CN105695370A - 一种丁酸梭菌及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丁酸梭菌及其培养方法与应用。所述丁酸梭菌从粪便中药（如白丁香、望月砂、龙涎香、鸡矢白、虫茶、五灵脂、夜明砂、黑冰片等）中分离得到，其分类命名为丁酸梭菌<i>（</i><i>Clostridium butyricum</i>）Q428，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016089。本发明所提供的丁酸梭菌的培养效率高，该梭菌能够合成益生因子丁酸，生产B族维生素、维生素K和多种氨基酸，分泌淀粉酶、蛋白酶。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域中的一种丁酸梭菌及其培养方法与应用。
背景技术
丁酸梭菌在自然界中主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物粪便及土壤中。丁酸梭菌作为微生态制剂的研究是由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告。1935年，俄罗斯微生物研究所Kingimiyairi博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌，可调节人体肠道微生态平衡，具有极强的整肠作用。丁酸梭菌在人体肠道内可体现三大生物特性：第一、促进肠道有益菌群（双歧杆菌、乳酸杆菌）的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生。第二、在肠道内能产生B族维生素、维生素K、淀粉酶、蛋白酶等物质、对人体具有保健作用。第三、丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质。
白丁香，中药名。为文鸟科动物麻雀的粪便，干燥的雀粪，呈圆柱形，有时稍弯曲，长5-8mm，直径1-2mm。表面灰白色或灰棕色。质稍硬，易折断。断面棕色，呈粒状。气微腥臭，分布于我国几遍及全境平地。具有消积，明目之功效。常用于积聚，疝气，外用治目翳，痈疽疮疖，扁桃体炎；龙涎香，在西方又称灰琥珀，是一种外貌阴灰或黑色的固态腊状可燃物质，鲸消化系统的肠梗阻所产生。行气活血，散结止痛，利水通淋。用于咳喘气逆，气结症积，心腹疼痛，淋病；鸡矢白：鸡矢白即家鸡粪便上的白色部分。性味甘咸，凉，有利水，泄热，祛风，解毒等作用，可治鼓胀积聚，黄疸，风痹等；夜明砂，本品为少常用中药，原名天鼠屎，"神农本草经"列为中品，"日华本草"称夜明砂。生药为蝙蝠类动物的干燥粪便；望月砂又称明 月砂，为兔科动物野兔的干燥粪便，是一味中药，主要治疗眼睛疾病和痔漏等症；五灵脂是哺乳纲、鼯鼠科动物复齿鼯鼠（寒号鸟）、飞鼠或其它近缘动物的粪便，具有疏通血脉，散瘀止痛的功效；是妇科要药；黑冰片，为猪科动物野猪的干燥粪便，用于消化不良，希拉痞，粘症。
目前报道的能产丁酸的菌有：丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）、酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）、柔嫩梭菌（Clostridiumleptum）、球形梭菌（Clostridiumcoccoides）、人罗斯拜瑞氏菌（Roseburiahominis）、霍氏真杆菌（Eubacteriumhallii）、直肠真杆菌（Eubacteriumrectale）、普氏栖粪杆菌（Faecalibacteriumprausnitzii）和粪厌氧棒状菌（Anaerostipescaccae）。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种丁酸梭菌，该丁酸梭菌能够合成益生因子丁酸，生产B族维生素、维生素K和多种氨基酸，分泌淀粉酶、蛋白酶。
本发明所提供的梭菌，被鉴定为丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum），来源于粪便中药（如白丁香、望月砂、龙涎香、鸡矢白、虫茶、五灵脂、夜明砂、黑冰片等）。
所述丁酸梭菌，其分类命名为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Q428，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCCNO：M2016089，保藏日期为：2016年3月7日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明所提供的丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428具有以下特征：
1）菌落特征：菌落直径为(0.6～1.4)×(2.3～7.3)μm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，白色或乳白色。
2）细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞直径1.3-3.2mm。
3）生理生化特征：厌氧生长；不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖等糖类生产丁酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸和甲酸，硝酸盐还原试验均为阴性。
4)丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的16SrRNA基因序列长度为1,516bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
本发明的另一个目的是提供一种培养丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的方法。
本发明所提供的培养丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的方法，是将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428接种于RCM培养基，在36℃，pH6.8的条件下培养。
在1,000mL上述RCM培养基中含有：胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；余量为水。
上述RCM培养基还包括氧化还原指示剂，具体可为刃天青，其含量为0.5mg/L。
本发明培养方法中，所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
本发明所提供的丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428易培养，培养效率高，可达4.75×109CFU/mL。
本发明的丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428是从粪便中药（如白丁香、望月砂、龙涎香、鸡矢白、虫茶、五灵脂、夜明砂、黑冰片等）中分离得到的，是一种能够利用葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵，主要发酵产物为丁酸，是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。2014年12月16日，欧盟委员会发布关于批准丁酸梭菌（CBM588）作为新食品原料投放市场的决定，并规定了其使用规格和指标。当其作为新食品原料用于食品补充剂时，最大剂量为1.35×108CFU/天，还需满足2002/46/EC的相关要求。由于它具有耐热耐酸及对常用抗生素有抗性等特点，在临床上广泛用于预防由大肠杆菌等病原菌。因此本发明中的丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428在新资源食品产业和益生因子丁酸的生产中有广阔的应用前景。
