CN109943510A - 一株具有益生特性的乳酸芽孢杆菌du-106及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有益生特性的乳酸芽孢杆菌DU‑106及其应用。于2019年3月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60621。本发明的乳酸芽孢杆菌能耐受消化道内的环境，耐受胃酸和胆盐，抗逆性强，能大量的以活菌形态定植于肠道中，且耐高温、耐干燥，能很好的添加到食品中进行加工和应用。本发明的乳酸芽孢杆菌还具有改善动物肠道功能、辅助降血脂、增强免疫力和辅助降血糖等益生应用。

Description

一株具有益生特性的乳酸芽孢杆菌DU-106及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种具有益生特性乳酸芽孢杆菌及其应用。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，也是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌具有可以提高人体对蛋白质、乳糖和钙等营养物质的消化吸收，可以产生多种机体所需的维生素，还可抑制肠道内腐败菌、致病菌的繁殖，降低血氨和血中胆固醇的含量，还可以提高机体免疫激活的作用，维持肠道菌群平衡。因此乳酸菌在发酵食品、饮料、饲料和医药等多个领域中获得广泛的应用。目前研究和应用表明，凡是能活体进入肠道的乳酸菌比死菌的作用大的多。但是，一般的乳酸菌如保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、嗜酸乳杆菌等，由于其不产芽孢，因而其耐热性、保存性都较差，对营养要求较高，对不良环境的抵抗力差，特别是抗干燥、抗高温、抗胃酸和抗胆汁的能力较弱，因此能活着进入肠道的乳酸菌的数量不多，大大限制了乳酸菌在食品中加工和运输的应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有乳酸菌耐热性低、保存性差、进入机体中活菌数量较少等缺陷，提供一株具备产乳酸、抗干燥、抗高温、抗胃酸和抗胆汁能力强的乳酸芽孢杆菌DU-106；

本发明的第二个目的是所述的乳酸芽孢杆菌DU-106具有改善动物肠道功能、辅助降血脂、增强免疫力和辅助降血糖等益生应用；

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的技术方案如下:

一种乳酸芽孢杆菌，为乳酸芽孢杆菌DU-106，于2019年3月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC60621。分类学名称为Bacillus lactics。

所述乳酸芽孢杆菌DU-106分离于内蒙古牧民传统自然发酵酸奶。菌落形态为圆形平台状，边缘整齐、不透明、有光泽、无色素、质地软。具有如下菌学特性：耐胃液和胆盐；耐高温和耐干燥。乳酸芽孢杆菌生长温度为10℃-45℃，生长初始pH值3.5-9.0。可用于改善动物肠道功能、辅助降血脂、增强免疫力和辅助降血糖。使用时乳酸芽孢杆菌的含量≥10¹⁰CFU/g。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的乳酸芽孢杆菌能耐受消化道内的环境，耐受胃酸和胆盐，抗逆性强，能大量的以活菌形态定植于肠道中，且耐高温、耐干燥，能很好的添加到食品中进行加工和应用。本发明的乳酸芽孢杆菌还具有改善动物肠道功能、辅助降血脂、增强免疫力和辅助降血糖等益生应用。

附图说明

图1为菌株DU-106发酵液高效液相色谱图；

图2为菌株DU-106在液体培养基37℃静置培养24h，显微镜下放大400倍观察图；

图3为菌株DU-106的菌落形态；

图4为菌株DU-106的16S rRNA的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。

实施例1样品采集、菌株分离及筛选

1.1分离及筛选培养基

乳酸细菌(MRS)液体培养基:蛋白栋1％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾2.0％，柠檬酸氢二铵0.2％，乙酸钠0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，半胱氨酸0.05％，碳酸钙0.05％，吐温80 1.0ml，调pH 5.4-6.40，115℃灭菌20min。

乳酸菌增殖培养基(YPG培养基)(g/L):葡萄糖5.0g，蛋白栋5.0g，酵母提取物1.0g，氯化钙0.1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调pH6.5，115℃灭菌20min。

固体培养基:在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂。

1.2样品采集

分离样品采集于2001年内蒙古牧民传统自然发酵酸奶。

1.3菌株的分离及筛选

本发明一株具有益生特性的乳酸芽孢杆菌DU-106(GDMCC 60621)的分离方法，采用梯度稀释法从内蒙古传统发酵酸奶样品中分离。包括以下步骤：吸取酸奶样品10mL，放入盛有90mL无菌生理盐水锥形瓶中，采用稀释平板法将上述样品涂布于MRS培养基中，37℃下静置培养:再将富集好的样品转入乳酸菌增殖培养基平板中，37℃恒温培养48h，待菌落长出，选取其中1株溶钙圈大的单菌落，反复划线分离至获得纯菌株，以‘DU’代表芽孢杆菌，将菌株编号为DU-l01,DU-102,DU-103...DU-106。将筛选得到的菌株按1％的接种量接入到200mL MRS肉汤中发酵48小时后，利用高效液相色谱测定发酵液成分，实验结果得到菌株DU-106发酵液成分中含有L型乳酸(见图1)，含量为13.04g/L,为所有菌株中含量最多，判定菌株DU-106为乳酸产生菌。

