CN110876475A - 一种药食同源组合发酵物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药食同源组合发酵物，所述的药食同源组合发酵物含有活性成分总多糖200mg/g～320mg/g,羧甲基茯苓多糖18mg/g～35mg/g,芦荟苷2μg/g～5.5μg/g，人参皂苷10mg/g～17mg/g，生物碱0.8mg/g～1.3mg/g，益生菌1.0*1010cfu/g～2.0*1012cfu/g。本发明中的药食同源组合发酵物的不仅含有丰富的营养素：膳食纤维和蛋白质；高含量的功效成分：羧甲基茯苓多糖和人参皂甙、芦荟苷、多糖、生物碱；并且使该药食同源组合发酵物具有提高免疫力、治疗感冒、降尿酸的功效。

Description

一种药食同源组合发酵物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药食同源组合发酵物及其制备方法。
背景技术
“药食同源”指，许多食物即药物。卫生部公布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中，对药食同源物品、可用于保健食品的物品和保健食品禁用物品做出具体规定。其中茯苓、芦荟、山楂均属于可用于保健品的药食同源的食品。茯苓中所含主要成分为茯苓多糖，茯苓多糖有抗肿瘤、抗癌，提高人体免疫机能等作用。芦荟多糖和芦荟苷是芦荟中主要的活性成分，对抗衰老、抗氧化、提高免疫力等医疗方面有超高的应用前景，又因为芦荟存在较低的毒性与独特的功能对于提高免疫，降血糖、抗菌等功能有较高的作用。山楂含有黄酮、多糖、有机酸等生物活性物质，对黄酮、有机酸等有效成分研究较多。山楂多糖具有抗疲劳、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤以及调血脂等药理作用。人参中含有的人参皂甙具有抗氧化，抗肿瘤，提高机体免疫力等作用，对于保护心脑血管，预防冠心病，脑血管疾病也是有作用的。多糖是铁皮石斛中一种重要的活性物质，且含量较高。研究表明，多糖成分与铁皮石斛的药效，如增强机体免疫机能、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降血糖等方面，有着密切的联系。生物碱类成分是石斛属植物中最早分离并进行结构确认的化合物,有抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、免疫调节、抗心律失常等等作用。
我国将微生物发酵应用于中药炮制工艺中已有千余年的历史，成为了世界上最早利用微生物对天然药物进行转化的国家。发酵可使微生物代谢过程中产生的一些酶对中药成分进行结构修饰，同化学反应相比，中药发酵要求的条件比较简单、专一性强、安全、成本也低，能够对一些复杂的化合物进行特定的氧化还原反应；并且能够对一些化合物进行结构上的修饰，使其的溶解性、生物活性大大的提高；发酵群在代谢过程中可分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶等几十种胞外酶释放到培养基中，这些酶有的可直接分解转化功效成分，形成新的物质，有的能分解细胞壁中纤维素、果胶质、半纤维素、木质素等致密结构，从而活性成分得以最大程度地释放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药食同源组合发酵物及其制备方法。
为此，在本发明第一方面，本发明提供了：
一种药食同源组合发酵物，所述的药食同源组合发酵物含有活性成分总多糖200mg/g～320mg/g,羧甲基茯苓多糖18mg/g～35mg/g,芦荟苷2μg/g～5.5μg/g，人参皂苷10mg/g～17mg/g，生物碱0.8mg/g～1.3mg/g，益生菌1.0*1010cfu/g～2.0*1012cfu/g。
进一步地，所述药食同源组合发酵物是将药食同源组合物通过益生菌粉发酵制成，所述药食同源组合物含有茯苓、芦荟、山楂、人参、铁皮石斛叶。
进一步地，以质量百分比计，所述药食同源组合物含有茯苓20％～25％、芦荟10％～15％、山楂20％～35％、人参5％～10％、铁皮石斛叶30％～35％。
进一步地，所述益生菌粉含有发酵乳杆菌和短双歧杆菌中的至少1种。
