CN109628346A - 发酵乳杆菌cqpc04及其在制备改善便秘的食品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.14493的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CQPC04，还公开了该发酵乳杆菌在制备改善便秘的食品中的应用，不仅丰富了乳酸菌菌种资源，而且扩大了发酵乳杆菌CQPC04的应用范围，有助于功能保健制品的开发，也给便秘的改善带来了新的希望。

Description

发酵乳杆菌CQPC04及其在制备改善便秘的食品中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌，还涉及该乳酸菌在制备食品中的应用。
背景技术
四川泡菜的生产过程是将新鲜的泡菜洗净，密封于坛内，在盐水中厌氧发酵浸泡的泡菜。泡菜水中含有丰富的天然乳酸菌，对泡菜风味和品质的形成起着关键作用，其使用可溶性成分(主要是糖和含氮物质)进行增殖，产生酸性物质并代谢出风味成分，使泡菜产生独特的酸脆口味。泡菜水中含有的乳酸菌主要包括发酵乳杆菌、L.短杆菌、干酪乳杆菌、发酵酵母菌、嗜酸乳杆菌等。乳酸菌种类的差异可能是由于地域、气候和生产工艺习惯等因素造成的。某些乳酸菌也被用作益生菌，对人体健康有多种益处，包括维持肠道菌群的微生态平衡、加强机体免疫功能、预防和抑制肿瘤发生、降低胆固醇、延缓机体衰老等。为了更好的利用这些微生物资源，应开展更广泛的分离和鉴定工作，积累丰富的菌种资源，开发出丰富的工业用益生菌种类。
便秘主要表现为排便困难，粪便干燥等。便秘导致肠道蠕动减缓，肠内有害菌增加，还能进一步引发其他肠道疾病。
发明内容
本发明的目的在于对泡菜水中的乳酸菌进行分离鉴定，并考察其对便秘的作用效果，以丰富乳酸菌菌种资源、开发功能保健制品。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CQPC04，保藏编号为CGMCC NO.14493。
2.发酵乳杆菌CQPC04在制备改善便秘的食品中的应用。
优选的，所述食品为发酵食品。
优选的，所述发酵食品为乳酸菌奶饮料、发酵乳、乳粉或乳粉胶囊。
本发明对泡菜水中的乳酸菌进行了分离鉴定，将其中一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)命名为CQPC04，于2017年8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.14493。
本发明的发酵乳杆菌CQPC04具有较强的抗胃酸能力，经pH3.0人工胃液处理3h后的存活率达到84.14％；同时该菌具有很好的耐胆盐能力，在0.30％胆盐中的生长效率达到无胆盐培养的66.38％。
活性炭诱导便秘小鼠模型实验结果显示，与模型组比较，发酵乳杆菌CQPC04灌胃处理能显著提高小鼠粪便含水率和小肠推进率，降低首粒黑便时间，减轻小肠绒毛的损伤程度；能显著提高便秘小鼠血清MTL(胃动素)、Gas(胃泌素)、AChE(乙酰胆碱酶)和SP(P物质)水平，同时显著降低便秘小鼠血清SS(生长抑素)水平；能增加便秘小鼠小肠c-Kit、SCF和eNOS的mRNA表达，同时减少iNOS的mRNA表达；高剂量组的效果更显著，对便秘具有良好的改善作用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种发酵乳杆菌CQPC04，消化道抗性强，而且可以有效地改善便秘，不仅丰富了乳酸菌菌种资源，而且扩大了发酵乳杆菌CQPC04的应用范围，有助于功能保健制品的开发，也给便秘的改善带来了新的希望。
附图说明
图1为发酵乳杆菌CQPC04的菌落形态。
图2为发酵乳杆菌CQPC04的革兰氏染色结果。
图3为发酵乳杆菌CQPC04的16S rDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标准，0为阴性对照，1为发酵乳杆菌CQPC04。
图4为小鼠实验过程中的体重变化。
图5为小鼠实验过程中的粪便含水率变化。
图6为小鼠首粒黑便时间，##表示与正常组比较存在极显著差异(p<0.01)；*与**分别表示与模型组比较存在显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异。
图7为小鼠小肠组织病理学切片观察，其中N为正常组，M为模型组，L为CQPC04低剂量组，H为CQPC04高剂量组，BS为比沙可啶组。
图8为小鼠小肠中SCF、c-Kit、iNOS和eNOS mRNA表达水平，##表示与正常组比较存在极显著差异(p<0.01)；*与**分别表示与模型组比较存在显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
一、发酵乳杆菌CQPC04的分离与鉴定
1、实验材料
采自重庆市南岸区农家自然发酵泡菜水6份，分别吸取40mL泡菜水放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。
2、乳酸菌的分离纯化
