CN109706092A - 一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌及纤溶酶和活菌片剂的制法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌HQ‑1，该凝结芽孢杆菌HQ‑1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.16058，分类命名为：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans。本发明还提供了利用该菌制备纤溶酶和活菌片剂的方法。本发明所得的凝结芽孢杆菌具有良好的药敏性、抑菌性和对酸碱环境的耐受能力；本发明所得的凝结芽孢杆菌所产的纤溶酶活性高，可达383.1U/mL；本发明所得活菌片剂制备方法简单，活菌率高，具有良好实际应用前景。

Description

一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌及纤溶酶和活菌片剂的制法

技术领域

本发明属于微生物及酶工程技术领域，具体涉及一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌及纤溶酶和活菌片剂的制法。

背景技术

血栓病(thrombotic disease，TD)是当前危害人类健康、死亡率最高的疾病之一。溶栓治疗是目前针对此类疾病最常用且最疗效的治疗手段之一。然而，现行临床应用的溶栓药物一方面远不能满足市场需求，还存在分解纤维蛋白特异性低、体内半衰期短、易引起出血和价格昂贵等缺点。因此，世界各国都在致力于开发显效、无毒副作用、价廉的新溶栓药物，寻找天然来源的纤溶酶也成为了研究的热点。

微生物因其物种丰富、繁殖快以及易于应用于工业生产是备受关注的溶栓药物的重要来源。目前，产纤溶酶菌株主要是来源于豆豉、酱等传统发酵食品和土壤、海泥等自然环境，经鉴定这些菌株大多为枯草芽孢杆菌属、金黄色葡萄球菌、霉菌和放线菌等，其中枯草芽孢杆菌产纳豆激酶已经商业化。然而，这些菌均为不能在食品中直接使用的菌株，所以限制了具纤溶酶功能性食品的开发。

目前关于乳酸菌产纤溶酶的研究较少。由于兼具乳酸菌和芽孢菌共同的特点，以及良好的安全性，凝结芽孢杆菌自1989年被美国FDA认可其为“普遍认为安全(GRAS)”的杆菌，还获得了欧洲欧盟食品安全局(EFSA)的安全资格认定(QPSS)，至今仍被评定为缺乏产毒潜能，并且在国家卫生计生委发布的2016年《关于发酵乳杆菌CECT5716等3个菌种的公告》中被列入《可用于食品的菌种名单》。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌HQ-1，所述凝结芽孢杆菌HQ-1保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.16058，分类命名为：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans。

本发明的另一个目的在于提供所述凝结芽孢杆菌HQ-1生产纤溶酶的方法，所述方法包括如下步骤：

将所述凝结芽孢杆菌HQ-1接种至培养基中进行发酵培养，至芽孢形成率达到90％以上时结束发酵，取发酵上清液，经纯化后获得纤溶酶。

作为一种可选的技术方案，所述培养基为MRS液体培养基。

作为一种优选的技术方案，进行发酵培养时，发酵条件为：温度37℃、摇床转速200r/min、发酵时间24-48h。

在进行发酵培养前，将凝结芽孢杆菌HQ-1进行活化并制备种子液。

作为一种可选的技术方案，所述活化的方法为：将所述凝结芽孢杆菌HQ-1接种到MRS液体培养基中，于37℃培养16h，按3％接种量转到12％脱脂乳液体培养基中，于37℃培养至凝乳，重复2-4次以恢复菌株活力；和/或，所述种子液的制备方法为：进行活化后，按接种量3％的比例接入MRS液体培养基，于37℃培养16h，得到种子液。

