端呈方形，常成链状，革兰氏染色阳性，不产芽孢，无鞭毛，不运动，兼性厌氧。能够利用乳糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、纤维二糖、果糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁甙(扁桃甙)、熊果甙、松叁糖、葡萄糖酸钠等进行发酵。
实施例4
益生菌粉的制备
实施例1～3所述的三种益生菌的冷冻干燥活菌粉均可采用以下方法进行制备：
a、将上述3种益生菌分别接种于MRS培养液或改良的中MRS培养液进行发酵，接种后，发酵液中益生菌活菌数分别为1.0×106CFU/g。将接种后的发酵液在38℃下培养发酵24h，获得含有益生菌的发酵液；获得的各发酵液中益生菌活菌数大于10亿个/毫升。
b、离心：将上述各发酵液在10万级洁净车间内以10000rpm离心，获得菌泥；
c、冷冻干燥：将得到的菌泥与菌泥重量10倍的水，以及菌泥重量1倍的脱脂奶粉混合，得到的混合物料在-40℃下冷冻干燥16～20小时，分别制成植物乳杆菌LP-Onlly菌粉、嗜酸乳杆菌LA11-Onlly菌粉、干酪乳杆菌LC18菌粉，其活菌数量不低于1.0×1011CFU/g。
实施例5
复合益生菌药食同源植物发酵饮料A
本实施例中，采用植物乳杆菌LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18三种菌组合成的复合菌种进行发酵，依以下步骤制备发酵饮料：
1)制备提取液：1kg饮料中，选用符合药典标准人参20g，黄精90g，枸杞60g，加水浸泡1h，煎煮2次，第一次浸提加水量为1:10，浸提温度在85℃，浸提时间为2h，第二次浸提加水量为1:6，时间为1h，过滤后合并两次滤液；在5000r/min下离心，弃去下层不溶物，得到提取液，提取液为透明无杂质，浓缩至600g(25℃下浓度以折光度计≥15％)。
2)调配：1kg饮料中，步骤1)中提取液600g，覆盆子果汁300g，低聚果糖50g，蔗糖20g，蜂蜜20g，明胶3g，葡萄糖5g，吐温2g，牛磺酸0.2g，葡萄糖酸锌0.04g，L-精氨酸0.01g，用碳酸氢钠调节至pH为5.5，搅拌均匀后均质于105℃灭菌10min，冷却至37℃后待用。
3)接种发酵：接种植物乳杆菌LP-Onlly冻干菌粉，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly冻干菌粉，干酪乳杆菌LC18冻干菌粉至上述灭菌后的发酵液中。每种益生菌的接种量分别为1.0×106CFU/g，采用发酵罐密封发酵，发酵温度控制在38℃，且尽可能避免加热现象，发酵过程静止培养，罐压维持在0.01Mpa。发酵开始后每隔1h测定一次pH值，临近发酵终点时每隔半小时测定一次pH值。发酵时间为12h～18h，当pH为4.20时达到发酵终点，停止发酵。待发酵液温度降至20℃以下后开始下步操作。
4)灌装：将均质后的发酵液快速置于0℃～4℃环境下进行无菌灌装，放于冷库中保存。
该发酵饮料产品呈均匀的红褐色，有少许菌体悬浮或沉淀，口感酸甜可口，有浓郁的发酵风味，pH值为4.20，其中活菌总数为3.4×109CFU/g。在0℃～4℃低温条件下进行保存实验4个月后，活菌总数为6.8×107CFU/g，pH为3.92，仅下降了0.28。
对比例1
采用上海交大昂立股份有限公司实验室保存三株益生菌：植物乳杆菌LP529(美国NCBI基因序列号：DQ235650),嗜酸乳杆菌La5(美国NCBI基因序列号：AY766421)和干酪乳杆菌Lc2(详见论文：Liu Qiulin，Hang Xiaomin，LiuXianglong,TanJing，Li Daotang,YangHong,Cloning and Heterologous Expression of the Manganese SuperoxideDismutase Gene from Lactobacillus casei Lc18，Annals of Microbiology,2012,62:129-137)组合成复合菌株进行发酵制备发酵饮料，其他步骤与实施例5相同。
0℃～4℃低温条件下，实施例5与对比例1所发酵制备的饮料分别保存4个月的活菌数及pH值变化情况见表1。
表1实施例5与对比例1制备的发酵饮料A在0℃～4℃储存稳定性评价
实施例5中复合菌种发酵的产品在0℃～4℃低温条件下保存4个月后，活菌总数为6.8×107CFU/g，远大于活菌产品1.0×106CFU/g作为判断保质期的标准。明显超过市场上同等产品在冷藏条件下达到的活菌稳定性和活菌总数，同时保质期为4个月远远大于目前同类产品的保质期限。而对照实验复合菌种植物乳杆菌LP529，嗜酸乳杆菌La5，干酪乳杆菌Lc2发酵的产品无论是发酵完成以及在0℃～4℃低温条件下保存4个月后，其活菌数均明显低于实施例5中植物乳杆菌LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18复合菌种发酵的产品。可见，本发明中的复合菌种具有良好的药食两用植物发酵能力，且发酵产品具有良好的稳定性。
