CN116376777A - 一种植物乳杆菌冻干粉剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂及其制备方法。所述植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法包括以下步骤：(1)将活化后的植物乳杆菌进行培养得到植物乳杆菌菌液；(2)将所述植物乳杆菌菌液离心得到菌泥；(3)将所述菌泥与保护剂混合后进行冷冻干燥得到植物乳杆菌冻干粉剂；所述保护剂包括以下重量份的组分：脱脂乳15～20份、蔗糖10～30份、丙三醇2～10份、山梨醇2～10份。本发明首先富集植物乳杆菌，采用本发明选择的保护剂和冻干条件，制得的植物乳杆菌冻干粉剂在储藏过程中依然能够保持较高的活力，且制备方法简便，便于后续的使用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种植物乳杆菌冻干粉剂及其制备方法。
背景技术
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)中的一种，其常存在于发酵的蔬菜和果汁中。植物乳杆菌属于益生菌的一种，也是肠道的正常菌群之一，能够改善肠道菌群、维持肠道微环境平衡、增强胃肠的消化吸收功能。植物乳杆菌还具有很多的保健功效，可对免疫进行调节，抑制致病菌，促进营养物质吸收，抑制肿瘤细胞形成等。除此之外，植物乳杆菌还能够应用到生活生产中，如净化水质、降低水体中的氨氮和亚硝酸盐等有害物质、维持水体pH等作用，在食品、饲料及医疗保健等领域有着广泛应用。
在使用植物乳杆菌时一般是使用其微生物制剂，但是在将植物乳杆菌制备成微生物制剂时制备工艺会影响到植物乳杆菌的功效，在制备制剂的过程中最需要注意的便是微生物的存活率与储存时间。现有的保存微生物制剂的方法为冷冻干燥处理，虽然冻干处理操作简单使用方便，但是冻干处理后的微生物生物活性降低，长期储存后会对微生物造成不可逆的损伤，不利于长期储存。因此，如何在长期储存微生物制剂的同时提高微生物的存活率是现如今亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌冻干粉剂及其制备方法，采用本发明制备方法制备得到的植物乳杆菌冻干粉剂在储藏过程中能够使微生物保持较高活力，便于后续使用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将活化后的植物乳杆菌进行培养得到植物乳杆菌菌液；
(2)将所述植物乳杆菌菌液离心得到菌泥；
(3)将所述菌泥与保护剂混合后进行冷冻干燥得到植物乳杆菌冻干粉剂；
所述保护剂包括以下重量份的组分：脱脂乳15～20份、蔗糖10～30份、丙三醇2～10份、山梨醇2～10份。
优选的，步骤(1)中所述培养时所用培养基为MRS液体培养基。
优选的，步骤(1)中所述培养的条件为：接种量5～10％，培养温度33～37℃，搅拌速度100～200r/min，培养时培养基的pH值为5.2～5.7。
优选的，步骤(1)中所述植物乳杆菌菌液的活菌数>109CFU/mL。
优选的，步骤(1)中所述培养过程中对培养基进行补料一次，所述补料的时间为开始进行培养后15～20h，所述补料量为原料液量体积的10～15％。
优选的，步骤(2)中所述离心的温度为0～5℃，所述离心的转速为6000～8000r/min，所述离心的时间为5～15min。
优选的，步骤(3)中所述菌泥与保护剂的比例为1g:1～2mL。
优选的，步骤(3)中所述冷冻干燥前进行预冻处理，所述预冻处理的温度为-85～-40℃，所述预冻处理的时间为1～3h。
优选的，步骤(3)中所述冷冻干燥的条件为：温度-85～-75℃，压力10～50pa，时间28～32h，冻干厚度5～10mm。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的植物乳杆菌冻干粉剂。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂及其制备方法，本发明首先对植物乳杆菌进行高密度培养，通过设置离心条件富集植物乳杆菌，降低植物乳杆菌菌体的损失率。为减少冻干处理对植物乳杆菌的影响，在冻干处理前添加保护剂来获得较高存活率的菌体，在冻干过程中，原本是水分子与菌体细胞膜上的亲水基及蛋白质极性基团结合，但是保护剂中的羟基取代了水分子，从而保证胞内结合水及蛋白质结构稳定性，保护了细胞结构。冻干处理后制成的制剂在保护剂的存在下能够维持较高存活率，储存时间大大延长，在微生物领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为不同接种量对植物乳杆菌的生长情况的影响；
图2为不同培养温度对植物乳杆菌的生长情况的影响；
图3为培养液不同pH值对植物乳杆菌的生长情况的影响；
图4为不同转速对植物乳杆菌的生长情况的影响；
图5为预冻条件对植物乳杆菌冻干存活率的影响；
图6为植物乳杆菌冻干时间和含水量以及存活率之间的关系。
具体实施方式
本发明提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将活化后的植物乳杆菌进行培养得到植物乳杆菌菌液；
(2)将所述植物乳杆菌菌液离心得到菌泥；
(3)将所述菌泥与保护剂混合后进行冷冻干燥得到植物乳杆菌冻干粉剂。
在本发明中，首先将活化后的植物乳杆菌进行培养得到植物乳杆菌菌液，所述植物乳杆菌购自兰州大学益生菌与生物饲料研究中心，将植物乳杆菌经MRS液体培养基活化2～3次，划线接种到MRS固体培养皿中，放入37℃恒温培养箱下培养48h，待其长出菌落后，挑取单个菌落涂片，然后进行革兰氏染色镜检，确定纯种无杂菌后，挑取纯种菌落接种到MRS液体培养基中作为种子液。
