CN111286469B - 一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法，属于益生菌发酵剂技术领域。该方法是收集副干酪乳杆菌的菌体，然后与冻干保护剂混合；冻干保护剂由脱脂奶粉，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，谷胱甘肽和水制备而成；然后将菌体和冻干保护剂的混合溶液平铺在冻干器皿中进行预冻处理，待冻结完全后将预冻好的样品进行真空冷冻干燥处理。本发明制备方法所制得的副干酪乳杆菌的冻干菌粉中菌体的存活因子达0.998±0.001，活菌数为2.35×10¹¹cfu/g，活菌数含量高。为副干酪乳杆菌产品的开发及其在乳制品、食品、医药等方面提供了必要的技术支持。

Description

一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法，属于益生菌发酵剂技术领域。

背景技术

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)群，广泛存在于奶酪、泡菜等发酵食品及人体胃肠道中，具有良好的耐酸及胆汁抗性，能降低血浆中胆固醇，具有促进人体肠道内病原体的清除、治疗肠道菌群紊乱从而防止食物过敏和急性腹泻、防止肿瘤产生等生理作用。

近年来，随着乳酸菌作用机制的不断研究，乳酸菌被广泛应用于食品行业、医药行业、轻工业及畜禽生产业等众多领域，这也促进了发酵剂种类的更新。目前制作乳酸菌发酵剂的方法有很多，主要有流化床干燥技术、喷雾干燥技术和真空冷冻干燥技术。其中流化床干燥技术是一种重要的包封技术，可以降低益生菌制剂的残留水分含量，但它不能用作益生菌的唯一干燥技术，通常与其他干燥技术(例如冷冻干燥或喷雾干燥)相结合使用，因此它的可用性有限。喷雾干燥技术处理量大，成本低，但进风温度和出口温度高，菌体存活率低，若降低温度，则容易出潮粉。真空冷冻干燥技术是将物料冻结到共晶点温度以下，在低压状态下，通过升华除去物料中水分的一种干燥方法。由于干燥过程中没有液态水，水分以固体状态就地升华，且在低温、低氧下进行，大多数生物反应停滞，使物料的原有结构和形状受到最小程度的破坏，保持菌种的形态、色泽，保存期长，储存运输、销售方便。

在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥两个步骤会对微生物的活性造成不同程度的影响，如减少细胞数量、细胞活性和酶活力降低，抗逆性下降等。为了减少这两个过程对微生物造成的损伤，需要采取有效的措施。

发明内容

为解决现有冻干工艺对于副干酪乳杆菌的损伤较大导致冻干菌粉中菌活力低且活菌数少的问题，本发明提供了一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法，该方法能够提高副干酪乳杆菌冻干存活因子及菌粉活菌数，采用的技术方案如下：

一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤一：将副干酪乳杆菌活化后进行扩大培养，待培养至指数中期时取菌液收集菌体，将收集的菌体重悬于与其等体积的培养基中制备成菌悬液，将菌悬液置于4℃～20℃下进行预处理2h，再置于37℃培养箱中培养至稳定期，离心去上清后重悬于1/10所述菌悬液体积的PBS溶液中，获得浓缩菌悬液，再用无菌生理盐水洗涤两遍后离心收集菌体，得到菌泥。

步骤二：将菌泥与冻干保护剂混合；所述冻干保护剂由脱脂奶粉，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，谷胱甘肽和水制备而成，调节冻干保护剂的pH至5.0～7.5；所述冻干保护剂与步骤一所述浓缩菌悬液的体积比为(1-3)：1；

步骤三：将步骤二所得菌体和冻干保护剂的混合溶液平铺在冻干器皿中使其在冻干器皿中的厚度为0.3cm～0.7cm，然后进行预冻处理，待冻结完全后将预冻好的样品进行真空冷冻干燥处理。

优选地，步骤一所述预处理是在15℃下预处理2h。

优选地，步骤二所述冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为10％-20％，蔗糖的质量浓度为10％-20％，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为5％-9％，谷胱甘肽的质量浓度为0.7％-1.3％。

