CN108125902A - 一种益生菌组合物、护肤精华液和面膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种益生菌组合物，使用该益生菌组合物制备的护肤精华液以及面膜，并公开了所述护肤精华液的制备方法。所述益生菌组合物包括植物乳杆菌C2(L.plantarum C2)(微生物保藏号为：CGMCC No.14532)，植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3)(微生物保藏号为：CGMCC No.14531)和植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)(微生物保藏号为：CGMCC No.14533)。所述益生菌组合物是通过生物发酵技术获得的含有改善面部皮肤的有益微生物和活性因子的菌剂，从而减少在皮肤上化学性药物的使用，所述护肤精华液以及面膜由所述益生菌组合物制备，富含活性益生因子，具有补水、抗氧化、美白和紧肤的作用，能够实现有效提升皮肤水润、亮丽和紧肤状态的效果。

Description

一种益生菌组合物、护肤精华液和面膜及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种益生菌组合物、使用该益生菌组合物制备的护肤精华液和面膜及其制备方法。
背景技术
传统护肤品通常使用化学类制剂作为主要成分，但是化学制剂常会引发各种皮肤问题，而且，长期使用以化学类制剂为主要成分的护肤品最终会导致皮肤受损。随着对护肤品自然亲肤的要求越来越强烈，目前有以植物提取物作为主要成分的护肤品。但是植物提取物通常也是以化学制剂作为助剂提取出来的，难免存在化学制剂残留，有些化学制剂即使是微量残留也会引起皮肤问题，甚至皮渗至血液中引发疾病。
因此，需要开发一种不含有化学制剂的护肤品。
发明内容
本申请的目的在于提供一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8)，干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)，乳双歧杆菌V9(B.lactisV9)，植物乳杆菌C2(L.plantarum C2)，植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3)和植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)。上述菌株已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其中，植物乳杆菌P-8的微生物保藏号为：CGMCC No.6312；干酪乳杆菌Zhang的微生物保藏号为：CGMCC No.5469；乳双歧杆菌V9的微生物保藏号为：CGMCC No.5470；植物乳杆菌C2的微生物保藏号为：CGMCC No.14532；植物乳杆菌LP3的微生物保藏号为：CGMCCNo.14531；植物乳杆菌LP4的微生物保藏号为：CGMCC No.14533。
在一种可实现的方式中，所述益生菌组合物中各菌株的活菌量之比为：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8):干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang):乳双歧杆菌V9(B.lactisV9):植物乳杆菌C2(L.plantarum C2):植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3):植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)＝(0.5～1.5):(1.5～2.5):(1.5～2.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)；所述益生菌组合物中活菌总量为100亿CFU/g。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum C2，L.plantarum C2)通过以下方法筛选得到：
自四川省自然发酵的泡菜样品，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌C2(Lactobacillus plantarum C2)，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.14532；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum C2)具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH 6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum C2)能够用于护肤。