在本发明中，所述培养的条件为：接种量5～10％，优选为6～9％，进一步优选为7～8％；培养温度33～37℃，优选为34～36℃，进一步优选为35℃；搅拌速度100～200r/min，优选为120～180r/min，进一步优选为140～160r/min；培养时培养基的pH值为5.2～5.7，优选为5.3～5.6，进一步优选为5.4～5.5，所述培养基的pH通过流加25％的氨水来维持。
在本发明中，所述植物乳杆菌菌液的活菌数>109CFU/mL，优选为1.2×109～1.8×109CFU/mL，进一步优选为1.4×109～1.6×109CFU/mL。
在本发明中，所述培养过程中对培养基进行补料一次，所述补料的时间为开始进行培养后15～20h，优选为16～19h，进一步优选为17～18h；所述补料量为原料液量体积的10～15％，优选为11～14％，进一步优选为12～13％。
在本发明中，将上述植物乳杆菌菌液离心得到菌泥，所述离心的温度为0～5℃，优选为1～4℃，进一步优选为2～3℃；所述离心的转速为6000～8000r/min，优选为6500～7500r/min，进一步优选为6800～7200r/min；所述离心的时间为5～15min，优选为6～14min，进一步优选为8～12min。
在本发明中，将上述菌泥与保护剂混合后进行冷冻干燥得到植物乳杆菌冻干粉剂，所述保护剂包括以下重量份的组分：脱脂乳15～20份、蔗糖10～30份、丙三醇2～10份、山梨醇2～10份，优选的，包括以下重量份的组分：脱脂乳16～19份、蔗糖15～25份、丙三醇4～8份、山梨醇4～8份，进一步优选的，包括以下重量份的组分：脱脂乳17～18份、蔗糖18～22份、丙三醇5～6份、山梨醇5～6份。
在本发明中，所述菌泥与保护剂的比例为1g:1～2mL，优选为1g:1.2～1.8mL，进一步优选为1g:1.4～1.6mL。
在本发明中，所述冷冻干燥前进行预冻处理，所述预冻处理的温度为-85～-40℃，优选为-70～-50℃，进一步优选为-65～-55℃；所述预冻处理的时间为1～3h，优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。
在本发明中，所述冷冻干燥的条件为：温度-85～-75℃，优选为-83～-78℃，进一步优选为-81～-79℃；压力10～50pa，优选为15～45pa，进一步优选为20～30pa；时间28～32h，优选为29～31h，进一步优选为30h；冻干厚度5～10mm，优选为6～9mm，进一步优选为7～8mm。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的植物乳杆菌冻干粉剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌经MRS液体培养基活化2次，划线接种到MRS固体培养皿中，放入37℃恒温培养箱下培养36h，待其长出菌落后，挑取单个菌落涂片，然后进行革兰氏染色镜检，确定纯种无杂菌后，挑取纯种菌落接种到MRS液体培养基中进行扩大培养作为种子液。具体扩大培养的方法为：挑取纯种菌落接种到2mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h；将发酵好的菌液按照1％的接种量接种到100mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h；最后按照10％的接种量扩大到1000mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h，得到种子液。将种子液以5％的体积比接种到18L MRS培养液中，以培养温度33℃，搅拌速度200r/min进行培养，在培养过程中通过流加25％的氨水来使培养过程中的pH维持在5.2，并且在开始进行培养后15h后进行补料一次，补料量为2L。当植物乳杆菌菌液的浓度达到109CFU/mL时停止培养。
(2)将上述植物乳杆菌菌液放入低温高速离心机中，以4℃，6000r/min离心15min后得到菌泥。
(3)配制植物乳杆菌的保护剂，由以下重量份的组分制得：10份脱脂乳、15份蔗糖、1份丙三醇、3份山梨醇，溶解在100份无菌水中。将上述菌泥与保护剂以1g:1mL比例混合，将菌悬液以10mm的厚度进行冻干，先在-60℃条件下预冻2h，然后在-80℃，压力30pa的条件下冻干30h，即得到植物乳杆菌冻干粉剂。
实施例2
本实施例提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌经MRS液体培养基活化3次，划线接种到MRS固体培养皿中，放入37℃恒温培养箱下培养36h，待其长出菌落后，挑取单个菌落涂片，然后进行革兰氏染色镜检，确定纯种无杂菌后，挑取纯种菌落接种到MRS液体培养基中进行扩大培养作为种子液。具体扩大培养的方法为：挑取纯种菌落接种到2mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h；将发酵好的菌液按照1％的接种量接种到100mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h；最后按照10％的接种量扩大到1000mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h，得到种子液。将种子液以7％的体积比接种到18L MRS培养液中，以培养温度35℃，搅拌速度150r/min进行培养，在培养过程中通过流加25％的氨水来使培养过程中的pH维持在5.7，并且在开始进行培养后20h后进行补料一次，补料量为2L。当植物乳杆菌菌液的浓度达到1010CFU/mL时停止培养。
