CN104651275B

CN104651275B - 一种益生菌培养基及其应用

Info

Publication number: CN104651275B
Application number: CN201510062630.6A
Authority: CN
Inventors: 马成杰; 陈正军; 刘振民; 龚广予; 华宝珍
Original assignee: WUHAN GUANGMING MILK PRODUCT CO Ltd
Current assignee: WUHAN GUANGMING MILK PRODUCT CO Ltd
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2035-02-06
Also published as: CN104651275A

Abstract

本发明公开了一种益生菌培养基及其应用，该益生菌培养基的制备原料包括：乳清蛋白，鱼肉，猪肝，黑豆，魔芋粉，甜菜，茶溶液或茶粉，葡萄糖，糖蜜，三聚磷酸钠和净化水。本发明生产益生菌发酵剂的所有原料均为食品原料或食品添加剂，来源广泛，价格低廉，制得的益生菌发酵剂安全性高，无需将发酵培养的培养基成分去除，可以将发酵培养菌液直接作为益生菌菌种添加到牛乳中制作益生菌发酵乳制品，简化了生产工艺，另外，使用该培养基，益生菌生长繁殖较快、菌数含量高，所生产的发酵乳制品发酵时间短、产品风味浓郁。

Description

一种益生菌培养基及其应用

技术领域

本发明涉及发酵乳制品工业，具体涉及一种益生菌培养基及其应用。

背景技术

联合国粮农组织和世界卫生组织定义益生菌为一种“当摄入充足的数量时，对宿主产生功能性健康益处的活体微生物”。为了发挥益生菌的功能与作用，益生菌菌株必须对人体消化系统具有良好的耐受性、保持存活，一些乳酸菌菌株如嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌等经过人体消化道时，不耐胃酸和胆汁，大部分被消化液破坏，其几乎不能存活，在人体肠胃道中也不能分离到这些菌株，这类菌株调节肠道菌群平衡、改善肠道微环境等益生功能有限，只能称之为“乳酸菌”，而不能定义为“益生菌”。

干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌能够有效耐受人体消化系统，包括口腔中的酶、低pH值的胃液以及小肠的胆汁酸等，在人体消化系统中也能分离到这些益生菌，他们进入人体后可以在肠道内大量存活，发挥调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时，这些益生菌的菌株还具有提高机体免疫力、抑制肿瘤生长、降胆固醇、降血脂、调血压等益生保健功能。目前，干酪乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌等益生菌在国内发酵乳制品中也得到了很好的发展和应用，一些益生菌功能性发酵乳制品也深受消费者青睐。益生菌发酵剂是生产益生菌发酵乳制品的核心成分与关键因素，遗憾的是，由于技术水平的限制，目前国内尚无成熟的益生菌发酵剂产业，这一市场被丹麦科•汉森、丹麦丹尼斯克、荷兰帝斯曼等几家外国公司所垄断，国内生产企业需从国外引进直投式益生菌发酵剂用于益生菌发酵乳制品生产。为了打破我国发酵剂市场被国外公司垄断的局面，近几十年来，国内科研院所和大型乳品生产企业在新型益生菌发酵剂优良菌株选育、优良益生菌菌株的益生功能研究、菌株高密度培养、浓缩干燥工艺等方面投入了大量的人力物力进行技术攻关，取得了一些进展。

对于益生菌发酵剂菌株的高密度培养而言，国内外较多地使用的是MRS培养基、TJA培养基或脱脂牛乳等进行益生菌的繁殖、培养。虽然MRS等培养基培养干酪乳杆菌等益生菌菌种总体生长较快、菌数含量较高，但由于MRS等培养基含有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等成分，其口感风味不佳，同时培养基中的吐温80、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、β-甘油磷酸二钠等不是食品原料，直接用于益生菌发酵乳制品生产存在食品安全隐患，故益生菌的液体培养需经离心或过滤、洗涤等工艺去除培养基成分，才能作为发酵剂在食品中使用。因此，这类益生菌发酵剂菌株的高密度培养基在使用上存在较大的局限性。使用脱脂牛乳作为培养基质则益生菌菌种总体生长较慢、菌数含量不高。同时，益生菌在牛乳中发酵乳糖产酸、凝乳，益生菌菌体分布在发酵乳凝胶中，无法再进行菌体的浓缩。

发明内容

本发明针对现有益生菌发酵剂所用培养基质存在的局限性，提供了一种完全以食品原料或食品添加剂为组成成分、菌数含量高、使用方便的益生菌培养基及其应用。

本发明提供的益生菌培养基，制备原料包括：乳清蛋白，鱼肉，猪肝，黑豆，魔芋粉，甜菜，茶溶液或茶粉，葡萄糖，糖蜜，三聚磷酸钠和净化水。

所述的乳清蛋白是指干酪副产物乳清经部分脱盐、部分去除乳糖的产物，乳清蛋白为常用食品原料。

所述的鱼肉是指淡水鱼类例如鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、草鱼等去除头、尾、鱼骨和鱼皮后易于食用的部分，其富含优质蛋白、脂肪酸、维生素等，鱼肉为常用食品原料。