进一步地，所述的益生菌粉活性为1.0*108～5.0*1012cfu/g。
进一步地，所述的发酵乳杆菌为发酵乳杆菌CECT5716、短双歧杆菌为短双歧杆菌M-16V。
在本发明第二方面，本发明提供了：
一种药食同源组合发酵物的制备方法，包括以下步骤：
a)药食同源组合物的制备：将茯苓粉、芦荟粉、山楂粉、人参、铁皮石斛叶混合后进行粉碎、过筛，加水，灭菌；
b)益生菌的培养：将益生菌粉接种于发酵培养基中培养；
c)药食同源组合物发酵液的制备：将益生菌发酵液接种于药食同源组合物中，发酵；
d)药食同源组合物发酵浓缩液：将药食同源发酵液加入水解乳清蛋白粉，浓缩；
e)干燥：将药食同源组合发酵浓缩液进行真空冻干得药食同源组合发酵物。
进一步地，药食同源组合物含有茯苓粉20％～25％、芦荟粉10％～15％、山楂粉20％～35％、人参5％～10％、铁皮石斛叶30％～35％。
进一步地，步骤a)中按照1：5-1：10的料液质量比加水。
进一步地，所述益生菌粉含有发酵乳杆菌和短双歧杆菌中的至少1种。
进一步地，所述的益生菌粉活性为1.0*108～5.0*1012cfu/g。
进一步地，所述的发酵乳杆菌为发酵乳杆菌CECT5716、短双歧杆菌为短双歧杆菌M-16V。
进一步地，步骤c)中益生菌发酵液的接种量为2mL～20mL/L。
进一步地，所述的水解乳清蛋白粉水解度为15～30，蛋白质含量为80％～90％，加入的水解乳清蛋白粉与药食同源组合物发酵液的质量比为(1～2)：10。
本发明的有益效果是：
本发明的发明人通过大量实验研究通过优选出最佳的药食同源组合物通过最优的发酵益生菌经过特定培养基培养后，对药食同源组合物进行发酵；加入水解乳清蛋白粉达到最佳的冻干效果和保存药食同源发酵组合物中益生菌的活性和数量；使最后得到的药食同源组合发酵物的不仅含有丰富的营养素：膳食纤维和蛋白质；高含量的功效成分：羧甲基茯苓多糖和人参皂甙、芦荟苷、多糖、生物碱；并且使该药食同源组合发酵物具有提高免疫力、治疗感冒、降尿酸的功效。
具体实施方式
本发明中提供一种药食同源组合发酵物，该药食同源组合发酵物含有活性成分总多糖200mg/g～320mg/g,羧甲基茯苓多糖18mg/g～35mg/g,芦荟苷2μg/g～5.5μg/g，人参皂苷10mg/g～17mg/g，生物碱0.8mg/g～1.3mg/g，益生菌1.0*1010cfu/g～2.0*1012cfu/g。
该药食同源组合发酵物是将药食同源组合物通过益生菌粉发酵制成，所述药食同源组合物含有茯苓20％～25％、芦荟10％～15％、山楂20％～35％、人参5％～10％、铁皮石斛叶30％～35％。益生菌粉含有发酵乳杆菌和短双歧杆菌中的至少1种，益生菌粉活性为1.0*108～5.0*1012cfu/g。其中，发酵乳杆菌为发酵乳杆菌CECT5716、短双歧杆菌为短双歧杆菌M-16V。
该药食同源组合发酵物的制备方法包括以下步骤：
a)药食同源组合物的制备：将茯苓粉、芦荟粉、山楂粉、人参、铁皮石斛叶混合后进行粉碎、过80目筛，按照1：5-1：10的料液质量比加水，在121℃下，灭菌10-30min；
b)益生菌的培养：将益生菌粉接种于发酵培养基中在25～45℃下培养12h-96h，益生菌发酵培养基为含大豆油5g-50g/L,蛋白胨3g-45g/L；酵母膏2g-10g/L，氯化钠0.1g-0.3g/L,氯化钾0.8g-1.0g/L,碳酸钙0.1g-0.3g/L,硫酸镁0.5g-3g/L,硫酸铵0.7g-4g/L,海藻糖0.8g-2.5g/L；
c)药食同源组合物发酵液的制备：将益生菌发酵液接种于药食同源组合物中，接种量为2mL/L-20mL/L，25～45℃下培养12h-96h；
d)药食同源组合物发酵浓缩液：药食同源组合物发酵液中加入10％-20％(质量比)的水解乳清蛋白粉，浓缩去除药食同源组合物发酵液80-90％的水分，水解乳清蛋白粉水解度为15-30；蛋白质含量为80-90％；
e)干燥：将药食同源组合发酵浓缩液进行真空冻干24h-48h得药食同源组合发酵物。
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
本发明中采用发酵乳杆菌CECT5716和短双歧杆菌M-16V进行发酵，使用这两种菌发酵效果更好，下述实施例1用于说明发酵乳杆菌CECT5716和短双歧杆菌M-16V的效果。
实施例1
1药食同源组合发酵物的制备方法如下：