实施例2筛选菌株的鉴定

2.1形态鉴定

图2为DU-106菌株静置培养24h后的形态，DU-106菌株为兼性厌氧菌，静置培养长势良好。

DU-106的菌落形态如图3示:菌落直径2.0-2.5mm，溶钙圈现象明显，平台状，边缘整齐，不透明，有光泽，无色素，质地软。在MRS液体培养基上呈均匀浑浊有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开，不形成菌膜和菌环。培养初期镜下观察细胞形态为杆状，芽孢端生，包囊不膨大，革兰氏染色阳性。菌株生长温度范围为10-45℃，生长pH值范围为3.5-9.0。

2.2生理生化鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》第九版和《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社)进行伴孢晶体检测、接触酶检测、厌氧生长检测、45℃生长检测和8％NaCl生长检测，之后再进行一系列的验证检测，包括革兰氏染色、吲哚产生试验、葡萄糖氧化发酵、淀粉水解试验、V-P测定等生理生化检测。具体见表1:

表1菌株DU-106生理生化鉴定结果

项目	DU-106	项目	DU-106
				革兰氏染色	+	葡聚糖	+
伴孢晶体	-	D-松二糖	-
				接触酶	+	D-甘露糖	+
45℃生长	+	肌苷	-
				淀粉水解	+	丙三醇	+
Voges–Proskauer测定	+	蔗糖	+
				吲哚产生试验	-	β-Methyl-D葡萄糖苷	-
葡萄糖氧化发酵	-	D-果糖	+
				8％Nacl生长检测	+	D-山梨醇	-
厌氧生长	+	L-组氨酸	-

注:“+”表示阳性，“-”表示阴性

DU-106可利用葡萄糖产酸不产气，能分解木糖、D-核糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖等，不分解甘露醇、山梨醇、赤藓糖和山梨糖等，可耐受0.02％的叠氮化物，在有0.01％的溶菌酶时不能生长，专性同型乳酸发酵生产L-乳酸。

将上述鉴定结果与《伯杰细菌鉴定手册》上关于芽胞杆菌属的描述相对照，菌株DU-106属于芽胞杆菌属(Bacillus sp.)。

2.3分子生物学鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明对DU-106菌株的DNA进行提取，对提取的细菌DNA进行PCR，PCR扩增后的序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得完整的16S rRNA基因序列，提交至GenBank中，保藏号为MG786930。使用BLAST算法将16SrRNA基因序列与GenBank和EzTaxon-e数据库进行比较，并使用CLUSTAL W程序下载和比对最密切相关物种的基因序列，并使用邻接法与MEGA 6.0软件在1000次自助重复下重建系统发育树，系统发育树如附图4所示。由系统发育树可以看出菌株DU-106与蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的现有物种的具有密切相关性，序列相似性为97.05％-99.92％，与其他芽孢杆菌物种的相似性低于95.66％，判定菌株DU-106为属于蜡样芽孢杆菌群。

平均核苷酸同源性(ANI)是一种可以用作区分已知与未知芽孢杆菌物种的方法，当ANI值在95％-96％时，可以认为两种菌株为同一物种。采用Hiseq4000测序并结合PacBioRSII第三代测序平台,测定并获取DU-106的全基因组序列信息，并从NCBI下载蜡样芽胞杆菌群菌株基因组序列，用Jspecies软件进行ANI分析，结果如表2所示：

表2芽孢杆菌全基因组平均核苷酸同源性(ANI)分析结果

菌株DU-106除了与蜡样芽孢杆菌ATCC14579^T和苏云金芽孢杆菌ATCC10792^T的ANI值达到＞96％外，与其他菌株均小于92％。结果表明：除了蜡样芽孢杆菌ATCC14579^T和苏云金芽孢杆菌ATCC10792^T以外，DU-106不属于其他蜡样芽胞杆菌菌种。

