ES2688538T3 - Composiciones crioprotectoras y uso de las mismas - Google Patents

Composiciones crioprotectoras y uso de las mismas Download PDF

Info

Publication number
ES2688538T3
ES2688538T3 ES11807839.3T ES11807839T ES2688538T3 ES 2688538 T3 ES2688538 T3 ES 2688538T3 ES 11807839 T ES11807839 T ES 11807839T ES 2688538 T3 ES2688538 T3 ES 2688538T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
composition
inositol
microorganisms
lactobacillus
trehalose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11807839.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Christophe HOLLARD
David FETT
Lars WEXØE PETERSEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DuPont Nutrition Biosciences ApS
Original Assignee
DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44802584&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2688538(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by DuPont Nutrition Biosciences ApS filed Critical DuPont Nutrition Biosciences ApS
Application granted granted Critical
Publication of ES2688538T3 publication Critical patent/ES2688538T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Composición que comprende: (a) al menos un azúcar no reductor, y (b) inositol o un derivado del mismo, en la que dicho derivado es un inositol en el que se ha modificado o sustituido al menos una función hidroxilo, en la que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es de 1,1 a 1,7, y (c) microorganismos.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Composiciones crioprotectoras y uso de las mismas Campo de la invención
La invención se refiere a composiciones crioprotectoras y a usos de las mismas.
Antecedentes de la invención
La actividad, la viabilidad y la conservación a largo plazo de material biológico, en particular microorganismos y células eucariotas, y de moléculas activas, por ejemplo, enzimas, se pueden ver afectadas por una diversidad de factores ambientales, por ejemplo, temperatura, pH, presencia de agua y oxígeno o agentes oxidantes o reductores. Por lo general, el material biológico y las moléculas activas, y en especial los microorganismos, se deben someter a un proceso de conservación para su conservación a largo plazo, por ejemplo se deben secar, congelar o liofilizar, antes o durante la mezcla con otros ingredientes de productos alimenticios o para el consumo directo como suplementos dietéticos. Estos procesos de conservación a menudo pueden dar como resultado una pérdida significativa de actividad y viabilidad debido a estrés mecánico, químico, y osmótico inducido por el proceso de conservación. Además, la pérdida de actividad y viabilidad se puede producir en muchas otras etapas distintas, por ejemplo el secado durante la fabricación de un producto alimenticio, la preparación del alimento (alta temperatura y alta presión), el transporte y el almacenamiento a largo plazo (temperatura y exposición a humedad), etc. La fabricación de alimentos o productos alimenticios con materiales vivos es particularmente exigente, debido a que los organismos vivos son muy sensibles a los procesos de conservación y a la temperatura y las condiciones de humedad del alimento o producto alimenticio.
Como resultado, la mayoría de los materiales biológicos o las moléculas activas pierden viabilidad o actividad durante el proceso de conservación, el proceso de fabricación, el transporte o el almacenamiento. Para compensar tal pérdida, se incluye una cantidad excesiva de material biológico o moléculas activas en el producto con la expectativa de que solo una parte sobreviva o permanezca activa. Además de una viabilidad cuestionable de vida en anaquel para estos productos, sin ninguna duda tales prácticas no son rentables. De ese modo, se han usado diversos agentes protectores en la técnica, con grados variables de éxito. Estos incluyen proteínas, ciertos polímeros, leche desnatada, glicerol, polisacáridos, y oligosacáridos. También se han sometido a ensayo disacáridos, tales como sacarosa y trehalosa (De Antoni, G.L. et al., Cryobology 26, 149-153 (1989); y Leslie, S. B. et al., Applied and Environmental Microbiology, Octubre de 1995, pág. 3592-3597), como crioprotectores.
Sin embargo, ninguno de los crioprotectores disponibles hasta la fecha son satisfactorios en términos de conservación de la viabilidad o de la actividad del material biológico o las moléculas activas. De ese modo, existe la necesidad de nuevos crioprotectores que confieran un aumento de viabilidad o un aumento de conservación de la actividad a material biológico o moléculas activas sometidos a un proceso de conservación, y en especial microorganismos. El documento de Patente US 2007/105186 desvela la conservación de células microbianas usando, entre otros, trehalosa e inositol.
Sumario de la invención
La invención se refiere a una composición sinérgica. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que una combinación particular de un azúcar o azúcares y un poliol o polioles, en una cantidad específica, aumenta la viabilidad y/o conservación de la actividad de material biológico o moléculas activas sometidos a un proceso de conservación, y en especial microorganismos.
De ese modo, la invención se refiere a composiciones que comprenden:
(a) un azúcar no reductor, y
(b) inositol o un derivado del mismo, en las que dicho derivado es un inositol en el que se ha modificado o sustituido al menos una de las funciones hidroxilo,
en las que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es de 1,1 a 1,7, y
(c) microorganismos.
La invención también se refiere a usos de las composiciones de acuerdo con la invención para conservar microorganismos.
La invención también se refiere a métodos para conservar microorganismos, que comprenden las siguientes etapas:
- preparar una composición de acuerdo con la invención,
- añadir dicha composición a microorganismos para obtener una composición que comprende material biológico
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
y/o moléculas activas,
- someter dicha composición que comprende microorganismos a al menos una etapa de conservación, en particular una etapa de congelación, secado o liofilización.
La invención también se refiere a microorganismos conservados obtenibles mediante un método de acuerdo con la invención.
