CN102510902A - 活菌数的测定方法及培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种活菌数的测定方法，其使用仅含有选自山梨糖醇及甘露醇中的至少1种糖醇作为糖源的培养基，从含有属于双岐杆菌属的微生物的待测菌中仅对属于短双岐杆菌的微生物进行识别，并测定其活菌数。另外，还可以提供作为前述测定方法中使用的选择性培养基而有用的、调制也容易的培养基。

Description

活菌数的测定方法及培养基
技术领域
本发明涉及一种利用培养法从含有双歧杆菌的待测菌中，仅对短双岐杆菌种的活菌数进行测定的方法，以及作为前述测定方法用的选择性培养基而有用的培养基。
本申请基于2010年3月26日在日本申请的日本特愿2010-72369号要求优先权，将其内容援引于此。
背景技术
双歧杆菌作为有用的肠内细菌的一种而众所周知，有很多关于其生理学意义的报告。例如，在肠内产生乳酸、醋酸等有机酸并抑制有害菌增殖的作用，维生素的产生、免疫力的激活等已被弄清楚。
因而，以往提出了各种双歧杆菌活菌制剂(非专利文献1)。另外，以通过摄取双歧杆菌来维持健康为目的，开发了含有双歧杆菌的各种食品，例如酸奶等发酵乳、点心、饮料、健康食品等。另外，在婴幼儿期，摄取母乳的婴幼儿双歧杆菌占优势，因而在日本以外，也正在开发含有双歧杆菌·乳酸菌的婴幼儿奶粉等。目前，在世界市场中作为主要添加于食品的双歧杆菌种可列举出长双岐杆菌种，也存在并用有短双岐杆菌种的制品(非专利文献2)。
认为对于消费者来说，从大量标示制品的信息的观点出发，将添加于制品中的有益菌的活菌数个别地表示有益的。另外，关于活菌数的标示，印度尼西亚已确立了如下法律：针对添加于制品中的有益菌，表示每一菌种的活菌数。
目前，作为从包含双歧杆菌和乳酸菌两者的制品中测定任一种菌的活菌数的方法，已经确立了使用仅生长双歧杆菌的培养基的方法、利用需氧培养仅对乳酸菌进行培养的方法。
另外，作为测定含有多种双歧杆菌或乳酸菌的制品中的双歧杆菌的菌种及其活菌数的方法，有根据将其涂抹于在BL琼脂培养基中添加有无菌脱纤维血液的培养基上，利用厌氧培养使其在培养基上生长而形成的菌落的形态(颜色、形状等)或利用革兰氏染色法得到的菌的形态等进行判定的方法(非专利文献3)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：光冈知足编著，《Research onbifidobacteria》，Japan Bifidus Foundation，1994年，第266-267页
非专利文献2：光冈知足编著，《Research onbifidobacteria》，Japan Bifidus Foundation，1994年，第282-283页
非专利文献3：《Method for the enumeration ofbifidobacteria in fermented milk and fermented milk drinks》，theBifidobacterium Testing Methods Review Committee of theJapanese Association of Fermented Milks and Fermented MilkDrinks，2000年3月，第1-13页
发明内容
发明要解决的问题
但是，对于如上述非专利文献3所记载的方法，当菌落的形态、菌的形状近似时，对菌种的辨别需要专业的知识。因而，各个菌种的活菌数的测定有时非常困难。另外，在日本国外，很多国家无法获得无菌脱纤维血液。对于这样的国家而言，无法制作带有血液的BL琼脂培养基，从而无法进行前述方法。
目前，由于如上述那样存在配合有短双岐杆菌种和长双岐杆菌种的制品，在世界益生菌市场中广泛使用短双岐杆菌种、长双岐杆菌种、乳双岐杆菌种等，因而寻求能够利用培养法从这些多个双岐杆菌种混合存在的制品中，仅对特定的菌种、例如仅对短双岐杆菌种进行容易地测定的技术。
