CN115066490A - 新型双歧杆菌属细菌以及包含其的组合物 - Google Patents

新型双歧杆菌属细菌以及包含其的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种分离出对健康有益的新的乳酸菌，并含有该新型乳酸菌的食品或饮品或益生菌组合物等的组合物。本发明提供一种从运动员的肠道菌群中分离的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB‑001菌株(NITE BP‑03095)以及含有其的食品或饮品或益生菌组成物等的组合物。

Description

新型双歧杆菌属细菌以及包含其的组合物
技术领域
本发明涉及新型双歧杆菌属细菌以及包含该双歧杆菌属细菌的组合物，更具体地，涉及从运动员的肠道内分离的、具有山梨糖醇同化能力的新型双歧杆菌属细菌以及含有该新型双歧杆菌属细菌的食品或饮品、益生菌组合物等。
背景技术
一直以来，已知通过调节肠道环境，能够改善或提高健康状态。另外，近年来，通过分子生物学方法分析粪便样本，能够掌握由大量肠道细菌组成的肠道菌群。因此，为了阐明肠道菌群的组成与健康状况之间的关联性，正在从各种观点进行研究。
其中，关于运动员肠道菌群的研究备受关注。运动员的身体能力优异，同时经常进行高强度的身体运动，因此与能量的吸收/消耗、免疫等相关的功能有可能与普通人不同。因此，为了获得对这些功能改善和健康状态的提高有用的知识，正在以运动员为对象进行肠道菌群的分析，肠道是能量吸收及免疫系统的场所。例如，在非专利文献1中，报告了以13名女子马拉松选手为对象进行肠道菌群的分析的结果，具有普氏菌属(Prevotella)的肠道细菌的选手存在一定比例(13名中有6名)等。
另一方面，我们经口摄入的食品和饮料中包含各种糖类。在糖类中，除了葡萄糖和蔗糖等所谓的糖以外，还存在山梨糖醇和木糖醇等糖醇、阿斯巴甜等合成甜味剂。其中，由于糖醇主要是植物来源的天然化合物，因此安全性高、由于不易消化吸收，因此热量低，所以被广泛用作甜味剂和食品添加剂等。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：松生香里，外7名，「マラソン選手における腸内細菌叢の特徴とBMIの関連」、川崎医療福祉学会誌、Vol.29、No.1、2019年,p.99-105
发明内容
发明所要解决的课题
在这样的背景技术下，需要能够用于调节肠道环境、改善健康状态等的新的微生物。特别是，有望从组成运动员的肠道菌群的微生物中分离出能够作为新的益生菌使用并具有特殊功能的乳酸菌。但是，根据上述的非专利文献1，分析运动员的肠道菌群的结果，仅获得了关于哪个属的微生物以何种比例存在的知识，没有对组成运动员的肠道菌群的各微生物进行研究或分离。
另一方面，在上述的糖类中，由于低聚糖或聚右旋糖难以在消化道中分解、吸收，成为对健康状态的提高有益的肠道细菌的选择性营养源促进增殖，因此被用作益生元。因此，作为食品或饮品的组成成分广泛使用的糖醇有望作为益生元所利用。
因此，本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于，从运动员的肠道菌群中分离并提供具有有益功能的新的乳酸菌。
另外，本发明的另一个目的在于，提供一种能够利用山梨糖醇等糖醇生长的具有糖醇同化能力并能够将糖醇作为益生元使用的新的乳酸菌。
另外，本发明的另一个目的在于，提供一种含有上述的新的乳酸菌的食品或饮品或益生菌组合物等的组合物。
课题解决手段
本发明人从500名以上的运动员中获取1000多个样本，以在分析运动员的肠道菌群的同时分离作为新的益生菌有用的新的乳酸菌为目的进行了专心研究，结果完成了本发明。
解决上述问题的本发明的新型乳酸菌是双歧杆菌(双歧杆菌属细菌)的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)。
根据本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)是具有山梨糖醇同化能力的新型双歧杆菌属细菌。由于这种新型双歧杆菌是一个长(longum)种，因此可以作为益生菌使用。另外，由于这种新型双歧杆菌属细菌具有山梨糖醇同化能力，因此可以将各种食品和饮料中混合的山梨糖醇和水果中天然包含的山梨糖醇作为益生元有效地利用。还有，这种新型双歧杆菌属细菌与基准菌株(长双歧杆菌ATCC15707菌株)相比还具有在耐酸性上优异的性质。
另外，本发明的包含新型双歧杆菌属细菌的组合物是含有长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)的组合物。
另外，优选地，本发明的组合物含有长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)以及山梨糖醇。由此，可以得到有益的微生物以及其营养源即益生菌和益生元混合的组合物。