La invención se refiere además a productos alimenticios, productos alimentarios, productos para el cuidado del consumidor o productos agrícolas que comprenden un material biológico y/o una molécula activa conservados de acuerdo con la invención.
Definiciones
De acuerdo con la invención, un "azúcar no reductor" es cualquier azúcar que, en solución, no contiene ningún carbonilo libre ni carbono anomérico, estando implicado en el enlace glucosídico el carbono carbonílico del grupo aldehído o cetona. El azúcar no reductor es por lo general un "disacárido no reductor" en el que los carbonos anoméricos de las dos unidades están unidos entre sí, tal como, por ejemplo, sacarosa, trehalosa, o los derivados de los mismos.
Por "derivado de trehalosa" se pretende indicar un compuesto que se obtiene a partir de trehalosa mediante un proceso químico o físico, en el que dicho compuesto no contiene ningún carbonilo libre ni carbono anomérico, estando implicado en el enlace glucosídico el carbono carbonílico del grupo aldehído o cetona.
Por "derivado de sacarosa" se pretende indicar un compuesto obtenido a partir de sacarosa mediante un proceso químico o físico, en el que dicho compuesto no contiene ningún carbonilo libre ni carbono anomérico, estando implicado en el enlace glucosídico el carbono carbonílico del grupo aldehído o cetona.
De acuerdo con la invención, "inositol" se refiere a ciclohexano-1,2,3,4,5,6-hexol (C6H12O6), que es un ciclohexano con seis grupos alcohol (poliol). "Inositol" de acuerdo con la invención se refiere a uno cualquiera de sus posibles estereoisómeros, tal como, por ejemplo, myo-, epi-, scylo-, chiro-, muco-, alo-, o meso-inositol.
De acuerdo con la invención, un "derivado de inositol" se refiere a inositol en el que se ha modificado o sustituido al menos una de las funciones hidroxilo. Algunos ejemplos de derivados de inositol son inositol fosfatado, sulfatado o metilado.
De acuerdo con la invención, una "composición crioprotectora" es una composición que proporciona a los compuestos o elementos cierta protección frente a los efectos perjudiciales de temperaturas bajas o de congelación, tales como a las que se someten, por ejemplo, en procesos de liofilización o congelación. Además, en el caso de liofilización o secado, confiere a los elementos secos cierta estabilidad a través del proceso de secado. La acción de la composición crioprotectora reducirá la pérdida de actividad o viabilidad durante el proceso de fabricación y posteriormente su acción mejora la actividad/viabilidad del material biológico o las moléculas activas durante el almacenamiento.
De acuerdo con la invención, "material biológico" se refiere a material que es capaz de autorreplicación ya sea directa o indirectamente. Algunos ejemplos representativos incluyen microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos, mohos, levaduras, archaea, protistas), algas, protozoos, células eucariotas, líneas celulares, hibridomas, plásmidos, virus, células de tejido de plantas, líquenes y semillas.
De acuerdo con la invención, una "molécula activa" se refiere a cualquier molécula que tiene un efecto en un tejido vivo. Algunos ejemplos de moléculas activas son proteínas que tienen actividad biológica, tales como, por ejemplo, enzimas, aminoácidos, proteínas, anticuerpos.
Descripción detallada de la invención
Composiciones
Los presentes inventores han descubierto que la presencia de una combinación de al menos un azúcar no reductor con inositol o un derivado de inositol en una composición que comprende material biológico y/o moléculas activas disminuye la pérdida de viabilidad y/o actividad de dicho material biológico y/o moléculas activas observada generalmente durante o después de un proceso de conservación. De ese modo, la invención se refiere a una composición que comprende:
(a) un azúcar no reductor, y
(b) inositol o un derivado del mismo, derivado en el que se ha modificado o sustituido al menos una función hidroxilo,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en la que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es de 1,1 a 1,7, y
(c) microorganismos.
Mediante el uso de esta combinación de azúcar o azúcares y poliol o polioles en la proporción particular de la invención se obtiene, por ejemplo, una excelente recuperación de células sometidas a un proceso de conservación. Dentro de esta proporción específica, esta combinación de azúcar o azúcares y poliol o polioles actúa como una sinergia.
En una realización, dicha composición de acuerdo con la invención consiste en:
(a) un azúcar no reductor, y
(b) inositol o un derivado del mismo, derivado en el que se ha modificado o sustituido al menos una función hidroxilo,
en la que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es de 1,1 a 1,7, y
(c) microorganismos.
Las composiciones de acuerdo con la invención tienen preferentemente una proporción p/p de (a)/(b) de 1,1 a 1,7. De acuerdo con una realización, las composiciones de acuerdo con la invención tienen una proporción p/p de (a)/(b) de 1,2 a 1,7, particularmente de 1,3 a 1,7, de 1,4 a 1,6, de 1,45 a 1,55 o, más particularmente, de 1,5.
En otra realización, en las composiciones de acuerdo con la invención, dicha (a) es una mezcla de azúcares no reductores.
En una realización particular, dicho azúcar o azúcares no reductores se seleccionan entre el grupo que comprende trehalosa, derivados de trehalosa, sacarosa, y derivados de sacarosa.
En una realización, en las composiciones de acuerdo con la invención, (a) es trehalosa y (b) es inositol. Composiciones que comprenden material biológico y/o moléculas activas
Las composiciones de acuerdo con la invención comprenden microorganismos, por lo general seleccionados entre bacterias, hongos, mohos, levaduras, archaea, protistas o cualquier mezcla de los mismos.
