CN103893214B - 一种全燕麦固态混菌发酵生产益生菌活菌粉剂及制备方法 - Google Patents
一种全燕麦固态混菌发酵生产益生菌活菌粉剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物制剂领域，公开了一种利用多种益生菌直投剂混菌固态发酵全燕麦获得三联益生菌活菌粉剂及其制备方法，所述三联益生菌活菌粉剂中含有乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌P‑8和干酪乳杆菌Zhang，以燕麦全粉为发酵基质制备而得,具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力；改善人体肠道菌群结构的能力；调节血脂代谢；提高肠道抗致病菌感染能力；有效预防缓解腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠易激综合症。
Description
发明领域
本发明属于生物制剂领域，是一种利用多种益生菌直投剂混菌固态发酵全燕麦获得三联益生菌活菌粉剂及其制备方法。
背景技术
益生菌是一类通过改善肠道微生物从而对宿主产生有益影响的微生物。它可通过参与肠道微生物平衡来抑制病原菌生长，避免了长期使用抗生素产生的耐药性和二重感染，因此，益生菌产品近年来备受人们的关注。
目前，虽然市场上的益生菌产品极其丰富，但是开发的产品以发酵乳制品为主，其中含有高的脂肪和胆固醇，还可能引发乳糖不耐症。所以，非乳益生菌产品成为发展的趋势。而居于谷物之首的燕麦，具有很高的营养和保健价值，其含有大量的膳食纤维，而膳食纤维的主要成分之一β-葡聚糖在燕麦麸皮中含量高，其具有降低血液中胆固醇的含量以及餐后血糖水平的作用。同时，肠道微生物发酵β-葡聚糖（作为一种益生元）后会形成短链脂肪酸，从而保护结肠膜。并且燕麦还具有含量相对较高的蛋白质，必需氨基酸组成合理，赖氨酸含量高于小麦粉和稻米，有利于饮食中其他氨基酸的吸收，色氨酸含量比较丰富。所以，以燕麦为基质的发酵食品越来越受到人们的关注。
然而，开发的燕麦发酵产品中普遍使用各种糖类以及添加剂，其高脂高糖并不适宜长期食用，尤其针对具有高血脂、高血糖的消费人群。以全燕麦（包含燕麦麸皮）为唯一基质的益生菌产品具有很好的发展前景，而通过三株益生菌直投剂进行混菌固态发酵燕麦全粉（包含燕麦麸皮）生产三联益生菌活菌粉剂产品的报道国内外还未见，且在混菌固态发酵中，菌株间的互利共栖协同作用，能提高产率和菌体浓度；多菌株的产酶、产酸和产营养物质能力、对基质的分解能力等要显著优于单菌发酵。混菌固态发酵还具有获得纯种发酵无法获得的产物，生长速度快，对底物利用率高，可多级转化，发酵后的微生物群体稳定，省工节能，简化工艺及发酵设备和易控制等诸多优点，且不易染菌。
植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）是2005年分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗草原上牧民家庭自然发酵酸牛乳样品中的1株具有优良益生特性的植物乳杆菌。具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力；能够在人体肠道中定植及繁殖，改善人体肠道菌群结构的能力；调节血脂代谢，对高血脂症肝脏具有保护修复作用，增强机体抗氧化能力；对机体免疫具有调节作用。
乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）是于2005年从健康蒙古族儿童肠道中分离筛选出的1株性能卓越的益生菌。具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力；能够有效拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力；有效预防缓解腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠易激综合症。
干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）是于2001年从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶样品中分离筛选出的1株性能卓越的益生菌。具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力；能够在人体肠道中定植及繁殖，改善人体肠道菌群结构的能力；能够有效拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力；调节血脂代谢，对高血脂症肝脏具有保护修复作用，增强机体抗氧化能力；对机体免疫具有调节作用；有效预防肿瘤生长和Ⅱ型糖尿病的发生。
其中，植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）与干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）均为兼性厌氧菌，而乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）为严格厌氧菌。利用其直投剂混菌发酵接种工艺为接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）与干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）一定时间后，再接种乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）,混菌发酵固态燕麦全粉。其机理在于，发酵前期植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）与干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）的生长、增殖及新陈代谢能够为乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）的增殖提供丰富的营养物质及必要的厌氧环境，更利于乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）生长的启动。再者，植物乳杆菌P-8（L.plantarumP-8）与干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）对膳食纤维的利用相对较少，保证乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）对膳食纤维的利用，进而产生多样化的生物活性物质，其机理类似于膳食纤维作为益生元进入人体后的作用机理。