分别取1mL泡菜水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-6，然后分别取10-4、10-5、10-6 3个梯度的稀释液100μL进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。
编号为CQPC04的菌株菌落形态如图1所示，菌落颜色多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑。
3、乳酸菌的初步鉴定
挑取平板上的纯菌落接种于5mL MRS液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1mL于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。
编号为CQPC04的菌株革兰氏染色呈现阳性，在100倍油镜下，菌株细胞形态如图2所示，细胞形态有长杆、短杆，且不存在出芽生殖。
4、乳酸菌DNA提取
将已纯化的疑似目标菌株接种于MRS肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。提取的DNA放于-20℃冰柜保藏备用。
5、基因组DNA PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
取提取的DNA，PCR扩增16S rDNA，其中上游引物27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，SEQ ID No.1)1μL、下游引物1495R(5'－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3'，SEQ IDNo.2)1μL、2×Taq plus Buffer 12.5μL、模板DNA 1μL，用无菌dd H2O将体系补足至25μL。以无菌超纯水替代模板DNA作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环；最后72℃延伸5min。然后取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为110V，45min。
编号为CQPC04的菌株16S rDNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，阴性对照组的泳道无条带，表明PCR扩增过程中未受到污染；编号为CQPC04的菌株的泳道有一条长度约为1500bp的条带，符合预期扩增片段的长度。
将编号为CQPC04的菌株的16S rDNA扩增产物委托北京擎科生物技术有限公司进行测序，测得序列如SEQ ID No.3所示。使用NCBI中的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)程序对测得序列进行同源性比对分析，结果显示，编号为CQPC04的菌株为乳酸菌中的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，其与Gene Bank数据库中已知乳酸菌的同源性均达99％。
6、乳酸菌体外抗性筛选
(1)耐受0.3％胆盐的能力
在MRS-THIO培养基(含0.2％巯基乙酸钠的MRS肉汤)中添加猪胆盐使其浓度为0.3％，121℃灭菌15min；将活化好的5mL菌种以2％(v/v)的接种量分别接入不含胆盐(0.0％)的MRS-THIO培养基和含0.3％胆盐的MRS-THIO培养基中，以空白培养基(未接菌的MRS-THIO培养基)为对照，37℃培养24h后，分别测定上述不同浓度培养基的OD600nm值，按公式(1)计算菌株对胆盐的耐受力：
结果显示，编号为CQPC04的菌株对胆盐具有很好的耐受能力，在0.3％胆盐中的生长效率达到无胆盐培养的66.38±0.55％。
(2)人工胃液耐受性试验
人工胃液的配制：由0.2％NaCl和0.35％胃蛋白酶组成，用1mol/L HCl调节pH为3.0，再用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌备用。
在超净工作台中吸取5mL培养好的含菌培养基于10mL无菌离心管中，经3000r/min离心10min，弃去上层培养基并收集菌体，加入5mL无菌生理盐水混匀制成菌悬液，然后取1mL菌悬液与9mL pH 3.0的人工胃液混匀，取1mL混合液作为人工胃液处理0h的样品，剩余9mL混合液置于恒温水浴摇床(37℃，150r/min)中培养3h。0h和3h的样品分别经10倍梯度稀释，选择合适梯度采用平板涂布的方法测定活菌数，在MRS固体培养基上37℃培养48h，按公式(2)计算存活率(％)。
结果显示，编号为CQPC04的菌株具有较好的抗胃酸能力，经pH3.0人工胃液处理3h后的存活率达到84.14±6.06％。
二、发酵乳杆菌CQPC04对便秘的改善作用
1、实验动物
SPF级6周龄雌性昆明小鼠，50只，购于重庆医科大学实验动物中心。饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。
2、实验方法