En una realización, dichos hongos/mohos se seleccionan entre Penicillium spp, Geotrichum spp, Lecanicillium spp, y Trichothecium spp.
En una realización, dichas levaduras se seleccionan entre Kluyveromyces spp, Debaryomyces spp, Yarrowia spp, Pichia spp, Williopsis spp, y Saccharomyces spp.
En una realización preferente, dichos microorganismos se seleccionan entre bacterias. Las bacterias se pueden seleccionar entre cualquier género o especie. Las bacterias preferentes de acuerdo con la invención son bacterias ácido lácticas, Bacillus y bacterias del género Corynebacterium tales como, por ejemplo, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp. De acuerdo con la invención, la expresión "bacterias ácido lácticas" incluye cualquier bacteria capaz de producir, como producto metabólico final principal de la fermentación de carbohidratos, ácido láctico o al menos uno de sus derivados (que incluyen, pero no se limitan a, ácido propiónico). Por lo tanto, el término pretende incluir bacterias del ácido propiónico (PAB), que producen ácido propiónico como producto de fermentación de carbohidratos. Preferentemente, las bacterias en la presente invención son bacterias ácido lácticas que se reconocen generalmente como seguras para consumo animal o humano (es decir, aprobadas como GRAS).
Las bacterias ácido lácticas adecuadas se pueden seleccionar entre los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Pediococcus, Streptococcus y las mezclas de los mismos. Por lo general, los microorganismos son probióticos o DFM (microorganismos de alimentación directa, o Direct Fed Microbials). De acuerdo con la invención, "probióticos" o "DFM" significa microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio saludable para el hospedador, siendo el hospedador un ser humano en el caso de los probióticos y un animal en el caso de los DFM.
En una realización particular, dichas bacterias ácido lácticas se seleccionan entre el grupo que comprende las cepas de las especies y subespecies de Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbruckii bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus pentoceus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
acidilactici, Pediococcus pervulus, Propionibacterium freudenreichi, Propionibacterium jenseni y Streptococcus salivarius.
En una realización, las composiciones que comprenden microorganismos de acuerdo con la invención comprenden microorganismos en una concentración de 1E8 CFU/g de composición a 5E12 CFU/g de composición,
particularmente de 1E9 CFU/g de composición a 1E12 CFU/g de composición, más particularmente de 1E10 CFU/g
de composición a 1E11 CFU/g de composición.
En una realización, las composiciones que comprenden material biológico y/o moléculas activas de acuerdo con la invención comprenden:
(a) al menos un 4 % en peso de dicho azúcar no reductor, y
(b) al menos un 3 % en peso de dicho inositol o un derivado del mismo,
en las que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es como se ha definido anteriormente.
En una realización particular, las composiciones que comprenden material biológico y/o moléculas activas de acuerdo con la invención comprenden:
(a) al menos un 5 %, particularmente al menos un 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, o al menos un 16 % en peso de dicho azúcar no reductor, y
(b) al menos un 4 %, particularmente al menos un 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, o al menos un 13 % en peso de dicho inositol o un derivado del mismo,
en las que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es como se ha definido anteriormente.
En otra realización, las composiciones que comprenden microorganismos de acuerdo con la invención comprenden:
(a) de un 4 % a un 16 %, particularmente de un 4 % a un 15 %, de un 4 % a un 14 %, de un 4 % a un 13 %, de
un 4 % a un 12 %, de un 5 % a un 13 %, de un 6 % a un 13 %, o de un 7 % a un 13 % en peso de dicho azúcar
no reductor, y
(b) de un 3 % a un 13 %, particularmente de un 3 % a un 12 %, de un 3 % a un 11 %, de un 3 % a un 10 %, de
un 3 % a un 9 %, de un 3 % a un 8 %, de un 4 % a un 10 %, de un 4 % a un 9 %, de un 5 % a un 10 %, o de un
5 % a un 9 % en peso de dicho inositol o un derivado del mismo,
en las que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es como se ha definido anteriormente.
Formulación de las composiciones de acuerdo con la invención
Las composiciones de acuerdo con la invención pueden ser sólidas, líquidas o estar en forma pastosa.
En una realización preferente están en forma líquida.
Las composiciones líquidas de acuerdo con la invención son por lo general composiciones acuosas (por ejemplo, los componentes están diluidos en agua).
Además del azúcar o azúcares y el poliol o polioles crioprotectores, y los microorganismos, las composiciones de acuerdo con la invención también pueden comprender otros componentes tales como, por ejemplo, otros disacáridos (por ejemplo melibiosa, lactulosa), oligosacáridos (por ejemplo rafinosa), oligofructosas, polisacáridos (por ejemplo maltodextrinas, dextrano, PEG, o goma de xantano, alginato, pectina, celulosa), pentosas (por ejemplo ribosa, xilosa), hexosas (por ejemplo fructosa, manosa, sorbosa), sales (fosfato, etc.).
Aplicaciones y métodos
Las composiciones de acuerdo con la invención son muy eficaces en la conservación de la viabilidad o la actividad de microorganismos. De ese modo, la invención se refiere al uso de una composición que comprende un azúcar no reductor e inositol o un derivado del mismo de acuerdo con la invención para la conservación de microorganismos. De hecho, gracias a las composiciones de acuerdo la invención, la viabilidad del material biológico y/o la actividad de las moléculas activas mejoran durante y después del proceso de conservación.
