CN107868763A - 一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌e21及其应用 - Google Patents

一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌e21及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌E21及其应用，该菌株的专利保藏号为CGMCC NO.13044。该菌株来源于健康动物肠道，经一系列试验证明该菌株具有较好的耐热性、耐酸性、胆盐耐受性、稳定性及高产L‑乳酸能力，并且该凝结芽孢杆菌的发酵菌量达100亿CFU/mL，该菌可以用于饲料添加剂。本发明中的凝结芽孢杆菌可以提高攻毒后白羽肉鸡的抗氧化性能，用敌草快对白羽肉鸡进行攻毒，机体处于氧化应激状态，空肠形态结构受到破坏，肠道屏障功能受到影响。而添加凝结芽孢杆菌可以提高攻毒后白羽肉鸡的抗氧化性能，恢复了空肠形态结构，促进了致炎因子和抑炎因子的平衡，并保护了肠道的屏障功能。

Description

一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌 E21及其应用
技术领域
本发明属于微生物添加剂及应用技术领域，具体涉及一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌E21及其应用。
背景技术
肠道不仅是体内最大的消化吸收器官，同时也是体内重要的免疫器官，生理功能完整的肠道粘膜对细菌和内毒素形成屏障。但是在应激状态下，大量的细菌和毒素穿过胃肠道进入宿主体内，降低肠粘膜上皮细胞的抵抗力、破坏紧密连接、损伤肠粘膜屏障。因此通过营养调控来增强动物的免疫机能和抗病能力，缓解氧化应激引起的肠道损伤，受到了越来越多学者的关注。益生菌(probiotics)是用来促进人和动物肠道微生物区系平衡的微生物制剂，能够调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡并提高机体免疫水平，被广泛地应用于医药、食品、畜牧和水产等行业。目前国内外广泛应用的益生菌有芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和酵母菌等，但大多数乳酸菌的抗胃酸、抗胆盐和抗高温能力差，而芽孢杆菌由于具有抗逆性强、耐高温高压、易贮藏等优点，成为益生菌中的研究热点。其中凝结芽孢杆菌作为一种能够形成芽孢的乳酸菌极具应用前景，凝结芽孢杆菌可形成芽孢、革兰氏阳性、兼性厌氧、杆状、可移动，在较宽温度(30～57℃)和pH值(2～10)范围内都能够生长。
发明内容
本发明的目的是提供了一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌E21及其应用，所述凝结芽孢杆菌可以提高动物机体受有毒试剂攻毒后的抗氧化应激能力，有助于动物尽快恢复正常生理机能，从而减少应激对动物的危害，有助于提高畜牧业发展水平。
为实现以上发明目的，本试验采取以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌E21，其分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.13044。
进一步的：所述凝结芽孢杆菌E21最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。
进一步的：所述凝结芽孢杆菌E21耐热温度为70℃-90℃，耐酸pH值范围为1.2-2.5，产L-乳酸。
本发明还提供了所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用。
进一步的：所述饲料添加剂中含有含菌量为100-200亿CFU/g的凝结芽孢杆菌E21菌粉。
进一步的：所述凝结芽孢杆菌E21的发酵培养基配方为：豆粕3-5％，蛋白胨1-2％，玉米面3-5％，葡萄糖1-1.5％，磷酸氢二钾0.3-0.5％，硫酸锰0.02-0.1％，硝酸钠0.05-0.1％。
进一步的：所述凝结芽孢杆菌E21有助于恢复空肠形态结构。
进一步的：所述凝结芽孢杆菌E21提高了攻毒后白羽肉鸡的抗氧化性能。
进一步的：所述凝结芽孢杆菌E21与益生菌配伍使用；或者单独添加到饲料中使用；或者添加到饮水中使用。
