CN102524534A - 一种饲用复合微生物添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种饲用复合微生物添加剂，具体地说是涉及包含有两种芽孢杆菌的微生物饲料添加剂及其制备方法，属于微生物饲料添加剂技术领域。该微生物饲料添加剂将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌按一定比例混合发酵培养，将发酵液离心所得菌泥进行处理后，低温烘干制成粉剂。由该方法制备的微生物饲料添加剂活菌含量高、耐热、耐动物胃肠道环境、产品保存时间长，将其添加到动物饲料中能起到平衡动物肠道菌群，提高免疫力及抗病力；促进增重，提高饲料转化率，降低料重比，具有治疗、预防、保健、增强免疫力的多重功效。

Description

一种饲用复合微生物添加剂及其制备方法

技术领域

本发明公开了一种饲用复合微生物添加剂，具体地说是涉及包含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K2008、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DY01两种芽孢杆菌的复合微生物饲料添加剂及其制备方法，属于微生物饲料添加剂技术领域。 

背景技术

随着人们对自身健康及食品安全的日益重视，饲料添加剂安全、绿色的重要性日渐凸显。过去使用抗生素作为饲料添加剂虽然给饲料行业带来了巨大的经济效益，但其同时带来的抗生素残留等副作用目前越来越引起人们的注意。微生态制剂以其功能多、无毒副作用、无残留、不污染环境等优点，代替抗生素作为饲料添加剂引起了国内外学者和饲料行业的广泛关注。 

芽孢杆菌类制剂作为微生物制剂的其中一种，是将正常肠道微生物群中或环境中的有益芽孢杆菌，通过鉴定、筛选、培养、干燥等工艺处理后制成的一种新型微生态添加剂，无毒、无残留，具有防治疾病、促进生长等作用。芽孢杆菌是一类好氧生长，能够形成芽孢抗逆体的革兰氏阳性菌，是被国家允许的饲料添加剂菌种。由于芽孢杆菌具有强抗逆性、耐高温、耐酸碱、易贮存等优势，因此受到饲料行业及学者的广泛关注，并已成为一个研究热点。芽孢杆菌为需氧菌，进入动物肠道能够消耗大量的游离氧，有利于有益厌氧菌的生长，同时抑制有害需氧菌肠杆菌的生长，从而提高动物对疾病的抵抗能力，降低胃肠道疾病的发生率。 

枯草芽孢杆菌是具有典型芽孢杆菌特征的革兰氏阳性菌，为嗜温、好氧、产芽孢的杆状细胞，分布广泛，易培养，在不良环境中枯草芽孢杆菌可先形成 芽孢，处于休眠状态，具有耐高温、耐挤压、耐氧化、耐酸碱等特点。在适当环境中，芽孢又可以复活，并大量繁殖。枯草芽孢杆菌具有丰富的产酶系统，可利用多种营养物质各类，能产生蛋白酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。可通过发挥生物拮抗作用和分泌抗菌物质，抑制其他菌的生长，目前在人的医药卫生和动植物的生物防治上已有广泛的应用。另外，枯草芽孢杆菌还能刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫力，提高群体免疫力。应用于动物养殖业中，可以很好的调节动物胃肠道微生态平衡，具有良好的抗病治病作用，并能提高消化率，促进动物生长。 

地衣芽孢杆菌具有调节肠道微生态平衡、治疗肠炎、腹泻等多种功效，可用以治疗肠道感染和肠功能异常，是调节人和动物肠道微生态平衡的有益菌。地衣芽孢杆菌属于细菌科、芽孢杆菌属，在条件不利的情况下能形成芽孢，将自己保护起来而保持高度的稳定性，能耐酸、耐碱、耐高温及耐挤压，在制粒过程和酸性胃环境中均能保持高度的稳定性。其在肠道中能分泌多种酶和维生素，从而促进小肠黏膜细胞的增殖，保证肠功能正常。地衣芽孢杆菌更具备兼性厌氧的生物特性，体外生物耗氧试验表明具有生物耗氧作用，是有效的生物耗氧菌种，植入肠道后将会持续地对其微生境起到生物耗氧效应，维持肠道厌氧环境，能促进双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌和梭菌等有益厌氧菌的生长，抑制肠杆菌和肠球菌等有害需氧菌的生长，有助于宿主调整肠道正常菌群，维持肠道微生态环境的平衡。中国人民解放军第二零三医院开发出的微生态制剂“整肠生”，其成分即为地衣芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均是2008年中国农业部公告的饲料添加剂品种目录中，国家允许使用的微生物添加剂品种。 