En una realización del uso de acuerdo con la invención, la composición que comprende un azúcar no reductor e inositol o un derivado del mismo de acuerdo con la invención se añade a los microorganismos antes de una etapa de conservación, tal como una etapa de congelación, secado o liofilización.
Las composiciones de acuerdo con la invención también son muy eficaces en la reducción de la higroscopicidad de microorganismos secos o liofilizados. Por higroscopicidad se pretende indicar la tendencia del material seco a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
absorber agua rápidamente y a cambiar sus propiedades físicas cuando su contenido de humedad aumenta.
La invención también se refiere a métodos para la conservación de material biológico o moléculas activas que comprenden las siguientes etapas:
- preparar una composición que comprende un azúcar no reductor e inositol o un derivado del mismo de acuerdo con la invención,
- añadir dicha composición a microorganismos para obtener una composición que comprende microorganismos,
- someter dicha composición que comprende microorganismos a al menos una etapa de conservación.
La etapa de conservación es preferentemente una etapa de congelación, secado o liofilización. La etapa de congelación, secado o liofilización se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos clásicos bien conocidos por el experto en la materia. Algunos ejemplos de procesos de conservación se desvelan, por ejemplo, en el siguiente documento: "bactéries lactiques, de la genetique aux ferments", George Corrieu y Francois-Marie Luquet, Lavoissier. Preferentemente, la etapa de conservación es una etapa de liofilización.
En una realización particular de los usos y los métodos de acuerdo con la invención, dichos microorganismos están en forma de un concentrado de microorganismos.
Un "concentrado de microorganismos" de acuerdo con la invención se refiere a microorganismos que se han sometido a al menos una etapa de concentración antes de su cultivo o síntesis. Algunos ejemplos de etapas de concentración son centrifugación, filtración, evaporación, sedimentación o floculación.
En una realización particular, la composición de acuerdo con la invención se añade al concentrado de microorganismos en las concentraciones que se han definido anteriormente.
La invención también se refiere a microorganismos congelados, secos o liofilizados conservados.
La invención también se refiere a productos alimenticios, productos alimenticios para animales, productos para el cuidado del consumidor o productos agrícolas que comprenden microorganismos conservados obtenibles mediante los métodos de acuerdo con la invención, especialmente microorganismos congelados, secos o liofilizados obtenibles mediante los métodos de acuerdo con la invención.
De acuerdo con la invención, por "producto alimenticio" se pretende indicar un producto o una preparación que está destinado para alimentar a un ser humano.
De acuerdo con la invención, por "producto alimenticio para animales" se pretende indicar un producto o preparación que está destinado a alimentar a un animal.
De acuerdo con la presente invención, "productos para el cuidado del consumidor" incluyen suplementos dietéticos, nutracéuticos y productos sin receta médica. Un consumidor puede ser un ser humano y/o un animal.
Un suplemento dietético (también denominado suplemento alimenticio o suplemento nutricional) significa una preparación destinada a proporcionar nutrientes, tales como vitaminas, minerales, fibra, ácidos grasos o aminoácidos, de los que carece, o que no se consumen en una cantidad suficiente en, la dieta de una persona. Un suplemento dietético puede ser para consumo humano y/o animal. Algunos ejemplos de suplementos dietéticos de acuerdo con la invención se envasan en polvo en sobrecitos o barritas, se incorporan en polvo a un comprimido, se rellenan en polvo en cápsulas.
El término "nutracéutico" significa un alimento funcional que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional y/o una satisfacción de sabor, sino que también es capaz de suministrar efectos terapéuticos (u otros efectos beneficiosos) al consumidor.
Un "producto sin receta médica" significa medicinas sin prescripción que pueden prevenir ciertas enfermedades o reducir síntomas asociados a salud intestinal o salud inmunitaria, estimulando de ese modo la salud intestinal o mejorando la función inmune. Por ejemplo, estos productos permiten la prevención y el tratamiento de alergias, la prevención y el tratamiento de infecciones del tracto respiratorio y otras aplicaciones nuevas de probióticos y microorganismos de alimentación directa (DFM).
De acuerdo con la presente invención, la expresión "producto agrícola" incluye biopesticidas, biofertilizantes, productos para el cuidado de las plantas, compost y productos secundarios así como productos de bioenergía (bioetanol, bioéster).
En una realización particular de la invención, dicho producto es un producto alimenticio. Más particularmente, el producto alimenticio es un producto lácteo. Algunos ejemplos de productos lácteos de acuerdo con la invención son leche fermentada, un yogur, una crema madurada, un queso, un queso fresco, una bebida de leche, un retentato de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
producto lácteo, un queso procesado, un postre de crema, un requesón o una leche para bebés. Más habitualmente, el producto lácteo de acuerdo con la invención incluye leche de origen animal y/o planta.
Todas las realizaciones específicas y preferentes que se han descrito anteriormente para las composiciones, por ejemplo la naturaleza de los microorganismos, las proporciones preferentes, etc., también se aplican para estos usos, métodos y productos.
