CN112694985B - 发酵乳杆菌tci275、其组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种发酵乳杆菌TCI275(Lactobacillus fermentum TCI275)，其具有分解乳糖的功能。此外该发酵乳杆菌TCI275及其代谢产物可进一步提供做为食品组合物或医药组合物。其中发酵乳杆菌TCI275寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)且保藏编号为DSM33289。
Description
技术领域
本发明关于一种发酵乳杆菌，特别是关于一种发酵乳杆菌TCI275(Lactobacillus fermentum TCI275)，以及发酵乳杆菌TCI275及其代谢产物的用途。
背景技术
益生菌(Probiotics)一般认为是指食入后对宿主(或称个体，如动物或人类)有正面效益的食入性微生物。其命名源于希腊语「for life」(对生命有益)，又称为「原生保健性菌种」；并且，益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。
一般而言，「乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)」是指能利用碳水化合物进行发酵生产多量乳酸之细菌总称，为一相当庞杂的菌群。在诸多乳酸菌的菌种中，部分乳酸菌菌种的菌株经研究发现其对于个体健康有益，故此些菌株被视为益生菌。换言之，益生菌大部分是乳酸菌，但乳酸菌中只有少数经研究证明对个体健康有益的菌株能被称为益生菌。
举例来说，常见的可作为益生菌的乳酸菌的菌种包括肠球菌属 (Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双岐杆菌属 (Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)等，而可作为益生菌的酵母菌的菌种包括酵母菌属(Saccharomyces)。
乳杆菌属是一群具有发酵能力、兼性厌氧、不会产生孢子的革兰氏阳性杆菌。乳杆菌因能够将碳水化合物发酵成乳酸而得名，可用于制造液态优酪乳、固态奶酪等各种发酵食品。
发明内容
本发明之一目的，在于提供一种发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)TCI275，其系寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)且保藏编号为DSM33289的发酵乳杆菌。
在一些实施例中，发酵乳杆菌TCI275包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
在一些实施例中，发酵乳杆菌TCI275筛选自人类母乳。
在一些实施例中，发酵乳杆菌具有生成羟脯胺酸之功能。
在一些实施例中，发酵乳杆菌具有耐胃酸及耐胆盐的能力。
在一些实施例中，发酵乳杆菌具有分解乳糖的能力。
本发明之另一目的，在于提供一种组合物，包含一发酵乳杆菌 (Lactobacillusfermentum)TCI275及/或其代谢产物，发酵乳杆菌系寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)且保藏编号为DSM33289的发酵乳杆菌。
在一些实施例中，组合物为食品组合物。
在一些实施例中，组合物含有5X109个菌数的发酵乳杆菌TCI275。
根据一些实施例，本发明提供一种将组合物用于制备改善乳糖不耐 (lactoseintolerance)的组合物的用途。
在一些实施例中，改善乳糖不耐为包括以下情况的任一者：改善大便稀淌、减少排气频率、减少胀气、减少腹痛。
根据一些实施例，本发明提供一种将组合物用于制备改善便秘的组合物的用途。
在一些实施例中，改善便秘为提升排便频率。
根据一些实施例，本发明提供一种将组合物用于制备提升一个体的肠胃中的柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)菌种比例的组合物的用途。
在一些实施例中，个体对为对乳糖不耐的个体。
根据一些实施例，本发明提供一种将组合物用于制备提升一个体的肠胃中的普雷沃氏菌属(Prevotella)菌种比例的组合物的用途。
在一些实施例中，个体为对具有便秘情况的个体。
本发明之详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明之特征。
附图说明
图1为发酵乳杆菌TCI275抗胃液及肠液的测试结果数据图。
图2为发酵乳杆菌TCI275提升柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)菌种比例的结果数据图。
图3为发酵乳杆菌TCI275提升普雷沃氏菌属(Prevotella)菌种比例的结果数据图。
生物材料的保藏
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)TCI275，于2019年9月19日寄存于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，地址：德国布伦瑞克市因霍芬大街 7B，保藏编号为DSM33289。
具体实施方式
