CN114262680A - 菌株及其应用 - Google Patents

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CN114262680A CN202210006155.0A CN202210006155A CN114262680A CN 114262680 A CN114262680 A CN 114262680A CN 202210006155 A CN202210006155 A CN 202210006155A CN 114262680 A CN114262680 A CN 114262680A
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Abstract

本发明涉及微生物领域,特别涉及菌株及其应用。该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),保藏编号为CGMCC No.23527。该菌株能够高效利用低聚半乳糖和低聚果糖,相比鼠李糖乳杆菌GG有较强的低聚糖代谢能力;对致病菌具有良好的抑制作用;同时对利福平、氨苄西林、头孢唑林、克拉霉素、氯霉素敏感,具有良好的安全性。

Description

菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域,特别涉及菌株及其应用。
背景技术
许多研究证明,相比于奶粉喂养的婴儿,母乳喂养的婴儿传染病发病率较低。
母乳中存在较多的微生物,主要包括乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)等,有利于婴儿体内微生物种群的形成,增强肠道功能。因此,从母乳中筛选出有优良益生潜力的乳酸菌具有重要的意义。
有害菌的低聚糖益生元利用率极低,因而低聚糖可以选择性促进有益菌的大量生长繁殖,增强益生菌的定植,抑制肠道内腐败菌的的生长,对宿主发挥健康作用,常见的低聚糖包括低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、低聚木糖(XOS)、水苏糖(Stachyose)等。
合生元由益生菌和益生元组成,二者相辅相成,共同发挥作用,对肠道的微生态具有调节作用,可以预防和治疗疾病。益生菌发酵低聚糖产生大量的短链脂肪酸,如乙酸、乳酸等,能刺激肠道蠕动,可以缓解便秘,改善肠道健康;合生元能够调节肠道菌群、促进食物的消化和加快代谢物排泄、降低肠道的发病率和缩短感染持续时间,调节过敏性反应,增强机体免疫功能,预防治疗疾病等。
目前国家允许使用到婴幼儿食品的菌株主要来自国外,尚无来自中国母乳的菌株。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了菌株及其应用,该菌株具有低聚糖利用能力、有良好的耐酸耐胆盐能力、对致病菌具有良好的抑制作用、同时对一些常用抗生素敏感,具有良好的益生功能和安全性。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),其特征在于,其保藏编号为CGMCC No.23527。
本发明还提供了上述菌株以低聚糖为唯一碳源制备产品中的应用;
所述低聚糖包括低聚半乳糖和/或低聚果糖。
在本发明的一些具体实施方案中,所述低聚糖的浓度为2%~6%。
在本发明的一些具体实施方案中,上述低聚糖的总浓度为2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%或6%。
本发明还提供了上述菌株的发酵方法,包括以低聚糖为唯一碳源培养所述菌株。
在本发明的一些具体实施方案中,上述发酵方法的pH为6.5,上述发酵方法的温度为37℃。
本发明还提供了上述菌株在制备微生物制品或发酵制品中的应用。
本发明还提供了微生物制剂,包括上述菌株以及可接受的辅料或助剂。
在本发明的一些具体实施方案中,上述辅料或助剂包括营养强化剂、甜味调节剂、酸度调节剂和/或等渗调节剂。
在本发明的一些具体实施方案中,上述营养强化剂包括低聚糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麦麸和/或奶粉。
在本发明的一些具体实施方案中,上述微生物制剂还包括其他任意微生物。
在本发明的一些具体实施方案中,上述微生物制剂还包括酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和/或放线菌等。
本发明还提供了上述微生物制剂在制备发酵制品中的应用。
本发明还提供了发酵制品,包括取发酵菌培养,收集发酵产物;