(2)将上述植物乳杆菌菌液放入低温高速离心机中，以4℃，8000r/min离心5min后得到菌泥。
(3)配制植物乳杆菌的保护剂，由以下重量份的组分制得：8份脱脂乳、5份蔗糖、1份丙三醇、1份山梨醇，溶解在100份无菌水中。将上述菌泥与保护剂以1g:2mL比例混合，将菌悬液以5mm的厚度进行冻干，先在-70℃条件下预冻3h，然后在-75℃，压力10pa的条件下冻干32h，即得到植物乳杆菌冻干粉剂。
实施例3
本实施例提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌经MRS液体培养基活化2次，划线接种到MRS固体培养皿中，放入37℃恒温培养箱下培养36h，待其长出菌落后，挑取单个菌落涂片，然后进行革兰氏染色镜检，确定纯种无杂菌后，挑取纯种菌落接种到MRS液体培养基中进行扩大培养作为种子液。具体扩大培养的方法为：挑取纯种菌落接种到2mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h；将发酵好的菌液按照1％的接种量接种到100mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h；最后按照10％的接种量扩大到1000mL MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧发酵培养8～12h，得到种子液。将种子液以9％的体积比接种到18L MRS培养液中，以培养温度37℃，搅拌速度100r/min进行培养，在培养过程中通过流加25％的氨水来使培养过程中的pH维持在5.5，并且在开始进行培养后16h后进行补料一次，补料量为3L。当植物乳杆菌菌液的浓度达到109CFU/mL时停止培养。
(2)将上述植物乳杆菌菌液放入低温高速离心机中，以4℃，6000r/min离心10min后得到菌泥。
(3)配制植物乳杆菌的保护剂，由以下重量份的组分制得：8份脱脂乳、10份蔗糖、3份丙三醇、3份山梨醇，溶解在100份无菌水中。将上述菌泥与保护剂以1g:1.5mL比例混合，将菌悬液以7mm的厚度进行冻干，先在-85℃条件下预冻1h，然后在-85℃，压力20pa的条件下冻干28h，即得到植物乳杆菌冻干粉剂。
对比例1
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(1)中种子液以3％的体积比接种到18LMRS培养液中，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(1)中接种到MRS培养液后的培养温度为40℃，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(1)中接种到MRS培养液后设置培养液的pH值为5.9，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(1)中接种到MRS培养液后设置培养液的pH值为6.2，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(1)中接种到MRS培养液设置培养液的pH值为6.5，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(1)中搅拌速度为50r/min，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(2)中离心条件为：4℃，5000r/min离心5min，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例8
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(3)中保护剂由以下重量份的组分制得：12份脱脂乳、5份蔗糖、5份丙三醇、3份山梨醇，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例9
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(3)中保护剂由以下重量份的组分制得：12份脱脂乳、10份蔗糖、1份丙三醇、5份山梨醇，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例10
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(3)中保护剂由以下重量份的组分制得：12份脱脂乳、15份蔗糖、3份丙三醇、1份山梨醇，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例11
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(3)中，菌泥与保护剂的混合比例为1g:2.5mL，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例12
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(3)中，菌泥与保护剂的混合比例为1g:3mL，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
对比例13
与实施例1相比，本对比例与实施例1区别在于，步骤(3)中，预冻处理的温度为-20℃，预冻处理的时间为2h，其余操作步骤与参数同实施例1相同。
实验例1
本实验例探究了制备植物乳杆菌冻干粉剂时制备步骤中的参数对植物乳杆菌活性的影响。
(1)种子液接种量对植物乳杆菌活菌数的影响
实施例1～3与对比例1的结果图见图1，由图1可知，接种量对植物乳杆菌活菌数有显著影响，采用本发明接种量能够使植物乳杆菌活菌数维持在一个较高的水平。