为了使本领域具有通常知识者能了解本发明的特点，以下就说明书及申请专利范围中提及术语及用语进行一般性之说明及定义。除非另有说明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书之定义为准。
本案使用Excel软体进行统计分析。数据以平均值±标准差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)进行分析。
本文中所使用之浓度符号「wt％」通常是指重量百分浓度，而浓度符号「vol％」通常是指体积百分浓度。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。
于本说明书中(尤其是在后述专利申请范围中)所使用之“个体”是指人类或非人的哺乳动物，较佳为人类。
于本说明书中(尤其是在后述专利申请范围中)所使用之“分解乳糖”是指将乳糖分解为葡萄糖及半乳糖或是指具有乳糖酶的能力。
本案发明人自人体母乳中筛选出一新颖菌株，经16S核糖体核糖核酸 (16S rRNA)序列分析，依亲缘关系鉴定为Lactobacillus fermentum(中文名称为发酵乳杆菌)，且经命名为Lactobacillus fermentum TCI275(以下称为发酵乳杆菌TCI275)，其系寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ) 且保藏编号为DSM33289。该发酵乳杆菌TCI275系具有如SEQ IDNO:1所示之16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。
根据本发明，所采用之发酵乳杆菌TCI275之代谢产物可以是透过在适于发酵乳杆菌TCI275生长的环境下进行培养所产生者。例如：先以适当之培养液对发酵乳杆菌TCI275进行培养，其后，视需要地去除前述培养液中之菌体等固体物，以获得含有代谢产物之液体。或例如，先以适当之培养液对发酵乳杆菌TCI275进行培养，其后，以离心等方法使菌体沉降于底部，再直接吸取上清液所获得含有代谢产物之液体。
可选用任意合宜之培养液以进行发酵乳杆菌TCI275之培养，以提供所欲之代谢产物，只要该培养液可提供发酵乳杆菌TCI275生长、代谢所需养分(如酵母菌萃取物、蛋白质及葡萄糖)与条件(如酸碱值)即可。此外，发酵乳杆菌TCI275之培养时间亦无特殊限制，只要足以使发酵乳杆菌 TCI275完成至少一次代谢循环即可。举例言之，于本发明一具体实施态样中，系以MRS培养液对发酵乳杆菌TCI275进行培养，历时18小时，使菌株进行代谢作用并产生代谢产物。
于本发明中，系可直接使用经历发酵乳杆菌TCI275之代谢循环的含发酵乳杆菌TCI275与代谢产物的培养液，或使用经移除发酵乳杆菌TCI275 等固体物之含代谢产物的液体。可采用任何合宜之操作以移除固体物，只要对培养后所产生的代谢产物之所欲效益没有不利的影响即可。一般而言，系采用物理手段以移除固体物，该物理手段包括，例如：离心分离、滤膜过滤、沉淀倾析等操作。视需要地，可重复或合并进行前述物理操作，以尽可能去除培养液中的菌体等固体物。
根据本发明所提供之食品组合物系可以为健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、或特殊营养食品，且可制成例如乳制品、肉类加工品、面包类、面食类、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为限。
根据本发明所提供之健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、及特殊营养食品系可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率食用，端视投予个体之年龄、体重、及健康状况而异。亦可针对特定族群之需要，调整据本发明所提供之健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、及特殊营养食品中的发酵乳杆菌TCI275及/或其代谢产物的含量，例如，调整至每日应服用的量。
针对根据本发明所提供之健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品及/或特殊营养食品，可于其外包装上标示建议使用量、特定族群(例如高血脂患者、孕妇等)的使用标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项等，以利使用者在无医师、药师或相关执事人员的指导下自行服用而无安全虞虑。于根据本发明所提供之食品组合物中，有关该发酵乳杆菌 TCI275及/或其代谢产物之态样，系如上述之说明。
视需要地，可于根据本发明所提供之食品组合物、或饲料组合物中另外含有合宜用量之添加剂，例如可提高该医药组合物、食品组合物、或饲料组合物于服用时的口适感及视觉感受之调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该医药组合物、食品组合物、或饲料组合物的稳定性及储存性之缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。
兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明之保护范围。本发明保护范围系如后附申请专利范围所示。