另外，优选地，本发明的组合物是食品或饮品。由此，选择合适的组合物的形态。另外，在本发明的食品或饮品中，当然也包含补充剂、健康食品、功能性食品、营养辅助食品以及特定保健用食品等。
另外，优选地，本发明的组合物是益生菌组合物。由此，选择合适的组合物的一个形态。
发明效果
根据本发明，可以提供具有以下优异效果的新型双歧杆菌属细菌以及包含新型双歧杆菌属细菌的组合物。
(1)是一种可作为益生菌使用的新的双歧杆菌属细菌，可以混合在食品和饮料、医药品等的组合物中使用。
(2)由于是对广泛混合在各种食品或饮品中的、天然水果中大量包含的山梨糖醇具有同化能力的双歧杆菌属细菌，因此可以将山梨糖醇作为益生元有效利用。
(3)由于与基准菌株(Bifidobacterium longum ATCC15707菌株)相比具有优异的耐酸性，因此即使经口摄入，也很容易以活的状态到达肠道。
附图说明
图1是示出实施例5中的培养本发明的新型双歧杆菌属细菌的培养液A(没有山梨糖醇)中的有机酸浓度的图表。
图2是示出实施例5中的培养本发明的新型双歧杆菌属细菌的培养液B(含有山梨糖醇)中的有机酸浓度的图表。
图3是示出实施例6中的培养本发明的新型双歧杆菌属细菌的“PY培养基+0.5％山梨糖醇”培养液中的有机酸浓度的图表。
图4是示出实施例6中的培养本发明的新型双歧杆菌属细菌的“PY培养基+0.5％葡萄糖”培养液中的有机酸浓度的图表。
具体实施方式
本发明的新型乳酸菌是具有山梨糖醇同化能力的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)。迄今为止几乎没有确认到具有山梨糖醇同化能力的除了青春双歧杆菌(B.adolescentis)、短双歧杆菌(B.breve)以及链状双歧杆菌(B.catenulatum)的一部分菌之外的双歧杆菌属细菌，在长双歧杆菌种中，这次由发明人首次确认并分离出来。
这种本发明的新型双歧杆菌属细菌是从运动员(男性，比赛项目：田径比赛，原奥运会日本代表)的肠道菌群中分离出来的。这种新型双歧杆菌属细菌，即，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株如下所述被国际保藏在专利微生物保藏机构。
(1)保藏编号：NITE BP-03095
(2)原保藏日：2019年12月25日
(3)保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8 122号室，邮编292-0818)
从运动员的肠道菌群中分离的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株的菌学性质示于下表1和表2。示于下表1的各试验是基于光学显微镜(奥林巴斯株式会社产品，型号：BX50F4)的形态观察以及Barrow和Feltham等人的方法(Cowan and Steel’sManual for the Identification of Medical Bacteria,3rd edition,Cambridge:University Press,1993)进行的。另外，对示于表2的各底物的反应试验是使用厌氧菌生化鉴定试剂盒(Apikenki(API20A)，生物梅里埃日本株式会社产品)进行的。
[表1]
Figure BDA0003785149260000051
[表2]
Figure BDA0003785149260000061
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株可以通过培养使其增殖。AuB-001菌株的培养温度优选为20℃至40℃，更优选为25℃至40℃，特别优选为30℃至40℃。另外，由于双歧杆菌属细菌是专性厌氧菌，因此优选在厌氧环境中培养，例如，优选在通入二氧化碳或氮气的同时培养。另外，作为培养基，可以使用通常用于培养双歧杆菌属细菌的培养基，没有特别限制，但可以列举GAM Broth“Nissui”(日水制药株式会社)或TOS丙酸琼脂培养基(养乐多药品工业株式会社)等。另外，也可以在该培养基中混合AuB-001菌株能够同化的山梨糖醇等的糖类。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株可以以培养液的状态、将培养液浓缩或稀释的状态、以及从培养液等回收的菌体的状态使用。另外，在不丧失本发明的效果的范围内，也可以对培养液以及回收菌体实施清洗处理、冷冻干燥或L-干燥、喷雾干燥等干燥处理或加热处理等的各种追加处理。另外，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株优选以活菌形式使用，但也可以是死菌，也可以以活菌和死菌混合的状态使用。