具体涉及利用植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）、干酪乳杆菌Zhang（L.caseiZhang）、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂，混菌固态发酵全燕麦制成三联活菌粉剂及其制备方法。三株菌中干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）和乳双歧杆菌V9（B.lactis V9），于2011年11月18日，而植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）于2012年6月28日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心（国家专利局指定专利微生物保藏中心）保藏，干酪乳杆菌Zhang、乳双歧杆菌V9和植物乳杆菌P-8的保藏号分别为CGMCC No.5469、CGMCCNo.5470和CGMCC No.6312。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
名称为一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用，申请号：200710118485.4。发明涉及一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用。所述干酪乳杆菌（L.casei Zhang）是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；改菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌株保藏中心，保藏号：CGMCC No.1697。本发明的干酪乳杆菌（L.caseiZhang）能实现在固态发酵中的应用，特别是作为发酵剂在乳制品、保健食品、微生物饲料以及动物保健制品中的应用；本发明的干酪乳杆菌菌体存活率提高的方法，是一种优化固态培养基的方法，能得到较高的菌体密度和菌体存活率；本发明的干酪乳杆菌固态发酵活菌数是液体MRS发酵活菌数的二十倍以上。
名称为一株植物乳杆菌及其高密度培养和冻干菌株制备的方法，申请号：201210115452.5。本专利设计一株植物乳杆菌及其高密度培养和冻干菌粉制备的方法。技术方案是：其特征在于：所述植物乳杆菌（L.plantarum P8）是分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗传统发酵乳制品（酸牛奶）中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、胆盐耐受性、肠道凝集作用及抑制常见肠道致病菌等特性；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.5468。
名称为有效缓解酒精性肝损伤的复合益生菌发酵豆乳饮料及制备方法，申请号：201210005581.9。本发明涉及有效缓解酒精性肝损伤的复合益生菌发酵豆乳饮料，其特征是配料组成为：大豆乳或大豆粉还原乳300kg、葡萄糖10～15kg、蔗糖100～120kg、稳定剂2～4kg、酸液0.1～0.3kg、食用香精或香料0.1～0.3kg、干酪乳杆菌（L.casei Zhang）发酵剂0.012～0.03kg、双歧杆菌（B.lactis V9）发酵剂0.015～0.03kg。所述发酵剂菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.5469和CGMCC No.5470。本发明还公开了其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种益生菌直投剂混菌固态混菌发酵全燕麦而生产三联益生菌活菌粉剂及其制备方法。
本发明实现目的技术方案如下：
一种益生菌活菌粉剂，所述益生菌活菌粉剂中含有乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8或干酪乳杆菌Zhang中至少一种，所述益生菌活菌粉剂以燕麦全粉为发酵基质，所述益生菌活菌粉剂采用乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8或干酪乳杆菌Zhang中至少一种经固态发酵制备而得。
三联益生菌活菌粉剂，所述益生菌活菌粉剂中含有乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8和干酪乳杆菌Zhang；所述益生菌活菌粉剂以燕麦全粉为发酵基质，所述益生菌活菌粉剂采用乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8和干酪乳杆菌Zhang经固态发酵制备而得。
所述三联活菌粉剂产品中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数不少于1.73×109CFU/g，干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）的活菌数不少于4.65×109CFU/g，乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）的活菌数不少于1.73×108CFU/g。
一种三联益生菌活菌粉剂，可由下述方法制得：
以燕麦全粉和水制得固态培养基，植物乳杆菌P-8、干酪乳杆菌Zhang直投剂分别按2%-10%（v/w）和2%-12%（v/w）的接种量接种固态培养基培养，pH自然，控制温度为34-38℃；固态发酵培养0～16h后将乳双歧杆菌V9直投剂再按2%-12%（v/w）的接种量接种固态培养基，再混菌固态发酵18-40h，温度不变，共计培养时间为24-42h；发酵结束获得的燕麦固态发酵新鲜曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作为保护剂，真空冷冻干燥16-28h，最后粉碎、过筛，得到三联活菌粉剂。