50只小鼠适应性喂养一周后，随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、CQPC04高剂量组、CQPC04低剂量组和比沙可啶(主治急、慢性便秘的药物)组。整个实验周期为9天，正常组和模型组每天灌胃生理盐水；CQPC04高、低剂量组每天灌胃发酵乳杆菌CQPC04菌悬液，高剂量组浓度为5.0×109CFU/mL，低剂量组浓度为1.5×108CFU/mL；比沙可啶组每天按100mg/kg灌胃比沙可啶水溶液；每组小鼠灌胃体积均为0.1mL/10g.bw。从第7天至第9天，除正常组小鼠外，其余各组小鼠每天另外灌胃10％活性炭冰水0.2mL。
3、小鼠体重变化
实验期间每天称量小鼠体重。
小鼠体重变化如图4所示，在整个实验过程中，所有组小鼠体重都呈现上升趋势，而且与正常组小鼠体重比较，其余组小鼠的体重均不存在显著差异(p>0.05)，说明活性炭造模不会对小鼠的体重产生较大影响，这与其他研究报道相一致。
4、小鼠粪便含水率变化
实验期间每天收集小鼠粪便并计算粪便含水率。粪便含水率是评价便秘模型造模成功与否的关键指标之一，当出现便秘时，常常伴随着粪便含水率下降、排便困难等症状。
实验期间小鼠粪便含水率变化如图5所示，第1～6天各组小鼠的粪便含水率不存在显著差异(p>0.05)；从第7天造模开始，除正常组小鼠之外，其余各组小鼠的粪便含水率都出现了不同程度的下降，其中模型组小鼠的粪便含水率在第9天下降到最低，显著低于正常组(p<0.05)；而灌胃CQPC04菌悬液和比沙可啶的小鼠粪便含水率明显高于模型组，其中CQPC04高剂量组、比沙可啶组和正常组小鼠的粪便含水率接近且不存在显著差异(p>0.05)。有文献报道称乳酸菌可以刺激肠道分泌肠液，所以发酵乳杆菌CQPC04可能是通过刺激肠道分泌肠液从而增加粪便的含水率，进而起到缓解便秘的作用。
5、小鼠首粒黑便时间与小肠推进率计算
第9天灌胃完成之后，所有小鼠禁食不禁水24h，第10天所有小鼠均灌胃10％活性炭冰水0.2mL，然后将每组小鼠分为两小组，5只小鼠从灌胃活性炭冰水开始观察其排出首粒黑便的时间；剩余5只小鼠在灌胃活性炭冰水30min后处死并收集血浆备用，取上自幽门、下至回盲部的小肠部分，测量小肠长度和活性炭在小肠中的推进距离，按公式(3)计算小肠推进率。
首粒黑便时间是评价便秘严重程度的重要指标，当出现便秘症状时，肠道蠕动减慢，粪便在肠道中滞留时间变长。
各组小鼠的首粒黑便时间如图6所示，模型组小鼠的首粒黑便时间为197.6±7.67min，极显著高于正常组小鼠的首粒黑便时间(p<0.01)；CQPC04低剂量组的首粒黑便时间为177.8±6.72min，虽然高于正常组，但与模型组比较存在显著差异(p<0.05)；CQPC04高剂量组的首粒黑便时间为148.4±9.84min，与模型组比较存在极显著差异(p<0.01)。说明发酵乳杆菌CQPC04可以不同程度的缩短便秘小鼠排出黑便的时间，且随着菌液浓度的升高，小鼠排出黑便的时间越短。
发酵乳杆菌CQPC04对活性炭诱导便秘小鼠小肠推进率的影响如表1所示，各组小鼠的小肠长度之间不存在显著差异，说明活性炭造模不会对小肠长度产生影响；模型组小鼠的小肠推进率为38.60％，极显著低于正常组(p<0.01)；而给予便秘小鼠发酵乳杆菌CQPC04灌胃后，低剂量组的小肠推进率与模型组比较得到了显著提高(p<0.05)，高剂量组的小肠推进率和比沙可啶组的小肠推进率接近，与模型组比较存在极显著差异(p<0.01)。说明发酵乳杆菌CQPC04可以促进小肠蠕动，加快活性炭在小肠中的推动速度，减少活性炭在小肠中的滞留时间，从而对便秘起到一定的改善作用。
表1 CQPC04对活性炭诱导便秘小鼠小肠推进率的影响
注：##表示与正常组比较存在极显著差异(p<0.01)；*与**分别表示与模型组比较存在显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异。
6、小鼠小肠组织病理学切片观察
取0.5cm左右的小鼠小肠组织，立即放于10％福尔马林溶液中固定48h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行HE染色，在光学显微镜下观察组织形态变化。当小肠绒毛受到损伤后，肠道蠕动功能也会受到不同程度的影响，而肠道蠕动减慢是引起便秘的因素之一，所以小肠绒毛的完整性对评价便秘同样具有重要意义。
各组小鼠小肠的组织病理学切片观察如图7所示，正常组小鼠的小肠绒毛排列整齐均一，不存在断裂或皱缩现象，而模型组小鼠的小肠绒毛出现严重断裂和皱缩，而且杯状细胞不完整；虽然CQPC04高剂量组和低剂量组的小肠绒毛也有一定程度的皱缩和断裂，但是小肠绒毛明显比模型小鼠的小肠绒毛更为完整，而且高剂量组小鼠的小肠绒毛几乎与正常组和比沙可啶组小鼠的小肠绒毛形态一致。
5、小鼠血清MTL、Gas、SS、AChE和SP水平测定
取小鼠血浆，于4℃、4000r/min离心10min，收集上层血清，严格按照MTL、Gas、SS、AChE和SP的试剂盒说明，分别测定它们在血清中的水平。有研究报道，一些便秘患者的神经递质水平(如MTL、Gas、SS、AChE和SP)会发生变化。