本发明还有一个目的在于提供由上述方法制备得到的纤溶酶。

本发明还有一个目的在于提供包含上述凝结芽孢杆菌HQ-1的活菌片剂，所述活菌片剂包括所述凝结芽孢杆菌HQ-1的菌粉和药学上可用的辅料。

作为一种优选的技术方案，所述辅料按重量比30:0.7:15:10:20计，为乳糖、硬脂酸镁、β-环糊精、海藻多糖和麦芽糊精的混合物。

作为一种可选的技术方案，所述凝结芽孢杆菌HQ-1的菌粉的制备方法为：取所述凝结芽孢杆菌HQ-1的培养液并收集菌体；将新鲜牛乳浓缩至原初体积的1/2，水浴灭菌后以体积比5:1的比例重悬所述凝结芽孢杆菌的菌体，采用喷雾干燥工艺得到所述凝结芽孢杆菌的菌粉。

本发明的另外一个目的在于提供制备所述片剂的方法，所述方法为：称取所述辅料按照比例混合后，按物料总重的1-5％均匀喷洒体积浓度为40％-60％的酒精，然后于40℃下干燥3h-6h，过20目筛后与所述凝结芽孢杆菌HQ-1的菌粉混合均匀进行压片，即得所述片剂。

本发明的有益效果：

1、本发明所得的凝结芽孢杆菌HQ-1具有良好的药敏性、抑菌性和对酸碱环境的耐受能力；

2、本发明所得的凝结芽孢杆菌HQ-1所产的纤溶酶活性高，可达383.1U/mL；

3、本发明所得活菌片剂制备方法简单，活菌率高，具有良好实际应用前景。

附图说明

图1为本发明的脱脂乳平板初筛实验结果图；

图2为本发明的纤维蛋白平板复筛实验结果图；其中，1：CY1-2，2：YCQ4-2，3：YB6-2，4：YCQ2-3，5：YCQ4-1，6:HQ-1，7：YB7-2，8：YB6-1；

图3为本发明所得尿激酶标准曲线，其中，A为溶解透明圈面积，B为标准尿激酶酶活(U/mL)；

图4为本发明菌株HQ-1的形态结果图，其中，A显示菌株HQ-1的菌落形态，B显示菌株HQ-1的菌体形态；

图5为本发明HQ-1菌株的16S rDNA PCR扩增结果图；

图6为本发明HQ-1菌株分子系统发育树；

图7为本发明HQ-1菌的生长曲线；

图8为本发明菌株HQ-1的发酵上清液经蛋白酶处理后酶液活性测定结果，其中，1：经胃蛋白酶处理后的发酵上清液(20μL)，2：经胰蛋白酶处理后的发酵上清液(20μL)，3：经糜蛋白酶处理后的发酵上清液(20μL)，4：经胃蛋白酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶处理后的发酵上清液(20μL)，5：胃蛋白酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶混合液(20μL)，6：发酵上清液(20μL)；

图9为本发明溶解纤维蛋白作用方式实验结果图，其中，A表示未加热平板处理组，B表示加热平板处理组；1：纳豆激酶(20μL)，2：尿激酶(20μL)，3：酶处理后HQ-1发酵上清液(20μL)，4：HQ-1发酵上清液(20μL)；

图10为本发明HQ-1菌经喷雾干燥所得菌粉的实物照片；

图11为本发明所得活菌片剂的实物照片。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

在本专利中，若无特别指示，“菌株HQ-1”和“HQ-1”均指的是凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans(CGMCC No.16058)。

1材料与方法

1.1试验材料

样品：从四川各地采集的豆豉、泡菜水、东北发酵大豆酱、福建发酵虾酱传统发酵食品489份。

试验菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923和沙门氏菌(Salmonella)ATCC 13311由四川农业大学食品微生物实验室保存。

1.2培养基

MRS培养基、LB培养基、蛋白胨水培养基、硝酸盐培养基、MH培养基、CM培养基、脱脂乳琼脂平板、12％脱脂乳液体培养基。1.3主要试剂

牛纤维蛋白原、凝血酶(生化试剂，40U/mg)、尿激酶标准品(生化试剂，50U/mg)购自上海源叶生物科技有限公司；胃蛋白酶(生化试剂，2500U/mg)、胰蛋白酶(生化试剂，250U/mg)、糜蛋白酶(1000U/mg)购自上海瑞永生物科技有限公司；SDS-PAGE试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；四甲基乙二胺(TEMED)、考马斯亮蓝R250、购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4试验方法