固态培养基以燕麦全粉（非燕麦精粉，包含燕麦麸皮）为唯一的发酵基质，含水量为40%-70%，不含各种糖类以及添加剂。
有益效果：
冻干后的三联活菌粉剂产品中同时含有高活性的三种益生菌，其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数不少于1.73×109CFU/g，干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）的活菌数不少于4.65×109CFU/g，乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）的活菌数不少于1.73×108CFU/g；发明产品中干酪乳杆菌Zhang和植物乳杆菌P-8主要作用于人体的小肠，乳双歧杆菌V9主要作用于人体的大肠，从而更好的调理肠道健康。
而且，燕麦中含有较为丰富的益生元——膳食纤维及β-葡聚糖等。相比于单菌发酵而言，混菌发酵中膳食纤维的损失偏低；而作为重要益生元的β-葡聚糖，发酵前后均为3.1g/100g DW，可有效促进益生菌在人体内的增殖。
而且，初步人体试验证实：利用三株益生菌混菌固态发酵燕麦制得的三联活菌粉剂治疗腹泻的效果比对照组显著。112名（0-15岁者：38名，15-35岁者：23名，35岁以上者：51名）志愿者食用三联活菌粉剂2周的平均治愈率为94.6%；尤其是对于15-35岁的志愿者，腹泻的治愈率达100%。同时，比已报道的干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）和双歧杆菌（B.lactis V9）发酵豆乳饮（专利申请号：201210006200.9）的治疗效果显著。
附图说明
图1：含水量对益生菌混菌固态发酵燕麦活菌数的影响
图2：直投剂接种量对益生菌混菌固态发酵燕麦活菌数的影响
图3：总培养时间对益生菌混菌固态发酵燕麦总活菌数的影响
具体实施方案
以下将结合具体实施例对本发明的方法进行更具体的描述，但本发明并不限于具体实施例。
1植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）与乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）混菌固态发酵燕麦，加水量、接种量以及培养时间的确定
（1）加水量的确定
筛选实例1
燕麦固态发酵培养基(%)：燕麦全粉55；水45；115℃灭菌20min。
接种与培养条件：先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂，再混菌发酵16h，三株乳酸菌直投剂的接种量均为5%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为3.56×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为1.82×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为1.74×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为3.71×107CFU/g。
筛选实例2
燕麦固态发酵培养基(%)：燕麦全粉50；水50；115℃灭菌20min。
接种与培养条件：先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂，再混菌发酵16h，三株乳酸菌直投剂的接种量均为5%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为5.59×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为2.57×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为3.21×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为8.39×107CFU/g。
筛选实例3
燕麦固态发酵培养基(%)：燕麦全粉45；水55；115℃灭菌20min。
接种与培养条件：先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂，再混菌发酵16h，三株乳酸菌直投剂的接种量均为5%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为3.69×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为1.60×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为2.08×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为8.33×107CFU/g。
筛选实例4
燕麦固态发酵培养基(%)：燕麦全粉40；水60；115℃灭菌20min。
接种与培养条件：先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂，再混菌发酵16h，三株乳酸菌直投剂的接种量均为5%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为3.18×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为1.12×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为2.05×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为7.28×107CFU/g。
结果：最佳的加水量为50%（见附图1）。
（2）接种量的确定
筛选实例5
在含水量已优化的固态发酵培养基中先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactisV9）直投剂，再混菌发酵16h。
