CN108018243B - 植物乳杆菌、复合益生菌枸杞子制品及其制备方法 - Google Patents

植物乳杆菌、复合益生菌枸杞子制品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP3)，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14531，该菌株可用于发酵食品，本申请还提供用包括该菌株的益生菌组合物制备枸杞子制品、枸杞子益生菌微生态制剂、枸杞子益生菌饮料及其制备方法，所述方法操作简单，原料来源丰富，制备条件温和，适于产业化生产，制得的枸杞子制品、枸杞子益生菌微生态制剂他枸杞子益生菌饮料使枸杞中的营养物质与益生菌复配，协同增效，保留了枸杞子和益生菌的营养成分，而且，除枸杞子和益生菌原有的功效外，还具有易于携带和食用、口感好且易于贮藏的特点。

Description

植物乳杆菌、复合益生菌枸杞子制品及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物发酵领域，特别涉及一株植物乳杆菌菌株，用该菌株制备的复合益生菌枸杞子制品及所述枸杞子制品的制备方法。
背景技术
枸杞子是传统名贵中药材，也是药食同源食品，具有性平味甘，归肝肾经，滋补肝肾，益精明目之功效，能缓解虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明等症状。枸杞子中蛋白质约占20％，脂肪约占10％，糖分约占40％，其中的营养物质主要为己多糖、多种氨基酸、微量元素、维生素、牛磺酸、生物碱、挥发油等。
目前，市场上的枸杞产品主要为枸杞干果制品、枸杞汁、枸杞果醋、枸杞果酒以及作为保健品的枸杞多糖、枸杞黄酮和枸杞籽油。通常，人们通过泡茶、泡酒或者煲汤等形式摄入枸杞中的营养物质，但是通过上述方式摄入枸杞中的营养物质不仅食用不方便，营养单一，而且枸杞在被加工的过程中会损失部分营养成分，导致枸杞的营养不能被充分地利用。
发明内容
本申请的目的在于提供以下几个方面：
第一方面，本申请提供一株分离的植物乳杆菌菌株。
为提供以上第一方面，本申请是通过以下技术方案来实现的：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP3，L.plantarum LP3)通过以下方法筛选得到：
自四川省自然发酵的泡菜样品，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌LP3(Lactobacillus plantarum)LP3，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.14531；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)LP3具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH 6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
本申请所分离的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)LP3能够用于制备发酵食品，如枸杞子、豆乳和牛乳等，具有抑制食品中致病细菌和腐败真菌的能力，其中，所述致病细菌如：大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特氏菌等，所述腐败真菌如：黄曲霉、寄生曲霉、娄地青霉等。
第二方面，本申请还提供一种使用所述植物乳杆菌(L.plantarum)LP3制备枸杞子益生菌制品的方法，包括以下步骤：
步骤1-1，将枸杞子用水浸泡，打浆，制得枸杞浆液；
步骤1-2，向步骤1-1制得的枸杞浆液中添加蛋白粉，灭菌处理；
步骤1-3，向步骤1-2制得的体系中接种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括L.plantarum LP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.casei Zhang；
步骤1-4，将步骤1-3制得的体系发酵。
第三方面，本申请还提供一种根据第二方面所述方法制备的枸杞子制品，所述枸杞子制品中益生菌活菌数为1.5×109CFU/g以上。
本申请提供所述枸杞子制品以解决枸杞子营养单一，传统食用方法食用不便，易造成枸杞子营养损失的问题。
本发明人发现，本申请提供的制备枸杞子制品的方法操作简单，原料来源丰富，制备条件温和，适于产业化生产。制得的枸杞子制品使枸杞中的营养物质与益生菌复配，协同增效，保留了枸杞子和益生菌的营养成分，而且，除枸杞子和益生菌原有的功效外，还具有易于携带和食用、口感好且易于贮藏的特点。
第四方面，本申请还提供一种用第二方面所述枸杞子制品制备枸杞子益生菌冻干粉的方法，所述方法包括：
步骤2-1，将根据前述第三方面所述枸杞子制品与抗结剂混合；
步骤2-2，将步骤2-1制得的体系在真空条件下冻干。
与现有技术相比，本申请提供的制备枸杞子益生菌微生态制剂的方法采用低温冷冻干燥和粉碎技术，显著降低枸杞加工过程中的活性成分损失。
第五方面，本申请还提供一种使用第四方面所述方法制备的枸杞子益生菌冻干粉，所述冻干粉中益生菌活菌数达到5.0×109CFU/g以上。
第六方面，本申请还提供一种使用第五方面所述枸杞子益生菌冻干粉制备枸杞子益生菌微生态制剂的方法，所述方法包括：在步骤2-2之后还包括：
步骤2-3，将所述枸杞冻干粉、甜味剂和填充剂混合。