所述的猪肝是指猪科动物猪的肝脏，猪肝富含蛋白质、微量元素、维生素等，为常用食品原料。

所述的黑豆是指豆科植物大豆[Glycine max (L.) Merr.]的黑色种子，俗称黑大豆或乌豆，是我国历史悠久的药食同源作物。

所述的魔芋粉是指多年生天南星科草本植物魔芋球茎果实经脱水、干燥、研磨等现有加工工艺制得的精粉，其主要成分是葡甘聚糖，魔芋粉是常用食品原料。

所述的甜菜是指两年生草本植物甜菜(Beta vulgaris L.)的根茎果实，是常用食品原料。

所述的茶溶液是指山茶科植物（Camellia sinensis）的叶子或芽经加工处理后的茶叶用水浸泡后的茶汤，茶溶液是我国较为流行的食品饮料。

所述的茶粉是用茶树鲜叶经杀青及特殊工艺处理后，粉碎成粒度能通过400目以上筛网的粉末，其最大限度地保持茶叶原有的色泽以及营养、功能成分，不含任何添加成分。

所述的葡萄糖粉是主要成分为葡萄糖的粉状食品原料。

所述的糖蜜是指利用甘蔗、甜菜、玉米等食品原料制取蔗糖的副产品，制糖过程中，糖液经浓缩析出结晶糖后，残留的棕褐色黏稠液体即为糖蜜，糖蜜是食品发酵工业的常用原料。

所述的三聚磷酸钠为一种酸度调节剂，根据《食品安全国家标准、食品添加剂使用标准》（GB2760），三聚磷酸钠为可在各类食品中按生产需要添加使用的食品添加剂。

在本发明中，所用的葡萄糖、糖蜜、甜菜含益生菌易于利用的碳源与生长促进因子。乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆酶解物为乳酸菌提供了易于利用的氮源。经研究分析，发现糖蜜、猪肝、茶为益生菌的生长繁殖提供了生长促进因子，同时黑豆、魔芋、茶、甜菜有助于各种益生菌发酵密度提高、在保藏过程中益生菌菌数含量的维持与稳定。三聚磷酸钠主要起调节体系pH值作用，避免体系pH值下降过快抑制益生菌生长繁殖。

优选地，上述益生菌培养基中，各原料的质量百分含量为：

乳清蛋白 1.0～2.0%；

鱼肉 0.5～1.0%；

猪肝 0.2～0.5%；

黑豆 1.0～2.0%；

魔芋粉 0.2～1.0%；

甜菜 1.0～2.0%；

茶溶液或茶粉 0.02～0.20%；

葡萄糖 2.0～3.0%；

糖蜜 2.0～4.0%；

三聚磷酸钠 0.1～0.2%；

净化水余量。

此外，上述益生菌发酵剂培养基中，还包括食品级蛋白酶和食品级葡聚糖酶，两种酶在制备过程中主要用于乳清蛋白、鱼肉、猪肝、魔芋粉、黑豆等的酶解，以获得丰富的多肽、氨基酸和低聚糖等营养成分。

优选地，上述益生菌培养基，其制备方法为：黑豆、鱼肉、猪肝和甜菜经清洗、破碎、研磨后，加入乳清蛋白、魔芋粉和净化水搅拌均匀得混合物，混合物中加入占乳清蛋白、鱼肉、猪肝和黑豆总质量0.1～0.3%的食品级蛋白酶，占黑豆、魔芋和甜菜总质量0.1～0.3%的食品级葡聚糖酶，酶解，酶解结束后加热灭酶，酶处理后的混合物经过滤取滤液或离心取上清，得酶处理物；酶处理物与其他原料混合，充分搅拌均匀，灭菌后获得益生菌培养基。

所述的蛋白酶是一类能将蛋白质分解为多肽、氨基酸的酶类，它广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，按照我国相关食品法规，食品级蛋白酶是食品加工中允许使用的加工助剂，其来源符合GB2760的规定。

所述的葡聚糖酶是一种内切酶，专一作用于β-葡聚糖的1,3及1,4糖苷键，产生3~5个葡萄糖单位的低聚糖及葡萄糖，它可以有效分解麦类和谷类植物胚乳细胞壁中的β-葡聚糖，按照我国相关食品法规，食品级葡聚糖酶是食品加工中允许使用的加工助剂，其来源符合GB2760的规定。

优选地，酶解温度为50～55℃，酶解时间为3～6小时。

本发明还提供上述益生菌培养基在培养益生菌菌株中的应用，所述益生菌为干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或副干酪乳杆菌。

本发明还提供一种培养益生菌的方法，是使用上述益生菌培养基，益生菌起始菌种接种量为10⁶～10⁷CFU/mL，培养温度为37～39℃，培养时间为12～18小时。其他步骤按常规培养方法进行。

本发明还提供了用上述培养益生菌的方法培养好的培养物在制备益生菌发酵乳制品、制备冷冻干燥发酵剂或制备深冷冻菌种中的应用。

本发明还提供了上述培养益生菌的方法培养好的培养物直接用于益生菌发酵乳制品生产的方法，接种量按质量百分比计为1～5%，或以菌数含量计为10⁶～10⁷ CFU /mL。其他步骤按常规培养方法进行。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和积极效果：