接种量与培养条件：三株乳酸菌直投剂的接种量均为2%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为3.59×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为1.70×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为1.88×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为7.14×107CFU/g。
筛选实例6
在含水量已优化的固态发酵培养基中先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactisV9）直投剂，再混菌发酵16h。
接种量与培养条件：三株乳酸菌直投剂的接种量均为5%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为5.59×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为2.57×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为3.21×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为8.39×107CFU/g。
筛选实例7
在含水量已优化的固态发酵培养基中先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactisV9）直投剂，再混菌发酵16h。
接种量与培养条件：三株乳酸菌直投剂的接种量均为8%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为6.47×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为1.40×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为5.07×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为1.46×108CFU/g。
筛选实例8
在含水量已优化的固态发酵培养基中先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactisV9）直投剂，再混菌发酵16h。
接种量与培养条件：三株乳酸菌直投剂的接种量均为10%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，共计培养24h，对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
测得的总活菌数为5.15×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为1.14×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为4.00×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为1.34×108CFU/g。
结果：最适的接种量为8%（见附图2）。
（3）培养时间的确定
筛选实例9
在含水量已优化的固态发酵培养基中先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂，混菌发酵8h后接种乳双歧杆菌V9（B.lactisV9）直投剂，三株乳酸菌直投剂的接种量均为8%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，再分别混菌发酵4、10、16、22、28、34h，分别对新鲜曲料中的益生菌活菌数进行检测。
结果：最佳培养时间为乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂接种后再混菌发酵28h，即最佳总发酵时间为36h（见附图3）。此时测得的总活菌数为8.83×109CFU/g。其中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为2.32×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.caseiZhang）活菌数为6.25×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为2.61×108CFU/g。
（4）真空冷冻干燥保护剂的选择
筛选实例10
在上述最佳优化结果的条件下（即筛选实例9），向混菌固态发酵的燕麦全粉新鲜曲料中加入10%的低聚异麦芽糖保护剂，搅拌均匀，预冻1-5h后，-70～-50℃进行真空冷冻干燥，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥16-28h，再进行粉碎。
测得的总活菌数为1.77×109CFU/g。植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为6.93×108CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为9.86×108CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为8.72×107CFU/g。
筛选实例11
在上述最佳优化结果的条件下（即筛选实例9），向混菌固态发酵的燕麦全粉新鲜曲料中加入10%的低聚果糖保护剂，搅拌均匀，预冻1-5h后，-70～-50℃进行真空冷冻干燥，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥16-28h，再进行粉碎。
测得的总活菌数为1.90×109CFU/g。植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为8.14×108CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为9.86×108CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为1.02×108CFU/g。