其在皮肤上能够产生大量的有机酸从而降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机体免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力。而且，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上产生过氧化氢、抗菌肽与细菌素等产物，这些产物对病原菌有明显的抑制作用。此外，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上代谢产生多种护肤活性因子，如超氧化物歧化酶、透明质酸等，从而实现护肤的作用。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP3，L.plantarum LP3)通过以下方法筛选得到：
自四川省自然发酵的泡菜样品，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌LP3(Lactobacillus plantarum LP3)，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.14531；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum LP3)具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH＝6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)通过以下方法筛选得到：
所述植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)是从传统泡菜中分离得到的潜在益生特性的益生菌；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.14533；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum LP4)；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH＝6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
一种益生菌组合物，其特征在于，包括：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8)，干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)，乳双歧杆菌V9(B.lactis V9)，植物乳杆菌C2(L.plantarumC2)，植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3)和植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)，其中，植物乳杆菌C2的微生物保藏号为：CGMCC No.14532；植物乳杆菌LP3的微生物保藏号为：CGMCCNo.14531；植物乳杆菌LP4的微生物保藏号为：CGMCC No.14533。
本申请还提供所述益生菌组合物用于护肤的用途。所述益生菌组合物的使用方法为在洁肤后，将所述益生菌组合物涂覆于皮肤上。
本申请还提供一种制备权利要求1所述益生菌组合物的方法，所述方法包括：
步骤1-1，将活化好的植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4接种于培养基中，发酵得到混合益生乳酸菌发酵液；
步骤1-2，提取步骤1-1得到的混合益生乳酸菌发酵液中上清液，所述上清液为所述益生菌组合物，可选地，对提取到的上清液进行杀菌处理。
在一种可实现的方式中，在步骤1-1中，植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4的活菌量之比为(0.5～1.5):(1～3):(1～3):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)，优选为1:2:2:1:1:1。
本申请还提供一种使用权利要求1所述益生菌组合物制备的护肤精华液，所述护肤精华液包括以下重量含量的组分：
各组分的重量含量为基于所述护肤精华液的总重量，以各组分的重量计，获得的重量百分含量，所述益生菌组合物的重量以其中所有益生菌的重量之和计。
在一种可实现的方式中，所述保湿剂选自丙二醇、丁二醇和甘油中的一种或多种；所述增稠剂选自羟乙基纤维素和黄原胶中的一种或多种；所述增溶剂选自氢化蓖麻油和司盘60中的一种或多种。
本申请还提供一种制备所述护肤精华液的方法，所述方法包括：
步骤2-1，将保湿剂与增稠剂混合；
步骤2-2，将步骤2-1制备的体系与纯净水混合；
步骤2-3，将步骤2-2制备的体系与增溶剂混合；
步骤2-4，将步骤2-3制备的体系与益生菌组合物混合；
步骤2-5，滤除步骤2-4制备的体系中的固形物。
本申请还提供一种面膜，所述面膜含有使用所述益生菌组合物制备的护肤精华液。有益效果：