1、使用方便、安全性高

本发明生产益生菌发酵剂所有原料均为食品原料或食品添加剂，未使用益生菌现有培养基常使用的柠檬酸氢二铵、β-甘油磷酸二钠、酵母膏、牛肉膏等非食品原料或非食品添加剂。因此，本发明所制得的益生菌发酵剂安全性高，不存在安全隐患，无需将发酵培养的培养基成分去除，可以将发酵培养菌液直接作为益生菌菌种添加到牛乳中制作益生菌发酵乳制品，因而使用很方便。

2、益生菌生长繁殖较快、菌数含量高

使用本发明的培养基，干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌等均生长繁殖较快、菌数含量高，12小时左右就能达到10⁹ CFU/mL。

3、培养基成本较低

本发明选用常用食品原料或食品添加剂为发酵剂培养基组成成分，原料均可购买市售商品，来源广泛、价格低廉，相对于常用的MRS等培养基，本发明提供的培养基成本较为低廉。

4、所生产的发酵乳制品发酵时间短、产品风味浓郁

按照本发明的优选方案，可直接将发酵剂培养物接种于牛乳生产益生菌发酵乳制品。由于本发明培养基成分中富含多肽、氨基酸、低聚糖等成分，其有利于刺激益生菌在牛乳中的生长繁殖，缩短发酵时间。以植物乳杆菌为例，使用直投式发酵剂或以脱脂乳进行扩培，其不能发酵凝乳，使用本发明的优选方案，直接将发酵剂培养物接种于牛乳则能生产出发酵时间较短、益生菌含量高、风味好的植物乳杆菌益生菌发酵乳制品。另一方面氨基酸、多肽是醛、酮等发酵乳制品特征风味物质的前体物，特别有利于发酵乳风味物质的形成，使最终的发酵乳制品产品风味浓郁。而使用直投式冷冻干燥菌粉或使用脱脂乳继代发酵剂则不具备这方面的优势。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中，原料及其来源：

1、脱脂乳：生牛乳离心脱脂或脱脂乳粉还原制得，脱脂乳粉来源于新西兰恒天然公司。

2、生牛乳：无抗生素残留生鲜牛乳，来源于武汉光明乳品有限公司。

3、MRS培养基：购自于英国的Oxoid公司。

4、干酪乳杆菌：干酪乳杆菌L.casei-01，商业冷冻干燥浓缩直投式发酵剂（菌粉），含单独的干酪乳杆菌菌株，购自丹麦科•汉森公司；干酪乳杆菌L.casei LC2W，冷冻干燥浓缩直投式发酵剂，含单独的干酪乳杆菌菌株，为光明乳业股份有限公司筛选的专利菌株（菌株保藏号CGMCC NO.0828）；

5、植物乳杆菌：植物乳杆菌L. plantarum LPHS，冷冻干燥浓缩直投式发酵剂，含单独的植物乳杆菌菌株，购自丹麦科汉森公司；

6、双歧杆菌：乳双歧杆菌Bifidobacterium lactis HN019，冷冻干燥浓缩直投式发酵剂，含单独的乳双歧杆菌菌株，购自丹麦丹尼斯克公司；

7、鼠李糖乳杆菌：鼠李糖乳杆菌L. rhamnosus GG，冷冻干燥浓缩直投式发酵剂，含单独的鼠李糖乳杆菌菌株，购自芬兰维利奥公司；

8、嗜酸乳杆菌：嗜酸乳杆菌L. acidophilus NCFM，冷冻干燥浓缩直投式发酵剂，含单独的嗜酸乳杆菌菌株，购自丹麦丹尼斯克公司；

9、副干酪乳杆菌：副干酪乳杆菌L. paracasei LPC37，冷冻干燥浓缩直投式发酵剂，含单独的副干酪乳杆菌菌株，购自丹麦丹尼斯克公司；

10、中性蛋白酶PB04、中性蛋白酶NP：食品级中性蛋白酶PB04购自南宁庞博生物工程有限公司，食品级中性蛋白酶NP购自丹尼斯克公司；

11、葡聚糖酶：食品级葡聚糖酶购自枣庄市杰诺生物酶有限公司；

12、葡萄糖粉：食品原料，购自山东鲁洲食品集团有限公司；

13、乳清蛋白粉：食品原料，其中乳清蛋白粉WPC34（蛋白质含量34%）购自泛亚乳品公司，乳清蛋白粉E300（蛋白质含量30%）购自上海戴维林公司；

14、绿茶粉：食品原料，购自大闽食品（漳州）公司；

15、魔芋粉：食品原料，购自湖北一致魔芋生物科技有限公司；

16、糖蜜：甘蔗糖蜜，购自广西亚糖太古贸易公司；

17、黑豆、新鲜草鱼肉、鲢鱼肉、猪肝、甜菜均为食品原料、市售；

18、三聚磷酸钠：各类食品按生产需要添加的食品添加剂，购自云南贝克吉利尼天创磷酸盐公司。

二、所涉及的实验测定方法

1、滴定酸度：按《GB 5413.34食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》方法进行。取10g发酵乳，加入到20mL蒸馏水中，同时滴加0.5%酚酞2mL，以0.1 mol/L的NaOH滴定至粉红色，滴定体积（mL）乘以10即为该发酵乳的滴定酸度值，用吉尔涅尔度ºT表示。

