CN113150996A - 一种乳酸菌复合冻干保护剂及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳酸菌复合冻干保护剂及其应用方法，所述保护剂组份具体如下：甘油、海藻酸钠、谷氨酸钠、脱脂奶粉和过滤除菌的抗坏血酸；所述保护剂应用方法，具体如下：在乳酸菌发酵培养到对数生长中期14h，加入灭菌的甘油、海藻酸钠、谷氨酸钠；对数生长中后期16h停止发酵，发酵液离心得到菌泥，5000rpm，20min；菌泥中加入灭菌的脱脂奶粉和过滤除菌的抗坏血酸。整体操作简单，操作步骤和条件明确，与现有技术相比，获得的乳酸菌粉活性高，存活率更高，常温存放衰减缓慢，无需低温存放减少能耗。成本更低，适合大规模生产应用。

Description

一种乳酸菌复合冻干保护剂及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种乳酸菌复合冻干保护剂，具体涉及一种乳酸菌复合冻干保护剂及其应用方法，属于乳酸菌复合冻干保护技术领域。

背景技术

对培养得到的乳酸菌菌泥直接喷雾干燥，喷雾干燥具有低成本,高效快速,可连续生产等优点,是一种潜在的可替代冷冻干燥用于制备乳酸菌菌粉的干燥技术,但喷雾干燥过程中热空气对乳酸菌的致死效应导致干燥后乳酸菌的存活率较低，此外，喷雾干燥能耗高；其中，冷冻干燥是广泛认可的对生物最适的脱水方法，目前最为常用，但降温过程细胞内外会形成冰晶，各种机械应力会损伤细胞，减少冻干得率，常温存放由于大分子物质变性失活菌体衰亡较快；另外，可使用冷冻保护剂减少冷冻干燥过程对菌体的损伤；本领域中已经使用了各种保护剂，并且具有不同程度的成功；这些成分保护剂分可为渗透性和非渗透性两大类，非渗透性为细胞外液抗冻保护剂，如蛋白、多糖、聚合物等，保护细胞表面免受伤害，渗透性保护剂为小分子化合物，如氨基酸、有机酸、低分子糖类和糖醇(多羟基化合物)类，其结合水能力强，可以增加溶液粘性，减少冰晶损伤和渗透压损伤；然而，就生物材料的生存力或活性的保存而言，迄今为止可用的冷冻保护剂都不令人满意，有一定保护效果但作用不明确；冻干保护剂的选择和用量不同，会导致冻干后乳酸菌收的率出现很大的波动，并且冻干保护剂不能保证乳酸菌长时间常温放置的活性，效果好的保护剂操作复杂，成本高，不利于扩大生产和实际利用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种乳酸菌复合冻干保护剂及其应用方法，能够提高冷冻干燥后乳酸菌的存活能力和长期储存能力；通过对保护剂成分的改进和优化，改进使用方式，得到冻干得率更高，保存时间更久的产品，且常温存放活菌数衰减慢，适合常温储藏或者进一步进行包被包埋处理，与低温储藏相比减少能耗，与现有能常温储存的保护剂相比操作简单，条件明确，适合大规模使用，成本更低。

本发明的乳酸菌复合冻干保护剂，所述保护剂组份具体如下：甘油、海藻酸钠、谷氨酸钠、脱脂奶粉和过滤除菌的抗坏血酸。

进一步地，所述甘油、海藻糖和谷氨酸钠加无菌水，并进行灭菌，灭菌温度115℃，灭菌时间20min，完成灭菌后放置到常温；脱脂奶粉加无菌水并进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间15min，完成灭菌后放置到常温；加入0.2μm水滤膜过滤除菌的抗坏血酸。

进一步地，所述保护剂添加量根据离心得到菌泥的湿重添加，菌泥湿重与保护剂湿重为1：1.25其余组分为无菌水。

一种乳酸菌复合冻干保护剂应用方法，其特征在于，所述方法具体如下：

在乳酸菌发酵培养到对数生长中期14h，加入灭菌的甘油、海藻酸钠、谷氨酸钠；对数生长中后期16h停止发酵，发酵液离心得到菌泥，5000rpm，20min；菌泥中加入灭菌的脱脂奶粉,过滤除菌的抗坏血酸。

进一步地，所述方法还包括：

混匀的菌泥平铺到冻干盘中厚度不超过1cm，0.5～0.8cm最佳，放入-30℃预冻4h，-50℃冷冻2h，-80℃冷冻2h；冻透的菌泥放入冻干机，-55℃，真空度10pa条件下冷冻干燥12h，-20℃，真空度30pa条件下干燥12h，得到菌饼；菌饼在低温粉碎机中粉碎，抽真空用铝膜包装封口。