从ATCC分别购买蜡样芽孢杆菌ATCC14579^T和苏云金芽孢杆菌ATCC10792^T，提取其基因组DNA，分别与DU-106基因组进行DNA-DNA杂交，并计算DNA杂交率。结果表明：菌株DU-106与蜡样芽孢杆菌ATCC14579^T和苏云金芽孢杆菌ATCC10792^T的菌株DNA杂交率分别为35.40％和14.43％，两者的杂交率均小于70％。说明：菌株DU-106也不属于蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

综合形态特点、生理生化鉴定、16S rRNA基因测序、基因鉴定和DNA-DNA杂交的结果，鉴定菌株DU-106为蜡样芽胞杆菌群的1个新种。命名为乳酸芽孢杆菌(Bacilluslactics)DU-106，于2019年03月保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC60621。

实施例3急性毒性试验

急性毒性试验参照GB 15193.3-2014最大耐受剂量法进行。检测结果显示:所有小鼠均未出现中毒和死亡现象。实验结果表明：乳酸芽孢杆菌DU-106菌株样品小鼠经口LD₅₀>10.0g/kg.b.w，按急性毒性分级标准属无毒物质。

实施例4耐模拟胃液能力

模拟胃液:胰蛋白胨8.3g、葡萄糖3.5g、氯化钠2.05g、氯化钙0.11g、氯化钾0.37g、磷酸二氢钾0.6g、猪胆盐0.05g、溶菌酶0.1g、胃蛋白酶13.3g、蒸馏水1000mL、盐酸分别调pH值至1.5-2.5，115℃灭菌20min。

将乳酸芽孢杆菌DU-106菌种活化后，按1％接种量转接100mL液体MRS培养基，37℃培养至全部形成菌体后，离心去上清液，收集菌体加入无菌模拟胃液，分别于0，2h后用平板计数法检测活菌数量，结果如表3所示。

通常胃酸pH值在1.5～3.0，食物在胃中停留时间大约为1～2h。由表3可以看出，乳酸芽孢杆菌DU-106在pH为1.5和2.5的模拟胃液中孵育2h，其存活率分别达到了71.43％和75.00％。

表3菌株在pH 1.5和pH 2.5中存活情况(CFU·mL^-1)

实施例5耐胆盐试验

准备MRS液体培养基，其中分别加有终浓度为0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、5.0％胆盐。取DU-106于37℃培养过夜后的菌体发酵培养液1mL，加入9mL上述胆盐浓度的培养液中。37℃静置培养12h后，稀释1000倍后取0.1mL涂MRS固体琼脂平板。生长情况表明其能耐该浓度胆盐的能力，如表4示。

表4 DU-106在不同猪胆盐浓度中存活情况

猪胆盐浓度(％)	0.1	0.3	0.5	1.0	2.0	3.0
							存活情况	++	++	++	++	+	+

注:++表示菌落生长数目超过30个:+表示菌落生长数目在5～30个之间。

小肠中胆盐对菌体会有抑制作用，小肠内胆盐浓度一般在0.03％～0.3％的范围，由表4可知，菌株DU-106在胆盐浓度0.03％～0.3％的范围内，均有较多的菌体存活，说明菌株DU-106耐猪胆盐的性能较强，菌株DU-106能顺利在小肠环境中发挥作用。

实施例6耐抗生素试验

采用CLSIM07-A9(2012年版)的微量肉汤稀释法，检测菌株DU-106对25种抗生素的敏感性，得到如下表5结果：

表5抗菌药物对菌株DU-106的最低抑菌浓度(MIC)

由表5可以看到，菌株DU-106对抗菌药物敏感性如下：敏感的抗菌药物有庆大霉素、克林霉素、加替沙星、环丙沙星、四环素、利福平、红霉素、诺氟沙星、亚胺培南、万古霉素和磷霉素等11种。处于中介的抗菌药物有链霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素、奈啶酮酸等4种。耐药的抗菌药物有青霉素G、头孢曲松、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢吡肟、甲氧氨苄嘧啶、头孢噻肟和氨苄西林等9种。

实施例7耐高温应用实验

以生理盐水为介质，不同的恒温水浴中保存一段时间，测定其存活率。结果如下表6所示：

表6湿热处理对DU-106菌株存活菌数的影响

乳酸芽孢杆菌DU-106经90℃，60min湿热处理后，其活菌数只下降了一个数量级，显示了乳酸芽孢杆菌DU-106较强的抗热性。

实施例8乳酸芽孢杆菌DU-106应用功能性评价实验

8.1乳酸芽孢杆菌DU-106可应用于促进动物消化功能

8.1.1实验方法

乳酸芽孢杆菌DU-106促进动物消化功能检验方法参照卫生部2003年印发的《保健食品检验与评价技术规范》里“促进消化功能检验方法”一章中描述的小肠运动的实验方法进行。