2、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌等益生菌菌数含量检测：按《GB 4789.35食品安全国家标准乳酸菌检验》方法进行。

3、益生菌发酵乳制品风味测定：采用固相微萃取法（SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术检测其发酵产生的挥发性风味成分，风味成分含量以平均锋面积表示[LiSha et al.，Flavour Analysis of Stirred Yoghurt with Cheddar Cheese Addinginto Milk，Food Science and Technology Research，2014，20(5)：939-946]。

三、具体实施例

实施例1（培养干酪乳杆菌）：

1、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、甜菜、魔芋粉的酶处理

称取5克新鲜鱼肉、5克新鲜猪肝、15克新鲜甜菜、15克黑豆，清洗干净后，加入200克净化水浸泡，用果汁机将其搅拌破碎、榨汁，并经胶体磨研磨、分散均匀，再加入15克乳清蛋白粉WPC34、10克魔芋粉、150克净化水，充分搅拌、混合均匀，升温至50℃，加入0.08克食品级蛋白酶NP、0.08克的食品级葡聚糖酶，50℃水浴保温酶解5小时。酶处理结束后，将体系95℃加热处理10分钟，灭酶。酶处理后经布袋式过滤器过滤去除未充分酶解的蛋白质大分子以及猪肝、黑豆等原料中的纤维等成分，得富含多肽、氨基酸、低聚糖的乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、魔芋等的酶处理物。

2、茶溶液制取

在1克绿茶茶叶中加入20克、95℃的净化水，密封泡制45分钟，经过滤后得无沉淀的茶溶液。

3、培养基配制与灭菌

将去除沉淀的黑豆、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、魔芋、甜菜的酶处理物与茶溶液混合，加入30克糖蜜、20克葡萄糖粉、1.5克三聚磷酸钠、512.34克净化水，充分搅拌、混合均匀，经高温灭菌，得益生菌发酵剂生长繁殖培养基。

4、培养基应用：活化好的干酪乳杆菌L.casei-01菌株，按5×10⁶CFU/mL的接种量在上述步骤3所述灭菌培养基中接入L.casei-01商业冷冻干燥直投式发酵剂，38℃培养18小时，得益生菌L.casei-01的扩大培养。

5、益生菌发酵乳制作：12%（质量百分比）还原的脱脂乳经95℃、90min保温杀菌后冷却至38℃，按1×10⁷CFU/mL的接种量接入上述步骤4所制得的益生菌L.casei-01的扩大培养，38℃恒温发酵至75ºT。

本实施例，步骤4中用本发明的培养基对益生菌L.casei-01进行扩培后，经检测分析，其益生菌含量为3.9×10⁹CFU/mL，菌数含量较高。用步骤4所制得的扩培发酵剂生产的干酪乳杆菌益生菌发酵乳到达终点酸度（75ºT）的发酵时间为18小时，产品口感细腻滑爽、组织状态良好、微量乳清析出、干酪乳杆菌特有发酵风味浓郁，经采用固相微萃取法（SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术检测其发酵产生的最主要挥发性风味成分为庚酮（平均锋面积：1671×10000）、壬酮（平均锋面积：535×10000），最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量为2.3×10⁹CFU/mL。

对比实施例1（使用直投式发酵剂）：

益生菌发酵乳制作：12%（质量百分比）还原的脱脂乳经95℃、90min保温杀菌后冷却至38℃，按1×10⁷CFU/mL的接种量接入L.casei-01商业冷冻干燥直投式发酵剂，38℃恒温发酵至75ºT。

本对比例1中用L.casei-01直投式发酵剂制作干酪乳杆菌益生菌发酵乳到达终点酸度（75ºT）的发酵时间为24.5小时，产品口感细腻滑爽、组织状态良好、微量乳清析出、具干酪乳杆菌特有发酵风味，经采用固相微萃取法（SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术检测其发酵产生的最主要挥发性风味成分也是庚酮、壬酮，但其平均锋面积分别只有32×10000、19×10000，最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量也仅为8.7×10⁸CFU/mL。

比较实施例1与对比例1可以看出，使用本发明的益生菌培养基进行发酵剂的扩培，其菌数含量高。同时，使用制得的益生菌发酵剂扩培直接用于发酵乳生产，具有发酵时间明显缩短、发酵乳产品益生菌含量高、产品风味浓郁、庚酮等特征风味物质含量高等特点。

此外，按WPC34乳清蛋白粉30元/千克、草鱼肉20元/千克、猪肝15元/千克、黑豆10元/千克、魔芋粉8元/千克、甜菜3元/千克、普通绿茶50元/千克、糖蜜1.5元/千克、葡萄糖粉4元/千克、三聚磷酸钠10元/千克、蛋白酶1000元/千克、葡聚糖酶1000元/千克计，则制作本实施例中培养基吨成本为1090.16元，即培养基成本约为1.1元/L。而实验室MRS培养基目前的市场售价约为850元/500g，500g培养基可配制发酵液9.6L，MRS培养基的物料成本约为元88元/L。因此，本发明所用培养基不仅可以直接应用、无食品安全隐患，而且成本低廉。