更优选地，步骤二所述冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为15％，蔗糖的质量浓度为20％，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为7％，谷胱甘肽的质量浓度为1.3％。

优选地，所述冻干保护剂的制备方法为：将脱脂奶粉、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮溶解于一部分蒸馏水中，于100℃-115℃灭菌10min-20min，灭菌后冷却至室温，将谷胱甘肽溶解于另一部分蒸馏水中用0.22μm滤膜过滤，将所得两种溶液混合均匀，调节pH至5.0～7.5，获得冻干保护剂。

优选地，步骤二所述冻干保护剂与步骤一所述浓缩菌悬液的体积比为1.5：1。

优选地，步骤二调节冻干保护剂的pH至6.5。

优选地，步骤三所述预冻处理是在-196℃预冻处理15min。

优选地，步骤三中菌体和冻干保护剂的混合溶液在冻干器皿中的厚度为0.5cm。

优选地，步骤三所述的真空冷冻干燥条件为：冷阱温度为-55℃，真空度为0.160mbar～0.370mbar，时间为12h～36h。

本发明有益效果：

本发明提供了一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法，本发明根据副干酪乳杆菌的特性采用了一种复合保护剂，该复合保护剂由脱脂奶粉，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，谷胱甘肽和水制成，将脱脂奶粉，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮和谷胱甘肽复配后用作菌种复配保护剂获得了较好的菌种保护效果，同时在本发明制备方法中还在制备菌泥的过程中对菌体进行了预处理，即将菌体在4℃～20℃下放置2h，该处理可以提高菌体的抗性，使得菌体先产生应激反应，分泌一些抗冻物质，如抗冻蛋白，以获得更好的抗冻效果，以及在真空冷冻干燥之前还通过预冻处理，在特定的预冻温度和预冻时间等条件可以进一步减小菌体细胞在真空冷冻干燥过程中所受到的损伤。本发明所提供的各个步骤和各个工艺参数组合获得了较好的冻干效果，本发明制备得到的副干酪乳杆菌冻干菌粉存活因子达0.998±0.001，活菌数为2.35×10¹¹cfu/g，为副干酪乳杆菌产品的开发及其在乳制品、食品、医药等方面提供了必要的技术支持。

附图说明

图1为不同预冷条件对副干酪乳杆菌冻干存活因子的影响。

图2为保护剂pH值对副干酪乳杆菌冻干存活的影响。

图3为保护剂和菌悬液比例对副干酪乳杆菌冻干存活的影响。

图4为物料冻干厚度对菌体存活因子的影响，图中字母不同代表有显著性差异(P≤0.05)。

图5为预冻方式对副干酪乳杆菌存活因子的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1

1.材料与方法

1.1菌株

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，商业途径购买。

1.2工艺流程：

菌种活化→扩大培养→菌体收集→洗涤→离心收集→菌体悬浮液配制(添加冻干保护溶液)→活菌计数→真空冷冻干燥→存活因子的测定

1.3实验方法

1.3.1菌体活化与扩大培养

副干酪乳杆菌，经MRS平板划线培养后，挑选典型的单个菌落接至液体培养基中，37℃培养20h,连续活化2次，镜检无杂菌后按2％接种量接至液体培养基中进行扩大培养。

1.3.2菌体的收集

将培养好的菌液置于离心机中，5000×g，4℃条件下离心10min，弃上清液，用0.85％无菌生理盐水洗涤菌体两次后，再以同样的条件离心即得菌泥。

1.3.3菌体细胞的真空冷冻干燥法制备

真空冷冻干燥：离心收集菌泥后，加入保护剂溶液，计算初始细胞活菌数后分装进行冰箱预冻(-80℃，2h)，冻结完全后将预冻好的样品放入冷阱温度为-55℃，真空度为0.160～0.370mbar的真空冷冻干燥机内冻干12～36h，然后置于低温冰箱中保存备用。

