CN106754579A

CN106754579A - 一种凝结芽孢杆菌及其用途

Info

Publication number: CN106754579A
Application number: CN201710161862.6A
Authority: CN
Inventors: 隋利涛; 曹亚彬; 梁晓彤
Original assignee: Harbin Zhongke Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Harbin Zhongke Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种凝结芽孢杆菌及其用途，属于生物工程技术领域。本发明所述凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)zkng160127，于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏单位为哈尔滨中科生物工程有限公司，保藏编号为CGMCC No.12125。本发明的凝结芽孢杆菌具有耐酸、耐胆盐、抑制病原菌生长的特性，能够有效提高免疫力，促进生长和改善肠道微环境，具有优异的益生作用。

Description

一种凝结芽孢杆菌及其用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌及其用途。

背景技术

乳酸菌是动物肠道正常菌群中的优势菌，能够利用可发酵糖产生大量乳酸，具有调节肠道内菌群平衡、提高机体免疫力并促进营养吸收等功能，也有不少关于乳酸菌促进动物增质量、提高饲料利用率、分泌抑菌物质并减少发病率等方面的报道。乳酸菌作为微生物饲料添加剂在饲料工业中具有广泛的用途，目前，我国生产上应用的菌株主要包括粪肠球菌、屎肠球菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌等，但由于此类菌株不耐加工和储存，在动物肠道的酸性、消化酶和厌氧环境作用下难以存活等原因，在畜牧生产中的应用效果并不稳定。因此，抗逆性较强的产乳酸芽孢菌(包括凝结芽孢杆菌)成为近年来乳酸菌研究的热点。凝结芽孢杆菌是饲料添加剂品种目录(2013)(中华人民共和国农业部公告第2045号)中允许使用的安全菌株。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的技术方案如下：

一种凝结芽孢杆菌，为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)zkng160127，保藏编号为CGMCC No.12125。

在上述方案的基础上，所述凝结芽孢杆菌分离于健康散养鸡肠道内容物。

在上述方案的基础上，所述凝结芽孢杆菌的菌落形态为不透明白色，圆形有光泽，边缘整齐，表面较平且湿润。

在上述方案的基础上，所述凝结芽孢杆菌，具有如下菌学特性：

具有磺胺和杆菌肽的抗性；耐胃液和胆盐；对猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coliO139)金黄色葡萄球菌(SA)和伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)具有抑制作用；能够产淀粉酶和蛋白酶。

在上述方案的基础上，所述凝结芽孢杆菌最适生长温度为35℃～45℃、最适初始pH值6.2～6.5。

在上述方案的基础上，所述凝结芽孢杆菌可用于调整动物肠道功能、促进动物生长、提高动物免疫力。

在上述方案的基础上，使用时凝结芽孢杆菌的含量≥10⁸CFU/mL。

一种调整动物肠道功能的方法，使用上述凝结芽孢杆菌制成微生态制剂或中药发酵制剂。

一种促进动物生长的方法，使用上述凝结芽孢杆菌制成微生态制剂或中药发酵制剂。

一种提高动物免疫力的方法，使用上述凝结芽孢杆菌制成微生态制剂或中药发酵制剂。

本发明的有益效果

本发明的凝结芽孢杆菌具有磺胺和杆菌肽的抗性；耐胃液和胆盐；对猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coli O139)金黄色葡萄球菌(SA)和伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)具有抑制作用；能够产淀粉酶和蛋白酶。此外，本发明的凝结芽孢杆菌菌株能耐受消化道内的环境，耐受胃酸和胆盐，抗逆性强，用本发明的凝结芽孢杆菌发酵中药而制备中药发酵制剂，有效的补充或增强了原有药物的功能；中药经凝结芽孢杆菌转化后产生了新的活性物质；该中药发酵制剂能够有效提高动物生物免疫力，促进生长和改善肠道微环境，具有优异的益生作用。

附图说明

图1.菌株Y-7在液体培养基37℃静置培养24h，显微镜下放大800倍观察图

图2.菌株Y-7的菌落形态

图3.菌株Y-7的16S rDNA系统发育树

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明所述的凝结芽孢杆菌Y-7于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；请求保藏单位为哈尔滨中科生物工程有限公司，保藏编号为CGMCC No.12125，保藏名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)zkng160127。