本发明是为了解决上述课题而进行的，其目的在于提供一种通过使用特定的培养法，从含有双歧杆菌的待测菌中仅对短双岐杆菌种的活菌数进行容易地测定的测定方法，以及作为前述测定方法用的选择性培养基而有用的、且调制也容易的培养基。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题，对伯杰氏系统细菌学手册(BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology)，1986年，第2卷，第1428页，表15.51及表15.54所记载的糖类及双歧杆菌(Bifidobacteria Microflora)，第1(1)卷，第3-24页(MitsuokaTomotari著，“肠道菌群的最近研究趋势(Recent Trends inResearch on Intestinal Flora)”所记载的糖类进行了详细地研究。结果发现：在利用培养法进行活菌数测定时，在短双岐杆菌种、长双岐杆菌种、动物双岐杆菌种、婴儿双歧杆菌种中，短双岐杆菌种的大部分可以将山梨糖醇及甘露醇同化；在长双岐杆菌种、动物双岐杆菌种、婴儿双歧杆菌种中，虽然婴儿双歧杆菌种的一部分菌株中存在将甘露醇及山梨糖醇同化的菌株，但其比例非常少。由此，本发明人等进行了深入研究，结果成功的开发出以下培养基：通过含有甘露醇及/或山梨糖醇作为唯一的糖源，并将糖以外的培养基成分(蛋白质、肽等)的浓度设为一定范围的浓度，从而使培养基中仅短双岐杆菌种形成大的菌落。即，本发明人等通过利用短双岐杆菌种的甘露醇及山梨糖醇的同化性，限定培养基成分的浓度，成功地开发了可以降低其它双歧杆菌的菌落形成能力(colony forming capacity)的、仅对短双岐杆菌种进行活菌数测定的培养基。由此，可以从前述4菌种中仅对短双岐杆菌种的活菌数进行测定。
解决上述课题的本发明的测定方法及培养基具有以下方式。
[1]一种活菌数的测定方法，其特征在于，其为使用培养基从含有属于双歧杆菌属的微生物的待测菌中仅对属于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)的微生物的活菌数进行测定的方法，前述培养基满足以下的1)及2)，且前述活菌数的测定是对形成于前述培养基的、直径0.7mm以上的菌落进行计测：
1)作为糖源仅含有选自山梨糖醇及甘露醇种的至少1种糖醇，
2)作为氮源含有胨、肉膏及酵母膏。
[2]根据[1]所述的方法，其中，前述培养基中的前述糖醇的浓度相对于培养基的总质量为4质量％以下。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，在1000mL培养基中，前述培养基中的前述胨的含量为6.0～14.0g/1000mL、前述肉膏的含量为6.0～14.0g/1000mL及前述酵母膏的含量为1.8～4.2g/1000mL。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，属于前述短双岐杆菌的微生物是短双岐杆菌·M-16V株。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，前述待测菌作为属于前述双歧杆菌属的微生物，含有
属于前述短双岐杆菌的微生物，
以及选自由属于长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)的微生物、属于动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)的微生物和属于长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的微生物组成的组中的至少1种微生物。
[6]根据[5]所述的方法，其中，属于前述长双歧杆菌长亚种的微生物是长双歧杆菌长亚种·BB536株。
[7]一种培养基，其在[1]～[6]中任一项所述的方法中使用，用于从含有属于双歧杆菌属的微生物的待测菌中，仅对属于短双岐杆菌的微生物的活菌数进行测定。
[8]根据[7]所述的培养基，其特征在于，其满足以下的1)～5)：
1)作为糖源仅含有选自山梨糖醇及甘露醇中的至少1种糖醇，
2)前述糖醇的浓度相对于培养基的总质量为4质量％以下，
3)在1000mL培养基中，含有酵母膏1.8～4.2g/1000mL，