1.4.1样品处理

将样品加入无菌生理盐水振荡充分，置于水浴锅中85℃水浴15min后接入pH为4.8的MRS液体培养基中，37℃下厌氧培养48-72h，获得富集培养液。

1.4.2产纤溶酶凝结芽孢杆菌的筛选

将富集培养液涂布于pH为5.2的MRS平板中，待菌落长出后挑取单菌落点接于含碳酸钙的MRS平板中，37℃恒温培养24-48h，挑取有溶钙圈的单菌落于MRS液体培养基中，55℃下培养48-72h。

(1)初筛：将55℃下生长的菌液接种于脱脂乳平板上，37℃培养48h，挑选溶解圈明显的单菌落，划线分离获得纯菌株。

(2)复筛：将初筛获得菌株接种于CM液体培养基中，37℃培养24h，收集1mL菌液于4℃，10000r/min离心10min，取20μL上清液加入纤维蛋白平板点样孔中，37℃培养18h，验证并选取有纤溶活性的菌株，纤溶酶活性测定参照Astrup等的方法并稍作修改。

1.5产纤溶酶凝结芽孢杆菌的鉴定

1.5.1形态学鉴定

将菌株划线于LB琼脂平板上37℃培养24h后，观察菌落特征和菌体特征。

1.5.2生理生化鉴定

依据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》。

1.5.316S rDNA序列分析

采用菌液PCR方式进行16Sr DNA扩增。使用细菌16Sr DNA的通用引物进行PCR扩增，引物序列如下：Forward primer27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，Revese primer1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR反应体系(25μL)：模板DNA2μL，上下游引物各0.8μL，2×mix 12.5μL，ddH₂O8.9μL。扩增反应条件为：94℃7min；94℃45S，55℃45S，72℃2min，30个循环；72℃5min。PCR产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果利用BLAST分析工具与GenBank数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，并用MEGA5.05软件构建系统进化树。

1.6产纤溶酶凝结芽孢杆菌的生物学特性

1.6.1药敏性药敏性试验

采用纸片琼脂扩散法进行药敏性药敏性试验，以大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为质控标准菌株。抗生素种类如下如下：氨苄西林、阿莫西林、头孢他啶、亚胺培南、万古霉素、四环素、氯霉素、庆大霉素、利福平、头孢哌酮、丁胺卡那、链霉素、青霉素和红霉素。将药敏片均匀放置于MRS固体培养基上，37℃培养18h后。观察并记录药敏纸片所形成的抑菌圈直径大小，实验重复3次并求平均值，采用一菌一药一判断值的原则，根据说明书敏感和耐药性的最小抑菌圈直径判定菌株的药敏性。

1.6.2抑菌试验

采用牛津杯法对筛选获得的菌株进行对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑制试验。用生理盐水校正指示菌大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌菌液浓度至1.5～3.0×10⁸CFU/mL，受试菌株菌液于4℃、8000r/min离心10min后得到上清液准备待用，以空白LB培养基为阴性对照，检测加入培养上清液对指示菌的抑制作用。

1.7模拟消化道环境耐受试验

1.7.1人工胃液耐受性试验

取对数中期的培养物4000r/min离心10min，pH6.8PBS缓冲液洗涤2次后重新悬浮，用移液器吸取100μL菌悬液分别加入900μL模拟胃液(pH2.5的PBS中加入终浓度0.35％的胃蛋白酶)和pH6.8缓冲液(对照)中，37℃保温3h后进行活菌计数，(试验做3个平行，取平均值)，并计算存活率。