本申请提供的益生菌组合物不同于常见的植物提取物或者化学类制剂，是通过生物发酵技术获得的含有改善面部皮肤的有益微生物和活性因子的菌剂，从而减少在皮肤上化学性药物的使用，提升面部皮肤的健康美丽。
本申请提供的护肤精华液以及面膜由所述益生菌组合物制备，所述护肤精华液富含活性益生因子，如：胞外多糖、、超氧化物歧化酶、苯乳酸、透明质酸、多肽及氨基酸，所述护肤精华液以及面膜能够抑制皮肤有害菌，改善皮肤微生态，具有补水、抗氧化、美白和紧肤的作用，能够实现有效提升皮肤水润、亮丽和紧肤状态的效果。
具体实施方式
本申请提供一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8)，干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)，乳双歧杆菌V9(B.lactis V9)，植物乳杆菌C2(L.plantarum C2)，植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3)和植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)。上述菌株已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其中，植物乳杆菌C2的微生物保藏号为：CGMCC No.14532；植物乳杆菌LP3的微生物保藏号为：CGMCC No.14531；植物乳杆菌LP4的微生物保藏号为：CGMCC No.14533。其中，菌株L.plantarumP-8，菌株B.lactis V9和菌株L.casei Zhang为现有技术已经公开的菌株，如中国专利CN105802876A中所公开的。
具体地，干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)是2001年分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶(Komiss)中的一株具有优良益生特性的干酪乳杆菌。目前该菌种保存于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.5469。
乳双歧杆菌V9(B.lactis V9)是2005年分离自内蒙古草原上健康蒙古族儿童肠道中的一株具有优良益生特性的乳双歧杆菌。目前该菌种保存于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.5470。
植物乳杆菌P-8是2003年从内蒙古自治区牧民家庭中的自然发酵酸牛奶中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，目前该菌种保存于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.5468。
本发明人发现，本申请提供的益生菌组合物能够在人体皮肤粘膜表面特定部位粘附和繁殖，形成自然的菌膜，可以帮助皮肤抵御外来致病菌的侵袭。益生菌群的生长对人体皮肤具有多重作用。首先，益生菌群可以参与皮肤皮脂腺代谢，形成乳化脂质膜(游离脂肪酸)，可以中和沾染皮肤上的碱性物质，抑制暂住菌、真菌等致病微生物的定植、生长和繁殖，对皮肤自净起重要作用。其次，定植在皮肤上的益生菌群形成生物膜，与其他菌群相互作用，提高皮肤免疫功能，保护机体的健康。第三，皮肤表面的益生菌生长会分解产生磷脂、固醇类、角质蛋白等成分，可以被皮肤细胞吸收，促进皮肤细胞生长，延缓老化和减少皱纹产生。
足量益生菌及其产生的抗菌素等代谢产物能抑制坏细菌的生长和繁殖。皮肤表面覆盖了益生菌，污染物就不会直接接触到皮肤。益生菌还能够抵挡自由基的攻击。正常皮肤表面偏酸性，其pH值约为5.5-7.0，这种弱酸性能阻止皮肤表面的细菌、真菌侵入，并有抑菌、杀菌的作用。益生菌可以产生醋酸和乳酸来维持皮肤表面的弱酸性环境。益生菌代谢产生的超氧化物歧化酶广泛应用于化妆品方面，能够有效被清除氧自由基，避免其对胶原蛋白、弹力纤维蛋白的破坏，保持皮肤湿润有弹性，减少黑色素沉积。此外，干燥的皮肤允许外来物质的渗入，这样可能就对引起炎症的刺激物和过敏原敞开了大门。而益生菌代谢产生的透明质酸是理想的天然保湿因子，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。
通过提供面部益生菌及其护肤活性因子来增强面部皮肤表面的益生菌，改善面部皮肤微生物环境，减少化学性药物的使用，提升面部皮肤健康美丽。
优选地，所述益生菌组合物中各菌株的活菌量之比为：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8):干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang):乳双歧杆菌V9(B.lactis V9):植物乳杆菌C2(L.plantarum C2):植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3):植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)＝(0.5～1.5):(1.5～2.5):(1.5～2.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)，优选为1:2:2:1:1:1，所述益生菌组合物中活菌总量为100亿CFU/g。