结果见表2，与正常组相比，模型组小鼠血清中的MTL、Gas、AChE、SP水平均极显著降低(p<0.01)，SS水平极显著升高(p<0.01)；与模型组相比，CQPC04低剂量组小鼠血清中的MTL、Gas、AChE和SP水平有所提高，SS水平极显著降低(p<0.01)；CQPC04高剂量组小鼠血清中的MTL、Gas、AChE和SP水平均显著或极显著高于模型组(p<0.05或p<0.01)，SS水平同样极显著低于模型组(p<0.01)。
表2小鼠血清MTL、Gas、SS、AChE和SP水平
注：##表示与正常组比较存在极显著差异(p<0.01)；*与**分别表示与模型组比较存在显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异。
有研究报道，一些便秘患者的神经递质水平(如MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP)会发生变化。MTL是近年来评估胃肠道蠕动的重要指标，多数学者认为MTL能促进胃肠道各个部位的运动，而MTL释放的减少会降低胃肠道蠕动。Gas是一种重要的胃肠激素，它能促进胃液分泌、增加胃肠道的蠕动、加速胃排空，同时促进幽门括约肌松弛。目前Ach(乙酰胆碱)被认为是在肠道运动中起重要作用的两种神经递质之一，它们通过与其受体结合起到促进胃肠蠕动的作用。一般来说，AChE水平与Ach水平呈正相关。SP是胃肠运动神经元的兴奋性递质。它强烈促进消化道平滑肌的收缩，刺激小肠和结肠粘膜分泌水和电解质，并促进胃肠蠕动。上述实验结果显示，模型组小鼠血清中的MTL、Gas、AChE和SP水平极显著低于正常组，而比沙可啶组和CQPC04高剂量组能显著提高这些神经递质的水平，说明便秘的发生与MTL、Gas、AChE和SP水平下降有关，而发酵乳杆菌CQPC04可以提高这些神经递质水平，起到缓解便秘的作用。
SS能抑制胃肠激素的释放，还可以降低胃排空速度，减少平滑肌收缩，所有这些都可能导致便秘。上述实验结果显示，模型组小鼠血清中的SS水平极显著高于正常组，比沙可啶组和CQPC04高剂量组的SS水平均显著降低(p<0.05)，意味着发酵乳杆菌CQPC04对便秘有一定的改善作用。
6、小鼠小肠SCF、c-Kit、iNOS和eNOS mRNA表达水平测定
按照Trizol(Invitrogen公司)说明书提取小肠总RNA，用超微量分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，将每个样本的RNA浓度调整到同一水平(1μg/μL)。然后取1μg/μL的RNA样品1μL，加入(oligo)primer dT 1μL和无菌超纯水10μL，混合，65℃反应5min，再加入Ribolock RNase Inhibitor 1μL、100mM dNTP mix 2μL、5×Reaction buffer 4μL和Revert Aid M-mu/v RT 1μL，混匀，在42℃、60min和70℃、5min条件下合成cDNA。接着对目标基因进行反转录和扩增(所用引物序列见表3)。反应条件为：95℃变性15min，60℃退火1h，95℃延伸15min，总共40个循环。以GAPDH作为持家基因，通过2-ΔΔCT计算目标基因的相对表达量。
表3引物序列
结果如图8所示，与其它四组相比，正常组的SCF、c-Kit和eNOS的相对表达量最高，iNOS的相对表达量最低，模型组呈现与正常组完全相反的趋势；用发酵乳杆菌CQPC04给予小鼠灌胃后，小鼠小肠组织中的SCF、c-Kit和eNOS的相对表达量得到不同程度的提高，iNOS的相对表达量则有所降低，以上基因在CQPC04高剂量组小鼠小肠中的相对表达量与模型组相比具有显著差异(p<0.05)。
Cajal细胞(ICC)是一种特殊的间充质细胞，研究表明结肠ICC数量改变、细胞形态学改变和细胞网络结构异常都会导致结肠蠕动速度变慢，进而可能导致慢传输型便秘。c-Kit是ICC特异性标志物之一，SCF是C-kit受体的天然配体。研究发现便秘患者小肠中的ICC密度下降，并表明ICC的降低与乙状结肠中c-Kit基因表达的下调以及c-kit蛋白和mRNA表达的降低有关。上述实验结果显示，发酵乳杆菌CQPC04处理组小鼠小肠中的c-Kit和SCFmRNA表达均有所升高，表明发酵乳杆菌CQPC04处理可以增加便秘小鼠的ICC数量。
内皮功能障碍可能引起炎症，NO的生物利用度降低是内皮功能障碍的重要因素。NO由NOS(一氧化氮合酶)催化合成，NOS有三种不同的亚型，包括NOS1(nNOS)，NOS2(iNOS)和NOS3(eNOS)。在正常生理条件下，血管内皮细胞NO主要来自eNOS，其主要作用是调节正常生理功能。iNOS在静息状态下不表达，但在机体受到损伤或者其他病理条件下，则会产生大量的iNOS和NO。上述实验结果显示，发酵乳杆菌CQPC04可以上调eNOS的表达，下调iNOS的表达。
实施例3、利用发酵乳杆菌CQPC04制备发酵食品
发酵乳杆菌CQPC04原始菌种的保存：在温度-75℃下以30wt％甘油悬液形式保存，或在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存。
发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂的制备，采用下述两种方法中的任意一种：