1.7.2人工肠液耐受性试验

根据1.7.1的方法将经过人工胃液处理的菌体重悬液加入模拟肠液中(pH8.0的PBS中加入终浓度0.1％的胰蛋白酶和0.3％的牛胆盐)，37℃保温3h后进行活菌计数(试验做3个平行，取平均值)，并计算存活率。

1.8蛋白酶处理对酶活的影响

将菌株HQ-1的发酵上清液调到胃蛋白酶的最适反应的pH4.0，然后加入胃蛋白酶使发酵上清液的酶终浓度为1mg/mL，37℃水浴2h。其后再将pH调到胰蛋白酶与糜蛋白酶最适反应的pH8.0，然后加入胰蛋白酶和糜蛋白酶使发酵上清液的酶终浓度为1mg/mL，37℃水浴2h。其后再将pH调回对照pH7.0，测定其纤溶活性。并以只用胃蛋白酶处理的发酵上清液、只用胰蛋白酶和糜蛋白酶混合处理的发酵上清液、胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶与糜蛋白酶混合溶液、发酵上清液原液做对照。

1.9溶解纤维蛋白作用方式测定

制得两个琼脂糖-纤维蛋白平板，取其中一个平板置于电热恒温培养箱中85℃加热30min，制得加热平板，另一个则为纤维蛋白标准。用直径为3mm的打孔器在平板上打孔，将20μL HQ-1发酵上清液以及经胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶处理后的HQ-1发酵上清液分别加入两个平板中，以等体积的尿激酶为阴性对照，纳豆激酶为阳性对照，37℃恒温培养18h，根据水解圈判断其溶解纤维蛋白作用方式。

1.10凝结芽孢杆菌HQ-1活菌片剂的制备

菌种活化：将菌株HQ-1接种到MRS液体培养基中，37℃培养16h左右按3％接种量转到12％脱脂乳液体培养基中，37℃培养至凝乳，重复2-4次以恢复菌株活力。

种子液制备：充分活化后按接种量3％的比例接入MRS液体培养基，37℃培养16h左右得到种子液。

发酵液制备：按3％接种量将种子液接入MRS液体培养基，37℃、200r/min摇床培养24-48h至菌株HQ-1芽孢形成率达到90％以上时结束发酵。

菌体收集：将培养液在4℃6000r/min离心10-15min后，弃上清。

喷雾干燥获取凝结芽孢杆菌HQ-1菌粉(下称菌粉)：采用旋转蒸发仪将新鲜牛乳浓缩至原初体积的1/2，水浴灭菌后以体积比5︰1的比例重悬菌体，采用喷雾干燥工艺得到菌粉。操作条件为：进风温度180℃，出风温度80℃。

凝结芽孢杆菌片剂(下称片剂)制备：将各种物料按比例混合均匀后取出进行压片。具体操作为：称取辅料按照比例混合后，均匀喷洒酒精溶液(体积浓度为40％-60％的酒精添加量为物料总重的1％-5％)后进行干燥(干燥条件为40℃,3h-6h)，过20目筛后与菌粉混合均匀再进行压片。其中各种物料按重量百分比计为：乳糖30％、硬脂酸镁0.7％、β-环糊精15％、海藻多糖10％、麦芽糊精20％、菌粉24.3％。

活菌计数：取样(菌粉或片剂称取1.0g，用无菌水溶解)，用无菌水进行梯度稀释，选取适宜的稀释度，采用平板涂布法检测活菌数，重复3次。使用LB培养基，37℃培养24h。

芽孢数检测：取10mL发酵液(菌粉或片剂称取1.0g，用无菌水溶解)，置于90mL无菌水中，85℃水浴热处理15min，用无菌水进行梯度稀释，采用平板涂布法检测含菌量，重复3次。使用LB培养基，37℃培养24h。芽孢形成率为芽孢数与总菌体数的比值。