Breve descripción de la figura
Figura 1: recuperación de células después de ensayo acelerado en función de la proporción de trehalosa/inositol. Ejemplos
Medición de recuentos celulares
El recuento celular del material liofilizado se evaluó a través de un método de recuento de bacterias habitual usado para bacterias ácido lácticas. En este método, las bacterias liofilizadas se suspendieron en una solución MRS con un homogeneizador Stomacher y se revitalizaron en esa solución durante 30 minutos. A continuación la suspensión se diluyó sucesivamente en botellas de tampón de peptona y finalmente se cultivó en un medio nutritivo mRs durante 48 a 72 horas a 38 °C en condiciones aerobias. Durante ese periodo, las bacterias forman colonias en el medio nutritivo. Estas colonias se contaron y los resultados se expresaron en forma de unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo.
Ensayo acelerado de estabilidad
La estabilidad a largo plazo de las bacterias liofilizadas en función del tiempo es una característica crítica para la aplicación comercial. La estabilidad a largo plazo se puede evaluar mediante ensayo acelerado de estabilidad que consiste en colocar células liofilizadas en una lámina delgada de aluminio laminada sellada en una cámara de temperatura constante mantenida a 38 °C durante catorce días. El recuento celular del material liofilizado se mide antes y después de la exposición a temperatura elevada. Se calcula la tasa de recuperación de las células restando las células medidas después del ensayo acelerado de estabilidad de la medición inicial de células y dividiendo los resultados de la resta por el recuento inicial. La tasa de recuperación del ensayo acelerado de estabilidad da una estimación relativa de la estabilidad de las células a largo plazo.
Ejemplo 1
Se mezclaron diversos crioprotectores (véase la Tabla 1) en una suspensión que contenía Lactobacillus acidophilus con un recuento celular aproximado de 1E11 CFU/g. La mezcla, denominada concentrado estabilizado, se mantuvo a 4-8 °C durante 1,5 h y se agitó continuamente antes de congelarse mediante dispersión de pequeñas gotas del concentrado estabilizado en nitrógeno líquido. Las gotas congeladas resultantes se denominan microgránulos congelados.
Tabla 1: Formulación de crioprotector basado en trehalosa sometido a ensayo en una suspensión de Lactobacillus
acidophilus.
Solución crioprotectora
Concentración de trehalosa (% p/p de concentrado estabilizado) Componente crioprotector adicional (% p/p de concentrado estabilizado)
Trehalosa sola del experimento 1
8 0
Trehalosa sola del experimento 2
14 0
Trehalosa con fosfato
13 1 como KHPO4
Trehalosa con EDTA
14 0,0021 como EDTA
Inositol solo
0 16,7 como Inositol
Trehalosa con inositol del experimento 1
14 3,4 como Inositol
Trehalosa con inositol del experimento 2
13 6,7 como Inositol
Trehalosa con Inosina Mono Fosfato (IMP)
14 3,4 como IMP
5
10
15
20
25
Los microgránulos congelados se liofilizaron en un liofilizador Virtis® a 100 mT y se llevó a cabo una medición de recuento celular justo después de la liofilización llevando a cabo un ensayo acelerado de estabilidad.
La Tabla 2 muestra los recuentos celulares iniciales, los recuentos celulares después del ensayo acelerado de estabilidad y la recuperación de células liofilizadas después del ensayo acelerado.
Tabla 2: Recuentos celulares y resultados de estabilidad acelerada para crioprotector basado en trehalosa sometido
a ensayo en una suspensión de L. acidophilus.
Solución crioprotectora
Recuentos de células viables después de liofilización (CFU/g) Recuento de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (CFU/g) Recuperación de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (%)
Trehalosa sola del experimento 1
7,4E+11 2,2E+11 29,0
Trehalosa sola del experimento 2
6,6E+11 2,4E+11 38,0
Trehalosa con fosfato
6,4E+11 1,3E+11 19,9
Trehalosa con EDTA
7,0E+11 1,9E+11 27,1
Inositol solo
3,2E+11 1,3E+11 41,0
Trehalosa con inositol del experimento 1
5,8E+11 3,2E+11 54,8
Trehalosa con inositol del experimento 2
5,0E+11 4,4E+11 89,0
Trehalosa con Inosina Mono Fosfato (IMP)
5,2E+11 1,2E+11 23,3
La Tabla 2 muestra que la mejor recuperación después del ensayo acelerado se consigue cuando la solución de trehalosa es al 13 % y el inositol es al 6,7 %, con una proporción de trehalosa/inositol = 1,9.
Ejemplo 2
También se sometieron a ensayo diversas proporciones de inositol con respecto a trehalosa. Los crio protectores se mezclaron durante 1 a 3 h a 10-30 °C hasta una suspensión que contenía Lactobacillus acidophilus con un recuento celular aproximado de 1E11 CFU/g. La mezcla se congeló y se liofilizó, y se llevó a cabo un recuento celular justo después de la liofilización llevando a cabo un ensayo acelerado de estabilidad, como se ha desvelado en el Ejemplo 1. La Tabla 3 da los resultados de este ensayo.
Tabla 3: Recuentos celulares y resultados de estabilidad acelerada para crioprotector basado en trehalosa sometido a ensayo en una suspensión L. acidophilus incluyendo la proporción de trehalosa con respecto a inositol y el porcentaje de recuperación de células después de ensayo acelerado de estabilidad.