实施例6
复合益生菌药食同源植物发酵饮料B
本实施例中，采用植物乳杆菌LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18三种菌组合成的复合菌种进行发酵，依以下步骤制备发酵饮料：
1)制备提取液：1kg饮料中，选用符合药典标准山楂90g，乌梅60g，山药120g，猴头菇160g，茯苓100g，甘草20g，加水浸泡2h，煎煮2次，第一次浸提加水量为1:10，浸提温度在90℃，浸提时间为2h，第二次浸提加水量为1:6，时间为2h，过滤后合并两次滤液；离心，转速为5000r/min，弃去下层不溶物，得到提取液，为透明无杂质，浓缩至500g(25℃下浓度以折光度计≥15％)，待用。
2)调配：1kg饮料中，步骤1)中提取液500g，纯净水250g，芹菜汁150g，蜂蜜31g，低聚异麦芽糖30g，蔗糖30g，葡萄糖5g，吐温2g，明胶1g，羧甲基纤维素钠1g，用碳酸氢钠调节至pH为7.5，搅拌均匀后于105℃灭菌10min，冷却至37℃后待用。
3)接种发酵：接种植物乳杆菌LP-Onlly冻干菌粉，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly冻干菌粉，干酪乳杆菌LC18冻干菌粉至上述灭菌后的发酵液中。每种益生菌的接种量分别为1.0×107CFU/g。采用发酵罐密封发酵，发酵温度控制在为37℃，且尽可能避免加热现象，发酵过程静止培养，罐压维持在0.0055Mpa。发酵开始后每隔1h测定一次pH值，发酵液pH值接近5.0临近发酵终点时每隔半小时测定一次pH值。发酵时间为18h-24h。当pH为4.50时达到发酵终点，停止发酵。待发酵液温度降至20℃以下后开始下步操作。
4)灌装：将发酵液冷却后快速置于0℃～4℃环境下进行无菌灌装，放于冷库中保存。
该发酵饮料产品呈均匀的灰绿色，有少许菌体悬浮或沉淀，口感爽滑，有浓郁的发酵风味，pH值为4.50，其中活菌总数为2.1×109CFU/g。在0℃～4℃低温条件下进行保存实验4个月后，活菌总数为3.5×107CFU/g，pH为4.10，仅下降了0.40。
对比例2
采用上海交大昂立股份有限公司实验室保存三株益生菌：植物乳杆菌LP529(美国NCBI基因序列号：DQ235650),嗜酸乳杆菌La5(美国NCBI基因序列号：AY766421)和干酪乳杆菌Lc2(详见论文：Liu Qiulin，Hang Xiaomin，Liu Xianglong,Tan Jing，Li Daotang,YangHong,Cloning and Heterologous Expression of the Manganese SuperoxideDismutase Gene from Lactobacillus casei Lc18，Annals of Microbiology,2012,62:129-137)组合成复合菌株进行发酵制备发酵饮料，其他步骤与实施例6相同。
0℃～4℃低温条件下，实施例6与对比例2所发酵制备的饮料分别保存4个月的活菌数及pH值变化情况见表2。
表2实施例6与对比例2的发酵饮料B在0℃～4℃储存稳定性评价
实施例6中复合菌种发酵的产品在0℃～4℃低温条件下保存4个月后，活菌总数为3.5×107CFU/g，明显超过市场上同等产品在冷藏条件下达到的活菌稳定性和活菌总数，同时保质期为4个月远远大于目前同类产品的保质期限。而对比例2复合菌种植物乳杆菌LP529，嗜酸乳杆菌La5，干酪乳杆菌Lc2发酵的产品无论是发酵完成以及在0℃～4℃低温条件下保存4个月后，其活菌数仅为3.2×104CFU/g，明显低于植物乳杆菌LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18-复合菌种发酵的产品。可见，本发明中的复合菌种具有良好的药食两用植物发酵能力，且发酵产品具有良好的稳定性。
实施例7
复合益生菌药食同源植物发酵饮料C
本实施例中，采用物乳杆菌为LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18三种菌组合成的复合菌种进行发酵，依以下步骤制备发酵饮料：
1)制备提取液：1kg饮料中，选用符合药典标准罗汉果100g，百合60g，薄荷20g，甘草15g，加水浸泡2h，煎煮2次，第一次浸提加水量为1:10，浸提温度在90℃，浸提时间为1.5h，第二次浸提加水量为1:6，时间为1.5h，过滤后合并两次滤液；在5000r/min下离心，弃去下层不溶物，得到提取液，提取液为透明无杂质，浓缩至500g(25℃下浓度以折光度计≥15％)。