例1：发酵乳杆菌TCI275之筛选与鉴定
(1-1)筛选
将各种取样样品(人类母乳、优酪乳、印度天贝(Tempeh)、牛粪) 分别与MRS培养液(MRS broth)以体积比1：100的比例混合，并置于 37℃下进行厌氧培养(氧气浓度介于10％至1％，较佳为低于5％)，历时18小时。其后，将前述培养液涂布于MRS固态培养基(MRSagar)上，并置于37℃下进行厌氧培养，以生成不同的菌落。接着，为确保菌株的单一性，使用无菌接种环挑选一菌落，于固态培养基上进行分区划线，再置于 37℃之厌氧培养箱中培养直到单一菌落(single colony)出现。
(1-2)鉴定
取(1-1)人类母乳取样样品所分离出之单一菌落的菌株后，进行基因族谱分析(phylogenetic analysis)，确认该菌株具有如SEQ ID NO:1所示之 16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)线上资料库进行比对，将SEQ ID NO:1所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表一 所示。因此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌TCI275(后文以 TCI275表示)。在此，将此发酵乳杆菌TCI275寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，其保藏编号为DSM33289。
取(1-1)优酪乳取样样品所分离出之一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认该菌株具有如SEQ ID NO:2所示之16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库进行比对，将SEQ ID NO:2所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16S rDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表一 所示。在此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌L206(后文以L206 表示)。
其中，取(1-1)优酪乳取样样品所分离出之再另一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认该菌株具有如SEQ ID NO:3所示之16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库进行比对，将SEQ ID NO:3所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表一 所示。在此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌L235(后文以L235表示)。
其中，取(1-1)优酪乳取样样品所分离出之再另一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认该菌株具有如SEQ ID NO:4所示之16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库进行比对，将SEQ ID NO:4所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表一 所示。因此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌L270(后文以L270表示)。
其中，取(1-1)优酪乳取样样品所分离出之再另一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认该菌株具有如SEQ ID NO:5所示之16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库进行比对，将SEQ ID NO:5所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表一 所示。因此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌L786(后文以L786表示)。
其中，取(1-1)印度天贝取样样品所分离出之一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认该菌株具有如SEQ ID NO:6所示之16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库进行比对，将SEQ ID NO: 6所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA 序列的相似性如表一 所示。因此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌L849 (后文以L849表示)。