筛选实例12
在上述最佳优化结果的条件下（即筛选实例9），向混菌固态发酵的燕麦全粉新鲜曲料中加入10%的低聚半乳糖保护剂，搅拌均匀，预冻1-5h后，-70～-50℃进行真空冷冻干燥，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥16-28h，再进行粉碎。
测得的总活菌数为6.55×109CFU/g。植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）活菌数为1.73×109CFU/g、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为4.65×109CFU/g、乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）活菌数为1.73×108CFU/g。
结果：保护剂为10%低聚半乳糖时的活菌数最高。
2植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）与乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）单菌固态发酵燕麦
筛选实例13
（1）植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）单菌固态发酵燕麦
通过优化确定植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）单菌固态发酵燕麦固态发酵培养基(%)：燕麦全粉50；水50；115℃灭菌20min。
最佳接种与培养条件：乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）直投剂单菌的接种量为8%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，培养24h。
向植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）单菌固态发酵的燕麦全粉新鲜曲料中加入10%的低聚半乳糖保护剂，搅拌均匀，真空冷冻干燥再进行粉碎，测植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）的活菌数。
结果：单菌固态发酵新鲜曲料中植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）的活菌数为1.58×109CFU/g，添加保护剂冷冻干燥后植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）的活菌数为1.04×109CFU/g。
筛选实例14
（2）干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）单菌固态发酵燕麦
通过优化确定干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）单菌固态发酵燕麦固态发酵培养基(%)：燕麦全粉50；水50；115℃灭菌20min。
最佳接种与培养条件：干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂单菌的接种量为10%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，培养28h。
向干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）单菌固态发酵的燕麦全粉新鲜曲料中加入10%的低聚半乳糖保护剂，搅拌均匀，真空冷冻干燥再进行粉碎，测干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）的活菌数。
结果：单菌固态发酵新鲜曲料中干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）的活菌数为6.26×109CFU/g，添加保护剂冷冻干燥后干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）的活菌数为4.31×109CFU/g。
筛选实例15
（3）乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）单菌固态发酵燕麦
通过优化确定乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）单菌固态发酵燕麦固态发酵培养基(%)：燕麦全粉40；水60；115℃灭菌20min。
最佳接种与培养条件：乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂单菌的接种量为10%（v/w），pH自然，培养温度37±1℃，培养36h。
向乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）单菌固态发酵的燕麦全粉新鲜曲料中加入10%的低聚半乳糖保护剂，搅拌均匀，真空冷冻干燥再进行粉碎，测乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）的活菌数。
结果：单菌固态发酵新鲜曲料中乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）的活菌数为1.22×108CFU/g，添加保护剂冷冻干燥后乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）的活菌数为7.81×107CFU/g。
总之，利用三株益生菌直投剂单菌或混菌固态发酵燕麦全粉的对比如表1所示。
3混菌、单菌发酵前后总膳食纤维、可溶性膳食纤维、不可溶性膳食纤维以及β-葡聚糖含量的测定
筛选实例16
利用AACC32-07和AOAC995.16法对单菌或混菌发酵前后总膳食纤维、可溶性膳食纤维、不可溶性膳食纤维含量及β-葡聚糖含量进行测定结果见表2。其中，作为重要益生元的β-葡聚糖含量在发酵前后相差不大。
4人体试验：三联活菌粉剂对志愿者腹泻的治疗情况
筛选实例17