实施例2（培养干酪乳杆菌）：

1、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、甜菜、魔芋粉的酶处理

称取10克新鲜鱼肉、2克新鲜猪肝、10克新鲜甜菜、10克黑豆，清洗干净后，加入200克净化水浸泡，用果汁机将其搅拌破碎、榨汁，并经胶体磨研磨、分散均匀，再加入20克乳清蛋白粉WPC34、8克魔芋粉、200克净化水，充分搅拌、混合均匀，升温至55℃，加入0.126克食品级蛋白酶NP、0.084克的食品级葡聚糖酶，55℃水浴保温酶解3小时。酶处理结束后，将体系95℃加热处理10分钟，灭酶。酶处理后经布袋式过滤器过滤去除未充分酶解的蛋白质大分子以及猪肝、黑豆等原料中的纤维等成分，得富含多肽、氨基酸、低聚糖的乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、魔芋等的酶处理物。

2、茶粉溶解

在2克绿茶粉中加入20克净化水，经过滤后得无沉淀的茶溶液。

3、培养基配制与灭菌

将去除沉淀的黑豆、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、魔芋、甜菜的酶处理物与茶溶液混合，加入20克糖蜜、30克葡萄糖粉、2克三聚磷酸钠、465.79克净化水，充分搅拌、混合均匀，经高温灭菌，得益生菌发酵剂生长繁殖培养基。

4、培养基应用：活化好的干酪乳杆菌L.caseiLC2W菌株，按1×10⁶CFU/mL的接种量接入上述步骤3所述灭菌培养基中，37℃培养18小时，得益生菌L.caseiLC2W的扩大培养。

5、益生菌发酵乳基料制作：12%（质量百分比）还原的脱脂乳经95℃、90min保温杀菌后冷却至37℃，按5%的质量百分比接入上述步骤4所制得的益生菌L.caseiLC2W的扩大培养，37℃恒温发酵至190ºT，制作益生菌发酵乳基料（用于生产活性益生菌饮品等）。

本实施例，步骤4中用本发明的培养基对益生菌L.caseiLC2W进行扩培后，经检测分析，其益生菌含量为4.3×10⁹CFU/mL，菌数含量较高。用步骤4所制得的扩培发酵剂生产的干酪乳杆菌益生菌发酵乳基料到达终点酸度（190ºT）的发酵时间为53小时，产品组织状态良好、微量乳清析出、干酪乳杆菌特有发酵风味浓郁，经采用固相微萃取法（SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术检测其发酵产生的最主要挥发性风味成分为庚酮（平均锋面积：2671×10000）、壬酮（平均锋面积：1235×10000），最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量为3.1×10⁹CFU/mL。

对比实施例2（使用脱脂乳扩培发酵剂）：

1、脱脂乳扩培发酵剂制作：L.caseiLC2W直投式发酵剂按1×10⁶CFU/mL的接种量在12%经95℃、90min灭菌的脱脂乳中37℃培养36小时，得L.caseiLC2W菌株的脱脂乳继代发酵剂扩大培养。

2、益生菌发酵乳基料制作：12%（质量百分比）还原的脱脂乳经95℃、90min保温杀菌后冷却至37℃，按5%的质量百分比接入上述步骤2所制得的LC2W菌株的脱脂乳继代发酵剂扩大培养，37℃恒温发酵至190ºT，制作益生菌发酵乳基料（用于生产活性益生菌饮品等）。

本对比实施例，用L.caseiLC2W直投式发酵剂制作益生菌发酵乳基料到达终点酸度（190ºT）的发酵时间为68小时，产品组织状态良好、微量乳清析出、具干酪乳杆菌特有发酵风味，经采用固相微萃取法（SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术检测其发酵产生的最主要挥发性风味成分仍然是庚酮、壬酮，但其平均锋面积分别只有387×10000、106×10000，益生菌发酵乳基料益生菌菌数含量也仅为8.7×10⁸CFU/mL。

比较实施例2与对比实施例2可以看出，使用本发明的益生菌培养基进行发酵剂的扩培，发酵时间较短、菌数含量高。同时，使用制得的益生菌发酵剂扩培直接用于益生菌发酵乳基料生产，具有发酵时间明显缩短、发酵乳基料产品益生菌含量高、产品风味浓郁、庚酮等特征风味物质含量高等特点。

此外，按WPC34乳清蛋白粉30元/千克、草鱼肉20元/千克、猪肝15元/千克、黑豆10元/千克、魔芋粉8元/千克、甜菜3元/千克、绿茶粉30元/千克、糖蜜1.5元/千克、葡萄糖粉4元/千克、三聚磷酸钠10元/千克、蛋白酶1000元/千克、葡聚糖酶1000元/千克计，则制作本实施例中培养基吨成本为1254.2元，即培养基成本约为1.25元/L，而目前脱脂牛乳的市场价格约为4.5元/L。因此，本发明所用培养基不仅可以直接应用、无食品安全隐患，而且成本低廉。

实施例3（培养植物乳杆菌）：

1、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、甜菜、魔芋粉的酶处理

称取10克新鲜鱼肉、4克新鲜猪肝、20克新鲜甜菜、20克黑豆，清洗干净后，加入300克净化水浸泡，用果汁机将其搅拌破碎、榨汁，并经胶体磨研磨、分散均匀，再加入10克乳清蛋白粉E300、10克魔芋粉、200克净化水，充分搅拌、混合均匀，升温至52℃，加入0.1克食品级蛋白酶PB04、0.1克的食品级葡聚糖酶，52℃水浴保温酶解4小时。酶处理结束后，将体系95℃加热处理20分钟，灭酶。酶处理后经离心去除未充分酶解的蛋白质大分子以及猪肝、黑豆等原料中的纤维等成分，得富含多肽、氨基酸、低聚糖的乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、魔芋等的酶处理物。