所述发酵菌包括本发明的菌株或上述微生物菌剂。
在本发明的一些具体实施方案中,上述发酵制品包括发酵乳、乳饮料、发酵果蔬饮料、合生元制剂或含益生元的食品中的一种或多种。
本发明获得的菌株具有如下效果:
1、抑菌试验结果表明,本发明的菌株对蜡样芽胞杆菌有一定的抑制能力,抑菌圈直径介于5mm和10mm之间,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌具有明显的抑制效果,抑菌圈直径均大于15mm;对枯草芽孢杆菌的抑制能力优于鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)。
2、药敏试验结果表明,本发明的菌株对对利福平、氨苄西林、头孢唑林(先锋)、头孢唑林、克拉霉素、氯霉素敏感,敏感抗生素较鼠李糖乳杆菌GG多,具有良好的安全性。
3、本发明的菌株在低聚果糖及低聚半乳糖培养基中生长速度较快,在整个生长周期中,本发明的菌株在这两种低聚糖培养基中的OD600值略高于葡萄糖组成的培养基,说明本发明的菌株对低聚果糖和低聚半乳糖有较好的利用能力。
4、本发明的菌株以低聚果糖为唯一碳源时,2%的低聚果糖即可达到最佳的促进效果,1%的低聚果糖不足以支持本发明的菌株生长至最高生长量,5%和6%的低聚果糖会产生抑制效果。本发明的菌株以低聚半乳糖为唯一碳源时,实验数据与低聚果糖类似。
5、本发明的菌株以低聚果糖和低聚半乳糖混合物为唯一碳源时,2%的低聚果糖即可达到最佳的促进效果,且混合比例对促进效果没有影响。
生物保藏说明
生物材料:AUH2103,分类命名:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),于2021年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所;保藏编号为CGMCC No.23527。
本发明中所述AUH2103即为上述保藏编号为CGMCC No.23527的菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为植物乳杆菌AUH2103的划线平板菌落形态;
图2为植物乳杆菌AUH2103的光学显微镜图;
图3为植物乳杆菌AUH2103在不同低聚糖中的生长曲线图;
图4为鼠李糖乳杆菌GG在不同低聚糖中的生长曲线图;
图5为植物乳杆菌AUH2103在不同浓度FOS中的生长曲线图;
图6为植物乳杆菌AUH2103在不同浓度GOS中的生长曲线图;
图7为植物乳杆菌AUH2103在不同比例FOS和GOS中的生长曲线图;
图8为植物乳杆菌AUH2103在低聚糖环境下的竞争优势。
具体实施方式
本发明公开了一种菌株及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供一株母乳来源、具有低聚糖利用能力的植物乳杆菌AUH2103,并提供其适用的低聚糖配方。
本发明使用的低聚糖为:低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、低聚木糖(XOS)、水苏糖(Stachyose)。发明人通过测定健康母乳来源的益生菌在不同种类低聚糖的生长情况,筛选出一株可以高效利用低聚糖的菌株,其以低聚半乳糖或低聚果糖为唯一碳源时,均能获得与以葡萄糖为唯一碳源时相当的生长能力,该菌株命名为植物乳杆菌AUH2103(Lactobacillus plantarum);最佳生长促进浓度为低聚半乳糖和低聚果糖共2%。
本发明还提供上述植物乳杆菌AUH2103的培养方法,具体步骤如下:将植物乳杆菌AUH2103接种至以低聚糖为碳源的改良MRS液体培养基中,培养pH为6.5,培养温度为37℃。
本发明中,所述的改良低聚糖液体培养基的配方为:胰蛋白胨10.0g/L,乙酸钠5.0g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,柠檬酸三铵2.0g/L,七水硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,牛肉浸膏10.0g/L,酵母浸膏5.0g/L,吐温80 1.0ml/L,低聚糖20.0g/L,pH6.5。
进一步地,本发明提供上述植物乳杆菌AUH2103及其培养配方在制备益生菌制品中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明的植物乳杆菌AUH2103来源于中国健康母亲的乳汁,以低聚半乳糖或低聚果糖为唯一碳源时,均能获得与以葡萄糖为唯一碳源时相当的生长能力,利用低聚糖的能力显著优于目前广泛应用的鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG);在低聚果糖和低聚半乳糖环境下可以获得相较于鼠李糖乳杆菌的竞争优势。同时对利福平、氨苄西林、头孢唑林、克拉霉素、氯霉素敏感,具有良好的安全性。本发明提供的低聚糖配方符合国家标准,且能够促进植物乳杆菌AUH2103充分生长。