8.1.2实验分组和给药剂量

取体重25-28g小鼠40只，雌雄各半，分为四组：空白对照组、DU-106高剂量组、中剂量组、低剂量组。分别灌服生理盐水10ml/kg、DU-106 2×10⁹CFU/kg、5×10⁸CFU/kg、1×10⁸CFU/kg，每日一次，给药1周，给药前禁食4小时，末次给药后禁食20小时，用5％炭末与10％阿拉伯胶制成混悬液，给小鼠灌胃(0.15ml/10g体重)，给药20min脱颈椎处死，取出自幽门至回盲部的消化管，不加牵引地平铺于玻璃板上，测其全长和炭末前沿至幽门的距离，计算其与全长的百分比，即推进百分率。

8.1.3实验结果及结论

表7乳酸芽孢杆菌DU-106对小鼠小肠炭末推进百分率(％)的影响

组别	动物数(n)	推进百分率(％)
			空白对照组	10	43.9±5.6
DU-106高剂量组	10	67.7±15.9*
			DU-106中剂量组	10	62.0±15.8*
DU-106低剂量组	10	59.2±8.9*

注：*与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)

由表7结果可以看出，乳酸芽孢杆菌高、中、低剂量组对小鼠小肠炭末推进百分率与空白对照组比较，经统计学处理均有显著性差异(P﹤0.05)，说明乳酸芽孢杆菌DU-106可以明显增加小肠蠕动的速度，具有促进动物消化的功能。

8.2乳酸芽孢杆菌DU-106可应用于动物辅助降血脂

8.2.1实验方法

乳酸芽孢杆菌DU-106应用于动物辅助降血脂检验方法参照卫生部2003年印发的《保健食品检验与评价技术规范》里“辅助降血脂功能检验方法”一章中描述的实验方法进行。

8.2.2实验分组和给药剂量

雄性SD大鼠40只，用普通饲料饲养1周，观察动物无异常后，尾静脉取血1.2ml，测定血清血脂参数，包括：总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三脂(TG)。然后将动物随机分5组。普通饲料生理盐水组、高脂饲料高血脂症模型组及高、中、低剂量乳酸芽孢杆菌治疗组。生理盐水组和高脂饲料模型组分别灌服生理盐水10ml/kg.d.BW，乳酸芽孢杆菌高、中、低剂量治疗组分别罐服菌株DU-1062.5mg/kg.d.BW、7.5mg/kg.d.BW、15mg/kg.d.BW，每日灌胃给药一次，连续4周。高血脂症模型组及高、中、低剂量产乳酸杆菌治疗组于给药一周后开始给自备高脂饲料(由胆固醇、胆酸钠、猪油及普通饲料组成)。各组分别于给药后4周再次取血，测定血脂变化情况。

8.2.3实验结果及结论

表8乳酸芽孢杆菌DU-106对高血脂症大鼠血脂(mmol/L)的影响

注：***表示与空白对照组相比P＜0.001；#、##、###分别表示与模型组相比P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001。

由表8可知，给高脂血症大鼠灌胃给予乳酸芽孢杆菌DU-1064周后，相对于模型对照组，高、中、低剂量组动物血清中TC和LDL-C均显著降低，中剂量组的TG显著降低。说明乳酸芽孢杆菌DU-106对大鼠高血脂症有一定的治疗作用且能有效防止大鼠动脉粥样硬化形成。

8.3乳酸芽孢杆菌DU-106增强免疫力特性

8.3.1实验方法

乳酸芽孢杆菌DU-106增强免疫力检验方法参照卫生部2003年印发的《保健食品检验与评价技术规范》里“增强免疫力功能检验方法”里描述的实验方法进行。

8.3.2分组给药

BALB/C小鼠40只(20±2g),随机均分成四组：空白对照组、DU-106高剂量组、DU-106中剂量组、DU-106低剂量组。分别灌服生理盐水10ml/kg、DU-106 2×10⁹CFU/kg、5×10⁸CFU/kg、1×10⁸CFU/kg，每日灌胃给药一次，连续15天。

8.3.3实验结果及结论

8.3.3.1乳酸芽孢杆菌DU-106血清溶血素测定结果

表9乳酸芽孢杆菌DU-106对小鼠溶血素的影响

注：***与空白对照组比较有显著性差异(P<0.001)

由上表9实验结果经统计学分析，可以得到，高剂量组与空白对照组相比有显著性差异(P<0.001)，可见乳酸芽孢杆菌DU-106在高剂量时，对小鼠体液免疫功能有一定的增强作用。