根据本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株虽然可以作为有益的新型双歧杆菌单独使用，但也可以作为与其他成分组合得到的各种组合物使用。作为本发明的含有长双歧杆菌AuB-001菌株的组合物，可以优选列举经口摄入的食品或饮品、益生菌组合物、肠道调节组合物、药妆品或医药品等。另外，食品或饮品中包含补充剂、健康食品、功能性食品、营养辅助食品以及特定保健用食品等。组合物中的AuB-001菌株的含量根据组合物的用途和使用方式等而不同，但作为一例，优选为1×106个细胞/g至1×1012个细胞/g，更优选1×107个细胞/g至1×1011个细胞/g。
本发明的含有长双歧杆菌AuB-001菌株的组合物可以含有山梨糖醇。由于AuB-001菌株具有山梨糖醇同化能力，因此作为组合物中的组成成分的山梨糖醇可以成为AuB-001菌株的选择性营养源，并激活AuB-001菌株的增殖和活性。虽然组合物中的山梨糖醇的混合比例没有特别限制，但作为一例，优选0.01重量％至20重量％，更优选0.1重量％至10重量％，特别优选0.5重量％至5重量％。
作为根据本发明的组合物的用途，优选食品或饮品。此时，可以作为片剂或胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、凝胶状剂等补充剂方式、发酵乳或乳酸菌饮料、清凉饮料、运动饮料等饮料、酸奶或冰淇淋等乳制品、糖果或口香糖、巧克力等点心、面包、粥、谷类食品、面条、果冻、汤、调味料等所有方式的食品或饮品组合物使用。另外，在该组合物中，除了构成食品或饮品组合物的原料以外，还可以将其他的功能性成分、其他的微生物、糖类、维生素、矿物质、氨基酸或蛋白质等营养素等进行各种组合。
这些食品或饮品组合物例如可以通过将粉末状或悬浮液状的长双歧杆菌AuB-001菌株添加至食品或饮品的原料中并混合等来制造。另一方面，也可以将长双歧杆菌AuB-001菌株添加到牛奶等发酵原料中，进行培养或发酵，制成发酵食品。
另外，作为根据本发明的组合物的用途，还优选作为用于调节肠道环境的益生菌组合物。作为益生菌组合物的形式，可以采用与上述食品或饮品同样的形式。此外，在作为益生菌组合物的情况下，优选作为组合促进AuB-001菌株的增殖和活性化的益生元成分的组合物。作为益生元成分，除了上述的山梨糖醇以外，没有特别限制，但可以列举低聚半乳糖或低聚果糖等低聚糖、聚葡萄糖或菊糖等膳食纤维，可以选择1种或2种以上的成分混合至组合物中。另外，也可以选择1种或2种以上的AuB-001菌株以外的长双歧杆菌菌株、双歧杆菌菌株或乳杆菌属菌株等益生菌混合至组合物中。
实施例
下面，通过实施例更具体地说明本发明，但是本发明并不特别限制在这些实施例。
[实施例1]
1.乳酸菌的分离
从大量的运动员采集粪便样本并进行了乳酸菌的分离。具体地，通过以下方法进行。将粪便样品悬浮于灭菌的PBS中，将该悬浮液进一步用PBS稀释，制备系列稀释液，并涂布在TOS丙酸琼脂培养基(养乐多药品工业株式会社产品)上。将该平板培养基在厌氧罐内使用脱氧/二氧化碳发生剂(三菱瓦斯化学株式会社产品，AnaeroPack(注册商标)/Kenki)，在37℃下厌氧培养2天至3天。挑取在平板培养基上形成菌落的细菌分离菌株，接种至示于下表3的培养基组成的液体培养基(GAM Broth“Nissui”，日水制药株式会社产品)中，在37℃的厌氧条件下培养。然后，如在下面实施例2中的详细说明，从各培养基中分别提取分离株的DNA，并对提取的DNA进行核糖体RNA基因(rDNA)碱基序列分析，推测分离株的菌种。使用用于纯培养的TOS丙酸琼脂培养基对推测为双歧杆菌属的分离株的培养液进行单菌落分离后，在表3所示的GAM Broth“Nissui”液体培养基中在37℃的厌氧条件下培养，并制成20％甘油原液后在-80℃中保存。
[表3]
Figure BDA0003785149260000091
[实施例2]
2.分离株的鉴定(1)
在实施例1中，为了推测形成菌落的细菌分离株的菌种，进行了16S核糖体RNA基因(rDNA)碱基序列分析。首先，从培养基中提取分离株的DNA，对提取的DNA通过PCR扩增16SrRNA基因。用于PCR的引物组的序列是“27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)”以及“1492R：5'-GGTTTACTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO：2)”。进行各PCR产物的碱基序列测定，得到各分离株的16S rRNA基因区域的碱基序列。对于该16S rRNA基因区域的序列，在NCBI的国际碱基序列数据库(Genbank)上，通过BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性检索。