实施例1样品采集、菌株分离及筛选

1.1分离及筛选菌种培养基

MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10.0、肉膏10.0、酵母浸粉5.0、葡萄糖20.0、碳酸钙20.0、磷酸氢二钾2.0、柠檬酸氢二铵2.0、乙酸钠5.0、硫酸镁0.58、硫酸锰0.28、半胱氨酸0.5、吐温80 1.0，调pH6.2-6.4。115℃灭菌20min。

乳酸菌增殖培养基(YPG培养基)：葡萄糖5.0g，蛋白质5.0g，酵母提取物1.0g，CaCl₂ 0.10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调pH6.5，115℃灭菌20min。

固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂。

1.2模拟胃液：胰蛋白胨8.3g、葡萄糖3.5g、氯化钠2.05g、氯化钙0.11g、氯化钾0.37g、磷酸二氢钾0.6g、猪胆盐0.05g、溶菌酶0.1g、胃蛋白酶13.3g、蒸馏水1000mL，盐酸分别调pH值至1.5、2.5，115℃灭菌20min。

1.3样品采集

分离样品采集于健康散养鸡肠道内容物。

采集时间和地点：散养鸡于2015年01月采购于哈尔滨道外区巨源镇养鸡场，将鸡屠宰后于无菌条件下从其盲肠和大肠中取出适量内容物。

1.4菌株的分离

取样品10g，放入盛有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡，80℃水浴20min。采用稀释平板法将上述样品涂布于MRS培养基中，37℃下静置培养；再将富集好的样品转入乳酸菌增殖培养基平板中，37℃恒温培养24h，待菌落长出，选取其中20株溶钙圈大的单菌落，反复划线分离至获得纯菌株，以“Y”代表芽孢杆菌将菌株编号Y-1、Y-2、Y-3......Y-20。

1.5菌株初筛

将上述菌株接种到MRS液体培养基中，37℃培养48h后，测定发酵液pH值并进行平板计数，选育出产酸能力强、活菌体数量较大5株乳酸菌，为Y-2、Y-7、Y-9、Y-15和Y-18。

1.6胆盐耐受和低pH耐受检测

取5支装有10mL乳酸菌增殖培养基的液体试管，分别调整pH至3.0；另取5支装有10mL乳酸菌增殖培养基的液体试管，分别加入终浓度为0.03％的牛胆盐；均接入1％的初筛菌种，于37℃下培养24h，以不调整pH和不添加胆盐的试管作对照，于D₆₀₀下检测吸光度。

对分离纯化得到的5株菌进行酸及胆盐耐受力的测定，结果见表1。

表1胆盐耐受和低pH值试验结果

由表1可知，Y-7受胆盐的毒害作用较小，受pH值影响明显较其他菌株低。因此，选取Y-7进行生理生化鉴定试验。

实施例2筛选菌株的鉴定

2.1形态鉴定

图1为Y-7菌株静置培养24h后的形态。Y-7菌株为兼性厌氧菌，静置培养长势良好。

Y-7的菌落形态如图2所示：菌落为不透明白色，圆形有光泽，边缘整齐，表面较平且湿润。菌株在MRS培养基中48h即形成直径2～3mm的菌落，溶钙圈现象明显。培养初期镜下观察为革兰氏阳性链状杆菌，芽孢端生，包囊不膨大。菌株最适生长温度为35℃～45℃、最适初始pH值6.2～6.5。

2.2生理生化鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行接触酶检测、厌氧生长检测、50℃生长检测和7％NaCl生长检测，之后再进行一系列的验证检测，包括葡萄糖氧化发酵、运动性检测、淀粉水解试验、V-P测定、酪素水解等。具体见表2：

表2菌株Y-7生理生化鉴定结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

将上述鉴定结果与《伯杰细菌鉴定手册》上关于芽胞杆菌属的描述相对照，菌株Y-7属于芽胞杆菌属(Bacillus sp.)。

2.3 16S rDNA序列测定

按照细菌DNA抽提试剂盒的说明对所选乳酸菌的DNA进行提取，利用细菌16S rDNA的通用引物：

上游引物：Primer F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'

下游引物：Primer R：5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'

对提取的细菌DNA进行PCR，PCR扩增后的序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测得的基因序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行Blastn比对分析。