与现有技术相比，本发明的乳酸菌复合冻干保护剂及其应用方法具有如下有益效果：

本发明对乳酸菌冻干保护剂进行优化，采用可渗透的甘油和海藻糖在对数生长末期添加，离心得到菌泥再添加其余保护剂成分，冻干得到菌粉，优选合适的成分和用量，改进使用方式，使各成分充分发挥功效，制备的冻干菌粉有得率高，活菌数高，长期常温储放效果显著提升，与常规低温储藏模式相比能耗减少，效果提高；冻干得到的乳酸菌存活率更高，常温长期储放活菌数更高，衰减缓慢，与现有方法比得到的产品品质更高；无需低温储藏减少能耗，操作简单，无需液氮研磨，滤膜过滤浓缩等复杂，高成本的操作，适宜进一步包被和大规模生产应用。

附图说明

图1为本发明的实施例1乳酸菌根据OD值和菌体重绘制生长曲线示意图。

具体实施方式

如图1所示的乳酸菌复合冻干保护剂，所述保护剂组份具体如下：甘油、海藻酸钠、谷氨酸钠、脱脂奶粉和过滤除菌的抗坏血酸；其中，非渗透性保护剂为脱脂奶粉，可以充当填充物质，使冻干产品形成理想蓬松的团块，此外奶粉中的蛋白质成分可以包裹乳酸菌，减少细胞外造成的损伤，减少胞内物质泄露。渗透性保护剂甘油和海藻糖可以进入细胞，提高玻璃态转化度，增加细胞粘度，减少冷冻过程胞内冰晶造成的伤害，其中羧基可以与细胞的蛋白质和脂质结合，减少脱水引起的结构改变，维持形态保持活性；海藻糖为非还原二糖，对于菌体长期存放效果好；谷氨酸钠可以进入细胞调节渗透压，抗坏血酸可以减少长期存放细胞膜中脂质和蛋白的氧化；冷冻前维持整体固体成分在4～25％，其余成分为无菌水。

其中，所述甘油、海藻糖和谷氨酸钠混合加无菌水，无菌水不少于混合液总量的20％，并进行灭菌，灭菌温度115℃，灭菌时间20min，完成灭菌后放置到常温；脱脂奶粉加无菌水，调制脱脂奶粉浓度大于10％；并进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间15min，完成灭菌后放置到常温；加入0.2μm水滤膜过滤除菌的抗坏血酸；所述保护剂添加量根据离心得到菌泥的湿重添加，菌泥湿重与保护剂湿重为1：1.25其余组分为无菌水。

实施例1：

一种乳酸菌复合冻干保护剂应用方法，所述方法具体如下：

S1：培养乳酸菌培养使用MRS液体培养基；按比例配置3.5L作为发酵罐培养基，两瓶160ml作为种子培养基；3.5L培养基的碳源要与氮源分开灭菌；所述培养基制备：蛋白胨10g、牛肉浸粉8.6g、酵母浸粉5g、K₂HPO₄2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温801mL、MgSO₄·7H₂O 0.58g、MnSO₄·4H₂O0.25g和蒸馏水1000mL；培养条件：37℃；培养：16h，转速60rpm；不通气或通入氮气；菌株为植物乳杆菌，甘油管-80℃冷冻保存；发酵菌数：3.0×10¹⁰-1.0×10¹¹cfu/mL；

S2：取1mL甘油管保藏的菌种，分别接入160mL种子培养基中；

S3：37℃静置培养16h，一瓶用于种子瓶，一瓶用于取样测定生长曲线；

S4：接种后每两小时取样10ml用于测量OD₆₀₀，离心得到菌体重；

S5：种子瓶接种到灭菌后降温至37℃的3.5L发酵罐中，流加氨水维持pH＝6.00；

S6：该乳酸菌发酵培养到对数生长中期14h加入灭菌的甘油1～5％、海藻酸钠1～5％、谷氨酸钠0.5～2％；

S7：对数生长中后期16h停止发酵，发酵液离心得到菌泥，5000rpm，20min；

S8：菌泥中加入灭菌的脱脂奶粉10～20％,过滤除菌的抗坏血酸0.15～0.5％；

S9：混匀的菌泥平铺到冻干盘中厚度不超过1cm，0.5～0.8cm最佳，放入-30℃预冻4h，-50℃冷冻2h，-80℃冷冻2h；

S10：冻透的菌泥放入冻干机，-55℃，真空度10pa条件下冷冻干燥12h，-20℃，真空度30pa条件下干燥12h，得到菌饼；

菌饼在低温粉碎机中粉碎，抽真空用铝膜包装封口。

a、本发明对培养菌种的测定生长曲线如图1所示，

其为0～24h，每间隔2h测定一次；其测量数据如下：

OD600：0.057、0.071、0.419、0.668、0.941、1.212、1.612、1.95、2.10、2.205、2.09、2.045。

b、摇瓶取16h发酵液离心，得到菌体含量占发酵液3.68％，按此比例配置添加保护剂；分别取与保护剂混匀的湿菌泥和冻干的菌泥，倾注法活菌计数，每个处理3个重复冻干存活率为：(m1/m2).100％；其中，m1为1g湿菌泥冻干后活菌数；m2为1g湿菌泥冻干前活菌数，其测量结果如表1所示；