其结果，发现从某男性运动员(比赛项目：田径比赛，原奥运会日本代表)的粪便样本中分离出的细菌分离株的16S rRNA基因区域的碱基序列与“长双歧杆菌猪瘟亚种菌株Su851 16S核糖体RNA，部分序列”具有99.3％的高同源性。因此，将该分离株的菌种推测为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，并命名为AuB-001菌株。该分离株(AuB-001菌株)的碱基序列确定的16S rRNA基因区域的碱基序列(SEQ ID NO：3)示于下表4。
[表4]
Figure BDA0003785149260000101
[实施例3]
3.分离株的鉴定(2)
在实施例2中，对推测为长双歧杆菌的AuB-001菌株进行了ANI(Averagenucleotide identity，平均核苷酸一致性)分析。ANI分析是通过将调查对象株以及现有株的全部基因组序列在计算机上分为约1000个碱基左右的片段，并使用序列检索算法计算两者的基因组序列的各片段的相似度进行的，DNA-DNA杂交形成试验中70％的一致度相当于ANI值的95％。因此，如果ANI值为95％以上，则判定为同种，如果ANI值小于95％，则判定为另一种。通过测序仪测定AuB-001菌株的全基因组序列，得到2,548,718bp的碱基序列。ANI分析由ANI tools Online(http://ani.mypathogen.cn/)网站上的程序进行。结果示于下表5。
[表5]
菌株名 ANI值
长双歧杆菌DJO10A 98.07％
长双歧杆菌F8 98.03％
长双歧杆菌JCM 97.70％
长双歧杆菌BBMN68 97.69％
长双歧杆菌JDM301 95.76％
长双歧杆菌infantis 94.02％
如表5所示，AuB-001菌株对长双歧杆菌种的多个菌株显示出95％以上的ANI值。因此，本发明的AuB-001菌株的菌种被鉴定为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。另外，由于与近缘菌株的ANI值小于100％，因此明确了AuB-001菌株是长双歧杆菌的新菌株。该长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株作为NITE BP-03095保藏在专利微生物保藏中心。
[实施例4]
4.糖同化能力的探讨
为了研究被鉴定为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)种的AuB-001菌株的糖同化能力，进行了以各糖类为底物的反应试验。试验使用厌氧菌生化鉴定试剂盒(Apikenki(API20A)，生物梅里埃日本株式会社产品)进行，作为比较对照，对作为长双歧杆菌的基准菌株的长双歧杆菌ATCC15707菌株进行了相同的试验。结果示于下表6。
[表6]
Figure BDA0003785149260000121
根据该结果，确认了根据本发明的AuB-001菌株与作为基准菌株的长双歧杆菌ATCC15707菌株不同，具有同化作为糖醇的山梨糖醇的能力。迄今为止几乎没有确认到具有山梨糖醇同化能力的除了青春双歧杆菌(B.adolescentis)、短双歧杆菌(B.breve)以及链状双歧杆菌(B.catenulatum)的一部分菌之外的双歧杆菌属细菌，这次由本发明人确认了在长双歧杆菌种中的山梨糖醇同化能力。因此，这次从运动员的肠道菌群中发现了具有山梨糖醇同化能力的长双歧杆菌，证明了运动员肠道菌群的多样性/功能性。
[实施例5]
5.有机酸产量的分析
有机酸除了使肠道保持酸性，促进肠道蠕动和肠道分泌水分之外，还具有预防感染、抑制腐败产物的产生、粪便性状/排便的改善效果的作用。因此，已知通过将产生有机酸的细菌保留在肠道中来调节肠道环境有助于健康。因此，为了研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株的有机酸产生能力，分析了培养液中的有机酸产量。另外，作为培养液，使用(1)不含山梨糖醇的培养液A、(2)含有山梨糖醇的培养液B这2种培养液，测定了各培养液中的有机酸产量。(1)作为不含山梨糖醇的培养基A，使用了示于上表3的GAM Broth“Nissui”液体培养基，(2)作为含有山梨糖醇的培养基B，使用了在示于下表7所示的GAM Broth“Nissui”液体培养基中将山梨糖醇混合至0.5％得到的培养液。试验如下进行。取在TOS丙酸琼脂培养基(养乐多药品工业株式会社)上以37℃、72小时厌氧培养生长的AuB-001菌株的菌落并悬浮于灭菌生理盐水中，制备成麦氏浊度No.0.5。将该菌液0.1mL分别接种至各培养液5mL中，并使用脱氧/二氧化碳发生剂(三菱瓦斯化学株式会社产品，AnaeroPack(注册商标)/Kenki)在37℃厌氧培养20小时。通过孔径0.20μm的膜过滤器过滤各培养液，将过滤液作为样品溶液，使用高效液相色谱仪(株式会社岛津制作所产品，有机酸分析系统)测定各有机酸的浓度。详细的测定条件如下。