第一种方法：将发酵乳杆菌CQPC04的原始菌种接种于经110℃灭菌10min的12wt％脱脂乳中，37℃培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂；然后将母发酵剂按3-5vol％接种于灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，凝乳中的活菌数约109cfu/mL，用作工作发酵剂。
第二种方法：将发酵乳杆菌CQPC04的原始菌种接种于MRS液体培养基中，37℃培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4vol％接种于MRS培养基中，培养16-18h，4℃、4000r/min离心15min，去除上清夜，细胞沉淀用无菌脱脂乳制成悬浮液，用作工作发酵剂。
1、制备乳酸菌奶饮料
将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到4℃，加入发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂使其浓度达到106cfu/ml以上，即得到含发酵乳杆菌CQPC04的乳酸菌奶饮料，4℃冷藏保存。
2、制备发酵乳
将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂，37℃发酵16h，即得到发酵乳杆菌CQPC04发酵乳，4℃冷藏保存。
或者，将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照原料乳体积的4％加入发酵乳杆菌CQPC04工作发酵剂，再按照原料乳体积的4％加入其它可共生的制备发酵乳的商业发酵剂(如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)，混匀，37℃混菌发酵至滴定酸度以乳酸计为0.6-0.7％，即得到混菌发酵乳，4℃冷藏保存。
3、制备乳粉
将原料乳(选自脱脂奶、鲜奶和复原奶中的一种或多种)在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，冷却到37℃，按照体积比3：1加入发酵乳杆菌CQPC04发酵乳，均质，真空浓缩，喷雾干燥，即得到含发酵乳杆菌CQPC04的乳粉。
4、制备乳粉胶囊
将含发酵乳杆菌CQPC04的乳粉装入胶囊壳中，即得到乳粉胶囊。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 重庆第二师范学院
<120> 发酵乳杆菌CQPC04及其在制备改善便秘的食品中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacggctac cttgttacga 20
<210> 3
<211> 1419
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌CQPC04 (Lactobacillus fermentum CQPC04)
<400> 3
ttaggcggtg gctctaaagg ttacccaccg actttgggtg ttaaaactct catggtgtga 60
cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120
agcgattccg acttcgtgca ggcgagttgc agcctgcagt ccgaactgag aacggtttta 180
agagatttgc ttgccctcgc gagttcgcga ctcgttgtac cgtccattgt agcacgtgtg 240
tagcccaggt cataaggggc atgatgatct gacgtcgtcc ccaccttcct ccggtttgtc 300
accggcagtc tcactagagt gcccaactta atgctggcaa ctagtaacaa gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat gcaccacctg 420
tcattgcgtt cccgaaggaa acgccctatc tctagggttg gcgcaagatg tcaagacctg 480
gtaaggttct tcgcgtagct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540
gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt 600
tagctccggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag cactcatcgt ttacggcatg 660
gactaccagg gtatctaatc ctgttcgcta cccatgcttt cgagtctcag cgtcagttgc 720