本发明所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:菌株筛选、鉴定与评估
1、实验菌株的制备
菌株在活化前均用70%甘油保藏于-20℃冰箱,使用前,在MRS培养基中以3%接种量连续活化1次,划线纯化后用于后续实验。
2、实验菌株的鉴定
(1)菌落形态与细胞形态观察
用接种环取1环菌悬液,划线于MRS平板,37℃培养24h后,观察菌落特征。挑取单菌落,经革兰氏染色,在生物学显微镜下观察细胞形态。
菌落形态如图1所示,菌株的菌落形态呈近圆形,乳白色,表面湿润,无褶皱,中间突起,边缘整齐。经革兰氏染色后,其细胞形态为杆状、革兰氏阳性、无芽孢,如图2所示。
(2)16S rDNA序列测定
利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA,将提取的菌株基因组DNA作为16S rDNA-PCR的模板进行扩增(引物序列为27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,即:SEQID NO.1;1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT,即:SEQ ID NO.2)。电泳检测扩增产物后,送上海生工生物工程股份有限公司进行测序,测序结果见序列表SEQ ID NO.3,将测序结果通过BLAST程序与GenBank基因库进行在线比对。
菌株AUH2103的比对结果为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
3、抑菌试验
选取蜡样芽胞杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等6种致病菌作为指示菌,采用牛津杯法测定菌株对致病菌的抑制作用。操作方法为在平板的底部倾倒薄层水琼脂;将致病菌置于LB液体培养基中37℃培养24h,取0.1mL的致病菌菌液涂布于30mL LB固体培养基表面。在水平放置的平板中均匀地放置灭菌的牛津杯,吸取0.2mL待测菌菌悬液于牛津杯中。将平板放置3-4℃冰箱中扩散24h,然后在37℃中培养24h,测量抑菌圈大小,每个菌株重复三次。
实验结果如表1所示。菌株AUH2103对蜡样芽胞杆菌有一定的抑制能力,抑菌圈直径介于5mm和10mm之间,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌具有明显的抑制效果,抑菌圈直径均大于15mm;对枯草芽孢杆菌的抑制能力优于LGG。
表1菌株对致病菌抑制能力测定结果
Figure BDA0003455542620000061
注:+:抑菌圈直径<5mm;++:抑菌圈直径介于5mm和10mm之间;+++:抑菌圈直径介
于10mm和15mm之间;++++:抑菌圈直径>15mm;LGG为Lactobacillus rhamnosusGG。
4、药敏试验
本研究对实验菌株进行药敏性试验。药敏纸片包括利福平、氨苄西林、万古霉素、复方新诺明、环丙沙星、头孢唑林(先锋)、头孢唑林、克拉霉素、青霉素、氯霉素、链霉素、四环素,同时做平行试验。
菌株AUH2103同时对利福平、氨苄西林、头孢唑林(先锋)、头孢唑林、克拉霉素、氯霉素敏感,敏感抗生素较LGG多(表2)。
表2抑菌圈直径判断标准及药敏试验结果
Figure BDA0003455542620000062
Figure BDA0003455542620000071
注:S:敏感;I:中介;R:耐药;LGG为Lactobacillus rhamnosus GG。
5、菌株AUH2103以不同低聚糖为唯一碳源时的生长能力
将菌悬液以3%的接菌量分别接种于各改良低聚糖培养基中。以普通MRS液体培养基和不添加碳源的培养基为阳性对照和阴性对照,将3%的接菌量分别接种于培养基中,保证初始浓度一致,混合均匀。将接入菌中的液体培养基震荡均匀,取200μL加于生长曲线仪的测试小孔中,每种培养基做三个平行,每1h记录小孔的生长情况,直至48h停止。以培养时间为横坐标,吸光度(OD600值)为纵坐标,绘制生长曲线。