本发明人发现，L.plantarum P-8、L.casei Zhang、B.lactis V9、L.plantarumC2、L.plantarum LP3和L.plantarum LP4 6株菌之间的比例对混合发酵的活菌含量及其代谢产物有显著影响，当活菌比例为1:2:2:1:1:1时，发酵液中活菌含量达到峰值，发酵过程积累的活性益生因子(如：胞外多糖、超氧化物歧化酶、苯乳酸、透明质酸、多肽等)含量也最高。
本申请还提供所述益生菌组合物用于护肤的用途。
本申请还提供一种制备前述益生菌组合物的方法，所述方法包括：
步骤1-1，将活化好的植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4接种于培养基中，发酵。
在一种可实现的方式中，植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4的活菌量之比为(0.5～1.5):(1～3):(1～3):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)，优选为1:2:2:1:1:1。
基于培养基的总重量，以所有菌株的活菌量之和计，所述益生菌组合物的总接种量为2％。所述培养基为在(110～130)℃，如121℃条件下经过10min～30min灭菌处理的无菌处理的培养基。其中，培养基配方为：大豆分离蛋白粉/脱脂大豆粉20～60g，胶原蛋白粉5～20g，乳清蛋白粉5～20g，酵母蛋白粉5～20g，蔗糖40～80g，蒸馏水1L，初始pH＝7.0。
在一种可实现的方式中，发酵条件为流加10mol/L NaOH溶液控制发酵过程pH值为4.5～5.5，如5.0，于20℃～40℃发酵20～40h。
步骤1-2，提取步骤2-1得到的混合益生乳酸菌发酵液中上清液，所述上清液为所述益生菌组合物，可选地，对提取到的上清液进行杀菌处理。
在一种可实现的方式中，将发酵完成的混合益生乳酸菌发酵液经高速离心提取上清液，提取到的上清液在80～100℃，如95℃条件下经过巴氏杀菌1～10min，如5min处理。
可选地，所述菌株可以采用以下方法进行活化：将植物乳杆菌P-8，乳双歧杆菌V9，干酪乳杆菌Zhang，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4菌种分别接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代2次。
本申请还提供一种使用前述所述益生菌组合物制备的护肤精华液，所述护肤精华液包括以下重量含量的组分：
优选地，
其中，各组分的重量含量为基于所述护肤精华液的总重量，以各组分的重量计，获得的重量百分含量，特别地，益组合物的重量以所述益生菌组合物中各益生菌的重量之和计。
其中，所述益生菌组合物为前述益生菌组合物，具体地，所述益生菌组合物包括植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8)，干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)，乳双歧杆菌V9(B.lactis V9)，植物乳杆菌C2(L.plantarum C2)，植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3)和植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)，优选地，所述益生菌组合物中各菌株的活菌量之比为：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8):干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang):乳双歧杆菌V9(B.lactis V9):植物乳杆菌C2(L.plantarum C2):植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3):植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)＝(0.5～1.5):(1.5～2.5):(1.5～2.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)，优选为1:2:2:1:1:1，所述益生菌组合物中活菌总量为100亿CFU/g。
在本申请中，所述保湿剂用于皮肤保湿，选自丙二醇、丁二醇和甘油中的一种或多种，优选为丁二醇重量:甘油重量＝1:1的组合物。本发明人发现，该重量的保湿剂能充分填入角质间隙，实现保湿功能。
在本申请中，所述增稠剂选自羟乙基纤维素和黄原胶中的一种或多种，优选为羟乙基纤维素的重量:黄原胶的重量＝2:1的组合物。本发明人发现，该重量的增稠剂能够增加护肤精华液的粘稠度、保持护肤精华液中的水分并且能够维护护肤精华液胶体稳定性