4)在1000mL培养基中，含有肉膏6.0～14.0g/1000mL，
5)在1000mL培养基中，含有胨6.0～14.0g/1000mL。
在本说明书及权利要求书中，只要没有特别限定，浓度(％)为w/v(质量/体积)的值。
双歧杆菌表示属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)的微生物。
另外，短双岐杆菌种表示属于短双岐杆菌(Bifidobacteriumbreve)的微生物，长双岐杆菌种表示属于长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)的微生物，动物双岐杆菌种表示属于动物双岐杆菌(Bifidobacterium animalis)的微生物，乳双岐杆菌种表示属于动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)的微生物，婴儿双歧杆菌种表示属于长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)的微生物。
“菌末”表示将菌粉末化的产物。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种通过使用特定培养法，从含有双歧杆菌的待测菌中仅对短双岐杆菌种的活菌数进行容易地测定的测定方法，以及作为前述测定方法用的选择性培养基而有用的、且调制也容易的培养基。
具体实施方式
本发明的测定方法中，使用仅含有选自山梨糖醇及甘露醇中的至少1种糖醇作为糖源的培养基，从含有双歧杆菌的待测菌中仅对短双岐杆菌种的活菌数进行测定。
关于培养基，详见后述。
作为短双岐杆菌种的菌株并无特别限定，可以是截止至今作为属于短双岐杆菌种的菌株而保藏于公共微生物保藏机构(ATCC、NTCC、JCM、DSMZ、BCCM、LMG等)的公共机构保藏株，也可以是通过公知的方法从自然界分离的分离株。作为公共机构保藏株，例如可列举出ATCC15700T株、M-16V株(以保藏号：BCCM/LMG23729进行保藏。作为M-16V菌末由森永乳业株式会社市售)等。上标文字T表示标准株。
待测菌所含有的双歧杆菌可以仅是短双岐杆菌种，但在本发明的有用性的观点上，优选除了短双岐杆菌种之外，还含有短双岐杆菌种以外的至少1种其它双歧杆菌。
作为前述短双岐杆菌种以外的其它双歧杆菌，并无特别限定，例如，可列举出通常作为益生菌而广泛使用的双歧杆菌。其中，由于形成于前述培养基的菌落的尺寸小、易于与短双岐杆菌种的菌落区分，因而优选含有选自长双岐杆菌种、乳双岐杆菌种、婴儿双歧杆菌种中的至少1种。其中，优选含有选自长双岐杆菌种·ATCC 15707T株、长双岐杆菌种·BB536株(以保藏号：ATCC BAA-999进行保藏。作为BB536菌末由森永乳业株式会社市售)、乳双岐杆菌种·DSM 10140T株、婴儿双歧杆菌种·ATCC 15697T株中的至少1种，特别优选含有长双岐杆菌种·BB536株。
作为含有通过本发明测定活菌数的待测菌的试样，只要含有前述待测菌则无特别限定。具体而言，可列举出发酵乳、点心、饮料、健康食品、婴幼儿奶粉等食品，药品、家畜用饲料等制品，对前述制品实施粉碎、利用稀释液的稀释等处理而得到的物质等。
前述试样的培养除了使用本发明的培养基作为培养基之外，可以利用以往在利用培养法的微生物活菌数的测定中使用的公知的培养法。作为前述培养法，可列举出固体培养法(使用琼脂培养基进行培养的培养法)。
作为固体培养法，具体而言，可列举出倾注培养法(pourplate method)、涂布培养法、旋转培养法(spiral plate method)等。倾注培养法是将试验试样(试样或将试样用稀释液稀释的稀释物)与加温溶解的琼脂培养基混合，进行冷却固化实施培养的方法。涂布培养法是将试验试样涂布在琼脂培养基上进行培养的方法。旋转培养法是使用机器等将试验试样带有浓度梯度地接种在培养基上的方法。