·色谱柱：Shim-pack SCR-102(H)、300mm×8mm ID，2条串联使用
·保护柱：Shim-pack SCR-102(H)，50mm x 6mm ID
·洗脱液：5mmol/L对甲苯磺酸
·反应液：5mmol/L对甲苯磺酸、100μmol/L EDTA、20mmol/L Bis-Tris
·流速：0.8mL/min
·烤箱温度：45℃
·检测器：电导率检测器CDD-10A
[表7]
Figure BDA0003785149260000141
另外，作为比较对照，使用作为基准菌株的长双歧杆菌ATCC15707菌株代替AuB-001菌株，将在TOS丙酸琼脂培养基上以37℃、72小时厌氧培养生长的ATCC15707菌株的菌落悬浮于灭菌生理盐水中，制备成麦氏浊度No.0.5。将该基准菌株的菌液0.1mL接种至各培养液5mL中，并对在37℃厌氧培养20小时的培养液(长双歧杆菌ATCC15707菌株)和未接种菌的培养液(空白)也进行了与上述同样的试验，并测定了有机酸的浓度。结果示于下表8、9以及图1、2。
另外，使用培养液A(表3)的厌氧培养后的AuB-001菌株的培养液A中的总细菌数为1.5×1010(个细胞/mL)，ATCC15707菌株的培养液A中的总细菌数为8.9×109(个细胞/mL)。另外，使用培养液B(表7)的厌氧培养后的AuB-001菌株的培养液B中的总细菌数为1.2×1010(个细胞/mL)，ATCC15707菌株的培养液B中的总细菌数为4.9×109(个细胞/mL)。
[表8]
Figure BDA0003785149260000151
[表9]
Figure BDA0003785149260000152
根据这些结果，确认了在培养液A(不添加山梨糖醇)中，AuB-001菌株具有与作为基准菌株的ATCC15707菌株同样的有机酸产生能力，均大量产生乳酸、乙酸以及甲酸。并且发现，即使在添加了山梨糖醇的培养液B中，AuB-001菌株也具有高的乳酸、甲酸以及乙酸的生产能力。由此可知，AuB-001菌株在山梨糖醇存在下活跃地增殖，能够产生有机酸。
[实施例6]
6.糖同化能力以及有机酸产量的分析
然后，代替实施例5中使用的含有葡萄糖的培养液，使用在不含碳水化合物的PY培养基中分别添加了作为碳水化合物源的葡萄糖或山梨糖醇的培养液，分析了AuB-001菌株以及基准菌株(Bifidobacterium longum ATCC15707菌株)在各培养液中的糖同化能力，即，增殖能力和有机酸产量。
本实施例中使用的PY培养基的组成示于下表10和表11。PY培养基是将示于表10的溶液1加温溶解后，添加溶液2，在121℃进行15分钟的高压灭菌处理得到的。将其骤冷后，将添加了D(-)-山梨糖醇使其浓度成为0.5重量％的培养液作为“PY培养基+0.5％山梨糖醇”，将添加D(+)-葡萄糖使其浓度成为0.5重量％的培养液作为“PY培养基+0.5％葡萄糖”。另外，表10中的刃天青溶液(※1)使用将25mg用100mL的蒸馏水溶解而成的溶液，盐溶液(※2)使用根据示于表11的成分制备的溶液，氯化血红素液(※3)使用将50mg的氯化血红素用1N的NaOH溶解并用蒸馏水稀释至100mL的溶液，维生素K1液(※4)使用将0.15mL的维生素K1用30mL的95％乙醇溶解的溶液。
[表10]
Figure BDA0003785149260000161
[表11]
Figure BDA0003785149260000162
试验如下进行。取出在TOS丙酸琼脂培养基(养乐多药品工业株式会社)上以37℃、72小时厌氧培养生长的AuB-001菌株的菌落并悬浮于灭菌生理盐水中，制备成麦氏浊度No.0.5。将0.1mL该AuB-001菌株的菌液分别接种至“PY培养基+0.5％山梨糖醇”和“PY培养基+0.5％葡萄糖”的各培养液10mL中，在37℃用灭菌加压试管进行20小时的厌氧培养。培养后，从各培养液中取出一部分培养液，从原液系列稀释至104倍，用血球计数板计数细菌数，求出每1mL各培养液的总细菌数。另外，将剩余的各培养液通过孔径0.20μm的膜过滤器分别过滤，将过滤液作为样品溶液，以与上述的实施例5同样的测定方法以及条件测定了各有机酸的浓度。
另外，使用作为基准菌株的长双歧杆菌ATCC15707菌株代替AuB-001菌株，将在TOS丙酸琼脂培养基上以37℃、72小时厌氧培养生长的ATCC15707菌株的菌落悬浮于灭菌生理盐水中，制备成麦氏浊度No.0.5。将该基准菌株的菌液0.1mL接种至各培养液10mL中，并对在37℃厌氧培养20小时的培养液(长双歧杆菌ATCC15707菌株)和未接种菌的培养液(空白)也进行了与上述同样的试验，并测定了每1mL各培养液的总细菌数和各有机酸的浓度。结果示于下表12、13以及图3、4。
[表12]
Figure BDA0003785149260000171
[表13]
Figure BDA0003785149260000181