1.3.4冻干保护剂的选择

1.3.4.1冻干保护剂的选择

选用脱脂奶粉、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和谷胱甘肽作为复合冻干保护剂，冻干保护剂的制备方法为：将脱脂奶粉、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮溶解于一部分蒸馏水中，于100℃-115℃灭菌10min-20min，灭菌后冷却至室温；将谷胱甘肽溶解于另一部分蒸馏水中用0.22μm滤膜过滤，将所得两种溶液混合均匀，调节pH至5.0～7.5，获得冻干保护剂。

1.3.4.2复合冻干保护剂的筛选

以存活因子为指标，通过正交实验L₉(3⁴)选出效果最佳的冻干保护剂配方，实验因素水平如表1。

表1保护剂正交因素水平表

1.3.5预冷

取生长到指数中期的菌悬液，用无菌生理盐水洗两次，重悬于等体积新鲜的MRS肉汤中，分别放置于4℃、10℃、15℃、20℃温度下处理2h。再置于37℃培养箱中培养至稳定期，按照1.3.3进行真空冷冻干燥处理，并计算菌体的存活因子。

1.3.6真空冷冻干燥保护剂pH值的选择

将筛选出来的复合保护剂用灭菌的乙酸或氨水分别调pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在37℃下与菌泥平衡20min后进行真空冷冻干燥，计算出菌体的存活因子。

1.3.7菌悬液和保护剂比例的确定

按照上述优化的试验方法，以菌悬液/保护剂(体积比)为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3的比例，研究其对菌体冻干存活因子的影响。

1.3.8冻干厚度的确定

在上述菌悬液和保护剂添加比例的基础上，对冻干厚度进行研究。将菌泥和保护剂振荡混匀后，以不同的厚度(0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm)装入玻璃平皿中，置于真空冷冻干燥机内进行冻干，计算其存活因子，确定出最佳的冻干厚度。

1.3.9预冻方式的选择

按照上述优化的试验方法，将样品分别置于-20℃冷冻2h，-80℃冷冻2h，-196℃冷冻15min，然后真空冷冻干燥24h，测菌体存活因子。

1.4测定方法

副干酪乳杆菌活菌数测定：平板培养计数法

冻干存活因子的测定：用平板计数法分别测定冻干前和冻干后的活菌数，计算菌体的冻干存活因子。冻干前活菌数为菌悬液中的活菌数；冻干后活菌数为冻干菌粉悬浮于10％的蔗糖溶液中，于37℃复水20-30min后，恢复活性后的活菌数。

冻干存活因子＝1-(logCFU_冻干前-logCFU_冻干后)/logCFU_冻干前

CFU_冻干前＝CFU/mL×v

CFU_冻干后＝CFU/g×m

式中：v代表冻干前菌悬液体积；m代表冻干后菌粉质量

2.结果与分析

2.1冻干保护剂的优化

2.1.1冻干保护剂正交试验

单独使用某种保护剂的效果并不理想，为进一步提高菌体存活因子，需对冻干保护剂进行复配实验。如表2所示，复合保护剂的最佳组合是即脱脂奶粉15％，蔗糖20％，PVP-K30 7％，GSH 1.3％。由于此组合未包含在正交试验的9个实验中，为了进一步确定实验结果，按最佳组合为保护剂进行冻干，验证试验，其存活因子为0.977，符合试验结果。

表2副干酪乳杆菌冻干保护剂正交试验结果

2.2预冷对副干酪乳杆菌冻干活力的影响

由图1可以看出，经过预冷处理后的细胞，真空冷冻干燥后存活因子都普遍升高。当冷胁迫温度为4℃时，与未处理组相比，菌体存活因子升高幅度不大。可能是在4℃下，细胞的代谢迟缓，不会或很少产生应激反应。10℃冷激的菌体细胞存活因子较对照组提高0.003，效果比4℃稍好。15℃冷激效果最佳，菌体细胞冻干后存活因子达到0.984，但20℃时冷激产生效果有所下降，可能是预冷温度升高，乳酸菌受到的刺激减小，从而产生抗冷冻干燥的物质减少所造成的。所以选择15℃2h作为预冷处理。