选择224名（0-15岁者：76名，15-35岁者：46名，35岁以上者：102名）腹泻志愿者，实验组连续食用经三株益生菌混菌固态发酵燕麦制得的三联活菌粉剂15天；对照组连续食用三株益生菌等比例配比的复合菌粉（直投剂）15天，调查每周平均排便次数，调查结果如表3所示。实验组职员制食用三联活菌粉剂10或15天，平均每周排便次数达到正常指标4-9次，且粪便状态呈现健康人群粪便状态，证实本产品能有效的治疗腹泻，且比对照组（只食用三株益生菌复合菌粉）的治疗效果显著。
本实验以燕麦全粉为原料，和水按一定的配比制成固态培养基，经灭菌后先接种植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）直投剂、干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）直投剂一定时间后再接种乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂进行混进固态发酵，获得的燕麦固态发酵新鲜曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作为保护剂，真空冷冻干燥16-28h，最后粉碎、过筛，得到三联活菌粉剂。通过混菌发酵制备的燕麦复合益生菌粉剂产品中三株益生菌的活菌数优于单菌发酵的活菌数，尤其是乳双歧杆菌V9（B.lactis V9），且膳食纤维的损失相对较低，亦提供多样化的生物活性物质。
混菌发酵制备的燕麦复合益生菌粉剂中干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）活菌数为4.65×109CFU/g，植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）的活菌数为1.73×109CFU/g，乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）的活菌数为1.73×108CFU/g，而干酪乳杆菌Zhang和植物乳杆菌P-8主要作用于人体的小肠，乳双歧杆菌V9主要作用于人体的大肠，从而更好的调理肠道健康。再者，燕麦中含有较为丰富的益生元——膳食纤维及β-葡聚糖等，相比于单菌发酵而言，混菌发酵中膳食纤维的损失偏低；而作为重要益生元的β-葡聚糖，发酵前后均为3.1g/100g DW，可有效促进益生菌在人体内的增殖。
并且，初步人体试验证实三联活菌粉剂能有效的治疗腹泻，112名志愿者食用三联活菌粉剂2周的平均治愈率为94.6%；尤其是对于15～35岁的志愿者，腹泻的治愈率达100%。比对照组（只食用三株益生菌复合菌粉）的治疗效果显著；比《营养学报》2011年第33卷第1期报道的双歧杆菌V9（B.lactis V9）单菌的治疗效果显著；也比已报道的干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）和双歧杆菌（B.lactis V9）发酵豆乳饮（专利申请号：201210006200.9）的治疗效果显著。
故而，通过干酪乳杆菌Zhang（L.casei Zhang）、植物乳杆菌P-8（L.plantarum P-8）和乳双歧杆菌V9（B.lactis V9）直投剂混菌固态发酵燕麦制备的复合益生菌粉中含有多种益生菌、益生元及丰富的赖氨酸、色氨酸、蛋白质等营养物质，且能有效治疗腹泻，有望成为新的功能性、复合益生菌食品。
表1益生菌单菌或混菌固态发酵燕麦的比较
表2单菌或混菌发酵燕麦中膳食纤维以及β-葡聚糖的含量变化
表3食用三联益生菌活菌粉剂对志愿者腹泻改善情况
备注：健康人群平均每周排便次数正常指标为4-9次/周;未治愈者的排便次数影响总体的平均每周排便次数。
Claims (5)
1.一种三联益生菌活菌粉剂，所述益生菌活菌粉剂中含有乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8和干酪乳杆菌Zhang；所述益生菌活菌粉剂以燕麦全粉为发酵基质，所述益生菌活菌粉剂采用乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8和干酪乳杆菌Zhang经固态发酵制备而得；所述三联活菌粉剂产品中植物乳杆菌P-8活菌数不少于1.73×109 CFU/g，干酪乳杆菌Zhang的活菌数不少于4.65×109 CFU/g，乳双歧杆菌V9的活菌数不少于1.73×108 CFU/g。
2.根据权利要求1所述三联益生菌活菌粉剂，由下述方法制得：
以燕麦全粉和水制得固态培养基，植物乳杆菌P-8、干酪乳杆菌Zhang直投剂分别按2%-10%（v/w）和2%-12%（v/w）的接种量接种固态培养基培养， pH自然，控制温度为34-38℃；固态发酵培养0~16 h后将乳双歧杆菌V9直投剂再按2%-12%（v/w）的接种量接种固态培养基，再混菌固态发酵18~40 h，温度不变，共计培养时间为24-42 h；发酵结束获得的燕麦固态发酵新鲜曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作为保护剂，真空冷冻干燥16-28 h，最后粉碎、过筛，得到三联活菌粉剂。
3.如权利要求2所述三联益生菌活菌粉剂，其特征在于，所述固态培养基以燕麦全粉为唯一的发酵基质，含水量为40%-70%。
4.如权利要求1-3任一权利要求所述三联益生菌活菌粉剂的制备方法，包括如下步骤：以燕麦全粉和水制得固态培养基，植物乳杆菌P-8、干酪乳杆菌Zhang直投剂分别按2%-10%和2%-12%的接种量接种固态培养基培养， pH自然，控制温度为34-38 ℃；固态发酵培养0~16 h后将乳双歧杆菌V9直投剂再按2%-12%的接种量接种固态培养基，再混菌固态发酵18~40 h，共计培养时间为24-42 h；发酵结束获得的燕麦固态发酵新鲜曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作为保护剂，真空冷冻干燥16-28 h，最后粉碎、过筛，得到三联活菌粉剂。
5.如权利要求4所述三联益生菌活菌粉剂的制备方法，包括如下步骤：在燕麦固态发酵培养基中先接种植物乳杆菌P-8和干酪乳杆菌Zhang直投剂，混菌发酵8 h后接种乳双歧杆菌V9直投剂，三株乳酸菌直投剂的接种量均为8%（v/w），pH自然，培养温度37±1 ℃，混菌发酵28h。
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