结果显示：Y-7菌株的16S rDNA序列结果与凝结芽孢杆菌NRIC 1530 16S rDNA的序列的覆盖率为98％，一致性为92％。

利用测得的Y-7菌株的16S rDNA序列构建核酸系统发育树如图3所示：

本发明的Y-7菌株与凝结芽孢杆菌HM-80和凝结芽孢杆菌NRIC 1530聚类。

表3.系统发育树所用序列名称及Genbank登录号

综合形态特点、生理生化鉴定和16S rDNA测序的结果，鉴定菌株Y-7为凝结芽胞杆菌(B.coagulans)的1个亚种。命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)zkng160127，于2016年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏单位为哈尔滨中科生物工程有限公司，保藏编号为CGMCC No.12125。

实施例3急性毒性试验

急性毒性试验参照GB15193.3—2003最大耐受剂量法进行。检测结果显示：所有小鼠均未出现中毒和死亡现象。说明凝结芽孢杆菌zkng160127急性毒性试验最大耐受剂量MTD>15000mg/kg，根据分级标准，该菌株为无毒物质。

实施例4耐抗生素试验

取活化好的菌液0.1mL接种于MRS平板上，放入常用抗生素药敏纸片37℃培养，观察其生长情况，测量抑菌圈直径。参照抗菌药物药敏纸片及实验判断标准，得到凝结芽孢杆菌对17种抗生素的耐药性分析如表4所示。

表4 zkng160127菌株耐常见抗生素结果

由表4可知，菌株zkng160127对磺胺和杆菌肽低敏，可相容。

实施例5耐模拟胃液能力

模拟胃液：胰蛋白胨8.3g、葡萄糖3.5g、氯化钠2.05g、氯化钙0.11g、氯化钾0.37g、磷酸二氢钾0.6g、猪胆盐0.05g、溶菌酶0.1g、胃蛋白酶13.3g，蒸馏水1000mL，盐酸分别调pH值至1.5、2.5，115℃灭菌20min。

对照菌种：凝结芽孢杆菌AS 1.2407，购自中国科学院微生物研究所。

将凝结芽孢杆菌zkng160127和AS 1.2407菌种活化后，按1％接种量转接100mL液体MRS培养基，37℃、200r/min培养至全部形成芽孢后，离心去上清液，收集芽孢加入无菌模拟胃液，分别于0、2h后用平板计数法检测活菌数量，结果如表5所示。

通常胃酸pH值在1.5～3.0，食物在胃中停留时间大约为1～2h。由表5可以看出，凝结芽孢杆菌zkng160127在pH为1.5和2.5的模拟胃液中孵育2h，其存活率分别达到了69.15％和78.09％。

表5菌株在pH 1.5和pH 2.5中存活情况(cfu·mL^-1)

由表5可知，在低pH环境下，两株菌存活率均较高，且菌株zkng160127存活率高于菌株AS 1.2407。

实施例6耐胆盐试验

准备MRS液体培养基，其中分别加有终浓度为0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、5.0％胆盐。各取zkng160127与AS 1.2407于37℃培养过夜后的菌体发酵培养液1mL，加入9mL上述胆盐浓度的培养液中。37℃静置培养12h后，稀释10000倍后取0.1mL涂MRS固体琼脂平板。生长情况表明其能耐该浓度胆盐的能力，如表6所示。

表6菌株在不同猪胆盐浓度中存活情况

注:++表示菌落生长数目超过30个；+表示菌落生长数目在5～30个之间；—表示菌落生长数目小于5个。

小肠中胆盐对菌体会有抑制作用，猪小肠内胆盐浓度一般在0.03％～0.3％的范围，由表6可知，菌株zkng160127在胆盐浓度0.03％～0.3％的范围内，均有较多的菌体存活，且存活的菌体个数较AS 1.2407多，这说明菌株zkng160127耐猪胆盐的性能较强，且明显优于菌株AS 1.2407；菌株zkng160127能顺利在小肠环境中发挥作用。

实施例7抑菌试验

猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coli O139)金黄色葡萄球菌(SA)、伤寒沙门氏菌(STO4Hi)由黑龙江省科学院微生物研究所提供。

在MRS斜面上活化保存的凝结芽孢杆菌zkng160127和AS 1.2407。于营养琼脂斜面上分别活化猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coli O139)、金黄色葡萄球菌(SA)和伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)。将菌株zkng160127和AS 1.2407转接至MRS液体培养基中，37℃静止培养24h。将活化的猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coli O139)、金黄色葡萄球菌(SA)和伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)接种于肉汤培养基培养24h后，进行菌株zkng160127和AS 1.2407的抑菌试验。