其中，取(1-1)牛粪取样样品所分离出之一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认该菌株具有如SEQ ID NO:7所示之16S核糖体核糖核酸 (16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库进行比对，将SEQ ID NO:7所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表一 所示。因此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌L1265(后文以L1275表示)。
其中，取(1-1)牛粪取样样品所分离出之另一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认该菌株具有如SEQ ID NO:8所示之16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库进行比对，将SEQ ID NO:8 所示的基因序列分别与其他发酵乳杆菌亚种之16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他发酵乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此，将此分离菌株命名为发酵乳杆菌L1275(后文以L1275表示)。
表一
综合以上，本发明自取样样品(人类母乳、优酪乳、印度天贝 (Tempeh)、牛粪)共筛选出八种发酵乳杆菌，分别命名为TCI275、 L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275。
(1-3)保存
使用液态培养的方式将(1-1)所获得之具单一性之八种发酵乳杆菌菌株培养于MRS培养液(BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth，型号DF0881- 17-5)中，以提供菌液，接着于菌液中添加25％之甘油，将所得混合液移至冷冻保存管中后，置于-80℃保存。
例2：发酵乳杆菌TCI275耐胃酸胆盐试验
于此，将发酵乳杆菌TCI275以缓冲液、人工胃液(pH 3)及人工肠液 (pH 7)进行测试，以确认发酵乳杆菌TCI275于生物体肠胃消化道中的酸碱耐受性。其中，缓冲液为0.2莫尔浓度(M)氯化钾(KCL,品牌Sigma- Aldrich)且pH值为7。人工胃液为0.2M氯化钾且pH值为3。人工肠液为 0.2M氯化钾及0.3重量％的牛胆盐(品牌DifcoTM Oxgall)且pH值为7。
进行一活化程序将发酵乳杆菌TCI275活化。首先，将发酵乳杆菌 TCI275冻菌以10体积％的菌量培养于液态乳杆菌MRS培养基(BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth)中，并于37下培养16小时，以活化发酵乳杆菌TCI275。
接着，将活化后的发酵乳杆菌TCI275菌液取1体积％的浓度接种至20 毫升的待测溶液中，然后以转速50rpm于37℃下震荡培养3小时。其中，三个组别的待测溶液分别为人工胃液(实验组)、人工肠液(实验组)及氯化钾缓冲液(控制组)。从培养后的菌液取100微升(μL)的菌液涂盘，并于28℃下静置培养3天，并于3天后以肉眼计数各组别的活菌数(计算固态乳杆菌MRS培养基上的菌落数)。
请参阅图1。图式中发酵乳杆菌TCI275的存活率为计数后的活菌数，并以log CFU/mL表示。其中，log CFU/mL代表每毫升菌液含有的菌落形成单位(CFU，colony-formingunit)并以对数(log10)表示。由图1可知，控制组的发酵乳杆菌TCI275的存活菌数为9.7logCFU/mL、人工胃液实验组的发酵乳杆菌TCI275的存活菌数为9.1log CFU/mL，及人工肠液实验组的发酵乳杆菌TCI275的存活菌数为9.2log CFU/mL。由此可知，人工胃液实验组的活菌数为控制组的93.8％，且人工肠液实验组的活菌数为控制组的 94.8％。
基于此实验数据，得知发酵乳杆菌TCI275可耐pH值为3的模拟胃酸环境并可耐胆盐模拟环境(人工肠液)，因此，得知发酵乳杆菌TCI275具有耐胃酸胆盐之功能，代表发酵乳杆菌TCI275可通过宿主肠胃道的酸碱值压力，定殖于宿主肠道中。
例3：发酵乳杆菌TCI275及其他发酵乳杆菌的乳糖分解能力比较
在此实施例中，将TCI275及其他发酵乳杆菌培养于含有乳糖的培养基中，以测试发酵乳杆菌分解乳糖的能力。
首先，进行一活化程序将发酵乳杆菌TCI275及其他发酵乳杆菌 (L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275)活化。首先，将发酵乳杆菌TCI275及其他发酵乳杆菌冻菌以10体积％的菌量培养于液态乳杆菌 MRS培养基(BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth)中，并于37度下培养16 小时，以活化发酵乳杆菌TCI275及其他发酵乳杆菌。