改良低聚糖液体培养基的配方为:胰蛋白胨10.0g/L,乙酸钠5.0g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,柠檬酸氢三铵2.0g/L,七水硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,牛肉浸膏10.0g/L,酵母浸膏5.0g/L,吐温80 1.0ml/L,低聚糖20.0g/L,蒸馏水。低聚糖分别为:低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、低聚木糖(XOS)、水苏糖(Stachyose)。添加葡萄糖和不添加碳源的培养基分别为阳性对照和阴性对照。
实验结果如图3所示。植物乳杆菌AUH2103在低聚果糖及低聚半乳糖培养基中生长速度较快,在整个生长周期中,AUH2103在这两种低聚糖培养基中的OD600值略高于葡萄糖组成的培养基,说明菌株AUH2103对低聚果糖和低聚半乳糖有较好的利用能力(图3)。鼠李糖乳杆菌GG对低聚糖利用情况则较弱,仅能利用低聚半乳糖,且利用率显著较低(图4)。
6、菌株AUH2103以不同浓度低聚糖为唯一碳源时的生长能力
将菌悬液(2.5×109CFU/mL)以3%的接菌量分别接种于不同浓度改良低聚糖培养基中。以普通MRS液体培养基和不添加碳源的培养基为阳性对照和阴性对照,将3%的接菌量分别接种于培养基中,保证初始浓度一致,混合均匀。将接入菌中的液体培养基震荡均匀,取200μL加于生长曲线仪的测试小孔中,每种培养基做三个平行,每1h记录小孔的生长情况,直至48h停止。以培养时间为横坐标,吸光度(OD600值)为纵坐标,绘制生长曲线。
改良低聚糖液体培养基的配方为:胰蛋白胨10.0g/L,乙酸钠5.0g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,柠檬酸氢三铵2.0g/L,七水硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,牛肉浸膏10.0g/L,酵母浸膏5.0g/L,吐温80 1.0ml/L,低聚糖,蒸馏水。低聚糖分别为:1%FOS、2%FOS、3%FOS、4%FOS、5%FOS、6%FOS、1%GOS、2%GOS、3%GOS、4%GOS、5%GOS、6%GOS(w/v)。
实验结果如图5和图6所示。植物乳杆菌AUH2103以低聚果糖为唯一碳源时,2%的低聚果糖即可达到最佳的促进效果,1%的低聚果糖不足以支持植物乳杆菌AUH2103生长至最高生长量,5%和6%的低聚果糖会产生抑制效果。植物乳杆菌AUH2103以低聚半乳糖为唯一碳源时,与低聚果糖类似。
7、菌株AUH2103以不同比例低聚糖为唯一碳源时的生长能力
将菌悬液(2.5×109CFU/mL)以3%的接菌量分别接种于不同浓度改良低聚糖培养基中。以普通MRS液体培养基和不添加碳源的培养基为阳性对照和阴性对照,将3%的接菌量分别接种于培养基中,保证初始浓度一致,混合均匀。将接入菌中的液体培养基震荡均匀,取200μL加于生长曲线仪的测试小孔中,每种培养基做三个平行,每1h记录小孔的生长情况,直至48h停止。以培养时间为横坐标,吸光度(OD600值)为纵坐标,绘制生长曲线。
改良低聚糖液体培养基的配方为:胰蛋白胨10.0g/L,乙酸钠5.0g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,柠檬酸氢三铵2.0g/L,七水硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,牛肉浸膏10.0g/L,酵母浸膏5.0g/L,吐温80 1.0ml/L,低聚糖,蒸馏水。低聚糖包括FOS和GOS,总量为20.0g/L,两种低聚糖的混合比例分别为:5:0、4:1、3:2、2:3、1:4、0:5。
实验结果如图7所示。植物乳杆菌AUH2103以低聚果糖和低聚半乳糖混合物为唯一碳源时,2%的低聚果糖即可达到最佳的促进效果,且混合比例对促进效果没有影响。
8、菌株AUH2103以低聚果糖和低聚半乳糖为唯一碳源时的竞争优势
将活化好的菌株AUH2103(2.5×109CFU/mL)和鼠李糖乳杆菌MP-108(1.0×109CFU/mL)按3%总接种量按1:1比例组合接于改良益生元液体培养基,进行混合发酵,以混菌接于MRS液体培养基为对照,37℃培养24h,每4h取样利用选择性培养基测定活菌数,以观察乳酸菌单独培养及混合发酵的生长变化。改良益生元液体培养基:以低聚果糖或低聚半乳糖代替MRS培养基中的葡萄糖,添加量为2%。菌株AUH2103在发酵初始时活菌数略高于鼠李糖乳杆菌MP108;进入对数期后菌株AUH2103生长一直为优势菌,活菌数高于MP108 20-50倍。
实施例2:植物乳杆菌AUH2103在合生元制剂中的应用