2)调配：1kg饮料中，步骤1)中提取液500g，梨汁200g，桑葚汁150g，低聚果糖50g，低聚异麦芽糖30g，蔗糖25g，蜂蜜25g，麦精13g，葡萄糖5g，吐温1g，明胶1g，用碳酸氢钠调节至pH为6.5，搅拌均匀后均质后于115℃灭菌10min，冷却至37℃后待用。
3)接种发酵：接种植物乳杆菌LP-Onlly冻干菌粉，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly冻干菌粉，干酪乳杆菌LC18冻干菌粉至上述灭菌后的发酵液中。每种益生菌冻干菌粉的活菌数均须大于1.0×1011CFU/g。1kg饮料中，植物乳杆菌LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18分别接种1.0×106CFU/g，采用发酵罐密封发酵，发酵温度控制在为37℃，且尽可能避免加热现象，发酵过程静止培养，罐压维持在0.001Mpa，发酵开始后每隔1h测定一次pH值，临近发酵终点时每隔半小时测定一次pH值。发酵时间为18h-24h。当pH为4.30时达到发酵终点，停止发酵。待发酵液温度降至20℃以下后开始下阶段操作。
4)灌装：将发酵液冷却后快速置于0℃～4℃环境下进行无菌灌装，放于冷库中保存。
该发酵饮料产品呈均匀的红棕色，有少许菌体悬浮或沉淀，口感爽滑，有浓郁的发酵风味，pH值为4.30，活菌总数为2.6×109CFU/g。在0℃～4℃低温条件下进行保存实验4个月后，活菌总数为3.2×107CFU/g，pH为3.80，仅下降了0.5。
对比例3
采用上海交大昂立股份有限公司实验室保存三株益生菌：植物乳杆菌LP529(美国NCBI基因序列号：DQ235650),嗜酸乳杆菌La5(美国NCBI基因序列号：AY766421)和干酪乳杆菌Lc2(详见论文：Liu Qiulin，Hang Xiaomin，Liu Xianglong,TanJing，Li Daotang,YangHong,Cloning and Heterologous Expression of the Manganese SuperoxideDismutase Gene from Lactobacillus casei Lc18，Annals of Microbiology,2012,62:129-137)组合成复合菌株进行发酵制备发酵饮料，其他步骤与实施例7相同。
0℃～4℃低温条件下，实施例7与对比例3所发酵制备的饮料分别保存4个月的活菌数及pH值变化情况见表3。
表3实施例7与对比例3的发酵饮料C在0℃～4℃储存稳定性评价
实施例7中的产品在0℃～4℃低温条件下进行保存4个月后，活菌总数为3.2×107CFU/g，远大于活菌产品1.0×106CFU/g作为判断保质期的标准。明显超过市场上同等产品在冷藏条件下达到的活菌稳定性和活菌总数。采用植物乳杆菌为LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18三种菌组合成的复合菌种进行发酵时，较对比例3发酵的产品，其活菌数更稳定，保质期更长。可见，本发明中的复合菌种具有良好的药食两用植物发酵能力，且发酵产品具有良好的稳定性。
实施例8
市售某乳酸菌饮品，其保质期在0℃～4℃冷藏条件下为30天。其原料组成为：水，果葡糖浆，白砂糖，蓝莓汁、蔓越莓汁、柠檬酸。该饮品采用一株乳酸菌发酵：植物乳杆菌。新鲜生产的产品，经过检测，活菌含量为3.2×108CFU/g，pH为4.31。在0℃～4℃条件下保存30天后，活菌含量仅为1.6×106CFU/g，pH为3.68，下降了0.63，产品后酸化较严重，风味发生了变化。在0℃～4℃冷藏条件下保存30天后的活菌数及pH值变化情况见表4。
表4市售冷链乳酸菌饮料在0℃～4℃冷藏条件下保存实验
保存时间(天) 活菌数(CFU/g) pH值
0 3.2×108 4.31
10 1.1×108 4.15
20 4.9×107 3.87
30 1.6×106 3.68
由此可见，现有技术中的益生菌发酵饮品，发酵成分中的营养物质在贮藏阶段慢慢消耗殆尽，不能继续为菌体增殖提供能源，同时随着乳酸的积累，生存环境恶化，活菌数逐渐下降。
本发明发酵饮料中含有药食同源物质提取液成分，其中富含功能性成分如人参皂苷、黄精多糖、山药多糖、甾体皂苷、枸杞多糖、生物类黄酮、酚类化合物等，在低温0℃～4℃条件下时，能够作为益生菌增殖的迟效能源，使活菌总数保持相对稳定，保质期更长。同时益生菌将这些大分子物质的分解代谢成小分子物质，更利于人体吸收，增强发酵饮料的保健功能。
