CN110157650A - 一株分离自母乳的乳双歧杆菌m8及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一株分离自母乳的乳双歧杆菌M8，其微生物保藏编号为CGMCC No.16070，所述乳双歧杆菌M8在低温发酵乳、低温褐色乳酸菌饮料以及鲜榨果汁中均可保持较高的活菌数，并且，后酸化程度较低，从而在产品货架期期间能维持较高的活菌数，可以保证产品的稳定性，起到良好的调节肠道菌群的作用中能维持较高的活菌数。

Description

一株分离自母乳的乳双歧杆菌M8及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株分离的乳双歧杆菌M8及其应用。

背景技术

益生菌是指通过摄取适当的量、对食用者的身体健康能发挥有效作用的活性微生物，其中，双歧杆菌是定植于人体肠道内的益生菌，是健康人群肠道内的优势菌群。人体肠道菌群中双歧杆菌的结构组成不仅与宿主的年龄、性别相关，还与宿主的饮含结构和生活方式等相关。双歧杆菌属于放线菌科双歧杆菌属，革兰氏阳性，无鞭毛、不运动，不形成芽子，厌氧；双歧杆菌菌体形状各异，较典型的有V形、Y形、勺状、曲状，双歧杆菌主要存在于人类和哺乳动物的肠道内。

母乳是大自然的恩赐，是妈妈赠予宝宝的最好礼物。母乳喂养在新生儿喂养中得到大力的提倡，不仅因为母乳中的抗体以及适合新生儿的营养物质是其它来源乳制品无法模拟与替代，而且母乳中还蕴含着母亲能够给予新生儿的健康有益的人体共生菌群。这些菌群结构复杂，是传统培养方式无法获取的重要微生物资源。生理母乳喂养是先喂细菌再喂乳汁的过程，这个过程能够促进婴儿肠道正常菌群的建立，不仅利于母乳的消化吸收，而且能够促进免疫系统成熟，预防过敏的发生。因此，系统的分析健康妈妈母乳与婴儿肠道中的菌群结构，并从中筛选有益微生物的研究有着重大的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株乳双歧杆菌的新菌株Bifidobacterium LactisM8，所述乳双歧杆菌Bifidobacterium Lactis M8是2017年从84份中国健康妇女母乳中分离所得364株乳酸菌和双歧杆菌中，筛选出的一株具有潜在益生特性的乳双歧杆菌。

本发明提供的乳双歧杆菌(Bifidobacterium Lactis)M8已于2018年7月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址：中国北京，保藏号为CGMCC No.16070，为简便描述，以下将乳双歧杆菌(Bifidobacterium Lactis)M8简称为“乳双歧杆菌M8”。

本申请人发现，所述乳双歧杆菌M8具有良好的耐受人体消化道不良环境的能力，例如，具有优异的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，具备作为益生菌的基本条件，可以更好地发挥其益生作用。

进一步地，所述乳双歧杆菌菌株M8具有增强免疫抵抗作用、能够提高肠道菌群多样性以及增加肠道菌群稳定性等益生特点。

本发明所提供的乳双歧杆菌M8是从84份内蒙古健康妇女母乳中分离的364株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株耐酸和耐胆盐的益生菌。

在一种可实现的方式中，本发明的乳双歧杆菌M8通过如下方法分离得到的：

将一株新分离的菌种接入到MRS液体培养基，于37℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行倍比稀释，得到10^-1～10^-7稀释梯度，分别吸取200μL 10^-4、10^-5、10^-6、10^-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48～72h。挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检，保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析，经过分析后命名为乳双歧杆菌M8。

其中，MRS培养基的组成可以是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温-80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。

本申请所分离的乳双歧杆菌M8具有如下生物学特性：菌种为革兰氏染色阳性，短杆状，单个、成对或成簇分布，两端呈椭球形，顶端有分叉。

本发明的另一目的是提供所述乳双歧杆菌M8用于发酵剂或者添加剂的用途，特别是用于酸奶或保健食品的发酵剂或者添加剂的用途。

在一种可实现的方式中，所述乳双歧杆菌M8在所述酸奶或者保健食品中的添加量为7 ×10⁶cfu/mL，发酵或者添加方法为直投式发酵剂。

本申请的另一目的是提供一种含有乳双歧杆菌M8的发酵食品，所述发酵食品包括搅拌型酸牛奶、饮用型酸奶(酸牛奶与饮用型酸奶的生产工艺条件不一样，产品的黏度和口感不一样)、乳酸菌饮料、益生菌果汁、益生菌发酵剂和益生菌固体饮料。