Concentración de trehalosa (% p/p de concentrado estabilizado)
Concentración de inositol (% p/p de concentrado estabilizado) Proporción trehalosa/ inositol Recuentos de células viables después de liofilización (CFU/g) Recuperación de células viables de microgránulos congelados con respecto a microgránulos liofilizados (%) Recuentos de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (CFU/g) Recuperación de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (%)
6,7
4,4 1,5 4,03E+11 104,4 3,70E+11 91,81
6,7
4,4 1,5 4,21E+11 75,3 3,71E+11 88,12
6,7
4,4 1,5 4,14E+11 79,3 4,01E+11 96,86
6,7
4,4 1,5 4,15E+11 90,7 3,51E+11 84,58
8,2
2,9 2,8 6,26E+11 83,0 3,05E+11 48,72
8,2
2,9 2,8 5,95E+11 75,2 3,50E+11 58,82
Concentración de trehalosa (% p/p de concentrado estabilizado)
Concentración de inositol (% p/p de concentrado estabilizado) Proporción trehalosa/ inositol Recuentos de células viables después de liofilización (CFU/g) Recuperación de células viables de microgránulos congelados con respecto a microgránulos liofilizados (%) Recuentos de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (CFU/g) Recuperación de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (%)
8,2
2,9 2,8 6,20E+11 87,0 3,25E+11 52,42
8,2
2,9 2,8 5,70E+11 67,3 3,77E+11 66,14
0,0
9,1 0,0 5,14E+11 81,2 3,72E+11 72,37
12,0
8,0 1,5 4,53E+11 82,5 3,73E+11 82,34
8,3
8,3
1,0 4,49E+11 81,1 3,99E+11 88,86
4,3
8,7 0,5 5,33E+11 89,0 3,80E+11 71,29
12,1
7,3 1,7 4,41E+11 87,5 4,16E+11 94,33
12,3
5,7 2,1 4,30E+11 84,6 3,54E+11 82,33
12,4
5,0 2,5 4,86E+11 81,9 3,48E+11 71,60
12,5
4,2 3,0 4,58E+11 81,7 3,23E+11 70,52
0,0
20,0 0,0 3,70E+11 94,7 2,42E+11 65,41
La recuperación de células después del ensayo acelerado de estabilidad se representó gráficamente en función de la proporción de trehalosa/inositol y se muestra en la Figura 1. La curva muestra claramente un efecto sinérgico entre la trehalosa y el inositol. Inicialmente, la recuperación aumenta cuando la proporción aumenta. Se consigue un 5 valor óptimo alrededor de 1,5, después de lo cual la recuperación disminuye. Los mejores valores de recuperación se obtuvieron cuando la proporción de trehalosa/inositol está comprendida entre 1,1 y 1,9.
Ejemplo 3:
10 Se mezclaron crioprotectores preparados a partir de inositol con azúcar no reductor tal como trehalosa o sacarosa con una suspensión de Bifidobacterium lactis con un recuento celular aproximado de 1E11 CFU/g. La mezcla, denominada concentrado estabilizado, se mantuvo a 4 °C y se agitó continuamente antes de congelarse mediante dispersión de pequeñas gotas del concentrado estabilizado en nitrógeno líquido. Las cotas congeladas resultantes se denominan microgránulos. Los microgránulos congelados se liofilizaron a continuación en un liofilizador Virtis® al
15 vacío a 100 mT. Los microgránulos liofilizados se evaluaron por medición de los recuentos celulares justo después de la liofilización y llevando a cabo un ensayo acelerado de estabilidad. Además, se calculó la recuperación de células a partir de los microgránulos congelados con respecto a los microgránulos liofilizados. Las Tablas 4 y 5 dan los resultados del ensayo.
20 Tabla 4: Comparación de recuperación después de liofilización y recuperación después de ensayo acelerado de
estabilidad para un crioprotector que contiene trehalosa e inositol.
Azúcar no reductor = Trehalosa (% p/p)
Concentración de inositol (% p/p) Proporción trehalosa/ inositol Recuperación de células viables de microgránulos congelados con respecto a microgránulos liofilizados (%) Recuperación de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (%)
8,80
6,7 1,3 91,3 84,9
13,33
6,7 2,0 94,4 81,8
Tabla 5: Comparación de recuperación después de liofilización y recuperación después de ensayo acelerado de estabilidad para un crioprotector que contiene sacarosa e inositol.
Azúcar no reductor = Sacarosa (% p/p)
Concentración de inositol (% p/p) Proporción sacarosa/ inositol Recuperación de células viables de microgránulos congelados con respecto a microgránulos liofilizados (%) Recuperación de células viables después de ensayo acelerado de estabilidad (%)
8,80
6,7 1,3 102,0 82,5
13,33
6,7 2,0 91,1 84,9
5 La recuperación de biomasa estabilizada con trehalosa o con sacarosa tiene una recuperación de células similar después de liofilización o después del ensayo acelerado. Se puede usar azúcar no reductor en combinación con inositol para secar y conservar Bifidobacterium lactis con éxito.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Composición que comprende:
    (a) al menos un azúcar no reductor, y
    (b) inositol o un derivado del mismo, en la que dicho derivado es un inositol en el que se ha modificado o sustituido al menos una función hidroxilo,
    en la que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es de 1,1 a 1,7, y
    (c) microorganismos.
  2. 2. La composición de la reivindicación 1, en la que los microorganismos son bacterias.
  3. 3. La composición de la reivindicación 1, en la que los microorganismos son bacterias ácido lácticas.
