CN110892935A - 一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌及其应用，乳双歧杆菌Probio‑M8经过耐酸耐胆盐筛选，具有较强的基因组稳定性，乳双歧杆菌Probio‑M8已经被证明具有增强机体免疫力、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性等多项功能。小规模人群试验表明，乳双歧杆菌Probio‑M8可以维持肠道菌群的丰富度，增加有益菌的丰度和减少潜在有害菌的丰度。乳双歧杆菌Probio‑M8显著的功能特性使其在多种形式的益生食品，如益生菌压片糖果、益生菌固体饮料中具有广泛的应用价值。

Description

一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌及其应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，特别涉及一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌及其应用。
背景技术
便秘的主要表现是排便次数减少和排便困难，许多患者的排便次数每周少于3次，严重者长达2～4周才排便一次，排便时间可长达30分钟以上。腹泻的主要表现是由乳糖不耐症、肠易激综合征、炎性肠病等引起的“拉肚子”的症状。便秘和腹泻影响生活质量的同时，也严重的威胁着身体健康。肠道菌群紊乱，菌群多样性降低是导致便秘和腹泻发生的主要因素。
发明内容
本申请的目的在于提供一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌Probio-M8(Bifidobacterium lactis Probio-M8)。
本申请的目的是通过以下技术方案实现的：
本申请所述乳双歧杆菌Probio-M8通过以下分离方法得到的：
所述乳双歧杆菌Probio-M8是从中国健康妇女母乳中分离的乳酸菌和双歧杆菌中，筛选出一株具有潜在益生特性的双歧杆菌。
将乳双歧杆菌Probio-M8菌种接入到MRS液体培养基，37℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力。对菌液进行倍比稀释，得到10-1～10-7稀释梯度。分别吸取200μL 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h。挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析。
其中MRS培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、Tween801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，在121℃下，灭菌15min。
所述乳双歧杆菌Probio-M8具有良好的抗胃肠道消化液耐受能力，具备作为益生菌的基本条件。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，该菌株已于2019年9月20日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.18610,该菌株的检测结果为存活。
所述的乳双歧杆菌Probio-M8菌株单菌落接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧生长良好，生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，菌落较小；革兰氏染色呈阳性，短杆状，单个、成对或成簇分布，两端呈楠球形，顶端有分叉；经16SrDNA比对鉴定为乳双歧杆菌。
本申请的另一目的在于提供一种乳双歧杆菌Probio-M8在治疗便秘的应用。
本申请的另一目的在于提供一种乳双歧杆菌Probio-M8在治疗腹泻的应用。
本申请的另一目的在于提供一种乳双歧杆菌Probio-M8在益生菌压片糖果中的应用。
本申请的另一目的在于提供一种乳双歧杆菌Probio-M8在益生菌固体饮料中的应用。
本申请的另一目的在于提供一种益生菌压片糖果的制备方法，所述制备方法包括：将原料混合过筛后，压片制得益生菌压片糖果，其中，所述原料包括权利要求1所述的乳双歧杆菌的菌粉、脱脂奶粉、水果粉、低聚半乳糖粉、木糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁。
可选的，所述益生菌压片糖果的原料质量配比为：菌粉3-4份、脱脂奶粉20-30份、水果粉25-35份、低聚半乳糖粉10-15份、木糖醇3.4-4.5份、微晶纤维素5-8份、硬脂酸镁0.5-1份。
本申请还提供一种根据上述方法制备的所述益生菌压片糖果，所述益生菌压片糖果中，益生菌活菌数为109CFU/g。
本申请的另一目的在于提供一种益生菌固体饮料的制备方法，所述制备方法包括：将原料混合后进行灌装，制得益生菌固体饮料，其中，所述原料包括权利要求1所述的干酪乳杆菌的菌粉、水果粉、低聚半乳糖粉、低聚果糖粉、麦芽糊精和柠檬酸。