2结果与分析

2.1产纤溶酶凝结芽孢杆菌的筛选

通过高温处理及厌氧富集培养以及产酸菌株脱脂乳初筛，从489份样品中分离到63株能形成蛋白水解圈的菌株，部分结果如图1所示。经琼脂糖-纤维蛋白平板验证有8株菌具有纤溶酶活性，其中菌株HQ-1、YCQ2-3、YCQ4-1以及YCQ4-2筛自豆豉样品，菌株CY1-2筛自发酵大豆酱，菌株YB6-2、YB7-2筛自泡菜水。选取水解圈面积最大的菌株(命名为HQ-1)进行鉴定并将其作为发酵生产纤溶酶的目的菌株。纤维蛋白平板结果如图2所示。

2.2纤溶活性的测定

通过配制不同浓度的尿激酶标准品，测定在纤维蛋白平板上透明圈面积，以尿激酶纤溶活性对数(lgB)为横坐标，以透明圈面积对数(lgA)为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线，如图3所示。根据绘制的尿激酶标准曲线计算出菌株CY1-2、YCQ4-2、YB6-2、YCQ2-3、YCQ4-1、HQ-1、YB7-2及YB6-1的发酵上清液中酶活力分别为223.3U/mL、217.1U/mL、230.7U/mL、289.2U/mL、117.9U/mL、383.1U/mL、99.1U/mL以及254.4U/mL。

2.3菌株HQ-1的鉴定

2.3.1形态学鉴定

菌株HQ-1在LB培养基37℃培养24h后的菌落特征如图3所示，菌落直径为2.0-3.0mm左右，菌落扁平呈乳白色、凸起、不透明、表明干燥、正反面颜色一致。菌体革兰氏染色阳性，显微镜下观察为杆状、部分菌体中存在芽孢。

2.3.2生理生化鉴定

生理生化指标结果见表1。

表1菌株HQ-1生理生化特征

注：表中“-”表示反应呈阴性；“+”表示反应呈阳性；“生长”表示可以生长。

2.3.3分子生物学鉴定

对菌株HQ-1进行16Sr DNA序列扩增PCR产物电泳结果见图4，目的条带大小为1500bp左右，与预期长度相符。将扩增产物送交上海生工进行序列测定，将所得序列与Genback中的16Sr DNA序列进行分析比对，并用MEGA 5.0建立系统发育树，如图5。结果显示该菌株与Genbank中Bacillus coagulans strain 55-LR4(MF077122)16SrDNA同源性达到99％，结合生理生化试验结果，进一步将菌株HQ-1鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。并保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号：CGMCC No 16058)。

2.4菌株HQ-1药敏性试验

药敏性试验结果如表2所示，HQ-1除对青霉素耐受外，对其余13种抗生素均敏感。凝结芽孢杆菌耐药性所导致的危害还未见报道，凝结芽孢杆菌制剂耐药性风险低。

表2菌株HQ-1对抗生素敏感性

注：S：敏感；I：中间敏感；R：耐药；表中数据为平均数±标准差

2.5菌株HQ-1的抑菌试验

抑菌试验结果如表3所示，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923及沙门氏菌抑菌圈大小均大于16mm，表明凝结芽孢杆菌对这三种致病菌有较强的抑菌效果。

表3菌株HQ-1对3种致病菌的抑菌效果

注：表中数据为平均数±标准差

2.6模拟消化道环境耐受试验

2.6.1菌株HQ-1生长曲线的测定

测定株菌在36h内的生长曲线如图7所示，取培养14h左右的菌液进行模拟消化道环境耐受试验。

2.6.2人工胃液耐受性试验

凝结芽孢杆菌HQ-1经人工胃液处理后测定活菌数，结果如表4所示。实验结果表明HQ-1对人工胃液具有良好的耐受性。

表4菌株HQ-1人工胃液耐受试验结果

2.6.3人工肠液耐受性试验

本试验研究了菌株HQ-1经过pH值为2.5的人工胃液处理3h后,继续经人工肠液的消化3h的活菌数变化情况,结果如表5所示。实验结果表明HQ-1对人工肠液具有良好的耐受性。