可选地，在步骤2-3之后还包括：
步骤2-4，将步骤2-1混合后的体系进行压片，制得枸杞子益生菌微生态制剂片。
或者，可选地，在步骤2-3之后还包括：
步骤2-5，将步骤2-1混合后的体系填充于胶囊中，制得枸杞子微生成制剂胶囊。
第七方面，本申请还提供一种使用第六方面所述方法制备的枸杞子益生菌微生态制剂，所述枸杞子益生菌微生态制剂可以为片剂、粉剂或者胶囊。
所述枸杞子益生菌微生态制剂中益生菌活菌数不低于3.0×109CFU/g，便于携带和食用、益生菌含量高、口感好且贮藏稳定性好，而且，所述枸杞子益生菌微生态制剂中富含活性益生菌，还含有对人体有益的枸杞多糖、甜菜碱。
第八方面，本申请还提供一种用第一方面所述枸杞子制品制备枸杞子益生菌饮料的方法，所述方法包括：
步骤3-1，将枸杞子用水浸泡，打浆，制得枸杞浆液；
步骤3-2，向步骤3-1制得的枸杞浆液中添加蛋白粉，甜味剂和增稠剂，进行均质以及灭菌处理；
步骤3-3，向步骤3-2制得的体系中接种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括L.plantarum LP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.casei Zhang；
步骤3-4，将步骤3-3制得的体系发酵。
可选地，在步骤3-4后还包括：
步骤3-5，将步骤3-4制得的体系进行杀菌处理。
第九方面，本申请还提供一种根据第八方面所述方法制备的枸杞子益生菌饮料，所述枸杞子益生菌饮料可以为低温型(未经杀菌处理，含活性益生菌)饮料，也可以为常温型(经过杀菌处理，不含活性益生菌)饮料。
其中，低温型枸杞子益生菌饮料益生菌含量为500亿CFU/100mL以上，常温型饮料中基于枸杞子益生菌饮料总重量，枸杞多糖的含量为4.86％以上，基于枸杞子益生菌饮料总重量，甜菜碱的含量为0.15％以上。
与现有技术相比，本申请提供的制备枸杞子益生菌饮料的方法操作简单，制备的枸杞子益生菌饮料使枸杞中的营养物质与益生菌复配，协同增效，保留了枸杞子和益生菌的营养成分，富含活性益生菌和枸杞活性物质，口感独特、色泽红艳。
具体实施方式
下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
以下详述本发明。
一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP3菌株，保藏编号为：CGMCCNo.14531。
本申请提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP3菌株可以用于发酵食品，如用于发酵枸杞子等。
一种制备枸杞子制品的方法，所述方法包括：
步骤1-1，将枸杞子用水浸泡，打浆，制得枸杞浆液；
步骤1-2，向步骤1-1制得的枸杞浆液中添加蛋白粉，灭菌处理；
步骤1-3，向步骤1-2制得的体系中接种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括L.plantarum LP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.casei Zhang；
步骤1-4，将步骤1-3制得的体系发酵。
在本申请步骤1-1中，枸杞子与浸泡枸杞子用水的料水比为枸杞子的重量:水的重量＝1:(4～9)，浸泡时间为1～3h，优选为2h，制得的枸杞浆液中固形物的粒径80-100目。
在本申请步骤1-2中，所述蛋白粉可以为大豆蛋白粉，枸杞子与蛋白粉的重量比为枸杞子的重量:蛋白粉的重量＝1000:(60～80)，其中，枸杞子的重量以浸泡前枸杞子的重量计。
在一种可实现的方式中，所述灭菌处理可以为在95℃～110℃温度下灭菌5～15min。本发明人发现，在上述条件下灭菌即可灭除体系中的细菌等微生物，残留的微生物不会影响制备枸杞子制品。
在本申请步骤1-3中，可选地，在接种前，调节体系的pH至6.0～6.8，如6.5，本发明人发现，接种前将体系的pH调整至6.0～6.8，特别是6.5，能够为益生菌的生长代谢提供最佳的环境。
可选地，可以使用氢氧化钠调节体系的pH。
在一种可实现的方式中，所述益生菌组合物中各组分的活菌数量比为L.plantarum LP3:L.plantarum P-8:B.lactis V9:L.casei Zhang＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)，优选为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，如1:1:2:1，其中，所述L.plantarum LP3的微生物保藏编号为CGMCC No.14531，L.plantarum P-8的保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9的保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的保藏编号为CGMCC No.5469。其中，菌株L.plantarum P-8，菌株B.lactis V9和菌株L.casei Zhang为现有技术已经公开的菌株，如中国专利CN105802876A中所公开的。
本发明人发现，按照此比例投放益生菌组合物有利于枸杞子的发酵，发酵终点益生菌活菌数达到1.5×109CFU/g以上，具体请参见实施例14～17，对比例5～6。