可选的，所述益生菌固体饮料的原料质量配比为：所述益生菌固体饮料的原料质量配比为：菌粉2-3份、水果粉30-35份、低聚半乳糖粉12-15份、低聚果糖粉3.5-5份、麦芽糊精25-40份和柠檬酸0.5-1份。
本申请还提供一种根据上述方法制备的所述益生菌固体饮料，所述益生菌固体饮料中，益生菌活菌数为1010CFU/g。
本申请公开了一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌Probio-M8及其应用，乳双歧杆菌Probio-M8经过耐酸耐胆盐筛选，具有较强的基因组稳定性，乳双歧杆菌Probio-M8已经被证明具有增强机体免疫力、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性等多项功能。乳双歧杆菌Probio-M8的摄入可以增加肠道菌群的丰富度和多样性，促进肠道蠕动，使食物快速通过肠道，减少停留时间。具体的，双歧杆菌Probio-M8可产生醋酸及其它有机酸来降低结肠pH值，而较低的pH值可促进结肠蠕动，从而减少结肠转运的时间。在控制食物于结肠内的转运时间同时，调节便秘患者通便频率，软化粪便并缓解腹痛。小规模人群试验表明，乳双歧杆菌Probio-M8可以维持肠道菌群的丰富度，增加有益菌的丰度和减少潜在有害菌的丰度。乳双歧杆菌Probio-M8显著的功能特性使其在多种形式的益生食品，如益生菌压片糖果、益生菌固体饮料中具有广泛的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请中乳双歧杆菌Probio-M8模拟消化道耐受性的实验结果；
图2为本申请中每周排便用力程度改善情况的示意图；
图3为本申请中不同年龄阶段的人群的改善排便用力程度的示意图；
图4为本申请中不同年龄段人群改善排便类型的示意图；
图5为本申请中每周排便频次变化示意图。
具体实施方式
下面通过对本申请进行详细说明，本申请的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
本申请提供一株乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis Probio-M8)，该菌株已于2019年9月20日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.18610。
本申请提供的乳双歧杆菌Probio-M8在治疗便秘的应用。
本申请提供的乳双歧杆菌Probio-M8在治疗腹泻的应用。
本申请提供的乳双歧杆菌Probio-M8可在益生菌压片糖果中的应用。
本申请提供的乳双歧杆菌Probio-M8可在益生菌固体饮料中的应用。
本申请提供一种益生菌压片糖果的制备方法，所述制备方法包括：将原料混合过筛后，压片制得益生菌压片糖果，其中，所述原料包括权利要求1所述的乳双歧杆菌M8的菌粉、脱脂奶粉、水果粉、低聚半乳糖粉、木糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁。
在一种可实现的方式中，所述益生菌压片糖果的原料质量配比为：菌粉3-4份、脱脂奶粉20-30份、水果粉25-35份、低聚半乳糖粉10-15份、木糖醇3.4-4.5份、微晶纤维素5-8份、硬脂酸镁0.5-1份。
按照上述质量配比投放乳双歧杆菌的菌粉在所述益生菌压片糖果中，益生菌活菌数为109CFU/g，水分含量小于4％，在保质期内其活菌数无明显变化。
本申请提供一种益生菌固体饮料的制备方法，所述制备方法包括：将原料混合后进行灌装，制得益生菌固体饮料，其中，所述原料包括权利要求1所述的干酪乳杆菌Probio-M8的菌粉、水果粉、低聚半乳糖粉、低聚果糖粉、麦芽糊精和柠檬酸。
在一种可实现的方式中，所述益生菌固体饮料的原料质量配比为：菌粉2-3份、水果粉30-35份、低聚半乳糖粉12-15份、低聚果糖粉3.5-5份、麦芽糊精25-40份和柠檬酸0.5-1份。
按照上述质量配比投放乳双歧杆菌的菌粉在所述益生菌固体饮料中，所述益生菌固体饮料中，益生菌活菌数为1010CFU/g，水分含量小于4％，在保质期内其活菌数无明显变化。
本申请公开了一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌Probio-M8及其应用，乳双歧杆菌Probio-M8经过耐酸耐胆盐筛选，具有较强的基因组稳定性，乳双歧杆菌Probio-M8已经被证明具有增强机体免疫力、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性等多项功能。小规模人群试验表明，乳双歧杆菌Probio-M8可以维持肠道菌群的丰富度，增加有益菌的丰度和减少潜在有害菌的丰度。乳双歧杆菌Probio-M8显著的功能特性使其在多种形式的益生食品，如益生菌压片糖果、益生菌固体饮料中具有广泛的应用价值。
实施例1：乳双歧杆菌Probio-M8的分离、鉴定。
a.菌株活化方法