根据这些结果，发现在含有作为碳水化合物源的葡萄糖的“PY培养基+0.5％葡萄糖”培养液中，AuB-001菌株以及作为基准菌株的ATCC15707菌株均增殖至109个细胞/mL的数量级，产生大量的乳酸和乙酸。另一方面，表明在含有作为碳水化合物源的山梨糖醇的“PY培养基+0.5％山梨糖醇”培养液中，AuB-001菌株活跃增殖至4.8×109个细胞/mL，产生大量的乳酸和乙酸，而作为基准菌株的ATCC15707菌株的总细菌数为5.6×106个细胞/mL，并没有增殖，而且几乎不产生乳酸和乙酸。
由此可知，AuB-001菌株虽然是长双歧杆菌，但可以利用山梨糖醇进行增殖，产生作为最终代谢产物的乳酸和乙酸。
[实施例7]
7.耐酸性的探讨
一般来说，双歧杆菌属细菌容易受到低pH环境的影响，因此在经口摄入的情况下，受到胃液的影响而容易死亡，存在难以活着到达肠道的问题。因此，使用模拟胃液调整至pH2.0的试验液，对根据本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株的耐酸性进行了研究。
首先，使用TOS丙酸琼脂培养基(养乐多药品工业株式会社)和脱氧/二氧化碳发生剂(三菱瓦斯化学株式会社产品、AnaeroPack(注册商标)/厌氧)将AuB-001菌株在37℃厌氧培养24小时。将该新鲜培养菌株悬浮于无菌生理盐水中，制备菌液使每1mL的菌数为108个细胞/mL。将该菌液0.1mL添加至灭菌中型试管中收容的10mL的人工胃液或10mL的灭菌生理盐水(对照)中，在37℃反应预定时间(人工胃液：10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟，灭菌生理盐水：0分钟、60分钟)。另外，人工胃液的组成示于下表14。人工胃液使用了调整至pH2.0并通过0.45μm的过滤器过滤灭菌后的人工胃液。另外，构成人工胃液的成分中，胃蛋白酶使用了“胃蛋白酶1:10000，来源于猪胃粘膜”(富士胶片和光纯药株式会社产品)。
[表14]
Figure BDA0003785149260000191
经过各反应时间后，取出添加了菌液的人工胃液或无菌生理盐水1mL，将其作为原液，通过稀释平板法测定了菌数。对于各稀释率，在3片琼脂平板培养基上涂布0.1mL原液或稀释液进行培养。另外，琼脂平板培养基使用TOS丙酸琼脂培养基，培养是通过使用脱氧·二氧化碳发生剂在37℃厌氧培养72小时来进行的。结果示于下表15。
另外，代替AuB-001菌株，对作为基准菌株的长双歧杆菌ATCC15707菌株也进行了与上述相同的试验。结果示于下表16。
[表15]
Figure BDA0003785149260000201
[表16]
Figure BDA0003785149260000202
由这些结果可知，AuB-001菌株的耐酸性比作为基准菌株的ATCC15707菌株还优异。具体地，在与pH2.0人工胃液接触30分钟时，AuB-001菌株存活了2.3×103CFU/mL，而ATCC15707菌株的存活菌数为3.3CFU/mL。
由此可知，根据本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株在具有利用山梨糖醇活跃地增殖并且能够产生作为最终代谢产物的乳酸和乙酸的山梨糖醇同化能力的同时，还具有优异的耐酸性。因此，表明AuB-001菌株具有与公知的诸如基准菌株的长双歧杆菌种不同的性质。
本发明不限于上述的实施方式或实施例，在不脱离权利要求书中记载的发明的主旨的范围内的各种设计变更的方式也包含在技术范围内。
工业可用性
本发明的新型长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)以及包含其的组合物是作为新的益生菌有用的双歧杆菌，可有效地用于改善肠道环境等，在食品(包括补充剂、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等)和医疗领域中有广泛的作用。
保藏编号
保藏编号：NITE BP-03095、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株，原保藏日：2019年12月25日，保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8 122号室，邮编292-0818)
序列表自由文本
SEQ ID NO:1：用于16S rRNA基因区域的PCR扩增的正向引物
SEQ ID NO:2：用于16S rRNA基因区域的PCR扩增的反向引物
SEQ ID NO:3：新型长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株的16SrRNA基因区域的碱基序列
序列表
<110> AuB株式会社
<120> 新型双歧杆菌属细菌以及包含其的组合物