本发明的测定方法具体而言，可如下实施：使用以1.5质量％左右浓度含有琼脂的本发明的培养基培养试验试样(试样或将试样用稀释液稀释的稀释物)，在所形成的菌落中，对一定以上尺寸(例如直径0.7mm以上)的菌落的数量进行计数。此时所计数的菌落数相当于用前述琼脂培养基培养的试验试样中所包含的短双岐杆菌种的活菌数。因此，可以由从该值和稀释倍率求出试样中所包含的短双岐杆菌种的活菌数(/g)。
作为稀释液，并无特别限定，可利用生理盐水、上述非专利文献3所记载的稀释液(A)(食品卫生检查指南所记载的厌氧性试样稀释液)等公知的稀释液。
本发明的培养条件可利用作为短双岐杆菌种的培养条件而公知的培养条件。
菌落数的计数通常在厌氧条件下于37℃培养48小时左右后，通过目视进行。
前述本发明的测定方法所使用的培养基作为糖源仅含有选自山梨糖醇及甘露醇中的至少1种糖醇(以下有时也称作特定糖源)。
作为前述特定糖源，可以仅为山梨糖醇，也可以仅为甘露醇。或者，还可组合山梨糖醇和甘露醇。另外，山梨糖醇优选为D-山梨糖醇，甘露醇优选为D-甘露醇。或者，还可以组合D-山梨糖醇和D-甘露醇。
在前述培养基中，前述特定糖源的浓度(山梨糖醇或甘露醇的浓度)从短双岐杆菌种的选择性的观点出发，相对于培养基的总质量，优选为4质量％以下。若考虑对渗透压的影响、经济性方面时，更优选为1～4质量％。进一步优选为1～3质量％。
予以说明，作为本发明的培养基不包含的、前述特定糖源以外的糖源，例如可列举出葡萄糖、淀粉、蔗糖、棉籽糖、半乳糖、阿拉伯糖等。
前述培养基还可含有前述特定糖源以外的成分。以下，将构成前述培养基的、除了作为糖源而唯一包含的前述特定糖源以外的成分记载为基础培养基成分。
作为基础培养基成分，可列举出酵母膏、肉膏、胨等氮源；氯化钠、醋酸钠、丙酸钠等钠盐，L-半胱氨酸盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐(例如硫酸镁、硫酸锰)等盐类。这些之中，前述本发明的测定方法中使用的培养基作为氮源含有酵母膏、肉膏及胨。
作为酵母膏、肉膏、胨，可分别利用通常用于微生物培养所用的物质。
酵母膏是以酵母作为原料，通过自消化酶等适度分解的营养源，具体而言，可例示出Yeast Extract(Becton，Dickinson andCompany制)等。肉膏是由肉的浸出液获得的营养源，通过赋予胨所不具备的矿物质、磷酸、能量源等必须要素，补充胨的营养素特性的营养源。具体而言，可例示出′LAB-MEMCO′powder(OXOID Ltd.制)等。胨是利用蛋白质分解酶或酸将牛奶酪朊、动物的肉、大豆蛋白质等部分水解的产物。具体而言，可例示出BactoTM peptone(Becton，Dickinson and Company制)等。
在1000mL培养基中，酵母膏的含量优选为1.8～4.2g/1000mL。更优选为2.7～4.2g/1000mL。
在1000mL培养基中，肉膏的含量优选为6.0～14.0g/1000mL。更优选为9.0～14.0g/1000mL。
在1000mL培养基中，胨的含量优选为6.0～14.0g/1000mL。更优选为9.0～14.0g/1000mL。
上述酵母膏、肉膏、胨各自的含量(g/1000mL)表示1000mL培养基中所包含的固体成分量(g)。
从渗透压的观点出发，本发明所使用的培养基优选含有前述盐类。作为前述盐类优选钠盐，特别优选氯化钠及醋酸钠。
培养基中，前述盐类的含量在1000mL培养基中优选为5～15g/1000mL。
本发明所使用的培养基从仅短双岐杆菌种易于形成大的菌落、从混合存在的多个双歧杆菌种之中易于正确地仅对短双岐杆菌种的活菌数进行测定的方面出发，特别优选满足以下1)～5)的所有条件。
1)作为糖源仅含有前述特定糖源。
2)前述特定糖醇的浓度相对于培养基的总质量为4质量％以下。
3)在1000mL培养基中，含有酵母膏1.8～4.2g/1000mL。
4)在1000mL培养基中，含有肉膏6.0～14.0g/1000mL。
5)在1000mL培养基中，含有胨6.0～14.0g/1000mL。
本发明的培养基可以根据需要在不损害本发明的效果的范围内含有上述以外的其它成分。
作为前述的其它成分，并无特别限定，可以含有通常添加于培养基的成分。例如，在活菌数测定时作为培养法使用固体培养法时，配合琼脂。琼脂通常按照其最终所得的培养基中的浓度达到1.5％左右的方式进行配合。