agaccaggta gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat tccaccgcta 780
cacatggagt tccactaccc tcttctgcac tcaagttatc cagtttccga tgcacttctc 840
cggttaagcc gaaggctttc acatcagact tagaaaaccg cctgcactct ctttacgccc 900
aataaatccg gataacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960
cgtgactttc tggttaaata ccgtcaacgt atgaacagtt actctcatac gtgttcttct 1020
ttaacaacag agctttacga gccgaaaccc ttcttcactc acgcggtgtt gctccatcag 1080
gcttgcgccc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtat gggccgtgtc 1140
tcagtcccat tgtggccgat cagtctctca actcggctat gcatcatcgc cttggtaggc 1200
cgttacccca ccaacaagct aatgcaccgc aggtccatcc agaagtgata gcgagaagcc 1260
atcttttaag cgttgttcat gcgaacaacg ttgttatgcg gtattagcat ctgtttccaa 1320
atgttgtccc ccgcttctgg gcaggttacc tacgtgttac tcacccgtcc gccactcgtt 1380
ggcgaccaaa atcaatcagg tgcaagcacc atcaatcaa 1419
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaatctccga agaggccaga a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgcaacag ggggtaacat 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaggttgtc caacttattg aga 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagtttgcc aagttggagt 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttctcagcc caacaataca aga 23
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtggacgggt cgatgtcac 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcagccatca cagtgttccc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atagcccgca tagcgtatca g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggggtcgttg atggcaaca 19

Claims (4)

1.发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CQPC04，保藏编号为CGMCC NO.14493。
2.权利要求1所述的发酵乳杆菌CQPC04在制备改善便秘的食品中的应用。
3.如权利要求2所述的发酵乳杆菌CQPC04在制备改善便秘的食品中的应用，其特征在于，所述食品为发酵食品。
4.如权利要求3所述的发酵乳杆菌CQPC04在制备改善便秘的食品中的应用，其特征在于，所述发酵食品为乳酸菌奶饮料、发酵乳、乳粉或乳粉胶囊。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110229769A (zh) * 2019-06-28 2019-09-13 江南大学 缓解pfoa毒害作用的多功能发酵乳杆菌ccfm1051、其发酵食品及应用
CN110692726A (zh) * 2018-07-10 2020-01-17 重庆第二师范学院 植物乳杆菌cqpc01及其在制备改善便秘的食品中的应用
CN114191490A (zh) * 2022-01-28 2022-03-18 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种发酵乳杆菌及其产物在抗氧化和抗肿瘤中的应用
CN114703105A (zh) * 2022-04-29 2022-07-05 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种复合益生菌在降血脂或缓解肥胖中的应用