(2)接种到MRS培养液后的培养温度对植物乳杆菌活菌数的影响
实施例1～3与对比例2的结果图见图2，由图2可知，培养温度对植物乳杆菌活菌数有显著影响，采用本发明培养温度能够使植物乳杆菌活菌数维持在一个较高的水平。
(3)培养过程中的pH值对植物乳杆菌增殖的影响
实施例1～3和对比例3～5的结果图见图3，由图3可知，培养液的pH值对植物乳杆菌增殖有显著影响，采用本发明pH值能够使植物乳杆菌活菌数维持在一个较高的水平。
(4)搅拌速度对植物乳杆菌活菌数的影响
实施例1～3与对比例6的结果图见图4，由图4可知，搅拌速度对植物乳杆菌活菌数有显著影响，采用本发明搅拌速度能够使植物乳杆菌活菌数维持在一个较高的水平。
(5)离心条件对植物乳杆菌活菌数的影响
实施例1～3与对比例7的结果见表1，其中，待离心后倒出上清液，对其进行梯度稀释涂布；向管中添加和上清液等体积生理盐水并与管中剩余菌泥混合，对其进行梯度稀释涂布，待培养后分别检测各自活菌数。根据以上数据计算离心上清液菌体细胞损失率和离心后菌体细胞存活率(收得率)。
离心损失率％＝上清液菌数(cfu/ml)/初始活菌数(cfu/ml)×100％；
离心收得率％＝沉淀细胞活菌数(cfu/ml)/初始活菌数(cfu/ml)×100％。
由表1可知，离心条件对植物乳杆菌活菌数有显著影响，采用本发明离心条件能够减少植物乳杆菌菌体细胞损失，提高菌体细胞得率。
表1.离心条件对植物乳杆菌收集情况的影响
(6)保护剂中各组分配比对植物乳杆菌冻干存活率的影响
实施例1～3与对比例8～10的结果见表2，由表2可知，保护剂中各组分配比对植物乳杆菌冻干存活率有显著影响，采用本发明保护剂能够提高植物乳杆菌冻干存活率。
表2.保护剂中各组分配比对植物乳杆菌冻干存活率的影响
(7)菌泥与保护剂的比例对植物乳杆菌冻干存活率的影响
实施例1～3与对比例11～12的结果见表3，由表3可知，菌泥与保护剂的比例对植物乳杆菌冻干存活率有显著影响，采用本发明菌泥与保护剂的比例能够提高植物乳杆菌冻干存活率。
表3.菌泥与保护剂的比例对植物乳杆菌冻干存活率的影响
| 组别 | 菌泥：保护剂(g:mL) | 冻干存活率％ |
| 实施例1 | 1:1 | 79.74±0.66 |
| 实施例2 | 1:2 | 79.99±0.63 |
| 实施例3 | 1:1.5 | 84.84±0.14 |
| 对比例11 | 1:2.5 | 75.59±1.11 |
| 对比例12 | 1:3 | 70.48±0.14 |
(8)预冻条件对植物乳杆菌冻干存活率的影响
实施例1与对比例13的结果见图5，由图5可知，采用本发明预冻条件能够显著提高植物乳杆菌的冻干存活率。
(9)冻干时间对植物乳杆菌冻干存活率的影响
在微生物储存期间，水分是影响其稳定性的关键因素。当冻干发酵剂的含水量为1.5～3.0％时，可以获得较高的存活率以及较长时间的储存期。如果含水量＞3.0％，发酵剂贮藏稳定性会随着水分的增大而降低；而当含水量＜1.5％时，由于干燥过度，菌体细胞严重脱水，细胞的冻干死亡率则被提高。冻干开始直至第15h以前，目测物料未完全干燥，无法确定冻干时间对细胞存活的影响。以实施例1的制备方法为例，从15h开始取样，测定冻干时间和活菌数以及物料含水量之间的动态变化情况。结果见图6，由图6可知，在干燥前期，物料含水量在急剧下降，大部分的水分随着升华作用从物料内部逸出，这段时间主要除去的是胞内“结合水”，干燥后期，水分下降趋势缓慢，主要是细胞内“自由水”比“结合水”更难被升华掉，所以花费时间更久一些。同时可以看出，随着干燥时间的延长和水分的散失，冻干制品的活菌数也呈现出下降的趋势，直到在解吸干燥快完成时才趋于稳定。
实施例2
本实施例探究了储藏时间对植物乳杆菌冻干粉剂稳定性的影响，将实施例1制备得到的冻干粉剂分别放置在4℃和常温两种温度下保藏，每隔15d进行活菌测定。保存60d后，4℃储存的植物乳杆菌冻干粉剂的活菌数仍然达到80％以上，说明本发明植物乳杆菌冻干粉剂能够延长植物乳杆菌的保存期限。
由以上实施例可知，本发明提供了一种植物乳杆菌冻干粉剂及其制备方法，采用本发明制备方法制备得到的植物乳杆菌冻干粉剂在储藏过程中能够使微生物保持较高活力，便于后续使用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活化后的植物乳杆菌进行培养得到植物乳杆菌菌液；
(2)将所述植物乳杆菌菌液离心得到菌泥；
(3)将所述菌泥与保护剂混合后进行冷冻干燥得到植物乳杆菌冻干粉剂；
所述保护剂包括以下重量份的组分：脱脂乳15～20份、蔗糖10～30份、丙三醇2～10份、山梨醇2～10份。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养时所用培养基为MRS液体培养基。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养的条件为：接种量5～10％，培养温度33～37℃，搅拌速度100～200r/min，培养时培养基的pH值为5.2～5.7。
4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中得到的植物乳杆菌菌液的活菌数>109CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养过程中对培养基进行补料一次，所述补料的时间为开始进行培养后15～20h，所述补料量为原料液量体积的10～15％。
6.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的温度为0～5℃，所述离心的转速为6000～8000r/min，所述离心的时间为5～15min。