予以说明，还可在不影响短双岐杆菌种的菌落生长和活菌数的范围内添加任意的抗生素。
如上所述，通过使用含有短双岐杆菌种具有同化性的前述特定糖源作为唯一糖源的培养基，可以从包含短双岐杆菌种在内的多种双歧杆菌混合存在的制品中，仅对短双岐杆菌种进行识别、并对其活菌数进行容易地测定。即，所述培养基中，仅短双岐杆菌种形成大的菌落。
例如，即使是存在部分同样具有前述特定糖源的同化性的菌株的婴儿双歧杆菌种，在本发明的培养基中所形成的菌落的尺寸也比短双岐杆菌种所形成的菌落的尺寸小。
当为没有前述特定糖源的同化性的双歧杆菌种(例如长双岐杆菌种、乳双岐杆菌种等)时，前述菌落的尺寸变得更小。作为菌落尺寸产生差异的理由，认为是上述培养基组成使短双岐杆菌种以外的双歧杆菌种的菌落形成能力(colony formingcapacity)降低。
因此，当使用本发明的培养基对包含短双岐杆菌种在内的多种双歧杆菌混合存在的制品进行培养时，即使不辨别菌落或菌的形态，通过计测生长得大的菌落数，可以仅对短双岐杆菌种进行识别，并测定其活菌数，较简单。另外，其测定值与在前述BL琼脂培养基中添加了无菌脱纤维血液的培养基那样的现存培养基的测定值同等程度地正确。
因此，本发明的培养基作为用于利用培养法对包含短双岐杆菌种在内的多种双歧杆菌混合存在的制品中的短双岐杆菌种的活菌数进行测定的选择性培养基是有用的。
而且，本发明的培养基不需要如无菌脱纤维血液那样的难以获得的材料，因而调制也容易。
在获得上述效果的方面来看，重要的是作为氮源将胨、肉膏、酵母膏的各成分以规定浓度进行组合。
予以说明，在本发明的培养基中可含有的盐类中，硫酸镁及硫酸锰在培养基中的含量越少，则菌落的生长变得越良好，因而优选。具体而言，在1000mL培养基中，硫酸镁的含量优选为0.1g/1000mL以下，特别优选为0g/1000mL。硫酸锰的含量优选为0.05g/1000mL以下，特别优选为0g/1000mL。
对培养基的制造方法并无特别限定，可以利用公知的方法进行制造。
若举出具体例子，首先将琼脂、氯化钠、醋酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐等任意成分与水一起添加至酵母膏、肉膏及胨中，进行溶解，调制基础培养基。此时的基础培养基中的各成分浓度设为从最终浓度计算为其1.25倍左右的浓度。接着，利用高压釜对前述基础培养基进行121℃、15分钟的灭菌处理。
通过另行用水溶解前述特定糖源而调制糖溶液。此时的糖溶液中的糖浓度设为由最终浓度计算为其5倍左右的浓度。接着利用过滤灭菌来进行前述糖溶液的灭菌处理。
然后，通过将前述基础培养基与糖溶液以4∶1的比例(体积比)进行混合，获得以所需浓度含有各成分的培养基。本说明书中，1000mL培养基表示用水将基础培养基成分及糖稀释，使其总量达到1000mL。
予以说明，本发明中，从含有双歧杆菌的待测菌中仅对短双岐杆菌种的活菌数进行测定的方法所使用的培养基也可记载为短双岐杆菌种选择用培养基、作为糖源仅含有选自山梨糖醇及甘露醇中的至少1种糖醇的短双岐杆菌种选择用培养基等。
实施例
接着，示出试验例及实施例，对本发明进行更详细的说明，但本发明不限定于以下的实施例。
<试验例1：关于基础培养基的探讨>
通过使用在1000mL中含有表1所示的各基础培养基成分的基础培养基A或B，并将各基础培养基中的基础培养基成分的浓度(1.0倍的浓度)设为表2～3所示的倍率的浓度的培养基，进行基础培养基中的有效成分浓度的探讨。表2～3所示的浓度的倍率表示在1000mL基础培养基中，以表1所示的基础培养基成分的含量为基准(1.0倍)时，在1000mL基础培养基中，在维持表1的配合比的同时变更各基础培养基成分的浓度的比例。
一般来说，在双歧杆菌的活菌数测定中，使用向RCA培养基(强化梭菌琼脂，Reinforced Clo stridial Me dium Agar)、MRS培养基(de Man Rogosa and Sharpe)中添加L-半胱氨酸盐酸盐的mMRS培养基(改良的MRS培养基，modified MRS培养基)等。因而，以RCA培养基、mMRS培养基的培养基组成为参考，调制分别含有表1所示基础培养基成分的基础培养基A及基础培养基B。