  4. 4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, en la que dicha proporción p/p de (a)/(b) es de 1,3 a 1,7.
  5. 5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho (a) es una mezcla de
    azúcares no reductores.
  6. 6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dichos azúcar o azúcares no reductores se seleccionan entre el grupo que comprende trehalosa, 2,3,2',3'-tetra-O-bencil-6,6'-di-O-decanoil-4,4'- bis-O(difenilfosfono) alfa, alfa trehalosa, 6,6'-di-O-decanoil-4,4'-di-O-fosfono alfa, alfa trehalosa, 2,3,2',3'-tetra-O- bencil-4,4'-bis-O-(difenilfosfono) alfa, alfa trehalosa 6,6', éster de ácido graso, sacarosa, sacarosa-6 benzoato, sacarosa-6 acetato, sacarosa-6 glutarato y sacarosa-6 laurato.
  7. 7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho (a) es trehalosa y dicho (b) es inositol.
  8. 8. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dichas bacterias ácido lácticas se seleccionan entre el grupo que comprende las cepas de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Pediococcus, Streptococcus y las mezclas de las mismas.
  9. 9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en la que dichas bacterias ácido lácticas se seleccionan entre el grupo que comprende las cepas de las especies y subespecies Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbruckii bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus pentoceus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pervulus, Propionibacterium freudenreichi, Propionibacterium jenseni, Streptococcus salivarius y las mezclas de las mismas.
  10. 10. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 8 y 9, en la que dicha composición comprende microorganismos en una concentración de 1E8 CFU/g de composición a 5E12 CFU/g de composición.
  11. 11. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, y 8-10, en la que dicha composición comprende:
    (a) al menos un 4 % en peso de dicho azúcar no reductor, y
    (b) al menos un 3 % en peso de dicho inositol o un derivado del mismo.
  12. 12. Uso de una composición que comprende:
    (a) al menos un azúcar no reductor, y
    (b) inositol o un derivado del mismo, en la que dicho derivado es un inositol en el que se ha modificado o sustituido al menos una función hidroxilo,
    en la que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es de 1,1 a 1,7, para conservar microorganismos.
  13. 13. Método para conservar microorganismos, que comprende las siguientes etapas: preparar una composición que comprende:
    (a) al menos un azúcar no reductor, y
    (b) inositol o un derivado del mismo, en la que dicho derivado es un inositol en el que se ha modificado o
    sustituido al menos una función hidroxilo,
    en la que la proporción p/p de (a)/(b) de dichas composiciones es de 1,1 a 1,7,
    5 - añadir dicha composición a microorganismos, para obtener una composición que comprende
    microorganismos,
    - someter dicha composición que comprende microorganismos, a una etapa de congelación, secado o liofilización.
ES11807839.3T 2010-12-23 2011-12-21 Composiciones crioprotectoras y uso de las mismas Active ES2688538T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061426645P 2010-12-23 2010-12-23
US201061426645P 2010-12-23
EP10196808 2010-12-23
EP10196808 2010-12-23
PCT/US2011/066461 WO2012088261A1 (en) 2010-12-23 2011-12-21 Cryoprotective compositions and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2688538T3 true ES2688538T3 (es) 2018-11-05

Family

ID=44802584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11807839.3T Active ES2688538T3 (es) 2010-12-23 2011-12-21 Composiciones crioprotectoras y uso de las mismas

Country Status (5)

Country Link
US (4) US20140004083A1 (es)
EP (1) EP2654417B1 (es)
DK (1) DK2654417T3 (es)
ES (1) ES2688538T3 (es)
WO (1) WO2012088261A1 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2729559B1 (en) 2011-07-06 2018-08-22 DuPont Nutrition Biosciences ApS Method for reducing the viscosity of a microorganism-containing suspension or concentrate
WO2013024178A1 (en) 2011-08-18 2013-02-21 Chr. Hansen A/S Method for purifying bacterial cells
DK3287518T3 (da) 2012-08-20 2022-02-21 Chr Hansen As Fremgangsmåde til frysetørring af et bakterieholdigt koncentrat
EP2885396B1 (en) 2012-08-20 2020-02-19 Chr. Hansen A/S Method for optimizing a process for freeze drying a bacteria-containing concentrate
KR20180101636A (ko) * 2015-08-31 2018-09-12 시에이치알. 한센 에이/에스 항진균 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 박테리아
CN110475479A (zh) 2017-01-31 2019-11-19 堪萨斯州立大学研究基金会 微生物细胞、产生其的方法以及其用途
US11898184B2 (en) * 2017-09-07 2024-02-13 Sweet Sense Inc. Low glycemic sugar composition
CA3079562A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Ms Biotech, Inc. Methods of producing ensiled plant materials using megasphaera elsdenii