本发明所述的生物材料，其分类命名为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)Q428，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCCNO：M2016089，保藏日期为：2016年3月7日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实验中所使用的RCM液体培养基的基本组成为（/升）：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
实验中所使用的RCM固体培养基是向上述RCM液体培养基中加入15g琼脂，使其终浓度为1.5%。
实施例1、菌株丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的分离制备
取粪便中药（如白丁香、望月砂、龙涎香、鸡矢白、虫茶、五灵脂、夜明砂、黑冰片等）水解液，将其接种于以木糖为底物的RCM液体培养基中传代培养，得到富集物；用富集物作为接种源，将其接种于以葡萄糖为底物的RCM固体培养基，用Hungate滚管技术分离得到。
将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2016089。
实施例2、菌种鉴定
一、形态及生理生化特征
将菌株丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428接种于以葡萄糖为底物的RCM固体培养基（含质量百分含量为1.5%的琼脂），在pH为6.8，温度为36℃的条件下厌氧培养48h。
观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验：1革兰氏染色试验；2血清蛋白试验；3液化明胶试验；4还原硝酸盐试验；5底物利用试验。
观察结果及实验结果如下：
1）菌落特征：菌落直径为(0.6～1.4)×(2.3～7.3)μm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，白色或乳白色。
2）细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞直径1.3-3.2mm。
3）生理生化特征：厌氧生长；革兰氏染色呈阳性；不水解明胶；不消化血清蛋白；能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖等糖类产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、乙酸和乳酸，还发现有少量的丙酸和甲酸；硝酸盐还原试验均为阴性。
二、菌株丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定
1）提取DNA（参照TAKARA提基因组试剂盒）
将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428接种于RCM液体培养基培养；取生长至对数晚期的发酵液，12,000转/分钟离心5分钟，去除上清液；加入500μL的BufferBS重悬细胞，加入50μL的Lysozyme（20mg/mL），充分吸打混匀，于37℃水浴温育1小时（每隔20分钟颠倒混匀一次）；12,000rpm离心5分钟，弃上清；加入180μL的BufferGL、20μL的ProteinaseK（20mg/mL）和10μL的RNaseA（10mg/mL），充分吸打混匀，于56℃水浴温育10分钟；加入200μL的BufferGB和200μL的100%乙醇，充分混匀；将SpinColumn安装在CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液；将500μL的BufferWA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液；将700μL的BufferWB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液，重复一次；将SpinColumn安置在CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟；将SpinColumn安置在新的1.5mL离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50~200μL的65℃灭菌蒸馏水，室温静置5分钟；12,000rpm离心2分钟洗脱DNA
2）16SrRNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-TTTTATTGAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，反向引物为5’-NGAAAGGAGGTGATCNNNNNNCAGG-3’。PCR反应体系（25μL）为：Mix25μL；ddH2O8.5μL；正反向引物各1μL；DNA模板2μL。PCR反应条件为：95℃5min，95℃1min，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃7min，4℃保存。
PCR产物的测序送至金唯智公司完成
测序结果表明，菌株丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的16SrRNA基因序列长度为1,516bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
将16SrRNA基因序列在GenBank中进行同源比对分析，结果表明，其序列与Clostridiumbeijerinckii的16SrRNA基因序列的相似性为95%。
参照《Bergey’sManualofSystematicBacteriology》（第二版），根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16SrRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428被鉴定为新种丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）。
实施例3、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的培养
1）将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428以5%的比例接种于50mLRCM液体培养基，在25℃，pH6.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1,000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（2.3±0.5）×109CFU/mL。
2）将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428以5%的比例接种于50mlRCM液体培养基，在36℃，pH6.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；麦芽糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（3.2±0.4）×109CFU/mL。