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<151> 2020-02-18
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1448
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001
<400> 3
gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gggatccacc gggctttgct 60
tggtggtgag agtggcgaac gggtgagtaa tgcgtgaccg acctgcccca tacaccggaa 120
tagctcctgg aaacgggtgg taatgccgga tgctccagtt gatcgcatgg tcttctggga 180
aagctttcgc ggtatgggat ggggtcgcgt cctatcagct tgacggcggg gtaacggccc 240
accgtggctt cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacattgg gactgaggta 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga 360
tgcagcgacg cagcgtgagg gatggaggcc ttcgggttgt aaacctcttt tatcggggag 420
caagcgagag tgagtttacc cgttgaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta gggtgcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagggct cgtaggcggt 540
tcgtcgcgtc cggtgtgaaa gtccatcgct taacggtgga tccgcgccgg gtacgggcgg 600
gcttgagtgc ggtaggggag actggaattc ccggtgtaac ggtggaatgt gtagatatcg 660
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cgtggggagc gaacaggatt agataccctg atagtccacg tcgtaaacgg tggatgctgg 780
atgtggggcc cgttccacgg gttccgtgtc ggagctaacg cgttaagcat cccgcctggg 840
gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaaga aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag 900
catgcggatt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg ggcttgacat gttcccgacg 960
gtcgtagaga tacggcttcc cttcggggcg ggttcacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag 1020
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cgcggtgaat gcgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt caagtcatga aagtgggcag 1380
cacccgaagc cggtggccta accccttgtg ggatggagcc gtctaaggtg aggctcgtga 1440
ttgggact 1448
PCT/RO/134表
Figure 000001

Claims (5)

1.长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)。
2.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)。