在另一种可实现的方式中，所述含有乳双歧杆菌M8的发酵食品可以根据包括以下步骤的方法制备：

步骤1，将待发酵食品进行预处理；

步骤2，在步骤1预处理后的食品中接种乳双歧杆菌M8；

步骤3，对步骤2接种后的体系进行发酵，发酵至终点后进行冷却。

在步骤1中，所述预处理可以包括灭菌、均质以及添加食品添加剂等。

在步骤2中，所述接种可以采用现有技术中任意一种在食品基体中接种益生菌的方法。

在步骤3中，可以根据不同产品的需求，适应性采用不同的发酵条件，发酵终点也可以根据不同的具体需求而具体设定。

本申请的另一目的是提供一种制备搅拌型酸乳的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1-1，将鲜牛奶加热，加入白砂糖，搅拌至完全溶解，预热，均质，杀菌，冷却；

步骤1-2，步骤1制得的体系中接种基础发酵剂和乳双歧杆菌M8；

步骤1-3，发酵至发酵终点后冷却，并进行后熟处理。

可选地，所述方法可以具体包括如下步骤：

步骤1-1，将鲜牛奶加热至55-60℃，加入5wt％～10wt％的白砂糖，例如8wt％白砂糖，搅拌至完全溶解，预热至50℃～70℃，例如，65℃左右，在15～25MPa，例如，20Mpa压力下均质，于90℃～100℃下，例如95℃杀菌3～10分钟，例如5分钟，冷却至30℃～40℃，例如，35℃；

步骤1-2，接种基础发酵剂YF-L904(购自科汉森)和乳双歧杆菌M8，其中，乳双歧杆菌M8接种量为5×10⁶cfu/mL～8×10⁶cfu/mL，例如，7×10⁶cfu/mL，基于步骤1-1中所述鲜牛奶的重量，所述基础发酵剂的接种量为0.01‰～0.05‰，例如，0.03‰；

步骤1-3，发酵终点为pH值为4.0～5.0，例如4.5，发酵至发酵终点后冷却至30℃～40℃，例如，35℃，放置于3℃～6℃，例如，4℃下后熟8～15h，例如，12h，即得含有活性乳双歧杆菌M8的发酵乳。

本申请的另一目的在于提供一种制备低温饮用型酵乳的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤2-1，将鲜牛奶加热，加入白砂糖，搅拌至完全溶解，预热，均质，杀菌，冷却；

步骤2-2，接种基础发酵剂和乳双歧杆菌M8；

步骤2-3，发酵至发酵终点后冷却，在无菌条件下进行二次均质；

步骤2-4，进行后熟处理。

可选地，所述方法可以具体包括如下步骤：

步骤2-1，将鲜牛奶加热到55-60℃，加入5wt％～10wt％的白砂糖，例如8wt％白砂糖，搅拌至完全溶解，预热至50℃～70℃，例如，65℃左右，在15～25MPa，例如，20Mpa压力下均质，于90℃～100℃下，例如95℃杀菌3～10分钟，例如5分钟，冷却至30℃～40℃，例如，35℃；

步骤2-2，接种基础发酵剂YF-L904(购自科汉森)和乳双歧杆菌M8，其中，乳双歧杆菌M8接种量5×10⁶cfu/mL～8×10⁶cfu/mL，例如，7×10⁶cfu/mL，基于步骤2-1所述鲜牛奶的总重量，所述基础发酵剂的接种量为0.01‰～0.05‰，例如，0.03‰；

步骤2-3，发酵终点为pH值为4.0～5.0，例如4.5，发酵至发酵终点后冷却至30℃～40℃，例如，35℃，在无菌条件下进行二次均质，其中，二次均质条件为一级压力为3～8MPa，例如，5Mpa，二级压力为12～18MPa，例如，15Mpa；

步骤2-4，将二次均质后的体系放置于3℃～6℃，例如，4℃下后熟8～15h，例如，12h，即得含有活性乳双歧杆菌M8的低温饮用型酸乳。

本申请的另一目的在于提供一种制备低温褐色乳酸菌饮料的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤3-1，将鲜牛奶加热，加入葡萄糖，搅拌至完全溶解，保温，冷却；