发明内容

本发明目的是提供一种包含有两种芽孢杆菌的饲用复合微生物添加剂及其制备方法，该微生物添加剂具有耐热、耐动物胃肠道消化环境、贮存期长的特点。采用两种芽孢杆菌混合发酵的方法，再进行一系列的后续加工工艺制备该微生物添加剂，该微生物添加剂制备工艺简单，适合产业化应用。 

本发明提供的饲用复合微生物添加剂中所包含的两种芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K2008、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DY01，已于2011年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，保藏编号分别为CGMCC No.4929、CGMCC No.4930。 

上述枯草芽孢杆菌K2008、地衣芽孢杆菌DY01菌株均分离自中国黑龙江哈尔滨英瑞斯饲料集团江北种猪场健康仔猪的新鲜粪样。两株菌的菌落形态和细胞特征差别不大，菌落形态均为圆形，乳白色或淡黄色，表面皱褶、无光泽、不透明，边缘不整齐，与培养基结合不紧密。DY01菌体呈杆状，长度较K2008偏长，K2008约为椭圆状；革兰氏染色阳性；中生或次端生椭圆形芽孢，芽孢均不明显膨大，无伴孢晶体。 

本发明提供的饲用复合微生物添加剂中两种芽孢杆菌的质量配比为1∶1。 

本发明提供一种饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于制备工艺如下：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌按比例混合培养后，采用特定的发酵条件进行好氧发酵，制备发酵液，再采用后续处理工艺制成微生态制剂。 

所述的两种芽孢杆菌混合培养，进行好氧发酵，制备发酵液，包括如下的步骤： 

1)菌种活化：将保存的枯草芽孢杆菌K2008、地衣芽孢杆菌DY01菌种分别转接于新鲜的斜面培养基上，34℃培养16h。斜面培养基采用LB培养基：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl1％，琼脂1％，自然pH。 

2)种子液的制备：在超净工作台中将活化好的枯草芽孢杆菌K2008、地衣芽孢杆菌DY01菌种用接种环分别接于LB液体培养基中。均以34℃、175r/min摇床培养20h。 

3)二联菌液的制备：在超净工作台中将步骤2)所得两种芽孢杆菌种子液均按1.5％的体积比接种到新的LB液体培养基中(总接种量为3％)，两种芽孢杆菌的质量配比为1∶1。34℃、175r/min摇床培养20h。 

4)发酵液的制备：将步骤3)所得二联菌液按3％的体积比接种到装有25L发酵培养基的发酵罐中，控制装液量为60～70％，初始pH值7.2～7.5，搅拌转速100～150r/min，34℃需氧培养24h，然后逐级上500L中罐、5000L大罐。所述的发酵培养基配方为：每L含糖蜜(总糖含量53％)15mL，玉米粉(氮含量4.76％)15g，豆粕粉(氮含量6.94％)20g，CaCl₂2g，MgSO₄·7H₂O2g，pH7.2～7.5。 

本发明提供的一种饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于后续处理工艺采用如下几种方法进行：静置，离心，掺拌吸水性介质，干燥。具体步骤如下： 

1)将检验合格的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌二联菌的发酵液静置处理36～48h，直至发酵液芽孢生成率均达90％以上； 