在本申请步骤1-3中，以益生菌组合物的总重量计，益生菌组合物的总接种量为(0.2～1.0)×107CFU/g，本发明人发现，增加益生菌组合物的总接种量能够缩短枸杞子发酵至终点的时间，而且制得的枸杞子制品中益生菌活菌含量递增；如果减少总接种量，虽然能够减少益生菌组合物的使用量，降低成本，但是发酵时间显著延长，导致生产周期加大，而且制得的枸杞子制品中活菌含量也有所下降；如果增加总接种量，不会显著提升枸杞子制品中益生菌活菌数或者缩短生产周期，因此，本申请选择益生菌组合物的总接种量为(0.2～1.0)×107CFU/g，具体请参见实施例9～13以及对比例3～4。在本申请步骤1-4中，发酵条件为在30℃～39℃下，优选为37℃下发酵至体系的pH＝4.5-5.0。
本发明人发现，使用本申请提供的方法制备的枸杞子制品中含有丰富的枸杞多糖，枸杞多糖是一种水溶性多糖，为由酸性杂多糖与多肽或蛋白质构成的复合多糖，是枸杞子降血糖、降血压、降脂、保肝、抗衰老、抗炎等的重要活性物质，具有调节机体免疫力，抑制肿瘤生产和细胞突变，延缓衰老，抗脂肪肝和降血糖等药理作用。
一种根据前述方法制备的枸杞子制品，其特征在于，所述枸杞子制品中益生菌活菌数为1.5×109CFU/g以上。
一种制备枸杞子益生菌冻干粉的方法，所述方法包括：
步骤2-1，将前述枸杞子制品与抗结剂混合；
步骤2-2，将步骤2-1制得的体系在真空条件下冻干。
在本申请步骤2-1中，所述枸杞子制品为使用前述方法制得的含有活性益生菌的枸杞子制品。
在一种可实现的方式中，基于所述枸杞子制品的总重量，所述抗结剂的加入量为0.2wt％～1wt％，如0.5wt％。本发明人发现，当抗结剂的用量大于1wt％后，制得的枸杞子益生菌冻干粉口味变苦，而减少抗结剂的加入量并不能明显改善所述枸杞子制品的流动性变差，甚至呈胶状，失去流动性，具体请参见实施例22～24，对比例8～9。
在一种可实现的方式中，所述抗结剂选自氯化钙、磷酸钙和磷酸三钙中的至少一种。
在本申请步骤2-2中，冻干的条件为-40℃～30℃，如使用程序升温的方法进行冻干，程序升温过程设定的温度梯度可以为-45℃—-15℃—-5℃—5℃—15℃—30℃，冻干时间可以为40h～50h。本发明人发现，采用该冻干工艺，制备的枸杞益生菌冻干粉水分≤3％，活性益生菌含量高，不易吸湿板结。
一种根据前述方法制备的枸杞子益生菌冻干粉，所述枸杞子益生菌冻干粉粉体流动性好，防吸湿性能高，不易板结，而且所述枸杞子益生菌微生态制剂中益生菌活菌数达到5.0×109CFU/g以上。具体请参见实施例22～24。
一种制备枸杞子益生菌微生态制剂的方法，所述方法在步骤2-2之后还包括：
步骤2-3，将所述枸杞益生菌冻干粉、甜味剂和填充剂混合。
在步骤2-3中，所述甜味剂选自木糖醇、蔗糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、低聚半乳糖、低聚果糖中的至少一种，如木糖醇、蔗糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、低聚半乳糖、低聚果糖按照等量配比得到的组合物。
所述填充剂选自微晶纤维素、脱脂乳粉、麦芽糊精中的至少一种，如微晶纤维素、脱脂乳粉、麦芽糊精按照等量配比得到的组合物。
可选地，在步骤2-3之后还包括：
步骤2-4，将步骤2-1混合后的体系进行压片，制得枸杞子益生菌微生态制剂片。
或者，可选地，在步骤2-3之后还包括：
步骤2-5，将步骤2-1混合后的体系填充于胶囊中，制得枸杞子微生成制剂胶囊。
本申请还提供一种根据前述方法制备的枸杞子益生菌微生态制剂，所述枸杞子益生菌微生态制剂可以为粉剂、片剂或者胶囊，所述枸杞子益生菌微生态制剂中益生菌含量为3.0×109CFU/g以上。具体请参见实施例25～27。
一种制备枸杞子益生菌饮料的方法，所述方法包括：
步骤3-1，将枸杞子用水浸泡，打浆，制得枸杞浆液；
步骤3-2，向步骤3-1制得的枸杞浆液中添加蛋白粉，甜味剂和增稠剂，进行均质以及灭菌处理；
步骤3-3，向步骤3-2制得的体系中接种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括L.plantarum LP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.casei Zhang；
步骤3-4，将步骤3-3制得的体系发酵，制得低温型益生菌饮料。
在本申请步骤3-1中，枸杞子与浸泡枸杞子用水的料水比为枸杞子的重量:水的重量＝1:(4～9)，浸泡时间为1～3h，优选为2h。
在申请步骤3-2中，首先将步骤3-1制得的体系过100目筛除渣，以避免直饮枸杞子饮料时的不良口感。
在一种可实现的方式中，所述蛋白粉可以为大豆蛋白粉，枸杞子与蛋白粉的重量比为枸杞子的重量:蛋白粉的重量＝1000:(5～15)，其中，枸杞子的重量以浸泡前枸杞子的重量计。
在一种可实现的方式中，所述甜味剂选自蔗糖、砂糖等中的至少一种。
在一种可实现的方式中，所述增稠剂选自结冷胶、高脂果胶、琼脂中的至少一种，优选为结冷胶、高脂果胶、琼脂的组合物，更优选地，所述增稠剂中结冷胶、高脂果胶、琼脂的重量配比为结冷胶的重量:高脂果胶的重量:琼脂的重量＝(1～2):(1～3):(1～2)，如结冷胶、高脂果胶、琼脂等重量比的组合物。
进一步地，枸杞子与所述增稠剂的重量比为枸杞子的重量:所述增稠剂的重量＝1000:(0.5～2.0)，其中，枸杞子的重量以浸泡前枸杞子的重量计，增稠剂的重量以增稠剂的总重量计。
在一种可实现的方式中，所述均质处理的条件为在温度为65℃，压力为20Mpa均质，一段均质。
在一种可实现的方式中，所述灭菌处理可以为在95℃～110℃，如95℃温度下灭菌5～15min，如5min。本发明人发现，在上述条件下灭菌即可灭除体系中的细菌等微生物，残留的微生物不会影响制备枸杞子饮料的品质。