2.3复合保护剂pH的选择

由图2可以看出，在pH为6.5时，菌体冻干后存活因子最高，pH过低时不利于菌体保持活力，当pH高于6.5时，菌体存活因子下降，可能是因为偏离乳酸菌生长的最适pH值，不利于菌体冷冻干燥。

2.4菌悬液和保护剂比例对菌体冻干存活的影响

由图3可知，当菌悬液和保护剂比例为1:1.5时，菌体的冻干存活因子最大，随着保护剂比例的增加，菌体存活因子下降，一方面可能是因为保护剂浓度过高，细胞的通透性下降，水分挥发受阻，导致较多冰晶生成，从而造成细胞死亡率增大；另一方面可能是因为保护剂过多，单位体积或质量菌粉活菌数减少。因此，选择菌悬液和保护剂比例为1:1.5时为最佳配比。

2.5冻干物料厚度对菌体冻干存活因子的影响

如图4所示，从冻干厚度来看，随着厚度的增加，菌体存活因子不断上升，当厚度达到0.5cm时，存活因子达到最大值，为0.994，但继续增加厚度，菌体的冻干活性下降。因此，选择0.5cm为最佳冻干厚度。

2.6预冻方式的确定

由图5结果显示，当用液氮预冻时，副干酪乳杆菌的存活因子达到0.998±0.001，显著高于-20℃预冻效果，也高于-80℃预冻效果。这可能是因为在-20℃条件下预冻，形成的冰晶大，在干燥阶段，升华速度慢，从而导致菌体活力下降。

3.结论

副干酪乳杆菌冻干保护剂配方为：脱脂奶粉15％，蔗糖20％，聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)7％，谷胱甘肽(GSH)1.3％；真空冷冻干燥的工艺参数为在15℃下预处理2h，保护剂pH为6.5，菌悬液和保护剂的体积比为1:1.5，冻干厚度为0.5cm，预冻方式为在-196℃下处理15min。即：本发明副干酪乳杆菌冻干菌粉的最优制备方法如下：

步骤一：将副干酪乳杆菌活化后进行扩大培养，待培养至指数中期时取菌液收集菌体，将收集的菌体重悬于与其等体积的培养基中制备成菌悬液，将菌悬液置于15℃下进行预处理2h，再置于37℃培养箱中培养至稳定期，离心去上清后重悬于1/10所述菌悬液体积的PBS溶液中，获得浓缩菌悬液，再用无菌生理盐水洗涤两遍后离心收集菌体，得到菌泥。

步骤二：将菌泥与冻干保护剂混合；所述冻干保护剂由脱脂奶粉，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，谷胱甘肽和水制备而成，调节冻干保护剂的pH至6.5；所述冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为15％，蔗糖的质量浓度为20％，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为7％，谷胱甘肽的质量浓度为1.3％；所述冻干保护剂与步骤一所述浓缩菌悬液的体积比为1.5：1；

步骤三：将步骤二所得菌体和冻干保护剂的混合溶液平铺在冻干器皿中使其在冻干器皿中的厚度为0.5cm，然后在-196℃预冻处理15min，待冻结完全后将预冻好的样品在冷阱温度为-55℃，真空度为0.160mbar～0.370mbar，时间为12h～36h的体检下进行真空冷冻干燥处理。

在此条件下，副干酪乳杆菌经真空冷冻干燥后存活因子达0.998±0.001，活菌数为2.35×10¹¹cfu/g。

为说明本发明所能够获得的效果，进行了如下实验：

对照组1：以脱脂奶粉，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮和水制备成的冻干保护剂(冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为15％，蔗糖的质量浓度为20％，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为7％)，其他按照上述所优化的副干酪乳杆菌冻干菌粉的最优制备方法进行；

对照组2：以脱脂奶粉，蔗糖，谷胱甘肽和水制备成的冻干保护剂(冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为15％，蔗糖的质量浓度为20％，谷胱甘肽的质量浓度为1.3％)，其他按照上述所优化的副干酪乳杆菌冻干菌粉的最优制备方法进行；