CN114732834A (zh) * 2022-03-25 2022-07-12 善恩康生物科技（苏州）有限公司 发酵乳杆菌在制备预防和/或治疗血栓产品中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004022727A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Vri Biomedical Ltd Probiotic bacterium: lactobacillus fermentum
CN104381440A (zh) * 2014-07-17 2015-03-04 西南民族大学 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂制品及其预防便秘保健用途
CN104498383A (zh) * 2014-05-28 2015-04-08 西南大学 一种可调节肠道运动、预防便秘的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum strain suo及其用途
CN104531549A (zh) * 2014-05-28 2015-04-22 西南大学 一种可调节肠道运动、预防便秘的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum zhao及其用途
CN107227275A (zh) * 2017-07-06 2017-10-03 西南大学 一种发酵乳杆菌hy01及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004022727A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Vri Biomedical Ltd Probiotic bacterium: lactobacillus fermentum
CN104498383A (zh) * 2014-05-28 2015-04-08 西南大学 一种可调节肠道运动、预防便秘的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum strain suo及其用途
CN104531549A (zh) * 2014-05-28 2015-04-22 西南大学 一种可调节肠道运动、预防便秘的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum zhao及其用途
CN104381440A (zh) * 2014-07-17 2015-03-04 西南民族大学 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂制品及其预防便秘保健用途
CN107227275A (zh) * 2017-07-06 2017-10-03 西南大学 一种发酵乳杆菌hy01及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUAYI SUO等: "Therapeutic effect of activated carbon-induced constipation mice with Lactobacillus fermentum Suo on treatment", 《INT. J. MOL. SCI.》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110692726A (zh) * 2018-07-10 2020-01-17 重庆第二师范学院 植物乳杆菌cqpc01及其在制备改善便秘的食品中的应用
CN110229769A (zh) * 2019-06-28 2019-09-13 江南大学 缓解pfoa毒害作用的多功能发酵乳杆菌ccfm1051、其发酵食品及应用
CN114191490A (zh) * 2022-01-28 2022-03-18 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种发酵乳杆菌及其产物在抗氧化和抗肿瘤中的应用
CN114732834A (zh) * 2022-03-25 2022-07-12 善恩康生物科技（苏州）有限公司 发酵乳杆菌在制备预防和/或治疗血栓产品中的应用
WO2023179274A1 (zh) * 2022-03-25 2023-09-28 善恩康生物科技（苏州）有限公司 发酵乳杆菌在制备预防和/或治疗血栓产品中的应用
CN114703105A (zh) * 2022-04-29 2022-07-05 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种复合益生菌在降血脂或缓解肥胖中的应用
CN114703105B (zh) * 2022-04-29 2022-12-27 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种复合益生菌在降血脂或缓解肥胖中的应用

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