1.1药食同源组合物的制备
20％茯苓粉、15％芦荟粉、20％山楂粉、10％的人参、35％铁皮石斛叶(质量比)混合后进行粉碎、过80目筛，按料液质量比1：10加水，在121℃下，灭菌15min。
1.2益生菌发酵培养基的制备
将大豆油10g/L,蛋白胨45g/L；酵母膏2g/L，氯化钠0.1g/L,氯化钾1.0g/L,碳酸钙0.1g/L,硫酸镁0.5g-3g/L,硫酸铵4g/L,海藻糖0.8g-2.5g/L，加入水中，在121℃下，灭菌15min。
1.3益生菌的培养
将分别含1.0*108cfu/g发酵乳杆菌CECT5716(A组)、1.0*108cfu/g短双歧杆菌M-16V(B组)、1.0*108cfu/g嗜酸乳杆菌NCFM(C组)、1.0*108cfu/g动物双歧杆菌Bb-12(D组)、1.0*108cfu/g鼠李糖乳杆菌LGG(E组)益生菌粉接种于发酵培养基中，在35℃下培养96h。F组不加入益生菌菌粉进行发酵。
1.4药食同源组合物发酵液的制备
将益生菌发酵液接种于药食同源组合物中，接种量为10mL/L，在35℃下培养96h。
1.5药食同源组合物发酵浓缩液的制备
将药食同源发酵液加入20％(质量比)水解度20的水解乳清蛋白粉，并进行浓缩去除90％水分。
1.6真空干燥：将药食同源组合发酵浓缩液进行真空冻干48h得药食同源组合发酵物。
2营养素、功效成分的测定
多糖的测定参考《GB5009.88-2014食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》、羧甲基茯苓多糖测定参考《欧立娟,王青,卢丽萍,等.羧甲基茯苓多糖含量测定[J].亚太传统医药,2013,9(7):27-29.》、芦荟苷的测定参考《张永文,陈玉武,李克明.RP—HPLC法测定芦荟中芦荟苷的含量[D].,1999.》人参皂甙的测定参考《GB/T22996-2008人参中多种人参皂甙含量的测定液相色谱-紫外检测法》、生物碱的测定参考《GB/T36942-2018化妆品中10种生物碱的测定液相色谱串联质谱法》。
3实验结果
表1不同益生菌对药食同源组合发酵物的影响
Figure BDA0002258961450000051
从表1中可以看出，药食同源组合物经过发酵后，其生物活性物质和益生菌增加，其中A组和B组增加的最多。
下面通过动物实验说明本实施例中制备的药食同源组合发酵物具有降尿酸的效果。
1、材料与方法
1.1实验动物：选用SPF级雄性SD大鼠，体重180±10g
1.2试验组别：试验分为空白对照组、模型组、苯溴马隆对照组、第一对照组、第二对照组、第一试验组、第二试验组，每组设30只大鼠。
1.3给药途径:灌胃给药(与人临床拟用药途径一致)。给药体积：1.5mL/100g。
1.4给药时间：造模的同时给予治疗药物灌胃，每日上午按体重灌胃1次。给药期限：连续给药28天。
药物配制：现用现配，称取一定量的受试物加入适量蒸馏水溶液，超声，搅拌混匀，备用。分组和组别情况见表2：
表2试验分组及给药情况
Figure BDA0002258961450000052
2试验方法：
氧嗪酸钾作为化学诱导剂可抑制尿酸分解，增加体内血清尿酸水平，导致体内血尿酸水平升高。本实验选择氧嗪酸钾作造模剂，观察受试物对大鼠高尿酸血症的影响。空白对照组腹腔注射生理盐水，其余各组腹腔注射氧嗪酸钾溶液；各给药组大鼠在造模的同时给予药物。
检测指标：实验周期为28d，期间每7天称取动物体重一次，每7天尾静脉取血一次，离心、分离血清。检测血清UA、尿素氮BUN、肌酐CRE。
3、结果统计与分析：
结果以均值±标准差表示；体重及血清生化指标分别用SPSS17.0统计软件计算出每组的平均值和标准差并进行ANOVA方差分析，P<0.05为显著性差异。
4、试验结果
4.1一般情况观察
试验前全部大鼠均状态良好。与正常对照组相比，模型组大鼠毛发欠光滑外，其外观体征、行为活动、粪便性状等未见明显差异。与模型对照组比较，其外观体征、行为活动、粪便性状等未见明显差异。
4.2对动物体重的影响
给药28d期间，与正常组比较，模型组大鼠第7、14、21、28d体重未见明显差异(P＞0.05)；与模型组比较，各给药组大鼠第7、14、21、28d体重未见明显差异见表3。
表3给药28d期间各组大鼠体重的变化(n＝30，x±s，g)
组别 给药前 第7天 第14天 第21天 第28天