3）将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428以5%的比例接种于50mLRCM液体培养基，在36℃，pH6.8的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；乳糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过上海跃进医疗器械有限公司生产的YQX-I厌氧培养箱得到的。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（4.1±0.4）×109CFU/mL。
4）将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428以5%的比例接种于50mlRCM液体培养基，在42℃，pH7.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；木聚糖和木糖中一种或两种，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1,000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（3.5±0.3）×109CFU/mL。
5）将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428以5%的比例接种于50mlRCM液体培养基，在45℃，pH8.5的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；蔗糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，平均菌体浓度达（2.3±0.2）×109CFU/mL。
6）将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428以5%的比例接种于50mlRCM液体培养基，在47℃，pH7.0的条件下培养。
RCM液体培养基的组成（/升）如下：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
实验设三次重复，三次重复中菌体均不生长。
实验结果表明：菌株丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428厌氧生长，生长温度从25℃-42℃，47℃不生长，最适生长温度35℃-38℃；pH生长范围6-8.5，最适生长pH为6.5-7.0。在最适生长条件下，菌体浓度可达（4.1±0.4）×109CFU/mL。
实施例4、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428中淀粉酶、蛋白酶的酶活测定
一、制备酶液
将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428接种于RCM液体培养基，pH为6.8，培养温度为36℃，培养2天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。
RCM培养基组成为（/升）：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1,000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1个大气压的量。
二、酶活测定
1）酶活测定反应体系（1,000mL）包括：反应底物溶于pH7.0的PBS缓冲液中，800μL；酶液，200μL。反应温度为37℃，反应时间30min，采用高效液相色谱法测定产生的还原糖量。
一个酶活力单位（1U）定义为每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
2）用上述酶活测定反应体系分别测定不同酶活，每个实验设三次重复：
A、淀粉酶：底物为麦芽糖，反应时间30min，三次重复平均测的酶活为2515.43U/mL。
B、蛋白酶：底物为酪蛋白，反应时间30min，三次重复平均测的酶活为93.72U/mL。
实施例5、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428生产丁酸
一、制备发酵液
将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428接种于RCM液体培养基，pH为6.8，培养温度为36℃，培养2天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。
RCM培养基组成为（/升）：
胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；刃天青，0.5mg；蒸馏水定容至1,000mL。
培养所需的厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的，一般注入达到1大气压的量。
二、纤维床固定化发酵产丁酸
连接好纤维床生物反应器系统装置后通30min无菌氮气以使系统达到厌氧状态。接入100mL发酵液，搅拌转速控制在150r/min，温度设定37℃，用6mol/L的NaOH和3mol/L的稀H2SO4控制pH在7.0。预培养48h后，菌体OD值达到8.0左右，打开蠕动泵，将培养基经由软管泵入纤维床反应器内，泵的转速为30mL/min，维持循环36?48h，进行菌体固定化培养，至发酵罐内的游离菌体浓度不再降低，取出所有的发酵液并更换新鲜的发酵培养基（2L体系），提高泵的转速至100mL/min，开始进行固定化发酵动力学研究。
丁酸的终产量维持在40.1?52.8g/L之间。
序列表
<110>南京工业大学
<120>一种丁酸梭菌及其培养方法与应用
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1516
<212>RNA
<213>丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428
<400>1
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Claims (5)
1.一种丁酸梭菌，其分类命名为丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428，其保藏编号为CCTCCNO：M2016089。
2.权利要求1所述丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428的培养方法，是将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428接种于RCM培养基36℃、pH6.8的条件下进行厌氧培养；
所述RCM培养基，在1,000mL中含有：胰蛋白胨，10g；牛肉膏，10g；葡萄糖，5g；氯化钠，5g；酵母膏，3g；乙酸钠，3g；可溶性淀粉，1g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g；余量为水。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述RCM培养基中还含有0.5mg/L刃天青。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：厌氧环境是通过85%N2、10%H2和5%CO2的混合气得到的。
5.权利要求1所述丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）Q428在新食品资源的应用，调节肠道微生态平衡，同有益菌群共生，对机体产生各种保健功能。
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