2、茶粉溶解

在0.2克绿茶粉中加入10克净化水，搅拌均匀，经过滤后得无沉淀的茶溶液。

3、培养基配制与灭菌

将去除沉淀的黑豆、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、魔芋、甜菜的酶处理物与茶溶液混合，加入40克糖蜜、20克葡萄糖粉、1克三聚磷酸钠、354.6克净化水，充分搅拌、混合均匀，经高温灭菌，得益生菌发酵剂生长繁殖培养基。

4、培养基应用：活化好的植物乳杆菌L. plantarum LPHS菌株，按1×10⁷CFU/mL的接种量在上述步骤3所述灭菌培养基中接入L. plantarum LPHS，37℃培养12小时，得益生菌L. plantarum LPHS菌株的扩大培养。

5、植物乳杆菌益生菌发酵乳制作：12%（质量百分比）还原的脱脂乳经95℃、90min保温杀菌后冷却至37℃，按1×10⁷CFU/mL的接种量接入上述步骤4所制得的益生菌L. plantarum LPHS菌株的扩大培养，37℃恒温发酵至75ºT。

本实施例，步骤4中用本发明的培养基对益生菌L. plantarum LPHS菌株进行扩培后，经检测分析，其益生菌含量为4.7×10⁹CFU/mL，菌数含量较高。用步骤4所制得的扩培发酵剂生产的植物乳杆菌益生菌发酵乳到达终点酸度（75ºT）的发酵时间为26小时，产品口感细腻滑爽、组织状态良好、微量乳清析出、发酵乳特有风味浓郁，最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量为9.5×10⁸CFU/mL。

对比实施例3（使用直投式发酵剂）

植物乳杆菌益生菌发酵乳制作：12%（质量百分比）还原的脱脂乳经95℃、90min保温杀菌后冷却至37℃，按1×10⁷CFU/mL的接种量接入L. plantarum LPHS商业冷冻干燥直投式发酵剂，37℃恒温发酵。

本对比实施例，用L. plantarum LPHS直投式发酵剂制作益生菌发酵乳其24小时、48小时、72小时的滴定酸度分别只有32ºT、37ºT、39ºT，产品未能成功凝乳、几乎不具发酵乳特有发酵风味，72小时发酵产品的菌数含量也仅为1.7×10⁷CFU/mL，这表明使用植物乳杆菌L. plantarum LPHS冷冻干燥直投式发酵剂不能在乳中单独发酵制作发酵乳制品。

比较实施例3与对比实施例3可以看出，使用本发明的益生菌培养基进行发酵剂的扩培，其菌数含量高。同时，由于培养基成分中含丰富的游离氨基酸、低聚糖、矿物盐等营养成分，用本发明的益生菌发酵剂培养物直接接种应用可成功生产制作植物乳杆菌益生菌发酵乳，且具有发酵时间较短、发酵乳产品益生菌含量高、产品发酵乳风味浓郁等特点，而应用植物乳杆菌商业冷冻干燥直投式发酵剂由于发酵菌株本身生产性能缺陷，不能凝乳发酵。

实施例4（培养副干酪乳杆菌）：

1、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、甜菜、魔芋粉的酶处理

称取8克新鲜鱼肉、3克新鲜猪肝、15克新鲜甜菜、20克黑豆，清洗干净后，加入300克净化水浸泡，用果汁机将其搅拌破碎、榨汁，并经胶体磨研磨、分散均匀，再加入10克乳清蛋白粉E300、2克魔芋粉、120克净化水，充分搅拌、混合均匀，升温至50℃，加入0.1克食品级蛋白酶NP、0.1克的食品级葡聚糖酶，50℃水浴保温酶解4小时。酶处理结束后，将体系95℃加热处理10分钟，灭酶。酶处理后经布袋式过滤器过滤去除未充分酶解的蛋白质大分子以及猪肝、黑豆等原料中的纤维等成分，得富含多肽、氨基酸、低聚糖的乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、魔芋等的酶处理物。

2、茶溶液制取

在0.5克绿茶叶中加入20克、95℃的净化水，密封泡制30分钟，经过滤后得无沉淀的茶溶液。

3、培养基配制与灭菌

将去除沉淀的黑豆、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、魔芋、甜菜的酶处理物与茶溶液混合，加入20克糖蜜、20克葡萄糖粉、1克三聚磷酸钠、460.3克净化水，充分搅拌、混合均匀，经高温灭菌，得益生菌发酵剂生长繁殖培养基。

4、培养基应用：活化好的副干酪乳杆菌L. paracasei LPC37菌株，按8×10⁶CFU/mL的接种量接入上述步骤3所述灭菌培养基中，39℃培养12小时，得益生菌L. paracaseiLPC37的扩大培养。