在本申请中，所述增溶剂用于润滑和增溶，选自氢化蓖麻油和司盘60中的一种或多种，优选为氢化蓖麻油。本发明人发现，该重量比的增溶剂，特别是氢化蓖麻油能令皮肤光滑和滋润，改善皮肤粗糙。
所述护肤精华液富含活性益生因子，如胞外多糖、超氧化物歧化酶、苯乳酸、透明质酸、多肽及氨基酸，能够抑制皮肤有害菌，改善皮肤微生态，实现补水、抗氧化、美白和紧肤的效果。
本申请还提供一种制备所述护肤精华液的方法，所述方法包括：
步骤2-1，将保湿剂与增稠剂混合。
本申请步骤2-1中，可以使用现有技术中任意一种用于将液体物质与固体微粒混合均匀的方法。可选地，可以将保湿剂加入均质乳化锅中，然后将增稠剂加入保湿剂中，均质搅拌均匀，均质时间为10～30min，如25min，转速为30-40r/min。
步骤2-2，将步骤2-1制备的体系与纯净水混合。
本申请步骤2-2可以使用现有技术中任意一种用于将两种液相物质混合均匀的方法。可选地，向步骤2-1的体系中加入纯净水，在乳化锅中，使各成分搅拌均匀，均质时间60-90min,转速30-40r/min。
步骤2-3，将步骤2-2制备的体系与增溶剂混合。
在一种可实现的方式中，将增溶剂加热搅拌均匀后加入步骤2-2制备的体系中，如，加入盛装有步骤2-2制备的体系的乳化锅中，均质搅拌均匀，均质时间10～40min，如25min，转速30-40r/min。
可选地，调整步骤2-3制备的体系温度为40～45℃条件下搅拌，本发明人发现，在此温度范围内，益生菌组合物中的活性物质易于保持活性。
步骤2-4，将步骤2-3制备的体系与益生菌组合物混合。
在一种可实现的方式中，将所述益生菌组合物加入步骤2-3制备的体系，如将所述益生菌组合物加入盛装有步骤2-4制备体系的乳化锅中，均质搅拌均匀，均质时间10～30min，如20min，转速30-40r/min。
步骤2-5，滤除步骤2-4制备的体系中的固形物。
在一种可实现的方式中，将步骤2-4制备的体系转移至静置储罐中，静置3h～5h，并用200～400目，例如300目滤网过滤。去除杂质和大颗粒物质，使得制得的面膜光滑细腻。
由于保湿剂能够充分溶解增稠剂，增加其在水中的分散性，增溶剂能够促进其他组分和益生菌组合物的溶解，形成均一的分散体系，因此，本申请选择加料的顺序为保湿剂、增稠剂和增溶剂。
本发明还提供一种用所述益生菌组合物制备的面膜，所述面膜含有所述护肤精华液，其富含活性益生因子，如胞外多糖、超氧化物歧化酶、苯乳酸、透明质酸、多肽及氨基酸，所述面膜能够抑制皮肤有害菌，改善皮肤微生态，实现补水、抗氧化、美白和紧肤的效果。
所述面膜通过包括以下步骤的方法制备：将所述护肤精华液体倒入面膜模具中，冷却至15℃～30℃，保持0.5小时～3小时，使面膜基体充分吸收所述护肤精华液，制得面膜。
实施例
在本实施例中所述试剂的商购信息如下：
MRS液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司，微生物检测用。
(一)菌株的活化
将植物乳杆菌P-8，乳双歧杆菌V9，干酪乳杆菌Zhang，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4菌种分别接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代2次，其中乳双歧杆菌V9厌氧培养。
实施例1益生菌组合物的制备
步骤1-1，将活化好的植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4按照2％(1:2:2:1:1:1)接种于经121℃，20min无菌处理的培养基中。通过流加10mol/L NaOH溶液控制发酵过程pH值为5.0于30℃发酵30h。培养基配方为：大豆分离蛋白粉/脱脂大豆粉20～60g，胶原蛋白粉5～20g，乳清蛋白粉5～20g，酵母蛋白粉5～20g，蔗糖40～80g，蒸馏水1L，pH＝7.0。
步骤1-2，将发酵完成的混合益生乳酸菌发酵液经高速离心提取上清液，上清液经巴氏杀菌(95℃，5min)处理。
实施例2含有益生菌组合物的护肤精华液的制备
(1)将丙二醇加入均质乳化锅中，然后将羟乙基纤维素依次加入锅中均质搅拌均匀，均质时间25min，转速30-40r/min；
(2)加入纯净水至乳化锅中，使各成分搅拌均匀，均质时间60-90min,转速30-40r/min。
(3)将氢化蓖麻油加热搅拌均匀后加入乳化锅中，均质搅拌均匀，均质时间25min，转速30-40r/min。
(4)将益生乳酸菌菌液加入乳化锅中，均质搅拌均匀，均质时间20min，转速30-40r/min。
(5)待检测合格后，将共混物抽至静置储罐中，并用300目滤网过滤。
实施例3含有益生菌组合物的面膜的制备
将实施例2制备的护肤精华液倒入面膜模具中，冷却至20℃，保持1.5小时制备出面膜成品。
本发明还涉及采用本发明方法所得到的益生乳酸菌面膜，其特征在其富含活性益生因子(胞外多糖、超氧化物歧化酶、苯乳酸、透明质酸、多肽及氨基酸)；能够抑制皮肤有害菌，改善皮肤微生态，实现补水、抗氧化、美白和紧肤的效果。
实验例