分别将三种致病菌均匀涂布于营养琼脂平板，在牛津杯中分别加入300μLzkng160127和AS 1.2407菌悬液，置于涂布了致病菌的营养琼脂平板上，37℃培养18h后测量抑菌圈直径。如表7所示。

表7凝结芽孢杆菌对不同菌株的抑制效果

注：抑菌圈直径(mm)：+++：19–24；++：15–18；+：10–15；–：无抑菌效果。

由表7可以看出，菌株zkng160127和AS 1.2407对三种致病菌均有良好的抑菌效果，且zkng160127抑制大肠杆菌(E.coli O139)和伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)的效果优于菌株AS 1.2407。

实施例8产酶分析(淀粉酶、蛋白酶)

采用平板透明圈法将菌株zkng160127和AS 1.2407分别接种于液体培养基中，摇床培养(37℃，200r/min)24h，调整菌液浓度为1.0×10⁸CFU/mL，用滤纸片粘取菌液，点种法接种到淀粉酶、蛋白酶的选择培养基平板上，每种处理设三个平行，37℃培养36h，观察并记录平板透明圈情况。如表8所示。

表8产酶分析

由表8可知，菌株zkng160127和AS 1.2407均可在淀粉酶培养基和蛋白酶培养基上生长并产生水解透明圈。透明圈直径的大小显示了菌株产淀粉酶、蛋白酶的情况；由表8可知，菌株zkng160127淀粉酶和蛋白酶的透明圈直径均大于菌株AS 1.2407，因此，菌株zkng160127产淀粉酶和蛋白酶量大于菌株AS 1.2407。

实施例9中药发酵制剂的制备

9.1菌液的制备

将本发明的凝结芽孢杆菌zkng160127菌种接种于活化培养基进行培养，培养温度为37℃，时间24h；将活化好的菌种接种于发酵罐中，控制温度37℃～43℃，时间24h～36h，制备发酵液。

所述活化培养基为：MRS培养基，成分为(g/L)：蛋白胨10.0、肉膏10.0、酵母浸粉5.0、葡萄糖20.0、磷酸氢二钾2.0、柠檬酸氢二铵2.0、乙酸钠5.0、硫酸镁0.58、硫酸锰0.28、半胱氨酸0.5、吐温80 1.0，调pH 6.2-6.4。

发酵所用培养基为：MRS培养基，成分同上。

发酵完成后，菌液中菌含量≥10⁸CFU/mL。

9.2中药发酵制剂的制备

一种中药发酵制剂，其中药成分按照重量份数组成为：柴胡8份、川穹6份、香附6份、陈皮6份、枳壳4.5份、芍药4.5份、甘草1.5份。

具体制备方法，包括以下步骤：

(1)按量取中药组分，粉碎，过60目筛网，备用；

(2)将粉碎后的各组分混合均匀，加入中药成分总重量80％的水，搅拌均匀后于100℃蒸汽灭菌30min，冷却至20-30℃；

(3)向冷却后的药物中加入菌液，菌液用量占加入后总量的10～15％；置于单向排气塑料袋中，在20℃～30℃条件下发酵30天。

上述的单向排气塑料袋为专利号为：200920100585.9的厌氧发酵饲料、中药及添加剂的单向排气袋。

实施例10促进动物生长、提高成活率

10.1药效试验

10.1.1试验组方

1)本发明实施例9中的中药发酵制剂

2)用菌株AS 1.2407替换实施例9中的菌株zkng160127的中药发酵制剂

10.1.2试验动物：选择健康和体重相近的1日龄黄羽肉鸡300只，随机分成3组，两个试验组分别在基础日粮基础上添加2g/kg中药发酵制剂进行饲喂。对照组饲喂基础日粮，基础日粮参照NRC(1994)肉鸡营养需要量标准配制玉米—豆粕型基础日粮，日粮组成及营养水平见表9。

表9基础日粮组成及营养水平

10.1.3饲养管理

试验前对鸡舍进行全面消毒，试验鸡全期采用笼养方式饲养，24h光照，自由采食、饮水，常规的日常管理，按正常免疫程序进行免疫接种。每日观察鸡群的生长状况并进行记录。

10.1.4测试指标及方法

生长性能测定

28、70日龄，分别以重复为单位对试验鸡进行空腹称重，统计每天饲粮消耗量，计算1～28日龄和1～70日龄的平均日增重、平均日采食量(ADFI)和料重比。每天记录各组死亡情况，计算成活率。

zkng160127和AS 1.2407分别代表两个菌种的中药发酵制剂。

两株凝结芽孢杆菌中药发酵制剂对黄羽肉鸡生长性能的影响见表10。

表10凝结芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能的影响

注：同列肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05)，肩标字母不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标字母不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