A组 233.12±1.56 263.44±3.26 327.65±8.79 356.79±13.84 384.11±22.90
B组 239.02±2.32 261.02±2.82 317.43±8.36 361.72±11.06 386.22±24.20
C组 233.15±3.41 269.65±3.89 323.64±7.47 360.56±13.58 386.14±25.72
D组 235.33±3.02 267.45±3.82 332.52±7.76 372.76±13.34 384.41±20.27
E组 237.68±3.14 257.78±4.79 321.45±5.72 371.22±10.75 391.45±23.56
F组 235.13±2.34 259.23±4.74 333.44±7.55 375.34±13.62 399.984±20.53
G组 239.23±3.76 270.65±4.63 322.70±6.34 374.41±12.20 399.17±30.54
注：与正常组比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
4.3对动物血清尿酸(UA)水平的影响
与正常组(A组)相比，第14、21、28天模型组(B组)血清UA水平显著升高(P<0.01)。
与模型组(B组)比，给药第14、21天苯溴马隆组(C组)血清UA水平显著降低(P<0.05)；给药第28天苯溴马隆组(C组)血清UA水平显著降低(P<0.01)。
给药第14、21、28d，第一对照组(D组)、第二对照组(E组)血清UA水平未见明显降低((P＞0.05)，
第一试验组(E组)、第二试验组(G组)给药后14天大鼠血清UA水平显著降低(P<0.05)，给药后21、28天大鼠血清UA水平显著降低(P<0.01)；见表4。
表4给药28天期间各组大鼠UA(n＝30，x±s，μmol/l)水平变化
组别 给药前 第7天 第14天 第21天 第28天
A组 69.17±15.91 74.12±34.99 66.35±10.10 100.51±16.63 100.92±32.15
B组 60.23±19.39 76.55±20.47 110.92±33.80<sup>**</sup> 142.40±42.17<sup>**</sup> 152.96±31.07<sup>**</sup>
C组 68.35±17.72 79.78±35.13 89.52±12.45Δ 96.52±18.37Δ 82.61±19.04<sup>ΔΔ</sup>
D组 64.32±19.79 70.32±23.18 102.35±13.21 96.78±20.43 144.65±28.33
E组 69.63±12.57 72.45±20.44 100.58±24.32 94.32±25.98 131.78±30.26
F组 66.48±16.88 67.38±19.68 82.15±26.56Δ 78.72±24.21<sup>ΔΔ</sup> 82.58±12.78<sup>ΔΔ</sup>
G组 66.39±13.52 67.38±19.63 88.58±22.17Δ 75.92±24.65<sup>ΔΔ</sup> 91.58±22.16<sup>ΔΔ</sup>
注：与正常组比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
由上述试验结果可知，F组和G组可以具有降低尿酸的效果，而未经发酵的D组和E组则没有降低尿酸的效果。
下面通过人体试食试验说明本实施例中制备的药食同源组合发酵物具有降尿酸的效果。
1.1实验对象
100例患者均为高尿酸血症患者(男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L),男、女各50例。男女比例1：1，年龄在20-50岁之间，平均年龄34岁。2组患者年龄、病程等,差异均无显著性意义(P>0.05)。
1.2实验方法
患者服用本发明具体实施例1中A组制备药食同源组合发酵物500mg/kg*bw，每天1次，每次500mg/kg，持续14d，在此期间患者不服用任何其他药物。在试验前、第7天、第14天分别测定患者尿酸水平。
2、试验结果