在本申请步骤3-3中，所述益生菌组合物中各组分的活菌数量比为L.plantarumLP3:L.plantarum P-8:B.lactis V9:L.casei Zhang＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)，优选为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，如1:1:2:1，其中，所述L.plantarum LP3的微生物保藏编号为CGMCC No.14531，L.plantarum P-8的保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9的保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的保藏编号为CGMCC No.5469。本发明人发现，按照此比例投放益生菌组合物有利于枸杞子的发酵，发酵终点益生菌活菌数达到4.0×108CFU/g以上，具体请参见实施例18～21。
在本申请步骤3-3中，以益生菌组合物的总重量计，益生菌组合物的总接种量为(0.5～1.2)×107CFU/g，优选为1.0×107CFU/g，本发明人发现，增加益生菌组合物的总接种量能够缩短枸杞子发酵至终点的时间，而且制得的枸杞子制品中益生菌活菌含量递增；如果减少总接种量，虽然能够减少益生菌组合物的使用量，降低成本，但是发酵时间显著延长，导致生产周期加大，而且制得的枸杞子制品中活菌含量也有所下降；如果增加总接种量，不会显著提升枸杞子制品中益生菌活菌数或者缩短生产周期，因此，本申请选择益生菌组合物的总接种量为(0.5～1.2)×107CFU/g。
在本申请步骤3-4中，发酵条件为在30℃～39℃下，优选为37℃下发酵至体系的pH＝4.5-5.0，制得的低温型枸杞子益生菌饮料中益生菌含量为500亿CFU/100mL，在4℃贮藏28d活菌存活率达到50％以上，最高可达80.17％。
可选地，在步骤3-4后还包括：
步骤3-5，将步骤3-4制得的低温型益生菌饮料进行杀菌处理，制得常温型枸杞子益生菌饮料，所述常温型枸杞子益生菌饮料中含有丰富的枸杞多糖(基于枸杞子益生菌饮料总重量，可达4.86％以上)和甜菜碱(基于枸杞子益生菌饮料总重量，0.15％以上)。
一种根据上述方法制备的低温型枸杞子益生菌饮料，所述低温型枸杞子益生菌饮料中益生菌含量为500亿CFU/100mL，在4℃贮藏28d活菌存活率达到50％以上，最高可达80.17％。
本申请还提供一种根据上述方法制备的常温型枸杞子益生菌饮料，所述常温型枸杞子益生菌饮料中含有丰富的枸杞多糖(基于枸杞子益生菌饮料总重量，可达4.86％以上)和甜菜碱(基于枸杞子益生菌饮料总重量，0.15％以上)。
实施例
本发明实施例中试验方法和条件如无特别说明均为常规方法。
实施例1植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LP3的分离、筛选与鉴定
1.材料与方法
1.1菌株来源、分离与鉴定
自四川省居民家庭采集自然发酵的泡菜样品，称取10g样品用90g无菌生理盐水稀释后，取0.1mL涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性菌株再划线于MRS固体培养基培养2-3次得到纯菌落。本菌株显微镜下观察形态为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状；在MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑，无运动特性。
对分离到的菌株进行生理生化鉴定和16s rRNA分子鉴定，根据《伯杰细菌鉴定手册》，使用细菌微量生化鉴定管(广东环凯微生物科技有限公司)进行鉴定，鉴定结果见表1。提取该菌株的DNA样品，样品经上海美吉生物医药科技有限公司进行16s rRNA分子鉴定，分子序列经NCBI数据库blastn比对，确认LP3为植物乳杆菌，16s序列见本申请提交的序列表。
表1植物乳杆菌LP3生化鉴定结果
Figure GDA0002637078000000061
实施例2植物乳杆菌(LactobacillusplantarumLP3)的抑菌性能
以临床分离致病菌株为指示菌，分别为：大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特氏菌、黄曲霉、寄生曲霉、娄地青霉；以植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum LP3)为抑菌剂，测定植物乳杆菌菌株(Lactobacillusplantarum LP3)的抑菌性能。
1.抑菌试验方法：将植物乳杆菌LP3的MRS培养基发酵液，经3600r/min离心10min后，取其发酵上清液，用0.22μm的微孔滤膜除菌体得无细胞提取液，于-20℃保藏待用。将指示菌菌悬液稀释到1.0×106CFU/mL加到冷却至45℃的灭菌MRS固体培养基中，摇匀后定量(20mL)加入至无菌平皿中，待冷却凝固后，使用打孔器(7mm)在平板上打孔。每孔加入100μL无细胞发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养48h，观察抑菌效果，并使用游标卡尺测量其抑菌圈直径。。