进一步的：所述畜禽动物为蛋鸡、鸭和猪。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明提供了一株凝结芽孢杆菌，该菌株来自于健康动物肠道，菌株具有良好的耐热性、耐酸性、胆盐耐受性，并具有高产L-乳酸能力，将该菌株进行生物保藏，其保藏号为CGMCC NO.13044。本发明通过试验考察了凝结芽孢杆菌对氧化应激白羽肉鸡肠道形态结构和肠粘膜免疫因子mRNA相对表达水平的影响，通过实验证明当动物处于应激状态或发生胃肠道疾病时，添加本发明所述的凝结芽孢杆菌能对动物起到良好的作用效果，为凝结芽孢杆菌在实际中的应用提供理论依据。
附图说明
图1是所述凝结芽孢杆菌E21在MRS和YPD培养基上的菌落形态。
图2是所述凝结芽孢杆菌E21的营养体和孢子镜检图。
图3是所述凝结芽孢杆菌E21的扫描电镜图(SEM)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
该菌株来自于健康鸡的盲肠食糜，经过多重筛选和纯化试验得到该菌的纯菌株，该菌可以产酸也可以产孢，纯菌经过液体培养基培养后提取该菌DNA，然后采用16S通用引物进行扩增16SrRNA全长，扩增产物送到测序公司公司测序，测序结果经过BLAST比对发现和凝结芽孢杆菌相似度99％，证实该菌为凝结芽孢杆菌。该菌株用三代测序PacBio技术手段进行了全基因组测序，结果发现该菌株和市场上菌株均不一致，经鉴定为凝结芽孢杆菌E21。
本发明筛选到的凝结芽孢杆菌E21的生理生化性质如下：革兰氏阳性菌，兼性厌氧，能分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。目前学术界将其归属于芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属。
将筛选到的凝结芽孢杆菌E21进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年9月26日；凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans的保藏编号为CGMCC NO.13044。
该凝结芽孢杆菌菌株不同于普通芽孢菌，在普通营养琼脂培养基(NA)上生长不良，而在含糖的培养基MRS和YPD上生长良好。MRS和YPD培养基的菌落基本一致(如图1所示)，均为白色、边缘近规则的圆形，表面凸起且平滑，闪烁着油光，菌落不透明也不产生色素。凝结芽孢杆菌，产孢前经结晶紫染色后，用100倍油镜镜检，可见长杆状(图2左)。当生长到一定时期后，杆变短开始产孢且芽孢端生呈火柴杆状(图2右)。其营养体通过扫描电镜观察，发现为0.6-4μm两端钝圆的长杆状，多单独存在，不具鞭毛和纤毛(见图3)。
所述凝结芽孢杆菌E21具有优良的特性，包括较好的耐热性、耐酸性、胆盐耐受性、稳定性及高产L-乳酸能力。各种特性如下：
(1)耐热性方面：将所述凝结芽孢杆菌E21菌粉经100倍稀释处理后，用70℃、75℃、80℃、85℃、90℃不同温度加热5min，存留率均在95％以上，说明该菌耐热性较好，可以在饲料制粒中使用。
(2)耐酸性方面：将所述凝结芽孢杆菌E21加入到含胃蛋白酶1500U/mL的不同pH的人工胃液中，pH1.2、pH1.5、pH2.0、pH2.5，40℃下作用60min后菌存留率均超过90％，说明该菌可以适应动物的胃酸环境，从而可以顺利到达动物肠道。
(3)胆盐耐受性方面：将所述凝结芽孢杆菌E21接种到含0.3％、0.5％胆盐的培养液中培养24h，检测菌量，以不加胆盐的为对照，计算存留率。结果发现菌存留率仍高于90％，说明该菌可以适应动物肠道内环境。
(4)稳定性方面：将所述凝结芽孢杆E21菌菌粉置于干燥阴凉处、常温条件保存，每3个月跟踪一次菌量，跟踪12个月。结果发现，菌粉常温保存6个月，菌存活率在95％以上；保存12个月，存活率不低于90％。
(5)产L-乳酸方面：与嗜酸乳杆菌相比，所述凝结芽孢杆菌E21发酵液的pH值下降快，接种24h后的pH比嗜酸乳杆菌低，产L-乳酸量和嗜酸乳杆菌基本一致，用生物传感仪测L-乳酸含量高达26g/L。气相结果发现，与植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌相比，凝结芽孢杆菌产乙酸量明显偏高，此外还产生少量异丁酸和正丁酸。
实施例2
本试验用一种双吡啶除草剂—敌草快对白羽肉鸡进行攻毒，具体操作如下：
试验选择1日龄白羽肉鸡，预饲7天，淘去体重差异大的鸡苗，其余进行分组试验，试验分3个处理组，每个处理组4个重复(即4个栏位)，每个重复15只鸡，3个组按以下方式攻毒处理：
对照组：不添加任何微生态制剂，试验第21天，注射等量的生理盐水；