表514天内患者UA(n＝50，x±s，μmol/l)水平变化
组别 治疗前 第7天 第14天
男性组 731±32 401±32<sup>**</sup> 361±32<sup>**</sup>
女性组 609±27 349±27<sup>**</sup> 309±27<sup>**</sup>
注：与治疗前比*P＜0.05，**P＜0.01
从表5中看出，经过服用实施例1中A组制备药食同源组合发酵物后，男性组尿酸水平在第7天和第14天都有显著下降，并且回到正常水平(P＜0.01)；男性组尿酸水平在第7天和第14天都有显著下降(P＜0.01)，并且回到正常水平。实施例1中A组制备药食同源组合发酵物可以降低高尿酸血症患者尿酸水平。
本发明中选用茯苓、芦荟、山楂、人参、铁皮石斛叶五种中药组合制备药食同源组合发酵物，五种中药协同增效，下述实施例2～3用于说明本发明中的中药组合的效果。
实施例2
1.药食同源发酵物的准备制备
1.1药食同源物的制备
A组：20％茯苓粉、15％芦荟粉、20％山楂粉、10％的人参、35％铁皮石斛叶(质量比)混合后进行粉碎、过80目筛。
B组：与A组同等质量的茯苓粉
C组：与A组同等质量的山楂粉
D组：与A组同等质量的人参
E组：与A组同等质量的铁皮石斛
A-E组分别混合后进行粉碎、过80目筛，按料液质量比1：10加水，在121℃下，灭菌15min。
1.2益生菌发酵培养基的制备
将大豆油10g/L,蛋白胨45g/L；酵母膏2g/L，氯化钠0.1g/L,氯化钾1.0g/L,碳酸钙0.1g/L,硫酸镁0.5g-3g/L,硫酸铵4g/L,海藻糖0.8g-2.5g/L，加入水中，在121℃下，灭菌15min。
1.3益生菌的培养
将分别含1.0*1012cfu/g发酵乳杆菌CECT5716益生菌粉接种于发酵培养基中，在35℃下培养48h。
将益生菌发酵液接种于药食同源组合物中，接种量为20mL/L，在35℃下培养96h。
1.5药食同源组合物发酵浓缩液的制备
将药食同源发酵液加入20％(质量比)水解度30的水解乳清蛋白粉，并进行浓缩去除90％水分。
1.6真空干燥：将药食同源组合发酵浓缩液进行真空冻干48h得药食同源组合发酵物。
2功效成分的测定
羧甲基茯苓多糖测定参考《欧立娟,王青,卢丽萍,等.羧甲基茯苓多糖含量测定[J].亚太传统医药,2013,9(7):27-29.》、芦荟苷的测定参考《张永文,陈玉武,李克明.RP—HPLC法测定芦荟中芦荟苷的含量[D].,1999.》、人参皂甙的测定参考《GB/T22996-2008人参中多种人参皂甙含量的测定液相色谱-紫外检测法》、生物碱的测定参考《GB/T36942-2018化妆品中10种生物碱的测定液相色谱串联质谱法》。
3实验结果
表6益生菌对不同药食同源物发酵的影响
组别 羧甲基茯苓多糖mg/g 芦荟苷mg/g 人参皂苷mg/g 生物碱mg/g
A组 29.1 5.36 15.1 1.16
B组 10.3 / / /
C组 / 2.24 / /
D组 / / 7.8 /
E组 / / / 0.59
从表6中得出，药食同源组合物(A组)比单一的药食同源(B-E组)经过发酵的生物活性物质增加了。
实施例3
1.药食同源组合发酵物的制备
1.1药食同源组合物的制备
25％茯苓粉、10％芦荟粉、25％山楂粉、10％的人参、30％铁皮石斛叶(质量比)混合后进行粉碎、过80目筛，按料液质量比1：10加水，在121℃下，灭菌15min。
1.2益生菌发酵培养基的制备
将大豆油5g/L,蛋白胨45g/L；酵母膏10g/L，氯化钠0.1g-0.3g/L,氯化钾0.8g/L,碳酸钙0.1g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸铵4g/L,海藻糖2.5g/L，加入水中，在121℃下，灭菌15min。
1.3益生菌的培养
将分别含1.0*1012cfu/g发酵乳杆菌CECT5716和1.0*1012cfu/g短双歧杆菌M-16V益生菌粉接种于发酵培养基中，在35℃下培养96h。
1.4药食同源组合物的制备
将益生菌发酵液接种于药食同源组合物中，接种量为10mL/L，在35℃下培养96h。
1.5药食同源组合物发酵浓缩液的制备
将药食同源发酵液加入20％(质量比)水解度30的水解乳清蛋白粉，并进行浓缩去除90％水分。
1.6真空干燥