2.抑菌效果：试验结果(表2)表明，本申请提供的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum LP3)可高产抑菌物质—乳酸菌素，对肠道致病菌和腐败真菌具有良好的抑菌效果。
表2植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP3对致病菌的抑菌效果
指示菌 抑菌圈大小(mm) 指示菌 抑菌圈大小(mm)
大肠杆菌O157:H7 20.24±0.66 单胞李斯特氏菌 24.62±0.08
鼠伤寒沙门氏菌 26.31±0.55 黄曲霉 20.05±0.09
弗氏志贺氏菌 22.95±1.35 寄生曲霉 21.37±0.41
金黄色葡萄球菌 21.67±0.25 娄地青霉 25.16±0.18
实施例3植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LP3的蛋白酶和胃肠液耐受性能
1.胃肠液耐受性试验方法：
1.1.在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液。
1.2.选择经耐酸性筛选后的菌株进行培养，如2.2.1中所述方法培养两代后离心洗菌两次，收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。
1.3.在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液。
1.4.将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于0h、4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数。
存活率＝[N1/N0]×100％
N0－0h活菌数；N1－经模拟消化3h或8h后的活菌数
2.耐受效果：植物乳杆菌LP3经模拟胃液和模拟肠液处理后，具有良好的耐受特性，存活率达89.96％。
表3 L.plantarum LP3模拟胃肠消化液存活情况
菌株 模拟胃液(pH2.5,3h)存活率(％) 模拟肠液(pH8.0,4h)存活率(％) 模拟肠液(pH8.0,8h)存活率(％)
LP3 95.12 92.75 89.96
根据实施例3中耐受胃肠液耐受效果可知，L.plantarum LP3在胃肠道中具有良好的耐受胃肠液及胆盐的特点，具有潜在益生特性。
本申请以下实施例中所述益生菌为：
L.plantarum LP3：保藏编号为CGMCC No.14531
L.plantarum P-8：保藏编号为CGMCC No.6312
B.lactis V9：保藏编号为CGMCC No.5470
L.casei Zhang：保藏编号为CGMCC No.5469
本申请以下实施例中所用原料的来源为：
枸杞子购自：宁夏沃福百瑞枸杞产业股份有限公司，型号/规格为特级；
大豆蛋白粉：吉林不二蛋白有限公司，型号/规格为金龟2200；
MRS合成培养基：广东环凯微生物科技有限公司，微生物检测用。
(一)活菌计数的方法
采用倾注平板计数法，具体操作步骤为：依据GB 4789.35-2016方法检测。
(二)测定益生菌活菌数培养基
本申请实验例中测定益生菌活菌数所用的培养基为MRS培养基。
(三)pH测定
使用精确pH计直接测定发酵液pH值。
实施例4～8，对比例1～2大豆蛋白质粉添加量对枸杞子制品的影响
将挑拣去杂后枸杞子1000g，用1:4纯净水浸泡2h，待枸杞子吸水软化后，经胶体磨破碎打浆，制得枸杞浆液；
向所述枸杞浆液中加入10g大豆蛋白粉，混合均匀，经95℃灭菌15min处理，制得发酵培养基。
将益生菌组合物接种于所述发酵培养基中，其中，基于所述发酵培养基的总重量，所述益生菌组合物包括L.plantarumLP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.caseiZhang，其中，L.plantarumLP3的活菌数量:L.plantarum P-8的活菌数量:B.lactis V9的活菌数量:L.casei Zhang的活菌数量＝1:1:2:1，所述益生菌组合物的总接种量为1×107CFU/g，调整体系的初始pH6.5，在37℃恒温培养，实时监测反应体系的pH，pH5.0为发酵终点。
实施例5～8所用方法与实施例4相同，区别仅在于大豆蛋白粉的用量分别依次为10g、40g、60g、80g和100g。
对比例1～2所用方法与实施例4相同，区别仅在于大豆蛋白粉的用量分别依次为0g和200g。
表4大豆蛋白质粉添加量对枸杞子发酵产物活菌数的影响
性能指标 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8 对比例1 对比例2
大豆粉添加量(g/kg枸杞子) 10 40 60 80 100 0 200
益生菌活菌数(CFU/g) 4.7×10<sup>8</sup> 5.1×10<sup>8</sup> 8.4×10<sup>8</sup> 1.2×10<sup>9</sup> 1.0×10<sup>9</sup> 4.3×10<sup>8</sup> 1.1×10<sup>9</sup>
由表3可知，单纯的枸杞子浆液中蛋白质含量低，不利于益生菌在枸杞子浆液中生长代谢，在所述枸杞子浆液中外加蛋白粉有益生菌生长，但当大豆蛋白粉添加至一定量(80g)时，继续补充蛋白活菌数无显著提升(实施例8和对比例2)。综合实验结果可知，在枸杞子浆液中添加大豆蛋白粉80g后，发酵制得的枸杞子制品中活菌数最高为12亿CFU/g，较未处理枸杞子活菌数(对比例1)显著提高2.79倍。
实施例9～13，对比例3～4复合益生菌接种量对枸杞子制品的影响