5、益生菌发酵乳制作：生鲜牛乳经65℃、20MPa均质、95℃、90分钟保温杀菌后冷却至39℃，按8×10⁶CFU/mL的接种量接入上述步骤4所制得的益生菌L. paracasei LPC37的扩大培养，39℃恒温发酵至90ºT。

本实施例，步骤4中用本发明的培养基对益生菌L. paracasei LPC37进行扩培后，经检测分析，其益生菌含量为1.8×10⁹CFU/mL，菌数含量较高。用步骤4所制得的扩培发酵剂生产的副干酪乳杆菌益生菌发酵乳到达终点酸度（90ºT）的发酵时间为21.5小时，产品组织状态良好、微量乳清析出、干酪乳杆菌特有发酵风味浓郁，最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量为1.6×10⁹CFU/mL。

对比实施例4（使用直投式发酵剂）

益生菌发酵乳制作：生鲜牛乳经65℃、20MPa均质，95℃、90分钟保温杀菌后冷却至39℃，按8×10⁶CFU/mL的接种量接入L. paracasei LPC37商业冷冻干燥直投式发酵剂，39℃恒温发酵至90ºT。

本对比实施例，用L. paracasei LPC37直投式发酵剂制作酸奶到达终点酸度（90ºT）的发酵时间为27小时，产品组织状态良好、微量乳清析出、具干酪乳杆菌特有发酵风味，最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量为5.1×10⁸CFU/mL。

比较实施例4与对比实施例4可以看出，使用本发明的益生菌培养基进行发酵剂的扩培，其菌数含量高。同时，使用制得的益生菌发酵剂扩培直接用于发酵乳生产，具有发酵时间明显缩短、发酵乳产品益生菌含量高、产品风味浓郁等特点。

实施例5（培养嗜酸乳杆菌）：

1、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、甜菜、魔芋粉的酶处理

称取5克新鲜鱼肉、2克新鲜猪肝、15克新鲜甜菜、15克黑豆，清洗干净后，加入300克净化水浸泡，用果汁机将其搅拌破碎、榨汁，并经胶体磨研磨、分散均匀，再加入15克乳清蛋白粉WPC34、5克魔芋粉、150克净化水，充分搅拌、混合均匀，升温至50℃，加入0.07克食品级蛋白酶NP、0.07克的食品级葡聚糖酶，50℃水浴保温酶解5小时。酶处理结束后，将体系95℃加热处理20分钟，灭酶。酶处理后经布袋式过滤器过滤去除未充分酶解的蛋白质大分子以及猪肝、黑豆等原料中的纤维等成分，得富含多肽、氨基酸、低聚糖的乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、魔芋等的酶处理物。

2、茶溶液制取

在0.5克绿茶粉中加入25克净化水，搅拌均匀，经过滤后得无沉淀的茶溶液。

3、培养基配制与灭菌

将去除沉淀的黑豆、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、魔芋、甜菜的酶处理物与茶溶液混合，加入30克糖蜜、20克葡萄糖粉、1克三聚磷酸钠、416.36克净化水，充分搅拌、混合均匀，经高温灭菌，得益生菌发酵剂生长繁殖培养基。

4、培养基应用：活化好的嗜酸乳杆菌L. acidophilus NCFM菌株，按2×10⁶CFU/mL的接种量接入上述步骤3所述灭菌培养基，38℃培养15小时，得益生菌L. acidophilus NCFM的扩大培养。

5、益生菌发酵乳制作：生鲜牛乳经65℃、20MPa均质、95℃、90分钟保温杀菌后冷却至38℃，按1%（质量百分比）的接种量接入上述步骤4所制得的益生菌L. acidophilus NCFM的扩大培养，38℃恒温发酵至80ºT。

本实施例，步骤4中用本发明的培养基对益生菌L. acidophilusNCFM进行扩培后，经检测分析，其益生菌含量为2.3×10⁹CFU/mL，菌数含量较高。用步骤4所制得的扩培发酵剂生产的嗜酸乳杆菌益生菌发酵乳到达终点酸度（75ºT）的发酵时间为14小时，产品口感细腻滑爽、组织状态良好、微量乳清析出、发酵乳特有风味浓郁，最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量为1.9×10⁹CFU/mL。

对比实施例5（使用脱脂乳扩培发酵剂）

1、脱脂乳扩培发酵剂制作：活化好的嗜酸乳杆菌L. acidophilus NCFM菌株，按2×10⁶CFU/mL的接种量在12%经95℃、90min灭菌的脱脂乳中38℃培养24小时，得L. acidophilus NCFM菌株的脱脂乳继代发酵剂扩大培养。

2、益生菌发酵乳制作：生鲜牛乳经65℃、20MPa均质、95℃、90分钟保温杀菌后冷却至38℃，按1%（质量百分比）接种量接入上述L. acidophilusNCFM菌株的脱脂乳继代发酵剂扩大培养，38℃恒温发酵至80ºT。

本对比实施例，用L. acidophilus NCFM脱脂乳继代发酵剂到达终点酸度（80ºT）的发酵时间为21小时，产品口感细腻滑爽、组织状态良好、微量乳清析出、具发酵乳特有发酵风味，发酵乳益生菌菌数含量为6.9×10⁸CFU/mL。