将药食同源组合发酵浓缩液进行真空冻干48h得药食同源组合发酵物。
下面通过动物实验来进一步说明本实施例制备的药食同源组合发酵物的免疫调节功能。
1材料
1.1材料：
A组：按照本发明具体实施例4中制备药食同源组合发酵物的方法制备，其中药食同源组合物中不含茯苓粉；
B组：按照本发明具体实施例4中制备药食同源组合发酵物的方法制备，其中药食同源组合物中不含山楂粉；
C组：按照本发明具体实施例4中制备药食同源组合发酵物的方法制备，其中药食同源组合物中不含芦荟粉；
D组：按照本发明具体实施例4中制备药食同源组合发酵物的方法制备，其中药食同源组合物中不含人参；
E组：按照本发明具体实施例4中制备药食同源组合发酵物的方法制备，其中药食同源组合物中不含铁皮石斛叶；
F组：按照本发明具体实施例4中制备药食同源组合发酵物的方法制备，其中不加药食同源物。
G组：本发明具体实施实例4中的药食同源组合发酵物。
1.2实验动物SPF级5～6周岁昆明小鼠，雌雄各半，体质量18～22g。
1.3仪器与试剂13P-211D型十万分之一分析天平、KQ3200DE型超声波清洗器、XW-80A型涡旋混合器仪、TGL-16G型离心机、STAFAX-2100酶标仪、全自动生化分析仪器等；主要试剂为氢化可的松注射液(杭州四季青化生物工程材料有限公司)，IL-2、TNF-αELISA及INF-γ试剂盒，5％鸡血红细胞(CKBI)悬液(自制)。
2方法
2.1动物分组与给药：SPF级昆明小鼠300只，雌雄各半，体质量18～22g，随机分为正常对照组、模型组、左旋咪唑阳性对照组及7个实验组：茯苓多糖(A组)、山楂多糖(B组)、芦荟提取物(C组)、药食同源组合发酵物(D组)，每组30只。正常对照组和模型组灌胃生理盐水，0.3mL/d，连续14d；左旋咪唑组灌胃左旋咪唑，5mg/kg，连续14d；实验组分别灌胃A-G组发酵物100mg/kg，连续14d。5～10天皮下注射氢化可的松，50mg/d，连续6d。
2.2小鼠巨噬细胞吞噬功能试验各组小鼠末次给药次日，每只腹腔注射5％鸡血红细胞1mL，2h后取出腹腔渗出细胞，丙酮-甲醇(1∶1)固定染色，测定巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数。
2.3对小鼠免疫器官影响试验各组小鼠末次给药次日处死动物，摘取胸腺和脾脏，称量质量，计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数或脾脏指数＝脏器质量/体质量×100％。
2.4小鼠免疫器官及免疫因子的影响试验各组小鼠末次给药次日，摘眼球取血，分离血清，按试剂盒说明书方法测IL-2、TNF-α、IFN-γ的含量。
2.5统计学处理实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析，不同组间指标差异采用单因素方差分析。
3结果
3.1对氢化可的松致免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
与正常对照组比较，模型组巨噬细胞吞噬率和吞噬指数显著降低(P＜0.05)，表明动物模型造模成功；与模型组比较，G组小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数显著升高，表明药食同源组合发酵物能提高小鼠巨噬细胞吞噬功能，并其作用强于A-F组(表7)。
表7对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(x±s，n＝30)
组别 剂量mg/kg 吞噬率 吞噬指数
正常对照组 - 46.83±13.86 0.96±0.33
模型组 - 34.50±9.75 0.52±0.23
左旋咪唑阳性对照组 5.0 66.83±3.86<sup>*</sup> 1.26±0.13<sup>*</sup>
A组 100 60.83±3.76<sup>*</sup> 1.06±0.21<sup>*</sup>
B组 100 47.83±3.32 0.96±0.31
C组 100 56.83±4.44 1.00±0.93
D组 100 58.54±4.71 1.06±0.87
E组 100 48.83±3.92 0.96±0.61
F组 100 47.83±3.32 0.96±0.31