由表10可知，1～28日龄和1～70日龄的平均日增重，试验组zkng160127均显著高于对照组(P＜0.05)，试验组AS 1.2407高于对照组但差异不显著(P＞0.05)；平均日采食量各组之间无显著性差异(P＞0.05)；计算料重比，试验组zkng160127显著小于对照组(P＜0.05)，试验组AS 1.2407小于对照组但差异不显著(P＞0.05)；1～28日龄成活率各组之间无显著性差异(P＞0.05)，1～70日龄成活率两个试验组zkng160127和AS 1.2407均显著高于对照组(P＜0.05)，分别提高了5.32％和4.77％。

10.2中药发酵制剂对免疫器官的影响

在42日龄每组随机抽取体重相近的鸡10只，空腹称个体重后屠宰，摘取脾脏、胸腺和法氏囊，剔除脂肪后称鲜重，计算器官指数(免疫器官鲜重g/宰前空腹活重kg)。

两种凝结芽孢杆菌中药发酵制剂对黄羽肉鸡免疫器官指数的影响(见表11)

表11凝结芽孢杆菌对黄羽肉鸡免疫器官指数的影响

由表11可知，脾脏指数试验组高于对照组但无显著性差异；胸腺指数两个试验组均显著高于对照组(P＜0.05)，zkng160127高于AS 1.2407但差异不显著；法氏囊指数，zkng160127 显著高于对照组(P＜0.05)，AS 1.2407高于对照组但差异不显著。

结果显示，菌种zkng160127加本试验中药组方制备的发酵制剂可提高机体免疫器官成熟速度，促进机体生长发育。

<110> 哈尔滨中科生物工程有限公司

<120> 一种凝结芽孢杆菌及其用途

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1574

<212> DNA

<213> Bacillus coagulans

<400> 1

tagagtgtcg taattgatca tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60

agtcgtgcgg accttttaaa agcttgctat tatatcgtta gctgagcagc tatgagtatg 120

acgtcagcaa ccacgctgta cgatcatgat tatccgagga aactggcact actaccggat 180

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gagtttgtaa cacccgacgt cggtgtggta acctttacgg agtcagccgc cgaaggtggg 1500

acagatgatt ggggtgaagt cgtaacatgg tagccgtatc ggatggtgcg cttggatcac 1560

ccggagccag ccgc 1574

Claims

1.一种凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)zkng160127，保藏编号为CGMCC No.12125。

2.根据权利要求1所述凝结芽孢杆菌，其特征在于：分离于健康散养鸡肠道内容物。

3.根据权利要求2所述凝结芽孢杆菌，其特征在于：菌落形态为不透明白色，圆形有光泽，边缘整齐，表面较平且湿润。

4.根据权利要求1-3任一项所述凝结芽孢杆菌，其特征在于：具有如下菌学特性：

具有磺胺和杆菌肽的抗性；耐胃液和胆盐；对猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coli O139)金黄色葡萄球菌(SA)和伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)具有抑制作用；能够产淀粉酶和蛋白酶。

5.根据权利要求4所述凝结芽孢杆菌，其特征在于：最适生长温度为35℃～45℃、最适初始pH值6.2～6.5。

6.根据权利要求1-5任一项所述凝结芽孢杆菌的应用，其特征在于：用于调整动物肠道功能、促进动物生长、提高动物免疫力。

7.根据权利要求6所述所述凝结芽孢杆菌的应用，其特征在于：使用时凝结芽孢杆菌的含量≥10⁸CFU/mL。

8.一种调整动物肠道功能的方法，其特征在于：使用权利要求1所述凝结芽孢杆菌制成微生态制剂或中药发酵制剂。

9.一种促进动物生长的方法，其特征在于：使用权利要求1所述凝结芽孢杆菌制成微生态制剂或中药发酵制剂。

10.一种提高动物免疫力的方法，其特征在于：使用权利要求1所述凝结芽孢杆菌制成微生态制剂或中药发酵制剂。