实施例9～13所用方法与实施例7相同，区别仅在于复合益生菌L.plantarumLP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.casei Zhang总接种量分别为2×106CFU/g、4×106CFU/g、8×106CFU/g、1×107CFU/g和2×107CFU/g。
对实施例9～13以及对比例3～4制得的产物进行性能检测，结果如以下表5所示。
依据实验结果，当复合益生菌接种总量为自2×106CFU/g逐渐增加至1.0×107CFU/g时，枸杞子发酵至终点的时间缩短，且益生菌活菌含量呈递增趋势。减少初始接量能够降低发酵菌种使用量，降低成本，但延长发酵时间，导致生产周期加大且活菌含量也降低(对比例3)；此外，加大接种量也不会显著提升益生菌活菌数和缩短生产周期(对比例4)。最优选L.plantarum LP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.casei Zhang的总接种量为1×107CFU/g，枸杞子发酵终点益生菌活菌数达到7.0×108CFU/g以上。
表5复合益生菌接种量对枸杞子发酵产物活菌数的影响
Figure GDA0002637078000000091
实施例14～17，对比例5～6复合益生菌各菌种的接种比例对枸杞子制品的影响
实施例14～18所用方法与实施例12相同，区别仅在于复合益生菌中各菌种的接种比例分别依次为1:1:1:1、1:2:1:1、1:1:2:1和1:1:1:2。
对实施例14～17以及对比例5～6制得的产物进行理化生性能检测，结果如以下表6所示。依据实验结果，当增大B.lactis V9(对比例5)或L.casei Zhang的接种比例(对比例6)并不会增加发酵枸杞子中的益生菌活菌含量，最优选的L.plantarum LP3、L.plantarumP-8、B.lactis V9和L.casei Zhang接种比例为1:1:2:1，有利于枸杞子的发酵，发酵终点益生菌活菌数达到1.5×109CFU/g以上。
表6复合益生菌接种比例对枸杞子发酵产物活菌数的影响
性能指标 实施例14 实施例15 实施例16 实施例17 对比例5 对比例6
LP3:P-8:V9:Zhang接种比例 1:1:1:1 1:2:1:1 1:1:2:1 1:1:1:2 1:1:3:1 1:1:1:3
益生菌活菌数(CFU/g) 7.8×10<sup>8</sup> 7.9×10<sup>8</sup> 1.5×10<sup>9</sup> 1.0×10<sup>9</sup> 6.3×10<sup>8</sup> 1.2×10<sup>9</sup>
综合实施例4～17，实施例16的发酵条件为最为优选的发酵条件，具体为益生菌组合物中L.plantarumLP3的活菌数量:L.plantarum P-8的活菌数量:B.lactis V9的活菌数量:L.caseiZhang的活菌数量＝1:1:2:1，总接种量为1×107CFU/g，在37℃下恒温发酵，以pH＝5.0为发酵终点，在该条件下制得的枸杞子制品中益生菌活菌数达到1.5×109CFU/g以上。
实施例18～21，对比例7～8制备枸杞子益生菌饮料
制备枸杞子益生菌饮料的具体方法包括：
步骤3-1，将1000g枸杞子用纯化水浸泡打浆(料水比1:4～1:9)；
步骤3-2，经100目过滤去渣取清液加入大豆分离蛋白粉5-15g，蔗糖40-60g、(结冷胶、高脂果胶和琼脂等重量比组合物)0.5-2.0g进行均质处理(65℃，20Mpa)，将均质后的枸杞浆液95℃灭菌5min后冷却至37℃；
步骤3-3，杀菌降温后的枸杞浆液接种L.plantarum LP3、L.plantarum P-8、B.lactis V9和L.casei Zhang(1:1:2:1，总接种量为1.0×107CFU/g)37℃恒温发酵至pH4.5-5.0，益生菌活菌数为5.3×108CFU/mL。
步骤3-4，发酵至终点的枸杞浆液经85℃杀菌15min灌装，或不经杀菌工艺直接无菌灌装后，制备常温型(不含有活性益生菌)和成低温型(含有活性益生菌)的枸杞子益生菌饮料，其中低温型枸杞子益生菌饮料益生菌含量为500亿CFU/100mL。具体配方参数和效果请参见下表7-表8，其中藏期间活菌存活率只涉及低温型枸杞子益生菌饮料。
表7不同辅料对枸杞子益生菌饮料的影响
制备参数 实施例18 实施例19 实施例20 实施例21 对比例7 对比例8
蔗糖含量(g/kg枸杞子) 40 50 60 70 0 100
大豆蛋白粉含量(g/kg枸杞子) 5 10 15 20 0 50
增稠剂用量(g/kg枸杞子) 0.5 1.0 1.5 2.0 0 5.0
表8不同配方枸杞子益生菌饮料的品质分析
Figure GDA0002637078000000101
综合实施例18～21，较对比例7和8，通过优化蔗糖、大豆蛋白粉和增稠剂的比例，能够提高枸杞发酵终点的益生菌活菌数和贮藏存活率。结合感官评定优选的最佳配方和工艺为实施例20，采用该工艺制备的枸杞子益生菌饮料酸甜适中，枸杞风味浓郁，口感清爽，色泽鲜红，饮料无沉淀，且低温型种类在贮藏期间活性益生菌存活率高，有利于其益生功效的发挥。此外该枸杞子益生菌饮料含有多种活性物质，包括枸杞多糖(4.86％)和甜菜碱(0.15％)。
实施例22～24，对比例8-9，制备枸杞子益生菌冻干粉剂
本实施例使用的枸杞子制品由实施例16制备。
制备枸杞子益生菌冻干粉剂包括：