G组 100 76.83±4.56<sup>**</sup> 1.33±0.23<sup>**</sup>
注:与模型组比较，*P＜0.05**、P＜0.01
3.2对氢化可的松致免疫低下小鼠免疫器官指数的影响
与正常对照组比较，模型组胸腺指数和脾脏指数显著降低(P＜0.05)，表明氢化可的松所致小鼠免疫功能低下的模型造模成功；与模型组比较，药食同源组合发酵物(G组)胸腺指数和脾脏指数显著升高(P＜0.01)，表明药食同源组合发酵物具有提高免疫器官功能的作用，并其作用强于A-F组，见表8。
表8对氢化可的松致免疫低下小鼠免疫器官指数的影响(x±s，n＝30)
组别 剂量mg/kg 胸腺指数 脾脏指数
正常对照组 - 0.235±0.044 0.416±0.33
模型组 - 0.105±0.054 0.251±0.31
左旋咪唑阳性对照组 5.0 0.135±0.033<sup>*</sup> 0.360±0.23<sup>*</sup>
A组 100 0.125±0.014<sup>*</sup> 0.263±0.13
B组 100 0.100±0.043 0.270±0.27
C组 100 0.132±0.047<sup>*</sup> 0.301±0.28<sup>*</sup>
D组 100 0.131±0.014<sup>*</sup> 0.244±0.17
E组 100 0.153±0.034<sup>**</sup> 0.406±0.37<sup>**</sup>
F组 100 0.131±0.055<sup>*</sup> 0.387±0.38<sup>*</sup>
G组 100 0.155±0.044<sup>**</sup> 0.451±0.16<sup>*</sup>
注:与模型组比较，*P＜0.05**、P＜0.01
3.3对氢化可的松致免疫低下小鼠免疫因子的影响
与模型组比较，A-G组均能促进T细胞分泌，使氢化可的松所致免疫功能低下小鼠血清中IL-2、TNF-α和TNF-γ等免疫因子显著升高。但G组的作用最明显，强于A-F组以及对照组。见表9。
表9对氢化可的松致免疫低下小鼠血清中免疫因子含量的影响(x±s，n＝30)
Figure BDA0002258961450000121
以上结果表明，药食同源发酵提取物有调节免疫的作用。
下面通过人体实验说明本实施例制备的药食同源组合发酵物的治疗感冒效果。
1.1实验对象
300例患者均为门诊病例,随机分为3组,每组100例。男女比例1：1，年龄在20-60岁之间，平均年龄38岁。病程7天个星期内。3组患者年龄、性别、病程等,差异均无显著性意义(P>0.05)。
1.2实验方法
对照组：不做任何处理。
治疗组分两组：A组口服盐酸吗啉胍片,每次0.2g,每天3次；氨酚伪麻美芬片Ⅱ/氨麻苯美片(商品名:白加黑)日用片,每次1片,每天2次；夜用片每次1片,睡前服。两组均以5d为1个疗程,均治疗1个疗程后判断疗效。B组采用实施实例4中所述的药食同源组合发酵物，每天1次，每次100mg/kg，持续3d。
1.3疗效标准
治愈：症状及局部体征消失,全身情况恢复正常,体温正常并稳定2d以上。
好转：症状及局部体征部分消失,全身一部分情况恢复正常,体温正常并稳定1d以上。
无效：治疗前后无变化。
1.4实验结果
表10治疗感冒
组别 治愈 好转 无效
对照组 8例 30例 62例
A组 63例 20例 17例
B组 69例 21例 10例
从表10中可知本发明具有治疗感冒的效果，其功能相当于感冒药的效果，甚至更佳。
本发明在药食同源组合物冻干前加入水解乳清蛋白粉，取得的冻干效果较好，下述实施例用于说明加入水解乳清蛋白粉的效果。
实施例4
1.药食同源组合发酵物的制备
1.1药食同源组合物的制备
25％茯苓粉、10％芦荟粉、25％山楂粉、10％的人参、30％铁皮石斛叶(质量比)混合后进行粉碎、过80目筛，按料液质量比1：10加水，在121℃下，灭菌15min。
1.2益生菌发酵培养基的制备
将大豆油5gg/L,蛋白胨45g/L；酵母膏10g/L，氯化钠0.1g-0.3g/L,氯化钾0.8g/L,碳酸钙0.1g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸铵4g/L,海藻糖2.5g/L，加入水中，在121℃下，灭菌15min。
1.3益生菌的培养