将植物乳杆菌AUH2103进行大规模培养,将培养物进行冷冻干燥,添加建议冲调体积总量2%~6%的低聚果糖和低聚半乳糖,生产合生元制剂。
实施例3:植物乳杆菌AUH2103在乳饮料中的应用
将4~7%的蔗糖溶于沸水中,待其冷却至60~70℃加入12%的脱脂乳粉溶解均匀后均质,95~105℃灭菌10min,接种2%的植物乳杆菌AUH2103(2.5×109CFU/mL),在32~37℃培养。可添加总量2%~6%的低聚果糖和低聚半乳糖。
实施例4:植物乳杆菌AUH2103在活菌制剂中的应用
将植物乳杆菌AUH2103进行大规模培养,将培养物添加辅料和保护剂,-50摄氏度保持30min,然后1h内升温至-25摄氏度,保持10h,然后升温至25摄氏度,保持12h进行冷冻干燥(真空度全程为1.3Pa)。
实施例5:植物乳杆菌AUH2103在发酵果蔬饮料中的应用
将果蔬与水1:1~5混合,打浆,95~105℃灭菌10min,冷却至32~37℃,接种2%的植物乳杆菌AUH2103(2.5×109CFU/mL),发酵12~48小时;离心,得发酵果蔬汁,添加稳定剂,均质,制成新型发酵果蔬饮料。可添加总量2%~6%的低聚果糖和低聚半乳糖。
实施例6:植物乳杆菌AUH2103在发酵乳中的应用
将4~7%的蔗糖溶于沸水中,待其冷却至60~70℃加入12%的脱脂乳粉溶解均匀后均质,95~105℃灭菌10min,接种商业直投式发酵剂(含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种,按说明书使用)和2%的植物乳杆菌AUH2103(2.5×109CFU/mL),在30~37℃培养至凝乳;转移至4℃进行后熟。可添加总量2%~6%的低聚果糖和低聚半乳糖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 澳优乳业(中国)有限公司
<120> 菌株及其应用
<130> MP21026516
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 19
<212> DNA
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<211> 1443
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cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1140
ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1260
agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1320
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac 1440
ctt 1443

Claims (9)

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),其特征在于,其保藏编号为CGMCCNo.23527。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)以低聚糖为唯一碳源制备产品中的应用;
所述低聚糖包括低聚半乳糖和/或低聚果糖。
3.如权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的发酵方法,其特征在于,以低聚糖为唯一碳源培养所述菌株。
4.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在制备微生物制品或发酵制品中的应用。
5.微生物制剂,其特征在于,包括如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)以及可接受的辅料或助剂。
6.如权利要求5所述的微生物制剂,其特征在于,还包括其他任意微生物。
7.如权利要求5或6所述的微生物制剂在制备发酵制品中的应用。
8.发酵制品,其特征在于,取发酵菌培养,收集发酵产物;
所述发酵菌包括如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或如权利要求5或6所述的微生物菌剂。
9.如权利要求8所述的发酵制品,其特征在于,其包括发酵乳、乳饮料、发酵果蔬饮料、合生元制剂或含益生元的食品中的一种或多种。
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