3.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)AuB-001菌株(NITE BP-03095)以及山梨糖醇。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物是食品或者饮品。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物是益生菌组合物。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW357191B (en) * 1996-06-04 1999-05-01 Food Industry Development Res Institute Bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method the invention relates to bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method
CN102510902A (zh) * 2010-03-26 2012-06-20 森永乳业株式会社 活菌数的测定方法及培养基
CN102604855A (zh) * 2011-12-15 2012-07-25 上海交通大学 一株长双歧杆菌sqs7-31及其制备方法和应用
CN103748213A (zh) * 2011-05-09 2014-04-23 益生菌股份公司 益生菌株和用于婴儿食品的包含该益生菌株的共生组合物
JP2019097544A (ja) * 2017-12-08 2019-06-24 森永乳業株式会社 新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物
CN110452829A (zh) * 2019-03-24 2019-11-15 广西大学 长双歧杆菌菌株及其应用
CN110494551A (zh) * 2017-01-31 2019-11-22 庆熙大学校产学协力团 新型乳酸菌及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3749359B2 (ja) * 1997-09-16 2006-02-22 雪印乳業株式会社 新規ビフィズス菌及びその利用
DK1449915T3 (da) * 2001-12-07 2006-08-14 Morinaga Milk Industry Co Ltd Bifidobacterium longum

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW357191B (en) * 1996-06-04 1999-05-01 Food Industry Development Res Institute Bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method the invention relates to bifidobacteria strains with acid, bile salt and oxygen tolerance and their culture method
CN102510902A (zh) * 2010-03-26 2012-06-20 森永乳业株式会社 活菌数的测定方法及培养基
CN103748213A (zh) * 2011-05-09 2014-04-23 益生菌股份公司 益生菌株和用于婴儿食品的包含该益生菌株的共生组合物
CN102604855A (zh) * 2011-12-15 2012-07-25 上海交通大学 一株长双歧杆菌sqs7-31及其制备方法和应用
CN110494551A (zh) * 2017-01-31 2019-11-22 庆熙大学校产学协力团 新型乳酸菌及其用途
JP2019097544A (ja) * 2017-12-08 2019-06-24 森永乳業株式会社 新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物
CN110452829A (zh) * 2019-03-24 2019-11-15 广西大学 长双歧杆菌菌株及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARCO TOSCANO: "Effect of Lactobacillus rhamnosus HN001 and Bifidobacterium longum BB536 on the healthy gut microbiota composition at phyla and species level: A preliminary study", WORLD J GASTROENTEROL, pages 2696 - 2704 *
刘松玲;蒋菁莉;刘爱萍;郭慧媛;冷小京;任发政;: "长双歧杆菌BBMN68冷冻保护剂筛选与优化", 农业机械学报, no. 04 *
王涛;孟祥晨;: "一株来源于人体的双歧杆菌的分离与鉴定", 东北农业大学学报, no. 07 *

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