将实施例16制备的枸杞子益生菌发酵液添加不同比例的氯化钙后，经真空冷冻干燥(真空度30pa，冻干时间48h)，得到枸杞子制品冻干粉(水分含量<3％)，具体配方参数和效果请参见下表9。将枸杞子制品冻干粉在液氮低温(-45℃)下粉碎，过80目筛后制备获得枸杞子益生菌原粉，检测其中的活性益生菌含量。
表9氯化钙对枸杞子益生菌冻干粉剂吸湿性的影响
Figure GDA0002637078000000102
Figure GDA0002637078000000111
综合实施例22-24分析，优选实施例22的冻干工艺制备的枸杞子益生菌冻干粉剂流动性好，防吸湿性能高，有效防止益生菌枸杞粉剂板结，且冻干粉制剂中益生菌活菌数达到5.0×109CFU/g。
实施例25～27，制备枸杞子益生菌微生态制剂(片剂、粉剂、胶囊)
本实施例使用的枸杞子益生菌冻干粉剂由实施例22制备。
制备枸杞子益生菌微生态制剂的方法具体包括：
步骤2-1，将实施例22制得的枸杞子益生菌冻干粉剂，甜味剂，填充剂5-15g，同时投入混料机中，以转速30r/min搅拌15min后混合均匀后装入盛料袋，其中，所述甜味剂为木糖醇、蔗糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、低聚半乳糖、低聚果糖按照等量配比的组合物，所述填充剂为微晶纤维素、脱脂乳粉、麦芽糊精按照等量配比的组合物；
步骤2-2，将混合后的物料加入旋转式压片机料仓，进行片剂成型(0.5g/片)，成型后进行益生菌含量和活性成分检测；
步骤2-3，将混合后的物料加入粉剂包装机料仓，进行粉剂成型(2.0g/包)，成型后进行益生菌含量和活性成分检测；
步骤2-4，将混合后的物料加入胶囊填充剂料仓，进行胶囊成型(0.3g/粒)，成型后进行益生菌含量和活性成分检测。
具体配方参数和效果请参见下表10-表12。
表10枸杞子益生菌微生态制剂(片剂、粉剂、胶囊)制备配方
制备参数 枸杞子益生菌冻干粉剂(g) 甜味剂(g) 填充剂(g)
实施例25(片剂) 70 15 15
实施例26(粉剂) 80 10 10
实施例27(胶囊) 90 5 5
表11不同配方枸杞子益生菌微生态制剂(片剂、粉剂、胶囊)品质分析
性能指标 乳酸菌活菌数(CFU/g) 枸杞多糖(％) 甜菜碱(％)
实施例25(片剂) 3.03×10<sup>9</sup> 13.15±0.08 0.41±0.02
实施例26(粉剂) 3.84×10<sup>9</sup> 13.57±0.23 0.47±0.01
实施例27(胶囊) 4.37×10<sup>9</sup> 13.62±0.19 0.49±0.00
表12不同配方枸杞子益生菌微生态制剂(片剂、粉剂、胶囊)贮藏稳定性结果
Figure GDA0002637078000000112
Figure GDA0002637078000000121
该枸杞子益生菌微生态制剂(片剂、粉剂、胶囊)中益生菌含量高(活菌数不低于3.0×109CFU/g)，易于携带和食用、不易吸潮和结块、枸杞风味浓郁、色泽粉红、酸甜适口且贮藏稳定性好。该制剂独有的枸杞精华(枸杞多糖、甜菜碱)复配高活性益生菌，能够产生独有健康的复合功效，形成倍增效益，不但可以有效补充人体所需的有益菌群，同时发挥枸杞的保健功效。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 金华银河生物科技有限公司
<120> 植物乳杆菌、复合益生菌枸杞子制品及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1465
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
actgtcacct taggcggctg gttctaaaag gttaccccac cgactttggg tgttacaaac 60
tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact 180
gagaatggct ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg taccatccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa 360
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt 480
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga 600
atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat 660
cgtttacggt atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct 720
cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg 780
catttcaccc gctacacatg gagttccact gtcctcttct gcactcaagt ttccccagtt 840
tccgatgcac ttcttcggtt gagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc 900
gctcgcttta cgcccaataa atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc 960
tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aaataccgtc aatacctgac agttactctc 1020