表一

组别	冻干前活菌数	冻干后活菌数	冻干存活率
				A	9.2×10<sup>11</sup>cfu/g	3.1×10<sup>11</sup>cfu/g	33.7％
B	9.3×10<sup>11</sup>cfu/g	7.8×10<sup>11</sup>cfu/g	85.0％
				C	9.8×10<sup>11</sup>cfu/g	9.2×10<sup>11</sup>cfu/g	93.9％

其中，A未添加保护剂，B离心后菌泥添加保护剂，C本实施例添加方法。准确称取冻干后样品，将称量皿连同样品置于105℃烘箱内，开盖，3h后取出，加盖，置于干燥皿中冷却25～30min后，将盖盖紧，于分析天平中称重；重复以上操作至恒重；残留水分含量按下式计算：

[(G 2-G 1)/m]*100％；

其中，G 1为恒重后样品和包装总质量(g)；G 2为烘干前样品和包装总质量(g)；m为样品质量(g),20.69g样品烘干至恒重；残留水分含量＝(40.16-39.10)/20.69*100％＝5.12％

冻干后菌粉，常温放置样品每月取样一次，每次1g，连续取半年，对样品溶液进行梯度稀释，其数据如表2所示，

表2

其中，A未添加保护剂；B离心后菌泥添加保护剂；C本实施例添加方法；真空冷冻干燥得到的菌粉收率93.9％，残留水分含量5.12％；常温储放六个月，活菌数仍有77.4％，达2.94×10¹²cfu/g

本发明乳酸菌接种量为培养基体积的3～8％，该乳酸菌发酵培养到对数生长中期加入灭菌的甘油1～5％、海藻酸钠1～5％、谷氨酸钠0.5～2％。发酵时间16～30h，pH控制在6～6.5，对数生长中后期停止发酵，离心收集菌体备用，加入灭菌后的脱脂奶粉10～20％,抗坏血酸0.15～0.5％；摊平不超过1cm厚度进行预冻，-50℃预冻4小时，初次冻干在-55℃，真空度10pa的冷冻干燥器冻干，二次冻干再-20℃，真空度30pa冻干12h，得到菌饼，低温粉碎得到菌粉，用铝膜在真空条件下密封。

上述实施例，仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。

Claims (5)

1.一种乳酸菌复合冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂组份具体如下：甘油、海藻酸钠、谷氨酸钠、脱脂奶粉和过滤除菌的抗坏血酸。

2.根据权利要求1所述的乳酸菌复合冻干保护剂，其特征在于：所述甘油、海藻糖和谷氨酸钠加无菌水，并进行灭菌，灭菌温度115℃，灭菌时间20min，完成灭菌后放置到常温；脱脂奶粉加无菌水并进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间15min，完成灭菌后放置到常温；加入0.2μm水滤膜过滤除菌的抗坏血酸。

3.根据权利要求1所述的乳酸菌复合冻干保护剂，其特征在于：所述保护剂添加量根据离心得到菌泥的湿重添加，菌泥湿重与保护剂湿重为1：1.25其余组分为无菌水。

4.一种乳酸菌复合冻干保护剂应用方法，其特征在于，所述方法具体如下：

在乳酸菌发酵培养到对数生长中期14h，加入灭菌的甘油、海藻酸钠、谷氨酸钠；对数生长中后期16h停止发酵，发酵液离心得到菌泥，5000rpm，20min；菌泥中加入灭菌的脱脂奶粉和过滤除菌的抗坏血酸。

5.根据权利要求1所述的乳酸菌复合冻干保护剂应用方法，其特征在于：所述方法还包括：

混匀的菌泥平铺到冻干盘中厚度不超过1cm，0.5～0.8cm最佳，放入-30℃预冻4h，-50℃冷冻2h，-80℃冷冻2h；冻透的菌泥放入冻干机，-55℃，真空度10pa条件下冷冻干燥12h，-20℃，真空度30pa条件下干燥12h，得到菌饼；菌饼在低温粉碎机中粉碎，抽真空用铝膜包装封口。

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