接着，将活化后的发酵乳杆菌TCI275及其他发酵乳杆菌的菌液取1体积％的浓度接种至含有5g/L(等于0.5％)浓度乳糖的20毫升的液态乳杆菌 MRS培养基(BD DifcoTMLactobacilli MRS Broth)中，然后于37℃下培养 16小时，并进行取样程序，取样程序包括：取1ml菌液(共八组)，以离心(10000至20000rpm，较佳为10000至15000rpm，更佳为13000rpm)1 分钟后取上清液(不含菌体，即为发酵乳杆菌TCI275的代谢产物)，以乳糖比色法测定试剂套组(厂牌：BioVision，检测套组名称
Lactose Colorimetric/Fluorometric Assay Kit，产品编号K624-100)进行乳糖含量检测。
检测原理是先依套组内试剂配置不同浓度的半乳糖(galactose)，以绘制标准曲线，接着将欲测的每种菌液样品(发酵乳杆菌TCI275及其他发酵乳杆菌(L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275))分为两孔 (96孔盘)。由于乳糖是由半乳糖及葡萄糖所组成，因此乳糖的含量可透过将某样品中的总半乳糖减去游离半乳糖(free galactose)所求得，因此在上述两孔中的其中一孔添加适量乳糖酶(Lactase)使欲测菌液中的所有乳糖转换为游离半乳糖(free galactose)(因此可求得总半乳糖)，另一孔不添加乳糖酶(因此可求得游离半乳糖)，透过检测570nm的吸光值以及公式：乳糖＝总半乳糖-游离半乳糖，求得菌液中的乳糖浓度，若乳糖浓度相较于原乳糖浓度(5g/L(等于0.5％))减少一半，则换算该菌的乳糖消耗率 (百分比)为50％。
详细的检测方式及样品配置方式可依照检测套组所附的使用说明书 (Datasheet)所进行，详细步骤可见网址： https://www.biovision.com/documentation/datasheets/K617.pdf，本发明在此不再赘述。
以下表二为发酵乳杆菌的乳糖消耗率(百分比)，数值越高代表其分解乳糖的能力越佳。
表二
| 测试菌种 | 乳糖消耗率(百分比) |
| 发酵乳杆菌TCI275 | 59.21 |
| 发酵乳杆菌L206 | 1.8 |
| 发酵乳杆菌L235 | 0 |
| 发酵乳杆菌L270 | 0 |
| 发酵乳杆菌L786 | 0 |
| 发酵乳杆菌L849 | 0 |
| 发酵乳杆菌L1265 | 0 |
| 发酵乳杆菌L1275 | 0 |
如表二所示，发酵乳杆菌TCI275的乳糖消耗率为59.21％，代表将发酵乳杆菌TCI275培养于含有5g/L(重量浓度，等于0.5％)浓度乳糖的培养基中16小时，培养基中乳糖浓度降为2.04g/L(等于0.204％)，表示有59.21％的乳糖经发酵乳杆菌TCI275所分解；同理可知，发酵乳杆菌L206 能分解培养基中1.8％的乳糖，其他发酵乳杆菌(L235、L270、L786、L849、L1265、L1275)的乳糖消耗率为0％，代表是不具有分解乳糖的能力。
例4：发酵乳杆菌TCI275对乳糖不耐症状及调节菌相的人体实验
乳糖不耐症(Lactose intolerance)就是身体无法完全消化乳糖，因此在食用乳制品后，乳糖会进入大肠成为微生物的食物，接着乳糖被发酵后产生气体及酸，使个体产生会有腹泻(大便稀淌)、排气、胀气和腹痛、绞痛感的情况。这种情况也称作乳糖吸收不良，虽然对人体没有大碍，但这些症状常令人不舒服。
为进一步确认发酵乳杆菌TCI275对于乳糖不耐症状及肠道菌相的影响。以每颗胶囊为50毫克TCI275菌粉，含有5X109cells(即5X109 cells/cap，等于5X109个菌数)的TCI275的活菌，提供给4位受试者(乳糖不耐症者，即喝牛奶后会出现腹胀、排气、腹痛或腹泻等症状的受试者)，每人在每日睡前服用一颗，并持续2周，以问卷方式分析受试者肠胃症状等情况，以及分析受试者的肠胃道菌相变化，详细分析方法如下所述。
(4-1)发酵乳杆菌TCI275对乳糖不耐情况的问卷调查(针对乳糖不耐症的受试者)
首先对上述受试者于第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)、第1周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后)及第2周 (服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后)进行肠胃状态的问卷调查。详细来说，在每周测试前，受试者服用牛奶(牛奶体积依个人食用量做为标准，但每次测试前服用的体积均相同)，自身观察服用牛奶后6小时内的乳糖不耐症状后，再填写问卷，其调查及计分方式如下表三。其中，第一部分的各分数代表各种症状的严重程度，0分为无困扰，1分为轻微，2分为有些严重，3分为严重。
表三
| 第一部分：情况/分数 | 0 | 1 | 2 | 3 |
| 1.大便稀淌(拉肚子、腹泻) | ||||
| 2.排气频率 | ||||
| 3.胀气 | ||||
| 4.腹痛、绞痛感 |
第一部分之问卷结果如下表四所示
表四
由以上表四的问卷结果可看出，4位受试者在第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)对大便稀淌的自身评估为2.0分(有些严重)，在服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊1周后，受试者对于大便稀淌的自身评估降为1.25分(约为轻微)，服用2周后，对于大便稀淌的自身评估也维持1.25分(约为轻微)，代表持续服用发酵乳杆菌TCI275 的活菌后一周即可改善大便稀淌的情况，且持续服用能维持改善大便稀淌的情况。