对照组3：以脱脂奶粉，蔗糖和水制备成的冻干保护剂(冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为15％，蔗糖的质量浓度为20％)，其他按照上述所优化的副干酪乳杆菌冻干菌粉的最优制备方法进行。

将对照组1-3所制备的副干酪乳杆菌的冻干菌粉进行存活因子和活菌数的检测，结果如下：

对照组1：存活因子达0.951，活菌数为6.86×10¹⁰cfu/g；

对照组2：存活因子0.943，活菌数为5.56×10¹⁰cfu/g；

对照组3：存活因子达0.932，活菌数为4.16×10¹⁰cfu/g。

本发明制备方法获得的副干酪乳杆菌冻干粉中存活因子达0.998±0.001，活菌数为2.35×10¹¹cfu/g，将对照组1-3与本发明制备方法比较可知：本发明制备方法相比于不采用聚乙烯吡咯烷酮和谷胱甘肽以及只含有聚乙烯吡咯烷酮或谷胱甘肽的技术方案，在存活因子和活菌数方面都获得了显著的提升，本发明通过将聚乙烯吡咯烷酮和谷胱甘肽一同使用，二者可以起到协同保护作用，协同显著减小冻干过程对菌体活力和数量的损伤，使得菌体具有较高的活力和活菌数量，尤其是在存活因子方面。

综上可知本发明通过将聚乙烯吡咯烷酮和谷胱甘肽一同使用可以起到协同保护作用，协同显著减小冻干过程对菌体活力和数量的损伤，使得菌体具有较高的活力和活菌数量，相比于不采用聚乙烯吡咯烷酮和谷胱甘肽或者只采用聚乙烯吡咯烷酮或谷胱甘肽的技术方案获得了预料不到的技术效果。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：将副干酪乳杆菌活化后进行扩大培养，待培养至指数中期时取菌液收集菌体，将收集的菌体重悬于与其等体积的培养基中制备成菌悬液，将菌悬液置于4℃~20℃下进行预处理2h，再置于37℃培养箱中培养至稳定期，离心去上清后重悬于1/10所述菌悬液体积的PBS溶液中，获得浓缩菌悬液，再用无菌生理盐水洗涤两遍后离心收集菌体，得到菌泥；所述预处理是在15℃下预处理2h；

步骤二：将菌泥与冻干保护剂混合；所述冻干保护剂由脱脂奶粉，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，谷胱甘肽和水制备而成，调节冻干保护剂的pH至5.0~7.5；所述冻干保护剂与步骤一所述浓缩菌悬液的体积比为（1-3）：1；所述冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为10%-20%，蔗糖的质量浓度为10%-20%，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为5%-9%，谷胱甘肽的质量浓度为0.7%-1.3%；

步骤三：将步骤二所得菌体和冻干保护剂的混合溶液平铺在冻干器皿中使其在冻干器皿中的厚度为0.3cm~0.7 cm，然后进行预冻处理，待冻结完全后将预冻好的样品进行真空冷冻干燥处理；所述预冻处理是在-196℃预冻处理15 min。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二所述冻干保护剂中脱脂奶粉的质量浓度为15%，蔗糖的质量浓度为20%，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为7%，谷胱甘肽的质量浓度为1.3%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂的制备方法为：将脱脂奶粉、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮溶解于一部分蒸馏水中，于100℃-115℃灭菌10min-20min，灭菌后冷却至室温，将谷胱甘肽溶解于另一部分蒸馏水中用0.22μm滤膜过滤，将所得两种溶液混合均匀，调节pH至5.0~7.5，获得冻干保护剂。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二所述冻干保护剂与步骤一所述浓缩菌悬液的体积比为1.5：1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二调节冻干保护剂的pH至6.5。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三中菌体和冻干保护剂的混合溶液在冻干器皿中的厚度为0.5cm。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三所述的真空冷冻干燥条件为：冷阱温度为-55℃，真空度为0.160mbar~0.370 mbar，时间为12h~36 h。

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