实验例1益生菌组合物的抑菌特性
测定实施例1制备的益生菌组合物的抑菌特性，测定方法依照QB/T2738-2012执行，结果如下表1所示。
表1益生菌组合物的抑菌特性
注：大肠杆菌阳性对照组平均生长菌落数为2.3×104CFU/mL；金黄色葡萄球菌阳性对照组平均生长菌落数为2.5×104CFU/mL；白色念珠菌阳性对照组平均生长菌落数为2.1×104CFU/mL；阴性对照组无菌落生长。
由表1可知，经植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4混合发酵制备的益生菌组合物具有良好的抑制皮肤有害菌的功效，且抑菌效果随作用时间的延长而呈显著增加。
实验例2益生菌组合物中活性物质的含量
测定实施例1制备的益生菌组合物中活性物质的含量，测定方法为：
1.超氧化物歧化酶(SOD)的测定依照国标GB/T 5009.171-2003执行。
2.透明质酸(HA)含量测定
2-1.称取HA标准品，分别配制浓度为100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL、180μg/mL、200μg/mL HA标样；
2-2.称取NaCl，稀释制得浓度为0.2μg/mL NaCl溶液。取100mL样液加入2.5g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，制得25mg/mL CTAB溶液；
2-3.取10μL不同浓度标样各加入20μL CTAB溶液，充分混合，反应10min后，以CTAB溶液为空白，准确测定OD400值(400nm下测定的光密度)，绘制标准曲线；
2-4.取发酵液经4200r/min离心15min，去除菌体取上清液，加入2.5倍的无水乙醇，在4℃静置1h，离心去沉淀，加入所取上清液适当倍数体积的去离子水，振荡溶解，即制得样液，取10μL加入离心管，取20μLCTAB加入离心管混合，反应10min测定OD400值，计算出样品中HA含量。
3.苯乳酸(PLA)含量测定
3.1取一定量的发酵液与1mol/L的盐酸以体积比1:4加入到离心管中，9000rpm离心10min，吸取10ml上清液过0.22μm滤膜，过滤后即为待测样品。
3.2苯乳酸、4-羟基苯乳酸色谱条件：色谱柱Waters HSS T3，柱温30℃，流动相分别为(A)0.1％甲酸(B)甲酸乙腈溶液，梯度洗脱条件(0～2min，20％～50％B；2.1～3min，50％～95％B；3～3.1min，95％～5％B；运行时间3.1min)，流速0.4mL/min，进样体积5.0μL。质谱检测采用ESI正离子模式，毛细管电压2.5kv，锥孔电压40v，离子源温度100℃，脱溶剂气温度600℃，锥孔气流量600L/h，脱溶剂气流量0L/h，并且以亮氨酸-脑啡肽[M-H＝554.2615]作为质量校正轴的参比物。
4.胞外多糖含量测定
4.1称取样品1.000g，于50mL具塞离心管内。用5mL水浸润样品，缓慢加入20mL无水乙醇，同时使用涡旋振荡器振摇，使混合均匀，置超声波提取器中超声提取30min。提取结束后，于4 000r/min离心10min，弃去上清液。不溶物用10mL80％乙醇溶液洗涤、离心。用水将上述不溶物转移入圆底烧瓶，加入50mL，于120W超声提取30min。冷却至室温，过滤，将上清液转移至200mL容量瓶中，残渣洗涤2-3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容。
4.2分别吸取不同体积的标准葡萄糖工作溶液置于20mL具塞试管中，用蒸馏水补至1.0mL。向试液中加入1.0mL苯酚溶液，然后快速加入5.0m L硫酸，静置10min。使用旋涡振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20min,490nm测吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。
4.3吸取1.00mL样品测定液于20ml具塞试管中，按步骤4.2操作，测定吸光度，计算样品中多糖含量。
5.多肽含量测定
5.1用5％的TCA依次配制不同浓度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.0ml标准溶液，加入4.0ml双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值(以第一管做空白对照)，制作标准曲线。
5.2取2.5ml样品溶液，加入2.5ml 10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。
检测结果如下表2所示。
表2益生乳酸菌菌液活性物质含量检测
由表2可知，经植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4混合发酵制备的益生菌组合物含有菌株代谢产生的多种活性成分。其中超氧化物歧化酶具有抗氧化的作用，可以有效防止皮肤衰老，祛斑，抗皱；透明质酸可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂；苯乳酸是乳酸菌产生的一种天然抑菌物质，对人和动物细胞无毒，抑菌谱宽、稳定性高，对多种致病细菌腐真菌具有抑制作用；胞外多糖具有保湿、抗氧化、增强免疫、修复皮肤组织、促进皮肤血液循环、抗痤疮等作用；多肽具有促进细胞分裂分化，促进表皮愈合等作用。