agatatgttc ttctttaaca acagagtttt acgagccgaa acccttcttc actcacgcgg 1080
cgttgctcca tcagactttc gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 1140
gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgattaccct ctcaggtcgg ctacgtatca 1200
ttgccatggt gagccgttac cccaccatct agctaatacg ccgcgggacc atccaaaagt 1260
gatagccgaa gccatctttc aaactcggac catgcggtcc aagttgttat gcggtattag 1320
catctgtttc caggtgttat cccccgcttc tgggcaggtt tcccacgtgt tactcaccag 1380
ttcgccactc actcaaatgt aaatcatgat gcaagcacca atcaatacca gagttcgttc 1440
gacttgcatt atagccgccg cacgc 1465

Claims (10)

1.一株分离的植物乳杆菌菌株（Lactobacillus plantarum）LP3，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC No.14531。
2.一种制备枸杞子制品的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1-1，将枸杞子用水浸泡，打浆，制得枸杞浆液；
步骤1-2，向步骤1-1制得的枸杞浆液中添加蛋白粉，灭菌处理；
步骤1-3，向步骤1-2制得的体系中接种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括L. plantarum LP3、L. plantarum P-8、B. lactis V9和L. casei Zhang；
步骤1-4，将步骤1-3制得的体系发酵，
其中，所述L. plantarum LP3的微生物保藏编号为CGMCC No.14531；
所述L. plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312；
B. lactis V9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470；
L. casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469。
3.一种根据权利要求2所述方法制备的枸杞子制品，其特征在于，所述枸杞子制品中益生菌活菌数为1.5×109CFU/g以上。
4.一种制备枸杞子益生菌冻干粉的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤2-1，将根据权利要求3所述枸杞子制品与抗结剂混合；
步骤2-2，将步骤2-1制得的体系在真空条件下冻干。
5.根据权利要求4所述方法制备的枸杞子益生菌冻干粉，其特征在于，所述冻干粉中益生菌活菌数达到5.0×109CFU/g以上。
6.一种使用权利要求5所述枸杞子益生菌冻干粉制备的枸杞子益生菌微生态制剂，其特征在于，所述枸杞子益生菌微生态制剂的剂型为片剂、粉剂或者胶囊，所述枸杞子益生菌微生态制剂中益生菌含量为3.0×109 CFU/g以上。
7.一种制备枸杞子益生菌饮料的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤3-1，将枸杞子用水浸泡，打浆，制得枸杞浆液；
步骤3-2，向步骤3-1制得的枸杞浆液中添加蛋白粉，甜味剂和增稠剂，进行均质以及灭菌处理；
步骤3-3，向步骤3-2制得的体系中接种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括L. plantarum LP3、L. plantarum P-8、B. lactis V9和L. casei Zhang；
步骤3-4，将步骤3-3制得的体系发酵，
其中，所述L. plantarum LP3的微生物保藏编号为CGMCC No.14531；
所述L. plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312；
B. lactis V9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470；
L. casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤3-4后还包括：
步骤3-5，将步骤3-4制得的体系进行杀菌处理。
9.一种根据权利要求7所述方法制备的枸杞子益生菌饮料，其特征在于，所述枸杞子益生菌饮料中益生菌含量为500亿CFU/100mL，在4℃贮藏28d活菌存活率达到50%。
10.一种根据权利要求8所述方法制备的枸杞子益生菌饮料，其特征在于，所述枸杞子益生菌饮料中基于枸杞子益生菌饮料总重量，枸杞多糖的含量为4.86%以上，基于枸杞子益生菌饮料总重量，甜菜碱的含量为0.15%以上。
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