比较实施例5与对比实施例5可以看出，使用本发明的益生菌培养基进行嗜酸乳杆菌的扩培，发酵时间较短、菌数含量高。同时，使用制得的益生菌发酵剂扩培直接用于益生菌发酵乳生产，具有发酵时间明显缩短、发酵乳产品益生菌含量高、产品风味浓郁等特点。

实施例6（培养乳双歧杆菌）：

1、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、甜菜、魔芋粉的酶处理

称取5克新鲜鱼肉、2克新鲜猪肝、15克新鲜甜菜、20克黑豆，清洗干净后，加入300克净化水浸泡，用果汁机将其搅拌破碎、榨汁，并经胶体磨研磨、分散均匀，再加入10克乳清蛋白粉E300、10克魔芋粉、150克净化水，充分搅拌、混合均匀，升温至55℃，加入0.135克食品级蛋白酶PB04、0.105克的食品级葡聚糖酶，55℃水浴保温酶解3小时。酶处理结束后，将体系95℃加热处理20分钟，灭酶。酶处理后经布袋式过滤器过滤去除未充分酶解的蛋白质大分子以及猪肝、黑豆等原料中的纤维等成分，得富含多肽、氨基酸、低聚糖的乳清蛋白、鱼肉、猪肝、黑豆、魔芋等的酶处理物。

2、茶溶液制取

在0.2克绿茶粉中加入20克净化水，搅拌均匀，经过滤后得无沉淀的茶溶液。

3、培养基配制与灭菌

将去除沉淀的黑豆、乳清蛋白、鱼肉、猪肝、魔芋、甜菜的酶处理物与茶溶液混合，加入20克糖蜜、20克葡萄糖粉、2克三聚磷酸钠、425.56克净化水，充分搅拌、混合均匀，经高温灭菌，得益生菌发酵剂生长繁殖培养基。

4、培养基应用：活化好的乳双歧杆菌B. lactis HN019菌株，按1×10⁷CFU/mL的接种量接入上述步骤3所述灭菌培养基中，37℃培养16小时，得益生菌B. lactis HN019的扩大培养。

5、益生菌发酵乳制作：生鲜牛乳经65℃、20MPa均质、95℃、90分钟保温杀菌后冷却至37℃，按1×10⁷CFU/mL的接种量接入上述步骤4所制得的益生菌B. lactis HN019的扩大培养，37℃恒温发酵至85ºT。

本实施例，步骤4中用本发明的培养基对益生菌B. lactis HN019进行扩培后，经检测分析，其益生菌含量为2.1×10⁹CFU/mL，菌数含量较高。用步骤4所制得的扩培发酵剂生产的双歧杆菌益生菌发酵乳到达终点酸度（85ºT）的发酵时间为19小时，产品口感细腻滑爽、组织状态良好、微量乳清析出、发酵乳特有风味浓郁，最终制作的益生菌发酵乳益生菌菌数含量为7.9×10⁸CFU/mL。

对比实施例6（使用直投式发酵剂）

1、益生菌发酵乳制作：生鲜牛乳经65℃、20MPa均质、95℃、90分钟保温杀菌后冷却至37℃，按1×10⁷CFU/mL的接种量接入上述B. lactis HN019菌株商业冷冻干燥直投式发酵剂，37℃恒温发酵至85ºT。

本对比实施例，用B. lactis HN019脱脂乳继代发酵剂到达终点酸度（85ºT）的发酵时间为24.5小时，产品口感细腻滑爽、组织状态良好、微量乳清析出、具发酵乳特有发酵风味，发酵乳益生菌菌数含量为2.9×10⁸CFU/mL。

比较实施例6与对比实施例6可以看出，使用本发明的益生菌培养基进行双歧杆菌的培养，发酵时间较短、菌数含量高。同时，使用制得的益生菌发酵剂扩培直接用于益生菌发酵乳生产，具有发酵时间明显缩短、发酵乳产品益生菌含量高、产品风味浓郁等特点。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种益生菌培养基，其特征在于，制备原料由乳清蛋白，鱼肉，猪肝，黑豆，魔芋粉，甜菜，茶溶液或茶粉，葡萄糖，糖蜜，三聚磷酸钠和净化水组成，各原料的质量百分含量为：

培养基的制备方法为：黑豆、鱼肉、猪肝和甜菜经清洗、破碎、研磨后，加入乳清蛋白、魔芋粉和净化水搅拌均匀得混合物，混合物中加入占乳清蛋白、鱼肉、猪肝和黑豆总质量0.1～0.3％的食品级蛋白酶，占黑豆、魔芋和甜菜总质量0.1～0.3％的食品级葡聚糖酶，酶解，酶解结束后加热灭酶，酶处理后的混合物经过滤取滤液或离心取上清，得酶处理物；酶处理物与其他原料混合，充分搅拌均匀，灭菌后获得益生菌培养基。

2.根据权利要求1所述的益生菌培养基，其特征在于，酶解温度为50～55℃，酶解时间为3～6小时。

3.权利要求1或2所述的益生菌培养基在培养益生菌菌株中的应用，所述益生菌为干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或副干酪乳杆菌。

4.一种培养益生菌的方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的益生菌培养基，益生菌起始菌种接种量为10⁶～10⁷CFU/mL，培养温度为37～39℃，培养时间为12～18小时。