试验组1：不添加任何微生态制剂，试验第21天，采用腹腔注射的方式注射敌草快(15mg/kg体重，敌草快稀释浓度为15mg/mL)；
试验组2：饮水中添加106CFU/mL的凝结芽孢杆菌，试验第21天，采用腹腔注射的方式注射敌草快(15mg/kg体重，敌草快稀释浓度为15mg/mL)；
3个处理组，注射24h后对肉鸡进行屠宰并采样分析。
本试验用攻毒试剂—敌草快是一种双吡啶除草剂，能够将单电子转移给氧形成自由基，可诱导肠道的氧化损伤，破坏肠道屏障并引起大量炎症因子的释放。
本试验测定指标包括：白羽肉鸡屠宰后取一段空肠组织分析抗氧化性能指标，另取一段空肠测定绒毛高度和隐窝深度，并使用无菌玻片刮取空肠粘膜用于测定肠粘膜炎症因子mRNA表达水平。
1、抗氧化性能指标测定：空肠组织中的丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定，测定方法按试剂盒说明书进行。
2、空肠肠道形态结构测定方法：取长约2cm的一段空肠，用10％福尔马林固定24h以上，进行石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红(HE)染色，显微镜测定空肠绒毛高度和隐窝深度。
3、肠粘膜炎症因子mRNA表达水平的测定：按照试剂盒的要求，利用RNAExtraction Kit提取试剂盒(TakaRa)提取白羽肉鸡空肠粘膜总RNA，以2.2％甲醛变性凝胶电泳和NanaDrop-1000微量核酸测定仪检测总RNA的纯度和浓度，吸光度D260nm/D280nm>1.80表明纯度复合试验要求。cDNA合成反应参照PrimeScriptTM RT reagent kit反转录试剂盒(TakaRa)的要求进行。RT-PCR扩增反应参照Premix Ex TaqTM II荧光定量试剂盒(TakaRa)的要求进行，反应体系为20uL；cDNA 2uL(1200ng/uL)，上、下游引物各0.8uL(10umol/L)，2×SYBR Premix Ex Taq II 10uL，RNase free H2O 6.4uL；PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃10s，44个循环。扩增结束后分析溶解曲线，表达水平以目的基因与内参β-actin的比值表示。
表1测定肠粘膜炎症因子mRNA表达水平的免疫因子引物序列
实验结果如下：
1、凝结芽孢杆菌对敌草快刺激空肠形态结构的影响如表2所示，试验组1的空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均显著低于对照组(P<0.05)，而隐窝深度显著高于对照组(P<0.05)，说明敌草快破坏了空肠肠道形态结构，对空肠形态造成了不利影响。而饮水中添加凝结芽孢杆菌的试验组2在攻毒后的空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均显著高于试验组1(P<0.05)，表明攻毒后凝结芽孢杆菌有助于恢复空肠形态结构。
表2凝结芽孢杆菌对敌草快刺激空肠形态结构的影响
注:肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
2、凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡血清抗氧化指标的影响如表3所示，攻毒后试验组1的MDA含量显著高于对照组(P<0.05)，而SOD含量显著低于对照组(P<0.05)，说明敌草快攻毒后白羽肉鸡处于氧化应激状态。饮水中添加凝结芽孢杆菌的试验组2的MDA含量与试验组1没有显著性差异(P>0.05)，SOD含量低于对照组但显著高于试验组1(P<0.05)，说明凝结芽孢杆菌提高了攻毒后白羽肉鸡的抗氧化性能。
表3凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡血清抗氧化指标的影响
3、本实施例中试验组1的TLR4和TLR5相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)，表明攻毒后肠道物理屏障被破坏，有大量的微生物侵入肠道上皮组织。试验组2的TLR5相对表达水平显著低于试验组1(P<0.05)，表明凝结芽孢杆菌在一定程度上保护肠道屏障免受敌草快攻毒的影响。
凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡空肠粘膜免疫因子mRNA相对表达量的影响如表4所示，攻毒后试验组1的致炎因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的mRNA相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而抑炎因子IL-10的mRNA相对表达水平显著低于对照组(P<0.05)，说明攻毒后白羽肉鸡空肠粘膜中的致炎因子和抑炎因子mRNA表达失衡，致炎因子mRNA表达水平异常升高，使动物机体处于炎症状态。饲喂凝结芽孢杆菌的试验组2粘膜中的抑炎因子IL-10的mRNA相对表达水平显著高于试验组1(P<0.05)，而致炎因子IL-1β的mRNA相对表达水平显著低于试验组1(P<0.05)，TNF-α、IFN-γ的mRNA相对表达水平与试验组1虽然没有显著性差异(P>0.05)，但平均值均减小，表明凝结芽孢杆菌降低了空肠粘膜内致炎因子的表达水平，促进了致炎因子和抑炎因子的平衡。
攻毒后试验组1的TLR4和TLR5的mRNA相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而试验组2的TLR5的mRNA相对表达水平显著低于试验组1(P<0.05)，表明凝结芽孢杆菌在一定程度上保护肠道屏障免受敌草快攻毒的影响。
表4凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡空肠粘膜免疫因子mRNA相对表达量的影响
实施例3
将本发明获得的凝结芽孢杆菌进行发酵培养，该菌发酵利用15L发酵罐，发酵周期为24-30h，发酵菌量达100亿CFU/mL，其中发酵培养基配方为：豆粕3-5％，蛋白胨1-2％，玉米面3-5％，葡萄糖1-1.5％，磷酸氢二钾0.3-0.5％，硫酸锰0.02-0.1％，硝酸钠0.05-0.1％。发酵后经后处理等工艺后得到200亿CFU/g的凝结芽孢杆菌菌粉，所述凝结芽孢杆菌菌粉可以和其他益生菌配伍使用，也可单独在饲料中使用，也可以在肉鸡饲喂过程中饮水添加、单独使用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，并非对其进行限制；尽管参照前前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一株提高攻毒后畜禽动物的抗氧化应激能力的凝结芽孢杆菌E21，其特征在于：其分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.13044。
2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌E21，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌E21最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。
3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌E21，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌E21耐热温度为70℃-90℃，耐酸pH值范围为1.2-2.5，产L-乳酸。
4.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述饲料添加剂中含有含菌量为100-200亿CFU/g的凝结芽孢杆菌E21菌粉。
6.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌E21的发酵培养基配方为：豆粕3-5%，蛋白胨1-2%，玉米面3-5%，葡萄糖1-1.5%，磷酸氢二钾0.3-0.5%，硫酸锰0.02-0.1%，硝酸钠0.05-0.1%。
7.根据权利要求4所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌E21有助于恢复空肠形态结构。
8.根据权利要求4所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌E21提高了攻毒后白羽肉鸡的抗氧化性能。
9.根据权利要求4所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌E21与益生菌配伍使用；或者单独添加到饲料中使用；或者添加到饮水中使用。
10.根据权利要求4所述的凝结芽孢杆菌E21在制备用于提高畜禽动物抗氧化应激能力的饲料添加剂中的应用菌，其特征在于：所述畜禽动物为蛋鸡、鸭和猪。
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