表5菌株HQ-1人工肠液耐受试验结果

2.7蛋白酶处理对凝结芽孢杆菌HQ-1产纤溶酶纤溶活性的影响

由图8可知，菌株HQ-1的发酵上清液经胃蛋白酶，胰蛋白酶及糜蛋白酶处理后仍具有纤溶活性，并且三种蛋白酶处理对菌株HQ-1的纤溶活性无明显的影响。

2.8凝结芽孢杆菌HQ-1产纤溶酶溶解纤维蛋白作用方式

试验结果如图9所示，阳性对照纳豆激酶在加热和未经加热的纤维蛋白平板中都有明显的溶解圈，而菌株HQ-1发酵上清液及酶处理后发酵上清液与阴性对照尿激酶一样，在加热后的纤维蛋白平板中无明显的溶解圈，推断该纤溶酶是通过激活纤溶酶原的方式间接溶解纤维蛋白。

2.9凝结芽孢杆菌HQ-1片剂制备

将菌株HQ-1发酵液与牛乳混合经喷雾干燥后得到干菌粉，如图10所示。最终发酵液中活菌数为7.8×10¹⁰CFU/mL,芽孢数7.1×10¹⁰CFU/mL，芽孢率达到91.02％；喷雾干燥所得菌粉活菌数达到了2.8×10¹¹CFU/g。将原辅料按比例混合后得到凝结芽孢杆菌片剂，每片重量约为0.4-0.6g，制得片剂如图11所示，活菌数为5.8×10¹⁰CFU/g。

Claims (10)

1.一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌HQ-1，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HQ-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.16058，分类命名为：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans。

2.利用权利要求1所述凝结芽孢杆菌HQ-1生产纤溶酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将所述凝结芽孢杆菌HQ-1接种至培养基中进行发酵培养，至芽孢形成率达到90％以上时结束发酵，取发酵上清液，经纯化后获得纤溶酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基为MRS液体培养基；和/或，发酵条件为：温度37℃、摇床转速200r/min、发酵时间24-48h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行发酵培养前，将凝结芽孢杆菌进行活化并制备种子液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活化的方法为：将所述凝结芽孢杆菌HQ-1接种到MRS液体培养基中，于37℃培养16h，按3％接种量转到12％脱脂乳液体培养基中，于37℃培养至凝乳，重复2-4次以恢复菌株活力；和/或，所述种子液的制备方法为：进行活化后，按接种量3％的比例接入MRS液体培养基，于37℃培养16h，得到种子液。

6.由权利要求2所述的方法制备得到的纤溶酶。

7.一种包含权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HQ-1的活菌片剂，其特征在于，所述活菌片剂包括所述凝结芽孢杆菌HQ-1的菌粉和药学上可用的辅料。

8.根据权利要求7所述的片剂，其特征在于，所述辅料按重量比30:0.7:15:10:20计，为乳糖、硬脂酸镁、β-环糊精、海藻多糖和麦芽糊精的混合物。

9.根据权利要求7所述的片剂，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HQ-1的菌粉的制备方法为：取所述凝结芽孢杆菌HQ-1的培养液并收集菌体；将新鲜牛乳浓缩至原初体积的1/2，水浴灭菌后以体积比5:1的比例重悬所述凝结芽孢杆菌的菌体，采用喷雾干燥工艺得到所述凝结芽孢杆菌的菌粉。

10.制备权利要求7-9任一项所述片剂的方法，其特征在于，所述方法为：称取所述辅料按照比例混合后，按物料总重的1-5％均匀喷洒体积浓度为40％-60％的酒精，然后于40℃下干燥3h-6h，过20目筛后与所述凝结芽孢杆菌的菌粉混合均匀进行压片，即得所述片剂。