此外，4位受试者在第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)对胀气的自身评估为2.0分(有些严重)，在服用上述的发酵乳杆菌 TCI275的活菌胶囊1周后，受试者对于胀气的自身评估降为1.0分(轻微)，服用2周后，对于胀气的自身评估也维持1.0分(轻微)，代表持续服用发酵乳杆菌TCI275的活菌后一周即可改善胀气的情况，且持续服用能维持改善胀气的情况。
此外，4位受试者在第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)对排气频率的自身评估为1.75分(接近有些严重)，在服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊1周后，受试者对于排气频率的自身评估约略降为1.5分(介于轻微及有些严重之间的程度)，服用2周后，对于排气频率的自身评估降为维持1.25分(约轻微)，代表持续服用发酵乳杆菌TCI275的活菌后二周可改善排气频率过多的情况。
此外，至于腹痛、绞痛感的问卷结果，由于4位受试者在第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)对腹痛、绞痛感的自身评估仅有为1.25分(约为轻微)，因此服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后的改善情况意义不大，本文不做讨论。
综合以上，对乳糖不耐症者，即喝牛奶后会出现腹胀、排气、腹痛或腹泻等症状的受试者来说，服用发酵乳杆菌TCI275的活菌后，对于一般常见的乳糖不耐症症状皆有明显改善，特别是针对大便稀淌、胀气及排气频率达到改善效果。
(4-2)发酵乳杆菌TCI275调节菌相的人体实验(针对乳糖不耐症的受试者)
在上述受试者于第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)及第2周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后)进行受试者肠道菌相检测。
检测方式可以是采集受试者粪便检体后，对粪便进行DNA萃取，并进行16S核糖体基因(16S ribosomal gene)的定量即时聚合酶链反应(quantitative real-timepolymerase chain reaction,qRT-PCR)，透过以知菌的引子序列来检测常见肠内菌的菌数比例。检测方式也可以将粪便进行DNA萃取后，对检体进行微生物体16S扩增子定序(16SAmplicon Sequencing)，其中特别是针对16S DNA其中的V3-V4区域进行放大，接着以次世代定序(Next Generation Sequencing(NGS))的方式，并进行后续的定序分析。
本实施例是以次世代定序方式进行，由图尔思生物科技股份有限公司进行微生物体16S扩增子定序(16S Amplicon Sequencing)，将粪便样本行 DNA萃取后，使用由Illumina(Illumina,San Diego,USA)开发之16S宏基因组测序文库制备方案进行16S rRNA基因扩增子测序。简言之，将粪便萃取的DNA采用靶向16S rRNA基因之V3/V4可变区之引子扩增：16S扩增子 PCR正向引子(V3区域) TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWG CAG(SEQUENCE ID NO：9)；16S扩增子PCR反向引子(V4区域) GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTA TCTAATCC(SEQUENCE ID NO：10)进行PCR扩增16S rRNA基因的可变区V3-V4(rRNA基因中的第341至805位)(参考Herlemann等人， 2000年；其中W＝A/T、H＝A/C/T、V＝G/C/A、N＝G/A/T/C)。完成扩增DNA 之序列及建库，依据MiSeq ReagentKit v3(Illumina,Wilmington,DE,USA) 建双端库(pair-end library)，并于Illumina系统进行高通量定序。定序完成后得到的原始数据(Raw Data)，会经由成对序列拼接(RawTags)、过滤得到Clean Tags，再进行去除嵌合体得到可用于后续分析的有效数据(Effective Tags)。接着基于有效数据进行相似度(大于97％)OTUs (OperationalTaxonomic Units)聚类和物种分类分析。根据OTUs聚类结果对代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况，分析检体内的微生物种类及比例。
参照图2，相服用前(第0周)，持续2周服用发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后可使柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)菌种比例(相对丰富度)增加约19％。
柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)是一种能够促使短链脂肪酸(丁酸)生成的肠内益生菌，丁酸的生成可促进肠道健康。可参见例如：微生态制剂调节便秘,腹泻人群肠道菌群结构与产短链脂肪酸关键菌属的相关性，食品科学9.5(2018):155-165，该文献之全文并于此处以供参考。
透过受试者粪便检体之定序检测，分析TCI275对于人体菌相调节的能力，特别是对于具有乳糖不耐症症状的受试者的肠胃道菌相的能力，由以上结果可知，于服用TCI275胶囊后，受试者肠胃道内的柔嫩梭菌属 (Faecalibacterium)明显增加，代表TCI275具有促进肠内益生菌比例以及促进肠胃道健康的功效。
例5：发酵乳杆菌TCI275对便秘相关症状及调节菌相的人体实验
为进一步确认发酵乳杆菌TCI275对于便秘及肠道菌相的影响。以每颗胶囊为50毫克TCI275菌粉，共含有5X109cells(即5X109cells/cap)的 TCI275的活菌，提供给4位受试者(有便秘情况、排便排不干净等症状的受试者)，每人每日睡前服用一颗，并持续2周，以问卷方式分析受试者肠胃状况、排便频率等情况，以及分析受试者的肠胃道菌相变化，详细分析方法如下所述。
(5-1)发酵乳杆菌TCI275对肠胃状况及排便频率的问卷调查(针对有便秘情况、排便排不干净等症状的受试者)
首先对上述受试者于第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)、第1周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后)及第2周 (服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后)进行肠胃状态及排便频率的问卷调查。详细来说，其调查及计分方式如下表五。其中，第一部分的各分数代表各种症状的严重程度，0分为无困扰，1分为轻微，2分为有些严重，3分为严重，4分为非常严重；第二部分为调查排便频率，调查方式如下表六，其中，四天一次代表受试者平均四天排便一次，为便秘程度最严重；一天两次以上代表受试者平均一天排便两次，为轻微便秘程度。
表五
| 第一部分：症状/分数 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 1.胀气 | |||||
| 2.腹鸣、腹部蠕动感 | |||||
| 3.排气频率 |
表六
第一部分之问卷结果如下表七所示
表七
由以上表七的问卷结果可看出，4位受试者在第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)对胀气的自身评估为3.25分(严重程度)，在服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊1周后，受试者对于胀气的自身评估降为1.25分(约为轻微)，服用2周后，对于胀气的自身评估也维持1.0分(轻微)，代表持续服用发酵乳杆菌TCI275的活菌后一周即可明显改善胀气的情况，且持续服用能维持改善胀气的情况。
此外，4位受试者在第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)对腹鸣、腹部蠕动感的自身评估为2.0分(有些严重)，在服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊1周后，受试者对于腹鸣、腹部蠕动感的自身评估降为1.25分(轻微)，服用2周后，对于腹鸣、腹部蠕动感的自身评估再降为1.0分(轻微)，代表持续服用发酵乳杆菌TCI275的活菌后一周即可改善腹鸣、腹部蠕动感的情况，且持续服用能维持改善腹鸣、腹部蠕动感的情况。
此外，4位受试者在第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)对排气频率的自身评估为2.25分(有些严重的程度)，在服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊1周后，受试者对于排气频率的自身评估约略降为1.75分(介于轻微及有些严重之间的程度)，服用2周后，对于排气频率的自身评估降为维持1.5分(约轻微)，代表持续服用发酵乳杆菌 TCI275的活菌后约二周可改善排气频率过多的情况。
第二部分之问卷结果如下表八所示
表八
由上述表八可知，对于有便秘情况的受试者在服用发酵乳杆菌TCI275 之前有50％的受试者的排便频率属于两天或四天一次排便，而服用发酵乳杆菌TCI275之后一周，有75％的受试者的排便频率为一天一次排便，而服用发酵乳杆菌TCI275之后两周，已没有受试者的排便频率为两天或四天一次排便，100％的受试者的排便频率为一天一次或一天两次以上。即各受试者平均而言，对于排便状态有明显的改善，整体提升了排便频率，改善了便秘情况。
综合以上，对有便秘情况、排便排不干净等症状的受试者来说，服用发酵乳杆菌TCI275的活菌后，对于一般常见的肠胃不适情况皆有明显改善，特别是针对胀气及腹鸣、腹部蠕动感达到改善效果，此外，对于排便状态有明显的改善，整体提升了排便频率，改善了便秘情况。
(5-2)发酵乳杆菌TCI275调节菌相的人体实验(针对有便秘情况、排便排不干净等症状的受试者)
在上述受试者于第0周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊前)及第2周(服用上述的发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后)进行受试者肠道菌相检测。