将乳双歧杆菌Probio-M8菌种接入到MRS液体培养基，37℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力。对菌液进行倍比稀释，得到10-1～10-7稀释梯度。分别吸取200μL 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h。挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析。
其中MRS培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、Tween80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g和蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，在121℃下灭菌15min。
b.分子生物学鉴定
将冷冻保存的供试菌株接种于TPY增菌液体培养基中，30℃恒温培养24h，经TPY传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
其中，TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温80 0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂和蒸馏水1L，在121℃下灭菌15min。
采用PacBio SMRT RSII第三代测序平台对乳双歧杆菌Probio-M8全基因组进行测定，其基因组长度1,948,830bp，GC(Guanine and Cytosine，鸟嘌呤和胞嘧啶)含量60.5％，染色体基因组含有1646个编码基因，64个RNA基因。
c.形态学特性
本申请的乳双歧杆菌Probio-M8具有如下形态学特征：菌种为革兰氏染色阳性，短杆状，单个、成对或成簇分布，两端呈楠球形，顶端有分叉。
d.菌落形态特性
本申请的乳双歧杆菌Probio-M8在MRS培养基上生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，菌落较小。
实施例2：乳双歧杆菌Probio-M8的菌株胃肠液耐受性。
图1为乳双歧杆菌Probio-M8模拟消化道耐受性的实验结果。
将PBS灭菌后，加入3.0mg/ml胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；将PBS灭菌后，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆汁，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胰液。
将复筛菌株活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml复筛菌液加入到4.5ml的pH 2.5模拟人工胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。之后，取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。
乳双歧杆菌Probio-M8在模拟胃液(pH 2.5)条件下存活3h后的活菌数呈现下降的趋势，在3h时的存活率为85.38％，在pH 2.5人工胃液中37℃保持3h后，转入pH 8.0的人工肠液中保持8h，其存活率高达97.25％。具有良好的胃肠道消化液耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效。
实施例3：乳双歧杆菌Probio-M8治疗便秘和腹泻的临床试验验证
临床随机选择到医院就诊的178例患有便秘或急慢性腹泻的患者为研究对象，其中便秘患者54例，腹泻患者123例，患者完全自愿的情况下，对乳双歧杆菌Probio-M8菌粉进行为期4周的临床试验验证，菌粉服用剂量为5.0×1010cfu/d。试验期间，每5天记录一次受试患者的排便频率和粪便形态，并在试验前和试验后采集粪便，测定受试患者体内主要肠道菌群的变化。试验结果证明，如表1所示，连续4周服用乳双歧杆菌Probio-M8菌粉，对便秘、急性腹泻和慢性腹泻患者的治疗有效率分别为98.1％、96.2％和88.6％，与试验前相比，患者粪便中的双歧杆菌数量明显增加(P＜0.05)，肠杆菌、肠球菌、拟杆菌的数量发生显著变化，接近健康人群肠道菌群结构。
表1试验分组及治疗有效率
Figure BDA0002275386580000051
实施例4：乳双歧杆菌Probio-M8益生菌发酵乳对志愿者便秘的改善。
招募具有便秘等肠道健康问题的受试者30人，进行7天排空，28d干预期的临床试验。根据临床便秘诊断标准，招募20-40岁年龄范围志愿者30名，食用含有乳双歧杆菌Probio-M8的益生菌发酵乳，双歧杆菌活菌数1.0×108cfu/g，每日一次，每次200g，试验周期28d。
饮用益生菌发酵乳后排便过程中的用力程度的变化情况如下图2所示，饮用益生菌发酵乳后，人均排便用力程度显著降低(p＜0.05)，饮用3周后排便用力改善率76％。如图3所示，不同年龄阶段的人群在饮用益生菌发酵乳后，排便用力程度均得到明显的改善(p＜0.05)，70后人群改善率达到100％。