2)将步骤1)所述发酵液进行离心，条件为：管式离心机8000～10000r/min 

离心30～40min，得到二联芽孢杆菌菌泥； 

3)向步骤2)中所述的二联芽孢杆菌菌泥中掺拌稻壳粉，其质量以刚好将菌泥完全包埋为准，吸干水分； 

4)将步骤3)所述的菌泥稻壳粉混合物置于烘干设备上，以25～30℃的低温将混合物烘干，得到粉剂； 

5)经检测合格后，称重包装，即得产品。 

具体实施方式

以下的实施方式是为了更好地理解本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。 

实施例1活菌数的测定方法 

二联芽孢杆菌活菌数的测定采用平板稀释涂布法进行计数，方法按照如下步骤进行： 

1)按如下配方配制培养基：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl1％，琼脂1％，自然pH，121℃灭菌15～20min。 

2)待步骤1)所述培养基灭菌后温度降至40～50℃，倒入已灭菌的培养皿中，用量为15～25mL/平皿，静置片刻，待培养基凝固。 

3)将待测样品(发酵液或菌粉)稀释到一定浓度后，取100μL(或200μL)菌液加入步骤2)的培养基上。 

4)用涂布棒将步骤3)所述菌液涂布均匀后，将培养皿倒置培养24h后计数。 

实施例2芽孢生成率的测定方法 

取培养后的发酵液(或菌粉)1mL加入9mL已灭菌的生理盐水中，80℃水浴中处理10min，立即用水冷却至室温，按照实施例1所述的方法测定活菌数即为芽孢数。 

实施例3本发明的复合微生物添加剂制备过程中活菌数及芽孢率的测定 

本发明发酵过程中实际生产数据见表1，由表1知发酵得到的复合微生态制剂具有很高的菌体活性，发酵液活菌数达10¹⁰CFU/g以上，芽孢率达77.3％；复 合微生物添加剂菌体活性高达8.7×10¹⁰CFU/g，芽孢率达96.1％。可见本发明的复合微生物饲料添加剂不仅具有高的活菌数，同时芽孢生成率也达到了很高的程度，这也预示着本发明的复合微生物饲料添加剂具有一定的抗逆性，能够抵御饲料制粒、饲喂等过程中热和动物胃酸对其的不良环境。 

表1发酵过程实际生产数据表 

实施例4热处理对本发明复合微生物添加剂的影响 

取复合微生物添加剂0.1g置于已灭菌的生理盐水中，制成菌悬液，分别置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴处理30min，立即用水冷却至室温，按照实施例1所述的方法测定活菌数。不同温度的热处理对本发明复合微生物添加剂菌体存活率的影响见表2。 

表2不同温度对复合微生物添加剂菌体存活率的影响 

本发明复合微生物添加剂在温度为45℃、50℃时发生了增殖现象，温度在55℃及以上时，菌体存活率较高，达到94.3％以上。可见本发明复合微生物添加剂具有较好的对高温的抵抗能力。在工业生产时，高温制粒对微生态制剂具有破坏作用，本实施例结果说明本发明复合微生物添加剂可以抵御65℃的高温。 

实施例5模拟仔猪胃肠溶液对本发明复合微生物添加剂的影响 

模拟胃液的配制：取质量浓度为1％的盐酸，加蒸馏水稀释使pH达到2.5，然后在液体中按1％(w/v)量添加胃蛋白酶，充分溶解后用孔径0.2μm的微孔 滤膜过滤除菌，备用。 

模拟胰液的配制：取KH₂PO₄0.68g，加蒸馏水50mL溶解，用1mol/L的NaOH溶液调pH至6.8，加水稀释至100mL，然后再加入1g胰蛋白酶，充分溶解后用孔径0.2μm的微孔滤膜过滤除菌，备用。 