实验例3益生菌组合物中活性物质的含量
测定实施例3制备的面膜的效果，测定方法为：志愿者面部清洁后，取出测试用面膜(右侧半部分)敷于右侧面部，以手指轻压使其紧贴肌肤，敷用15min后取下，对比观察左侧和右侧面部皮肤状态，记录使用效果。每名志愿者每天使用1次面膜，连续使用5天测试结束后，统计300名志愿者使用效果进行汇总，结果如下表3所示。
表3益生乳酸菌面膜使用效果
效果描述
未使用面部 肤色暗沉无光泽，松弛、干涩。
使用面部 肌肤水润有光泽、富有弹性，细腻光滑无皱纹
注：300名志愿者试用时采用左侧脸部不使用任何护肤品，右侧脸部敷用益生乳酸菌面膜的方式。
由表3可知，益生乳酸菌面膜具有补水、抗氧化、美白、亮丽和紧肤的作用。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种益生菌组合物，其特征在于，包括：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8)，干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)，乳双歧杆菌V9(B.lactis V9)，植物乳杆菌C2(L.plantarumC2)，植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3)和植物乳杆菌LP4(L.plantarum LP4)，其中，植物乳杆菌C2的微生物保藏号为：CGMCC No.14532；植物乳杆菌LP3的微生物保藏号为：CGMCCNo.14531；植物乳杆菌LP4的微生物保藏号为：CGMCC No.14533。
2.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，
所述益生菌组合物中各菌株的活菌量之比为：植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8):干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang):乳双歧杆菌V9(B.lactis V9):植物乳杆菌C2(L.plantarum C2):植物乳杆菌LP3(L.plantarum LP3):植物乳杆菌LP4(L.plantarumLP4)＝(0.5～1.5):(1.5～2.5):(1.5～2.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)；和/或
所述益生菌组合物中活菌总量为100亿CFU/g。
3.权利要求1所述益生菌组合物用于护肤的用途。
4.一种制备权利要求2所述益生菌组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1-1，将活化好的植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4接种于培养基中，发酵得到混合益生乳酸菌发酵液；
步骤1-2，提取步骤1-1得到的混合益生乳酸菌发酵液中上清液，可选地，对提取到的上清液进行杀菌处理，所述上清液为益生菌组合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤1-1中，植物乳杆菌P-8，干酪乳杆菌Zhang，乳双歧杆菌V9，植物乳杆菌C2，植物乳杆菌LP3和植物乳杆菌LP4的活菌量之比为(0.5～1.5):(1～3):(1～3):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)，优选为1:2:2:1:1:1。
6.使用权利要求1所述益生菌组合物制备的护肤精华液，其特征在于，所述护肤精华液包括以下重量含量的组分：
各组分的重量含量为基于所述护肤精华液的总重量，以各组分的重量计，获得的重量百分含量，所述益生菌组合物的重量以其中所有益生菌的重量之和计。
7.根据权利要求6所述的护肤精华液，其特征在于，
所述保湿剂选自丙二醇、丁二醇和甘油中的一种或多种；和/或
所述增稠剂选自羟乙基纤维素和黄原胶中的一种或多种；和/或
所述增溶剂选自氢化蓖麻油和司盘60中的一种或多种。
8.一种制备权利要求6或7所述护肤精华液的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤2-1，将保湿剂与增稠剂混合；
步骤2-2，将步骤2-1制备的体系与纯净水混合；
步骤2-3，将步骤2-2制备的体系与增溶剂混合；
步骤2-4，将步骤2-3制备的体系与益生菌组合物混合；
步骤2-5，滤除步骤2-4制备的体系中的固形物。
9.一种面膜，其特征在于，所述面膜含有使用权利要求1所述益生菌组合物制备的护肤精华液。
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