在上述的各基础培养基中添加琼脂，使其最终浓度(添加D-甘露醇或D-山梨糖醇后的浓度)相对于培养基的总质量达到1.5质量％，再添加D-甘露醇或D-山梨糖醇，使其最终浓度相对于培养基的总质量达到1质量％，调制各培养基1-1～1-14、2-1～2-8。
使用所调制的培养基，按照以下步骤实施了利用培养法(倾注培养法)的活菌数测定。
作为试验试样，使用M-16V菌末(森永乳业株式会社制、1.7×1011/g含有品)，作为活菌数测定时稀释试验试样的稀释液，使用了0.85％生理盐水。
用稀释液稀释试验试样，调制了测定试样。利用倾注培养法将前述测定试样与预先加热至45℃而使其溶解的培养基一起散布在平板上，在琼脂凝固后，在厌氧条件下进行37℃、48小时的培养。
培养后，通过目视测定培养基上生长的菌落数，由前述测定值算出试验试样中的活菌数值。将其结果示于表2～3。另外，利用0.1mm刻度的标尺测定前述菌落的直径(mm)，求出其平均值。将前述平均值作为“菌落直径”示于表2～3。表中，“％”表示”质量％”。
[表1]
Figure BDA0000144339630000141
单位表示g/1000mL。
[表2]
Figure BDA0000144339630000142
[表3]
Figure BDA0000144339630000143
如表2所示，在使用与培养基成分A相同组成的培养基1-1～1-14中，在浓度为0.1倍的培养基1-1、1-2及浓度为3.0倍的培养基1-13、1-14中进行培养的例子的活菌数小于5.0×109/g。
另外，在浓度为0.3倍的培养基1-3、1-4中进行培养的例子的活菌数分别为1.6×1011/g、1.4×1011/g，但菌落的直径变为0.5mm，形成了较小的菌落。
另一方面，在其它的培养基1-5～1-12中进行培养的例子的活菌数值为1.4×1011/g～1.8×1011/g，菌落直径为0.8～1.3mm，观察到良好的生长。
因而可知，通过在浓度0.6倍～2.0倍范围内使用与基础培养基A相同的组成作为基础培养基，形成了活菌数高、菌落直径为0.8mm以上的可识别菌落。
如表3所示，在使用与基础培养基B相同组成的培养基2-1～2-8中，在浓度为0.1倍的培养基2-1、2-2中进行培养的例子的活菌数小于5.0×109/g。
另外，在浓度为0.3倍的培养基2-3、2-4中，在作为糖源配合有D-甘露醇的培养基2-3中进行培养的例子中观察到良好的生长；但在作为糖源配合有D-山梨糖醇的培养基2-4中进行培养的例子中，虽然活菌数为1.6×1011/g，但菌落的直径变成0.6mm，形成较小的菌落。
另一方面，在其它培养基2-5～2-8中进行培养的例子的活菌数值为1.7×1011/g～1.9×1011/g，菌落直径为0.9～1.1mm，观察到良好的生长。
由此可知，通过在浓度0.6倍～1.0倍的范围内使用与基础培养基B相同的组成，形成了活菌数高、菌落直径为0.9mm以上的、可识别菌落。
由基础培养基A及基础培养基B的组成以及表2～3的结果可确认，在1000mL培养基中包含胨6.0～20.0g、肉膏6.0～20.0g及酵母膏3.0～6.0g的基础培养基对于短双岐杆菌种的良好生长是有效的。
<试验例2：关于利用双歧杆菌种的差异的分离性的探讨>
作为双歧杆菌，使用短双岐杆菌种ATCC 15700T株、短双岐杆菌种M-16V株、长双岐杆菌种ATCC 15707T株、长双岐杆菌种BB536株、乳双岐杆菌种DSM 10140T株。上标文字T表示标准株。
上述中，短双岐杆菌种M-16V株以保藏号：BCCM/LMG23729进行保藏、长双岐杆菌种BB536株以保藏号：ATCC BAA-999进行保藏。
表4表示分别摘录自伯杰氏系统细菌学手册，1986年，第2卷，第1428页，表15.51(以下称作文献A)和双歧杆菌，第1(1)卷，第3-24页(以下称作文献B)的文献中的短双岐杆菌种、婴儿双歧杆菌种、长双岐杆菌种、乳双岐杆菌种的甘露醇的同化性及山梨糖醇的同化性。
对于摘录自文献A的数值而言，d表示11～89％的菌株具有同化性，-表示90％以上的菌株没有同化性。对于摘录自文献B的数值，其分母值表示进行了试验的菌株数，分子值表示进行了试验的菌株中具有同化性的菌株数。