饮用益生菌发酵乳后排便类型的变化情况如下图4所示，不同年龄段人群饮用益生菌发酵乳后，有效的改善了排便类型，粪便均变的光滑柔软，对70后人群改善尤为明显，改善率达到100％。饮用益生菌发酵乳后，粪便类型均变为光滑柔软更易排出，粪便类型得到了明显改善(p＜0.05)。
坚持饮用益生菌发酵乳患者的排便频次变化情况如下图5所示，不同年龄段人群饮用益生菌发酵乳后，其排便类型显著增加(p＜0.05)。
实施例5：乳双歧杆菌Probio-M8可以有效预防和治疗仔猪腹泻及母猪便秘。
选用36头胎次相近的母猪，如表2所示，随机分为对照组和试验组，对照组18头，饲喂基础饲料，试验组18头，饲喂基础饲料+乳双歧杆菌Probio-M8菌粉(1.5×108cfu/g)。结果表明：对哺乳母猪饲喂乳双歧杆菌Probio-M8菌粉，能够显著提高母猪的每日采食量，减少母猪的便秘现象，治疗有效率为76.3％，仔猪日增重提高28.6％，仔猪断奶重增加19.3％，同时对减少仔猪腹泻效果明显，治疗有效率为82.1％(p＜0.05)。
表2试验分组情况
Figure BDA0002275386580000061
实施例6：乳双歧杆菌Probio-M8益生菌固体饮料的制作。
1.原料配方(以基本100g计)
一种益生菌固体饮料的的制作步骤如下：每100g固体饮料包含麦芽糊精25g-40g、菌粉2g-3g、水果粉30g-35g、低聚半乳糖粉12g-15g、低聚果糖粉3.5g-5g、柠檬酸0.5-1.0g，以上各成分按照重量进行配比。
2.制作方法：
A、原料按比例配制。
B、混合：将经步骤A的原料过100目筛后倒入混合机，充分混匀。
C、灌装：经步骤B混匀后的原料倒入灌装设备，灌装塑封后得益生菌固体饮料产品。
3.检验：益生菌固体饮料倍比稀释后经平板计数，Probio-M8菌粉的活菌数大于1×1010CFU/g，，水分含量小于4％，在保质期内其活菌数无明显变化。
实施例7：乳双歧杆菌Probio-M8压片糖果的制作。
1.一种益生菌压片糖果，其制作步骤如下：
原料配制：脱脂奶粉20g-30g、益生菌菌粉3g-4g、水果粉25g-35g、低聚半乳糖粉10g-15g、木糖醇3.5g-4.5g、微晶纤维素5g-8g、硬脂酸镁0.5g-1g，以上各成分按照重量进行配比。
2.制作方法：
A、原料按比例配制。
B、混料：将经步骤A的原料倒入混合机(900r/h、30min)，混匀。
C、过筛和压片：经步骤B混匀后的原料通入筛选机，过80目筛后，进入压片机，得益生菌压片产品。
3.检验：益生菌片破碎后倍比稀释经平板计数，Probio-M8菌粉的活菌数大于1×109CFU/g，水分含量小于4％，在保质期内其活菌数无明显变化。益生菌压片糖果在片重差异、硬度、脆碎度方面符合国标。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一株用于治疗便秘和腹泻的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis Probio-M8)，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC No.18610。
2.权利要求1所述的乳双歧杆菌在治疗便秘的应用。
3.权利要求1所述的乳双歧杆菌在治疗腹泻的应用。
4.权利要求1所述的乳双歧杆菌在益生菌压片糖果中的应用。
5.权利要求1所述的乳双歧杆菌在益生菌固体饮料中的应用。
6.一种益生菌压片糖果的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将原料混合过筛后，压片制得益生菌压片糖果，其中，所述原料包括权利要求1所述的乳双歧杆菌的菌粉、脱脂奶粉、水果粉、低聚半乳糖粉、木糖醇、微晶纤维素和硬脂酸镁。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述益生菌压片糖果的原料质量配比为：菌粉3-4份、脱脂奶粉20-30份、水果粉25-35份、低聚半乳糖粉10-15份、木糖醇3.4-4.5份、微晶纤维素5-8份、硬脂酸镁0.5-1份。
8.根据权利要求5所述方法制备的益生菌压片糖果，其特征在于，所述益生菌压片糖果中，益生菌活菌数为109CFU/g。
9.一种益生菌固体饮料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将原料混合后进行灌装，制得益生菌固体饮料，其中，所述原料包括权利要求1所述的干酪乳杆菌的菌粉、水果粉、低聚半乳糖粉、低聚果糖粉、麦芽糊精和柠檬酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述益生菌固体饮料的原料质量配比为：菌粉2-3份、水果粉30-35份、低聚半乳糖粉12-15份、低聚果糖粉3.5-5份、麦芽糊精25-40份和柠檬酸0.5-1份。
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