7.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述菌泥与保护剂的比例为1g:1～2mL。
8.根据权利要求1所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述冷冻干燥前进行预冻处理，所述预冻处理的温度为-85～-40℃，所述预冻处理的时间为1～3h。
9.根据权利要求1或8所述的植物乳杆菌冻干粉剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述冷冻干燥的条件为：温度-85～-75℃，压力10～50pa，时间28～32h，冻干厚度5～10mm。
10.利用权利要求1～9任一项所述制备方法制备得到的植物乳杆菌冻干粉剂。
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|---|---|---|---|---|
| CN116574611A (zh) * | 2023-04-26 | 2023-08-11 | 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 | 一种用于布氏乳杆菌的冻干保护剂及利用冻干保护剂制备布氏乳杆菌冻干粉剂的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106880051A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-06-23 | 黑龙江八农垦大学 | 一种植物乳杆菌软胶囊的制备方法 |
| CN108330080A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-07-27 | 北京好实沃生物技术有限公司 | 一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用 |
| CN110305811A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-10-08 | 天津生机集团股份有限公司 | 一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法以及应用 |
| CN112877262A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-06-01 | 天益健康科学研究院（镇江）有限公司 | 一种植物乳杆菌及其应用 |
| CN115505534A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-12-23 | 澳优乳业（中国）有限公司 | 冻干保护剂、其制备方法及应用、菌体的冻干方法 |
-
2023
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106880051A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-06-23 | 黑龙江八农垦大学 | 一种植物乳杆菌软胶囊的制备方法 |
| CN108330080A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-07-27 | 北京好实沃生物技术有限公司 | 一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用 |
| CN110305811A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-10-08 | 天津生机集团股份有限公司 | 一种植物乳杆菌菌剂及其高密度发酵制备方法以及应用 |
| CN112877262A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-06-01 | 天益健康科学研究院（镇江）有限公司 | 一种植物乳杆菌及其应用 |
| CN115505534A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-12-23 | 澳优乳业（中国）有限公司 | 冻干保护剂、其制备方法及应用、菌体的冻干方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 任艳 等: "真空冷冻干燥过程中保护剂对乳酸菌的保护机理", 中国乳品工业, vol. 41, no. 9, pages 2 * |
| 唐京: "两株乳酸菌浓缩型直投式发酵剂的制备研究", 兰州大学硕士学位论文, pages 3 - 2 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116574611A (zh) * | 2023-04-26 | 2023-08-11 | 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 | 一种用于布氏乳杆菌的冻干保护剂及利用冻干保护剂制备布氏乳杆菌冻干粉剂的方法 |
| CN116574611B (zh) * | 2023-04-26 | 2023-10-13 | 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 | 一种用于布氏乳杆菌的冻干保护剂及利用冻干保护剂制备布氏乳杆菌冻干粉剂的方法 |
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