将分别含1.0*108cfu/g发酵乳杆菌CECT5716和1.0*108cfu/g短双歧杆菌M-16V益生菌粉接种于发酵培养基中，在35℃下培养96h。
1.4药食同源组合物的制备
将益生菌发酵液接种于药食同源组合物中，接种量为10mL/L，在35℃下培养96h。
1.5药食同源组合物发酵浓缩液的制备
A组：将药食同源发酵液加入20％(质量比)水解度30的水解乳清蛋白粉，并进行浓缩去除90％水分。
B组：将药食同源发酵液加入20％(质量比)浓缩乳清蛋白粉，并进行浓缩去除90％水分。
C组：将药食同源发酵液加入20％(质量比)全脂奶粉，并进行浓缩去除90％水分。
D组：将药食同源发酵液加入20％(质量比)脱脂奶粉，并进行浓缩去除90％水分。
1.6真空干燥
将药食同源组合发酵浓缩液进行真空冻干48h得药食同源组合发酵物。
2水分含量和益生菌的测定
水分的测定参照《GB5009.3食品中水分的测定》，益生菌含量的测定参照《GB4789.35食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。
3实验结果
表11不同物质对药食同源组合发酵液真空干燥的影响
组别 水分含量g/100g 益生菌含量cfu/g
A组 0.018 7.8*10<sup>11</sup>
B组 0.087 1.8*10<sup>11</sup>
C组 0.121 6.9*10<sup>10</sup>
D组 0.13 3.8*10<sup>11</sup>
从表11得出，在药食同源组合发酵液中加入水解乳清蛋白，冻干效果最佳，得到的药食同源组合发酵物的水分含量最低，益生菌含量最高。

Claims (10)

1.一种药食同源组合发酵物，其特征在于：所述的药食同源组合发酵物含有活性成分总多糖200mg/g～320mg/g,羧甲基茯苓多糖18mg/g～35mg/g,芦荟苷2μg/g～5.5μg/g，人参皂苷10mg/g～17mg/g，生物碱0.8mg/g～1.3mg/g，益生菌1.0*1010cfu/g～2.0*1012cfu/g。
2.根据权利要求1所述的药食同源组合发酵物，其特征在于：所述药食同源组合发酵物是将药食同源组合物通过益生菌粉发酵制成，所述药食同源组合物含有茯苓、芦荟、山楂、人参、铁皮石斛叶。
3.根据权利要求2所述的药食同源组合发酵物，其特征在于：以质量百分比计，所述药食同源组合物含有茯苓20％～25％、芦荟10％～15％、山楂20％～35％、人参5％～10％、铁皮石斛叶30％～35％。
4.根据权利要求3或4所述的药食同源组合发酵物，其特征在于：所述益生菌粉含有发酵乳杆菌和短双歧杆菌中的至少1种。
5.根据权利要求4所述的药食同源组合发酵物，其特征在于：所述的益生菌粉活性为1.0*108～5.0*1012cfu/g。
6.根据权利要求4所述的药食同源组合发酵物，其特征在于：所述的发酵乳杆菌为发酵乳杆菌CECT5716、短双歧杆菌为短双歧杆菌M-16V。
7.权利要求1～6任一项所述的药食同源组合发酵物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a)药食同源组合物的制备：将茯苓粉、芦荟粉、山楂粉、人参、铁皮石斛叶混合后进行粉碎、过筛，加水，灭菌；
b)益生菌的培养：将益生菌粉接种于发酵培养基中培养；
c)药食同源组合物发酵液的制备：将益生菌发酵液接种于药食同源组合物中，发酵；
d)药食同源组合物发酵浓缩液：将药食同源发酵液加入水解乳清蛋白粉，浓缩；
e)干燥：将药食同源组合发酵浓缩液进行真空冻干得药食同源组合发酵物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中按照1：5-1：10的料液质量比加水。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤c)中益生菌发酵液的接种量为2mL～20mL/L。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的水解乳清蛋白粉水解度为15～30，蛋白质含量为80％～90％，加入的水解乳清蛋白粉与药食同源组合物发酵液的质量比为(1～2)：10。
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