AU2019366968A1 (en) 2018-10-26 2021-05-27 Danisco Us Inc Stable microbial composition and drying process
BE1027135B1 (fr) 2019-03-21 2020-10-19 Aquatic Science Sa Composition pour optimiser le traitement biologique des piscines
BE1027133B1 (fr) 2019-03-21 2020-10-19 Aquatic Science Sa Procede pour optimiser le traitement biologique des piscines
EP4225031A1 (en) 2020-10-06 2023-08-16 Danisco US Inc. Readily dispersible shelf-stable bioactive granules
EP4056053A1 (en) 2021-03-12 2022-09-14 Biogaia AB Pre-conditioning of l. reuteri
CN117062543A (zh) 2021-03-12 2023-11-14 雀巢产品有限公司 Gos预处理乳杆菌菌株和最终制剂中的gos
EP4056052A1 (en) 2021-03-12 2022-09-14 Biogaia AB Gos pre-conditioning l. reuteri and gos in final formulation
JP2024515796A (ja) * 2021-04-30 2024-04-10 アランタ バイオ ホールディングス，エルエルシー 嫌気性微生物を保存するための組成物ならびにその作製および使用方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9002003D0 (en) 1990-01-29 1990-03-28 Ici Plc Stabilized cultures of microorganisms
GB9308734D0 (en) 1993-04-28 1993-06-09 Ici Plc Viable bacteria
US5827640A (en) * 1996-06-14 1998-10-27 Biostore New Zealand Limited Methods for the preservation of cells and tissues using trimethylamine oxide or betaine with raffinose or trehalose
US6743575B2 (en) 1996-06-14 2004-06-01 Biostore New Zealand Ltd. Compositions and methods for the preservation of living tissues
FR2813756B1 (fr) * 2000-09-11 2003-03-07 Imv Technologies Dilueur pour la conservation de spermatozoides de porcins
WO2004000335A1 (en) * 2002-06-19 2003-12-31 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Lactic acid bacteria cultures that inhibit food-borne pathogens
CN1259849C (zh) * 2002-06-28 2006-06-21 王建华 青贮专用乳酸菌接种剂及其制造方法
AU2003268033A1 (en) * 2002-07-26 2004-02-16 The General Hospital Corporation Systems and methods for cell preservation
US20050100559A1 (en) * 2003-11-07 2005-05-12 The Procter & Gamble Company Stabilized compositions comprising a probiotic
US20070105186A1 (en) * 2005-02-09 2007-05-10 Gibson Berman C Method for preserving microbial cells
JP5214464B2 (ja) 2005-12-28 2013-06-19 アドバンスド バイオニュートリション コーポレーション 多糖類、糖類およびポリオール類の乾燥マトリックスを含む、ガラス形態の、プロバイオティクス細菌用送達媒体およびその製造方法
DK2142635T3 (en) 2007-05-03 2018-08-20 Tobias Olofsson HISTORY OF UNKNOWN BACTERIA ISOLATED FROM HONEY BEER'S HONEY-PRODUCING CHANNEL
US7888062B1 (en) * 2010-02-01 2011-02-15 Microbios, Inc. Process and composition for the manufacture of a microbial-based product

Also Published As

Publication number Publication date
US20140004083A1 (en) 2014-01-02
US20210261908A1 (en) 2021-08-26
US20170369834A1 (en) 2017-12-28
DK2654417T3 (en) 2018-10-29
EP2654417B1 (en) 2018-07-11
WO2012088261A1 (en) 2012-06-28
US20190376023A1 (en) 2019-12-12
EP2654417A1 (en) 2013-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2688538T3 (es) Composiciones crioprotectoras y uso de las mismas
KR101604633B1 (ko) 유산균 배지 조성물 및 이를 이용한 유산균 분말의 제조 방법
Tripathi et al. Probiotic functional foods: Survival of probiotics during processing and storage
US10792316B2 (en) Lactic acid bacteria compositions
Zayed et al. Influence of trehalose and moisture content on survival of Lactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage
JP2015535280A (ja) 胃腸管において有益な細菌を刺激する方法及び組成物
US11291696B2 (en) Pairing probiotics and prebiotics, methods for growth and use, separately and in combination
CN105420111A (zh) 一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法
KR101927859B1 (ko) 초음파를 이용한 프로바이오틱스의 안정성과 코팅효율을 증가시키는 방법 및 그 방법으로 제조된 프로바이오틱스 동결건조분말을 유효성분으로 함유하는 식품조성물
CN105105146A (zh) 一种益生菌的活性保持方法及其在固态脂质食品中的应用
Tantratian et al. Select a protective agent for encapsulation of Lactobacillus plantarum
Jawan et al. Influence of type and concentration of lyoprotectants, storage temperature and storage duration on cell viability and antibacterial activity of freeze-dried lactic acid bacterium, Lactococcus lactis Gh1
Zhang et al. Protection of lyophilized milk starter Lactobacillus casei Zhang by glutathione
CN104271731A (zh) 包含活化的微生物生物质的组合物
CN111286469B (zh) 一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法
EP4012017A1 (en) Method for preparing pure plant-based microbial culture
CN109182129A (zh) 一种细菌保护剂及其应用
CN111107877A (zh) 储存细菌的方法和组合物
CN112795558A (zh) 一种提升乳酸菌稳定性的三层包埋方法
Tian et al. Effect of freeze-dried protectants on the survival rate and fermentation performance of fermented milk's directed vat set starters
Pyar et al. Effect of cryoprotective agents on survival and stability of Lactobacillus acidophilus cultured in food‐grade medium
Ge et al. Research progress on improving the freeze-drying resistance of probiotics: a review
You et al. Optimization of Protective Agents and Freeze-Drying Conditions for Lactobacillus casei LT-L614
Ge et al. Optimization of cryoprotectants for improving the freeze-dried survival rate of potential probiotic Lactococcus lactis ZFM559 and evaluation of its storage stability
CN110037157A (zh) 一种提高植物乳杆菌在口香糖制备及贮藏过程中稳定性的方法