本实施例是以次世代定序方式进行，采取的步骤及方式与例(4-2)相同，本段落不再赘述。
参照图3，相服用前(第0周)，持续2周服用发酵乳杆菌TCI275的活菌胶囊后可使普雷沃氏菌属(Prevotella)菌种比例(相对丰富度)增加约42％。
普雷沃氏菌属(Prevotella)具有植物聚醣降解能力，饮食中富含蔬果或是素食者肠道中比例较高；由于此菌可利用纤维代谢出较多短链脂肪酸 (Short-chain fattyacid，SCFA)，因此研究显示与健康人群相比，便秘人群缺乏普雷沃氏菌属肠道菌。可参见例如：European Journal of Clinical Microbiology&Infectious Diseases 37.3(2018):555-563，该文献之全文并于此处以供参考。
透过受试者粪便检体之定序检测，分析TCI275对于人体菌相调节的能力，特别是对于具有便秘情况的受试者的肠胃道菌相调节的能力，由以上结果可知，于服用TCI275胶囊后，受试者肠胃道内的普雷沃氏菌属明显增加，代表TCI275具有促进肠胃道健康的潜力。
于此，透过例2可知，发酵乳杆菌TCI275可适应于人体肠胃环境。透过例3可知，发酵乳杆菌TCI275有分解乳糖的能力，且能力明显优于其他发酵乳杆菌(L206、L235、L270、L786、L849、L1265、L1275)，明显具有与同种习知菌株不同之微生物学性质。透过例4可知，发酵乳杆菌 TCI275能改善乳糖不耐相关症状(特别是针对大便稀淌、胀气及排气频率)以及提升柔嫩梭菌属的能力，特别是在乳糖不耐症的受试者中有此效果。透过例5可知，发酵乳杆菌TCI275能改善经常便秘便秘的受试者的肠胃相关不适症状(特别是针对胀气及腹鸣、腹部蠕动)以及提升普雷沃氏菌属的能力。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
【序列表】
<110> 大江生医股份有限公司
<120> 发酵乳杆菌TCI275、其组合物及其用途
<130> 2116--TW-UT001
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1190
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 1
gccccgggcg ggtgctatac atgcagtcga acgcgttggc ccaattgatt gatggtgctt 60
gcacctgatt gattttggtc gccaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc 120
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Claims (16)
1.一种发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)TCI275，其系寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)且保藏编号为DSM33289的发酵乳杆菌。
2.如权利要求1所述的发酵乳杆菌TCI275，其包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
3.如权利要求1所述的发酵乳杆菌TCI275，其筛选自人类母乳。
4.如权利要求1所述的发酵乳杆菌TCI275，其具有耐胃酸及耐胆盐的能力。
5.如权利要求1所述的发酵乳杆菌TCI275，其具有分解乳糖的能力。
6.一种组合物，其包含一发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)TCI275，所述发酵乳杆菌系寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)且保藏编号为DSM33289的发酵乳杆菌。
7.如权利要求6所述的组合物，其为食品组合物。
8.如权利要求6所述的组合物，其中该组合物含有5× 109个菌数的发酵乳杆菌TCI275。
9.一种如权利要求6所述的组合物的用途，其系用于制备改善乳糖不耐(lactoseintolerance)的组合物。
10.如权利要求9所述的用途，其中该改善乳糖不耐为包括以下情况的任一者：改善大便稀淌、减少排气频率、减少胀气、减少腹痛。
11.一种如权利要求6所述的组合物的用途，其系用于制备改善便秘的组合物。
12.如权利要求11所述的用途，其中该改善便秘为提升排便频率。
13.一种如权利要求6所述的组合物的用途，其系用于制备提升个体的肠胃中的柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)菌种比例的组合物。
14.如权利要求13所述的用途，其中该个体为对乳糖不耐的个体。
15.一种如权利要求6所述的组合物的用途，其系用于制备提升个体的肠胃中的普雷沃氏菌属(Prevotella)菌种比例的组合物。
16.如权利要求15所述的用途，其中该个体为具有便秘情况的个体。
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