模拟胆汁的配制：在LB液体培养基中加入牛胆酸盐，配制成胆汁浓度为0.3％、的液体培养基，115℃灭菌15min，备用。 

将本发明复合微生物添加剂置于模拟胃液中处理2.5h，模拟胰液中处理3h，模拟胆汁溶液中处理8h后，菌体存活情况如下表： 

表3模拟仔猪胃肠溶液对复合微生物添加剂菌体存活率的影响 

本发明复合微生物添加剂在经过模拟仔猪胃液处理后，存活率为60.5％；经过模拟仔猪胰液处理后，菌体数量没有降低，反而呈现增加趋势；经模拟仔猪胆汁处理后，仍有15.8％的菌体存活；经过胃液、胰液、胆汁液的接续处理后，存留在肠道中的总活菌数仍能达到9.08×10⁹CFU/mL以上，证明本发明复合微生物添加剂在饲喂过程中能够较好的抵御仔猪的胃肠环境。 

实施例6本发明复合微生物添加剂的贮存稳定性 

将本发明复合微生物添加剂产品置于-7℃保存，每隔10d测一次总活菌数，共测3个月，以检测本发明复合微生物添加剂的保质期，结果如下表： 

表4复合微生物添加剂的贮存稳定性 

本发明复合微生物添加剂保存3个月，总活菌数仍保持在10¹⁰CFU/mL以上，存活率达26.9％，可见本发明复合微生物添加剂具有良好的贮存稳定性。 

实施例7本发明复合微生物添加剂对仔猪生长性能的影响 

本实施例中所用的实验动物为体重及出生日期几乎相同的断奶健康杜长大三元仔猪80头，断奶日龄为28日龄，由哈尔滨英瑞斯饲料集团江北种猪场提供。随机分成试验组和对照组，每个组设2个重复，每个重复20头猪。 

本实施例中所用的实验动物日粮选用玉米-豆粕型日粮，营养需要参照哈尔滨英瑞斯饲料有限公司企业标准Q/HYRS02-2007设计，饲料为粉料，日粮组成及营养水平见表5。 

表5仔猪基础日粮配方及营养水平 

饲养试验在哈尔滨英瑞斯饲料集团江北种猪场进行，圈养，室温18～23℃；采用粉料拌湿饲喂，其中试验组添加复合微生物制剂0.01％，饲喂时间在每天8:00、13:00、19:00，自由饮水；每次饲喂直至料槽剩余少许饲料为止，并记录采食时间。 

测定指标： 

1)日增重：分别于试验的第一天和最后一天早晨8:00空腹称重，根据各组仔猪始末体重，计算平均日增重。 

2)耕料量及料重比：记录每天每组总投料量及总剩料量，计算头均日耗料量及料重比(头均日耗料量/头均日增重) 

3)腹泻率及腹泻指数：每天早晨08:00定时观察仔猪粪便情况。记录腹 泻头数，计算腹泻率和腹泻指数。 

腹泻率＝总腹泻次数/(总头数×试验天数)×100％ 

腹泻指数＝粪便评分之和/供试猪总头数(评分表见表6)，该指数越高，表示腹泻越严重。 

表6腹泻评分标准 

4)营养物质消化率：采用全收粪法在试验开始后的第21～25d进行为期5d的消化试验。粪样烘干后粉碎过40目筛，放置于-20℃冰箱保存备用。测定试验日粮和粪样的干物质、粗蛋白质、总能及粗灰分含量，从而计算其消化率。 

本发明复合微生物添加剂对断奶仔猪生长性能的影响见表7。由表7知试验组和对照组料重比分别为1.56和1.78，差异显著(P＜0.05)，在仔猪日粮中添加复合微生物制剂，可使日增重提高20.72％，料重比降低12.36％，显著的提高了断奶仔猪的生长性能(P＜0.05)。 

本发明复合微生物添加剂对断奶仔猪腹泻的影响见表8。由表8可知，虽然试验组腹泻率和腹泻指数较对照组差异不显著(P＞0.05)，但试验组与对照组相比，腹泻率下降了22.73％，腹泻指数也有所下降，证明饲料中添加复合微生物制剂可以在一定程度上降低断奶仔猪的腹泻发生率。 