予以说明，前述伯杰氏系统细菌学手册中，短双岐杆菌种的甘露醇及山梨糖醇的同化性为11～89％，而根据文献B可知短双岐杆菌种的所有菌株均具有甘露醇及山梨糖醇的糖的同化性。另外，可知在婴儿双歧杆菌种、长双岐杆菌种、乳双岐杆菌种中，大多数菌株没有甘露醇及山梨糖醇的同化性。
[表4]
d：表示11～89％的菌株具有同化性
-：表示90％以上的菌株没有同化性
*：分母值表示进行了试验的菌株数、分子值表示进行了试验的菌株中具有同化性的菌株数
调制以下培养基：在1000mL培养基中含有酵母膏3g、肉膏10g、胨10g、氯化钠5g、醋酸钠3g及L-半胱氨酸盐酸盐0.5g的基础培养基A；以及对前述基础培养基A进行稀释，使基础培养基A的各培养基成分的浓度(1.0倍的浓度)达到表5所示倍率(0.1倍～0.9倍)浓度的基础培养基。
在上述的各基础培养基中添加琼脂，使其最终浓度(添加糖源后的浓度)达到1.5质量％，调制基础培养基3-1～3-4。
另外，在上述的各基础培养基中添加琼脂，使其最终浓度(添加糖源后的浓度)相对于培养基的总质量达到1.5质量％，进而作为糖源添加D-葡萄糖、D-山梨糖醇或D-甘露醇，使其最终浓度相对于培养基的总质量达到1质量％，调制各培养基3-5～3-16。
使用mMRS培养液以接种量3％在37℃下对上述的各菌株进行15小时的继代培养。使用0.85％生理盐水将已确认其稳定生长的培养液稀释至适当的浓度。
利用倾注培养法将稀释的培养液与预先加热至45℃而使其溶解的培养基一起散布在平板上，在琼脂凝固后，在厌氧条件下进行37℃、48±2小时的培养。培养后，与试验例1同样地测定在培养基上生长的菌落的直径(mm)。将其结果示于表5。
表5中，N.T.表示未进行试验(培养及菌落直径的测定)。
[表5]
Figure BDA0000144339630000181
如表5所示，即使在未添加糖源的培养基(3-1～3-4)中进行培养，进行试验的全部菌株均仅生长了0.3mm以下的菌落。
在添加有1质量％的D-葡萄糖的培养基(3-5～3-7)的情况下，所形成的菌落直径与培养基成分浓度成比例地增大，在培养基成分浓度为0.6倍以上的培养基中，任一种菌种均形成了直径0.7mm以上的菌落，但未见菌种间的差异。
在添加有1质量％的D-山梨糖醇的培养基(3-8～3-12)的情况下，在培养基浓度为0.3～1.0倍时，短双岐杆菌种ATCC15700T株及M-16V株均形成了直径0.7mm以上的菌落。
另一方面，短双岐杆菌种以外的婴儿双歧杆菌种、长双岐杆菌种、乳双岐杆菌种的4株所形成的菌落直径均为0.3mm以下，仅生长了可容易地与短双岐杆菌种的菌落进行区分的尺寸的菌落。
由以上的结果可以确认：通过使用在特定的基础培养基中添加了规定量D-山梨糖醇或D-甘露醇作为唯一糖源的培养基，仅使短双岐杆菌种形成了大的菌落，可以容易地测定其活菌数。
因此，即使在待测菌中除了短双岐杆菌种之外还混合存在婴儿双歧杆菌种、长双岐杆菌种、乳双岐杆菌种等，通过使用上述培养基进行培养，也可仅对短双岐杆菌种进行识别、并容易地测定其活菌数。
<实施例1、比较例1～2>
准备已知配混有短双岐杆菌种M-16V株的菌末及长双岐杆菌种BB536株的菌末两者的奶粉制品。
作为培养基，使用加入有马脱纤维血液的BL琼脂培养基(以往作为可通过菌落形状进行区分的培养基的培养基)、RCA培养基(已知形成2株双歧杆菌的菌落的培养基)、在下述基础培养基中添加有1质量％的D-山梨糖醇的培养基(本发明培养基)这3种，与试验例1同样地测定前述奶粉制品中的各菌种的活菌数。其中，仅BL培养基不使用倾注培养法，而使用涂布法进行培养。
基础培养基：在1000mL培养基中包含酵母膏2.5g、肉膏8.2g、胨8.2g、氯化钠4.1g、醋酸钠4.1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.41g及琼脂15g的基础培养基。
在使用BL培养基的例子中，通过生长于前述BL培养基上的菌落的形状、显微镜检查，分离出短双岐杆菌种和长双岐杆菌种并进行计测。将其总值表示为两种菌株的总活菌数值。
