CN101153316A - 一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法。属于化学成分检测的技术领域。利用培养基及加入氯洁霉素抗生素的培养基对干酪乳杆菌进行分离。然后，分别挑取疑似菌落进行革兰氏染色，对镜检结果为革兰氏阳性无芽孢杆菌的进行生物化学鉴定。采用过氧化氢酶和糖发酵试验进行生化鉴定。在培养基上分离出的菌种，镜检细菌形状为杆状，过氧化氢酶阴性，七叶苷、纤维二糖、甘露醇、山梨醇和蔗糖呈阳性，麦芽糖呈阴性的菌种即为干酪乳杆菌。

Description

一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法。属于化学成份检测的技术领域。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵的糖类产生大量乳酸的细菌通称。这类细菌广泛分布在土壤、植物根茎、湖泊及动物的体内。

益生菌是一种对人体有益的细菌，它们可直接作为食品添加剂服用，以维持肠道菌丛的平衡。益生菌保健产品数以百计，其中包括：含益生菌的酸牛奶、酸乳酪、酸豆奶以及含多种益生菌的口服液、片剂、胶囊等等。在我国市场上以各类益生菌乳制品最受人们喜爱，因为它们不但具有丰富的营养价值，并能促进肠道正常微生物群的稳定。

目前国内还没有专门用于乳制品干酪乳杆菌的检测，此方法的开发可以弥补乳制品中干酪乳杆菌的检测的空缺，并能及时掌握益生菌乳制品的研究进程和生产控制。

发明内容

本发明的目的：提供一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法，能及时掌握益生菌乳制品的研究进程和生产控制。

本发明的技术方案如下：

益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法，其特征在于：

具体的检测步骤如下：

1)取适量冻干菌种无菌操作溶于无菌温水中，混匀制备得到混合菌悬液；

2)用胰化胨溶液将样品进行稀释，得到稀释混合菌悬液；

3)将稀释混合菌悬液接种到培养基上；

4)在37℃厌氧培养箱中，培养70-72小时；

5)用常规方法测得酪乳杆菌菌落；

6)镜检细菌形状为杆状，过氧化氢酶阴性，七叶苷、纤维二糖、甘露醇、山梨醇和蔗糖呈阳性，麦芽糖呈阴性的菌种即为干酪乳杆菌；即可判断干酪乳杆菌的存在。

1.1材料与设备

1.1.1菌种

标准菌株：干酪乳杆菌是来自丹麦丹尼斯克公司的标准冻干菌种。

1.1.2试剂

①稀释剂：

用无菌的胰化胨溶液稀释细菌的菌落计数。

②培养基组成：

培养基的组织成分：

组成成重量(g)