结论：实施例5～7表明，以植物乳杆菌为LP-Onlly，嗜酸乳杆菌LA11-Onlly，干酪乳杆菌LC18作为复合发酵剂应用于药食同源植物饮料的制备时，该发酵饮料益生菌活菌总数大于109CFU/g，且在0℃～4℃冷藏条件下保存4个月时，活菌数仍有107CFU/ml，该发酵饮料不仅能补充益生菌，同时能大大延长产品的保质期。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种复合益生菌药食同源植物发酵饮料，其特征在于，包括以下重量份数的发酵原料：复合益生菌0.001～0.1份，药食同源植物水提液30～60份，增殖因子0.5～10份；
其中，所述复合益生菌为以下3种菌种任意比例的混合：保藏编号为CGMCC No.2106的嗜酸乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.1258的植物乳杆菌，保藏编号为CNCM I-4458的干酪乳杆菌；
所述药食同源植物水提液的浓度以折光度计，在25℃下的折光度不低于15％。
2.根据权利要求1所述的发酵饮料，其特征在于，所述发酵饮料发酵生产日时的益生菌活菌总数为8.0×108CFU/g～4.0×109CFU/g，0～4℃冷藏4个月后，益生菌活菌数不低于107CFU/g。
3.根据权利要求1所述的发酵饮料，其特征在于，所述复合益生菌为冻干粉，所述冻干粉中益生菌的活菌数不低于1.0×1011CFU/g。
4.根据权利要求1所述的发酵饮料，其特征在于，所述药食同源植物水提液为将药食同源植物按照蒸煮法得到的药食同源植物水提液。
5.根据权利要求1或4所述的发酵饮料，其特征在于，所述药食同源植物原料为：山药、山楂、乌梅、木瓜、甘草、龙眼肉、决明子、百合、麦芽、沙棘、枣、罗汉果、金银花、枸杞子、姜、胖大海、茯苓、桑葚、荷叶、莲子、菊花、黄精、葛根、黑芝麻、蒲公英、薄荷、酸枣、覆盆子、人参、山银花和玫瑰花中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的发酵饮料，其特征在于，所述药食同源植物包括：人参15～25份，黄精80～100份，枸杞50～70份。
7.根据权利要求5所述的发酵饮料，其特征在于，所述药食同源植物包括：山楂80～100份，乌梅50～70份，山药100～140份，猴头菇150～170份，茯苓90～110份，甘草15～25份。
8.根据权利要求5所述的发酵饮料，其特征在于，所述药食同源植物包括：罗汉果90～110份，百合50～70份，薄荷15～25份，甘草10～20份。
9.根据权利要求1所述的发酵饮料，其特征在于，所述增殖因子为蔗糖、菊粉、吐温、麦精、葡萄糖和低聚糖中的一种或者多种。
10.根据权利要求1所述的发酵饮料，其特征在于，所述发酵原料中还包括果蔬汁10～20份。
11.根据权利要求1或10所述的发酵饮料，其特征在于，所述发酵原料中还包括营养强化剂、调味剂和稳定剂中的任意一种或几种；
所述营养强化剂添加的重量份为0.001～0.1份，所述调味剂添加的重量份为0.0001～5份，所述稳定剂添加的重量份为0.01～0.5份。
12.如权利要求1～9任意一项所述发酵饮料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述药食同源植物水提液、所述增殖因子与水混合，得到总固形物浓度为10％以上的发酵培养液，调整发酵培养液的pH值至5.5～7.5，灭菌；
(2)在步骤(1)灭菌后的发酵培养液中接种所述复合益生菌进行密闭静止发酵，发酵温度为36℃～42℃，当发酵液的pH值降至3.5～4.5时发酵结束，得到的发酵液即为所述复合益生菌药食同源植物发酵饮料。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述接种的复合益生菌在所述发酵培养液中的总活菌数为1.0×105CFU/g～1.0×108CFU/g。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述药食同源植物水提液的制备方法包括：将药食同源植物原料在水中浸泡后，在85℃～90℃下水煎浸提，过滤得到滤液，将所述滤液离心弃去下层不溶物，得到的提取液浓缩后即为药食同源植物水提液。
15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养液中还包括果蔬汁。
16.根据权利要求12或15所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养液中还包括营养强化剂、调味剂和稳定剂中的一种或者多种。
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