8.3.3.2乳酸芽孢杆菌DU-106对小鼠脾淋巴细胞转化的影响

表10乳酸芽孢杆菌DU-106对小鼠脾淋巴细胞转化实验结果

分组	n	加ConA孔OD值减去不加ConA孔OD值
			空白对照组	10	0.049±0.027
DU-106低剂量组	10	0.036±0.021
			DU-106中剂量组	10	0.031±0.019
DU-106高剂量组	10	0.103±0.065**

注：**与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)

由上表10结果，经统计学软件分析，可以得到高剂量组与空白对照组相比有显著性差异(P<0.01)，其他组与对照组比较无显著性差异，可见乳酸芽孢杆菌DU-106在高剂量时，对ConA诱导下的小鼠淋巴细胞转化有增强作用。

8.3.3.3乳酸芽孢杆菌DU-106对小鼠NK细胞活性的影响

表11乳酸芽孢杆菌DU-106对小鼠NK细胞活性的影响实验结果

分组	n	NK细胞活性(％)
			空白对照组	10	12.87±3.01
DU-106低剂量组	10	14.94±6.93
			DU-106中剂量组	10	20.07±9.04**
DU-106高剂量组	10	26.03±2.94***

注：***与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.001)

**与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)

由上表11结果，经统计学软件分析，可以得到高剂量组与空白对照组相比有极显著性差异(P<0.001)，中剂量组与空白对照组相比有显著性差异(P<0.01)，低剂量组与空白对照组相比无显著性差异(P>0.05)，可见乳酸芽孢杆菌DU-106在高、中剂量时，可增强小鼠NK细胞活性。

8.4乳酸芽孢杆菌DU-106可应用于辅助降血糖

8.4.1实验方法

乳酸芽孢杆菌DU-106辅助降血糖益生特性检验方法参照卫生部2003年印发的《保健食品检验与评价技术规范》里“辅助降血糖功能检验方法”一节中描述的检验方法进行。

8.4.2分组给药

将SD大鼠随机分为5组，每组8只，对照组为正常大鼠，给予生理盐水10ml/kg.d.BW；模型对照组为糖尿病模型大鼠，给予生理盐水10ml/kg.d.BW；阳性对照组为糖尿病模型大鼠，给予90mg/kg.d.BW降糖灵药物治疗；乳酸芽孢杆菌DU-106中、高剂量组使用糖尿病模型大鼠，给予乳酸芽孢杆菌DU-106 7.5mg/kg.d.BW、15mg/kg.d.BW进行干预。

8.4.3实验结果及结论

表12乳酸芽孢杆菌DU-106对实验性糖尿病大鼠血糖浓度(mmol/L)的影响

注：与对照组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001

与模型组比较#P<0.05##P<0.01###P<0.001

由上表12实验结果可以看到，经乳酸芽孢杆菌DU-106干预的糖尿病大鼠，中、高剂量组的血糖值均有不同程度的下降；降糖效果以中剂量乳酸芽孢杆菌DU-106干预为最佳，其作用与阳性对照组相近。

表13乳酸芽孢杆菌DU-106对实验性糖尿病大鼠糖耐量的影响

组别/时间(h)	0	0.5	1	2	3
						正常对照组	5.58±1.17	15.98±3.87	11.06±1.95	8.53±1.98	5.97±0.79
模型对照组	14.98±8.03***	33.03±14.04***	34.28±8.75***	25.02±6.96***	23.94±8.96***
						阳性对照组	5.49±1.20##	23.08±4.38###***	24.94±10.15##***	14.25±5.34###**	13.05±8.17##**
DU-106中剂量组	5.82±1.12##	26.87±4.19	24.97±6.32###***	21.42±6.07***	15.21±7.08##***
						DU-106高剂量组	7.67±2.07##	26.32±6.35	31.36±13.45***	24.83±8.22***	18.04±7.07***

由上表13可以看出，糖尿病大鼠进行糖耐量实验，在0.5-1小时达到高峰，高血糖状态持续至3小时。各用药组与模型组比较，中、高剂量组乳酸芽孢杆菌DU-106均有降低空腹血糖的效果，与阳性对照组相似；血糖浓度达峰后，各用药干预组血糖降低速度较模型组快。

上述两项实验结果表明中低剂量的乳酸芽孢杆菌DU-106具有一定的辅助降血糖效果。

Claims (2)

1.一种乳酸芽孢杆菌，为乳酸芽孢杆菌DU-106，于2019年3月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60621。

2.权利要求1所述乳酸芽孢杆菌可用于促进动物消化功能、辅助降血脂、增强免疫力和辅助降血糖。