本发明复合微生物添加剂对断奶仔猪营养物质消化率的影响见表9。由表9可知，添加复合微生物制剂的试验组与对照组相比，蛋白质、有机物质、干物质和总能量均有提高，其中总能量、有机物质分别提高了2.99％和4.15％；蛋白质和干物质分别提高5.70％和2.81％，差异显著(P＜0.05)。可见本发明复合微生物添加剂可在一定程度上提高仔猪对营养物质的消化能力，从而提高饲料利 用率，增加经济效益。 

表7复合微生物添加剂对断奶仔猪生长性能的影响 

注：表中同一列没有相同小写字母标记者表示差异显著(P＜0.05)，有相同字母者标记者差异不显著(P＞0.05)，下同。 

表8复合微生物添加剂对断奶仔猪腹泻率的影响 

表9复合微生物添加剂对仔猪营养物质消化率的影响 

Claims (10)

1.一种饲用复合微生物添加剂，其特征是该添加剂中包含有两种芽孢杆菌。

2.如权利要求1所述的饲用复合微生物添加剂，其特征在于所述两种芽孢杆菌分别为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K2008，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.4929；地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)DY01，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.4930。

3.如权利要求2所述的饲用复合微生物添加剂，其特征在于添加剂中枯草芽孢杆菌K2008、地衣芽孢杆菌DY01菌种的质量配比为1∶1。

4.一种饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于制备工艺如下：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌按比例混合培养后，采用特定的发酵条件进行好氧发酵，制备发酵液，再采用后续处理工艺制成微生态制剂。

5.如权利要求4所述的饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌混合培养，采用特定的发酵条件进行好氧发酵，制备发酵液，包括如下的步骤：

1)菌种活化：将保存的枯草芽孢杆菌K2008、地衣芽孢杆菌DY01菌种分别转接于新鲜的斜面培养基上，34℃培养16h。斜面培养基采用LB培养基：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl1％，琼脂1％，自然pH。

2)种子液的制备：在超净工作台中将活化好的枯草芽孢杆菌K2008、地衣芽孢杆菌DY01菌种用接种环分别接于LB液体培养基中。均以34℃、175r/min摇床培养20h。

3)二联菌液的制备：在超净工作台中将步骤2)所得两种芽孢杆菌种子液均按1.5％的体积比接种到新的LB液体培养基中(总接种量为3％)，两种芽孢杆菌的质量配比为1∶1。34℃、175r/min摇床培养20h。

4)发酵液的制备：将步骤3)所得二联菌液按3％的体积比接种到装有25L发酵培养基的发酵罐中，控制装液量为60～70％，初始pH值7.2～7.5，搅拌转速100～150r/min，34℃需氧培养24h，然后逐级上500L中罐、5000L大罐。所述的发酵培养基配方为：每L含糖蜜(总糖含量53％)15mL，玉米粉(氮含量4.76％)15g，豆粕粉(氮含量6.94％)20g，CaCl₂2g，MgSO₄·7H₂O2g，pH7.2～7.5。

6.如权利要求4所述的饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于后续处理工艺采用如下几种方法进行：静置，离心，掺拌吸水性介质，干燥。

7.如权利要求6所述的饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于所述的静置方法将如权利要求5所述的发酵液静置处理36～48h，直至发酵液芽孢生成率达90％以上，即为合格。

8.如权利要求6所述的饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于所述的离心方法，条件为：管式离心机8000～10000r/min离心30～40min，得到二联芽孢杆菌菌泥。

9.如权利要求6所述的饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于所述的掺拌吸水性介质，为向权利要求8所述的二联芽孢杆菌菌泥中掺拌稻壳粉，其质量以刚好将菌泥完全包埋为准，吸干水分。

10.如权利要求6所述的饲用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于所述的干燥方法，将权利要求8中所述的菌泥、稻壳粉混合物置于烘干设备上，以25～30℃的低温将混合物烘干，得到粉剂。经质检合格后称重包装，即得产品。