在使用RCA培养基及本发明培养基的例子中，由生长而得到的菌落数计算活菌数。
予以说明，表6中，“-”表示由于菌落的尺寸小于0.2mm而未计数。另外，表6中，“％”表示“质量％”。
[表6]
Figure BDA0000144339630000201
如表6结果所示，使用本发明培养基测定的活菌数值为使用加入有马脱纤维血液的BL培养基测定的短双岐杆菌种的活菌数值的同等以上。因此显示了通过使用本发明的培养基可以仅对短双岐杆菌种进行识别，并测定其活菌数值，其活菌数值也为与使用前述BL培养基时基本同等程度正确的值。
另一方面，使用RCA培养基进行测定的活菌数值与使用加入有马脱纤维血液的BL培养基测定的短双岐杆菌种及长双岐杆菌种的总活菌数值是同等的。因此，使用RCA培养基时无法区分短双岐杆菌种及长双岐杆菌种的活菌数。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种通过特定培养法，从含有双歧杆菌的待测菌中仅对短双岐杆菌种的活菌数进行容易地测定的测定方法，以及作为前述测定方法用的选择性培养基而有用的、且调制也容易的培养基。

Claims (8)

1.一种活菌数的测定方法，其特征在于，其为使用培养基从含有属于双歧杆菌属的微生物的待测菌中仅对属于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)的微生物的活菌数进行测定的方法，所述培养基满足以下的1)及2)，且所述活菌数的测定是对形成于所述培养基的、直径0.7mm以上的菌落进行计测：
1)作为糖源仅含有选自山梨糖醇及甘露醇中的至少1种糖醇，
2)作为氮源含有胨、肉膏及酵母膏。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基中的所述糖醇的浓度相对于培养基的总质量为4质量％以下。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在1000mL培养基中，所述培养基中的所述胨的含量为6.0～14.0g/1000mL、所述肉膏的含量为6.0～14.0g/1000mL及所述酵母膏的含量为1.8～4.2g/1000mL。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，属于所述短双岐杆菌的微生物是短双岐杆菌·M-16V株。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述待测菌作为属于所述双歧杆菌属的微生物，含有
属于所述短双岐杆菌的微生物，
以及选自由属于长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)的微生物、属于动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)的微生物和属于长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的微生物组成的组中的至少1种微生物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，属于所述长双歧杆菌长亚种的微生物是长双歧杆菌长亚种·BB536株。
7.一种培养基，其在根据权利要求1～6中任一项所述的方法中使用，用于从含有属于双歧杆菌属的微生物的待测菌中，仅对属于短双岐杆菌的微生物的活菌数进行测定。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，其满足以下的1)～5)：
1)作为糖源仅含有选自山梨糖醇及甘露醇中的至少1种糖醇，
2)所述糖醇的浓度相对于培养基的总质量为4质量％以下，
3)在1000mL培养基中，含有酵母膏1.8～4.2g/1000mL，
4)在1000mL培养基中，含有肉膏6.0～14.0g/1000mL，
5)在1000mL培养基中，含有胨6.0～14.0g/1000mL。
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