牛肉蛋白粉10

鱼肉汁10

酵母浸出汁粉5

葡萄糖20

醋酸钠5

柠檬酸二铵2

吐温80 0.1

硫酸镁0.58

硫酸锰0.28

蒸溜水1000ml

灭菌后用乙酸调节PH到5.4。

③胰化胨溶液：

组成：胰蛋白胨1g，NaCl(氯化钠)8.5g，蒸馏水1000ml

制法：溶液分瓶装。数量小于100毫升的，用灭菌锅121℃灭菌15分钟，数量大于100毫升的，121℃灭菌20分钟。

保藏：4℃下保藏一个月。

1.1.3设备

超净工作台；高压灭菌锅；厌氧培养箱；显微镜。

1.2方法

1.2.1混合菌悬液的制备

取适量冻干菌种无菌操作溶于无菌温水中，混匀备用。

1.2.2样品稀释

无菌操作称取25g(ml)均匀样品(或混合菌悬液)，于225ml胰化胨溶液中，制成10^-1的均匀稀释液；

无菌操作吸取10^-1的稀释液1ml，于9ml胰化胨溶液中，制成10-2的均匀稀释液；

无菌操作吸取10^-2的稀释液1ml，于9ml胰化胨溶液中，制成10^-3的均匀稀释液；

如此类推，制成几个适当倍数的均匀稀释液。

1.2.3接种培养

选择2-3个合适稀释度，分别吸取1ml于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

每个平皿倒入适量50℃的选择性培养基(见表1)约15ml，转动平皿使之混匀，并做空白对照。

培养基凝固后，翻转平板，置37℃厌氧培养箱中，培养70-72小时。

表1干酪乳杆菌的培养基要求

菌种名	培养基要求
		干酪乳杆菌	培养基，pH5.4

1.2.4可疑菌落计数

①计数原则：

同GB4789.2-2003种菌落总数计数原则。

②菌落形态：

培养基内表都生长，培养基表面的呈白色，圆滑湿润，菌落中等大小；培养基内的呈白色，形状不一，菌落中等大小。

1.2.5菌种鉴定

符合上述菌落形态的为可疑菌落，从中选择5个进行如下3项鉴定。

①菌种形态：

革兰氏阳性无芽孢杆菌。

②过氧化氢酶试验：

过氧化氢酶阴性。

③碳水化合物反应(见表2)：

表2干酪乳杆菌的碳水化合物反应

菌种名	七叶甘	纤维二糖	麦芽糖	甘露醇	山梨醇	蔗糖
							干酪乳杆菌	+	+	d	+	+	+
注：d有些菌株阳性，有些菌株阴性。

1.2.6干酪乳杆菌的菌落计数

例如样品10-4稀释液的可疑菌落为35个，选择5个菌落进行鉴定，证实为干酪乳杆菌的4个，则1ml(g)样品中干酪乳杆菌菌落数为：35×4/5×104＝2.8×105。

实施方案的结果与讨论

实验中的菌种样配制和样品中菌种添加量在同一梯度，都使用了7个菌液稀释度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)进行接种培养，目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长出30-300个菌落的稀释度为最佳。

干酪乳杆菌

在培养基培养基上只有一种菌落，对其进行革兰氏染色，镜检结果革兰氏阳性无芽孢杆菌，菌体形状一致。

生化鉴定的情况：1.过氧化氢酶试验。选5个具有代表性的菌种接种于3％双氧水中不产生气泡为阴性。2.碳水化合物反应(见表1)。七叶苷由黄色变为棕黑色呈阳性，纤维二糖、甘露醇、山梨醇和蔗糖由紫色变为黄色呈阳性，麦芽糖有的未变色呈阴性、有的由紫色变为黄色呈阳性。

将实验结果与生化鉴定对照得出结论为：用培养基可以分离检测干酪乳杆菌。

Claims (5)

1.一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法，其特征在于：具体的检测步骤如下：

1)取适量冻干菌种无菌操作溶于无菌温水中，混匀制备得到混合菌悬液；

2)用胰化胨溶液将样品进行稀释，得到稀释混合菌悬液；

3)将稀释混合菌悬液接种到培养基上；

4)在37℃厌氧培养箱中，培养70-72小时；

5)用常规方法测得酪乳杆菌菌落；

6)镜检细菌形状为杆状，过氧化氢酶阴性，七叶苷、纤维二糖、甘露醇、山梨醇和蔗糖呈阳性，麦芽糖呈阴性的菌种即为干酪乳杆菌；即可判断干酪乳杆菌的存在。

2.如权利要求1所述的干酪乳杆菌的检测方法，其特征在于：

其中所述的步骤2的稀释方法如下：

1)无菌操作称取25g(ml)均匀样品(或混合菌悬液)，于225ml胰化胨溶液中，制成10-1的均匀稀释液；

2)无菌操作吸取10-1的稀释液1ml，于9ml胰化胨溶液中，制成10-2的均匀稀释液；

3)无菌操作吸取10-2的稀释液1ml，于9ml胰化胨溶液中，制成10-3的均匀稀释液。

3.如权利要求1所述的干酪乳杆菌的检测方法，其特征在于：

步骤3中的培养方法如下：

1)选择2-3个合适稀释度，分别吸取1ml于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿；

2)每个平皿倒入适量50℃的选择性培养基，转动平皿使之混匀，并做空白对照。

4.如权利要求1所述的干酪乳杆菌的检测方法，其特征在于：

所述的培养基的组成及制备方法如下：

培养基的组织成分：

组成成重量(g)

牛肉蛋白粉10

鱼肉汁10

酵母浸出汁粉5

葡萄糖20

醋酸钠5

柠檬酸二铵2

吐温800.1

硫酸镁0.58

硫酸锰0.28

蒸溜水1000ml

灭菌后用乙酸调节PH到5.4。

5.如权利要求1所述的干酪乳杆菌的检测方法，其特征在于：所述的胰化胨溶液组成及制备方法如下：

组成：胰蛋白胨1g，NaCl 8.5g，蒸馏水1000ml；

制法：溶液分瓶装，数量小于100毫升的，用灭菌锅121℃；

灭菌15分钟，数量大于100毫升的，121℃灭菌20分钟。