步骤3-2，接种干酪乳杆菌LC-01(购自科汉森)和乳双歧杆菌M8；

步骤3-3，发酵至发酵终点后冷却；

步骤3-4，在无菌条件下进行二次均质；

步骤3-5，再加入已预混的糖液，所述糖液是指糖类物质与水的混合物，其中，所述糖类物质包括白砂糖，进行无菌均质。

可选地，所述方法可以具体包括如下步骤：

步骤3-1，将鲜牛奶加热到55-60℃，加入0.5wt％～5wt％的葡萄糖，例如2wt％葡萄糖，搅拌至完全溶解，在90℃～100℃下，例如，95℃保温1～5h，例如，2.5h，冷却至30℃～42℃，例如，37℃；

步骤3-2，接种干酪乳杆菌LC-01(购自科汉森)和乳双歧杆菌M8，其中，乳双歧杆菌M8接种量为3×10⁶cfu/mL～7×10⁶cfu/mL，例如，5×10⁶cfu/mL，基于步骤3-1鲜牛奶的总重量，所述干酪乳杆菌LC-01(购自科汉森)的接种量为0.03‰～0.08‰，例如，0.05‰；

步骤3-3，发酵终点为pH值为3.2～4.2，例如，3.7左右，发酵至发酵终点后冷却至30℃～40℃，例如，35℃；

步骤3-4，在无菌条件下进行二次均质，二次均质条件为一级压力为3～8MPa，例如，5Mpa，二级压力为15～20MPa，例如，18Mpa；

步骤3-5，再按照发酵乳基料与预混糖液的重量比为发酵乳基料的重量:预混糖液的重量＝1:3的比例加入已预混的糖液中，再进行无菌均质，无菌均质冷却后，即得含有活性乳双歧杆菌M8的低温褐色乳酸菌饮料。

本发明的乳双歧杆菌M8及与之相关的技术方案带来如下有益效果：

(1)所述乳双歧杆菌M8在低温发酵乳中可保持较高的活菌数，并且，后酸化程度较低，在本申请中，所述后酸化是发酵乳在正常发酵后，在贮存、运输和销售过程中，虽然环境温度比较低，但是菌体仍然能够利用残存的乳糖进行缓慢发酵，从而继续产生乳酸，使得发酵乳的酸度继续升高，积累到一定程度后，产生的过酸味让消费者无法接受，失去作为商品的价值；

(2)所述乳双歧杆菌M8在低温褐色乳酸菌饮料，低温褐色乳饮料作为活菌型乳饮料，在产品货架期期间能维持较高的活菌数，可以保证产品的稳定性，起到良好的调节肠道菌群的作用中能维持较高的活菌数；

(3)所述乳双歧杆菌M8在鲜榨果汁中能维持较高的活菌数，并且，保证果汁的风味不改变，从而使消费者在享用鲜榨果汁营养美味的同时，摄入高活性的益生菌，进而增加产品的附加值。

附图说明

图1示出乳双歧杆菌M8在模拟胃肠液中的存活率结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。

实施例1乳双歧杆菌M8的鉴定

a.菌株活化方法

将一株新分离的菌种接入到MRS液体培养基，于37℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行倍比稀释，得到10^-1～10^-7稀释梯度，分别吸取200μL 10^-4、10^-5、10^-6、10^-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48～72h。挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检，保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析。

其中MRS培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、Tween80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。

b.分子生物学鉴定

将冷冻保存的供试菌株接种于TPY增菌液体培养基中，于30℃恒温培养24h，经TPY传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g 离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。

其中，TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温80 0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。

采用PacBio SMRT RSII第三代测序平台对乳双歧杆菌M8全基因组进行测定，测定结果为：基因组长度1,948,830bp，GC含量60.5％，染色体基因组含有1646个编码基因，64个RNA基因。

c.形态学特性

所述乳双歧杆菌M8具有如下形态学特征：菌种为革兰氏染色阳性，短杆状，单个、成对或成簇分布，两端呈椭球形，顶端有分叉。

d.菌落形态特性

所述乳双歧杆菌M8在MRS培养基上生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，菌落较小。

e.菌株胃肠液耐受性

(1)模拟胃液的制备方法：将PBS灭菌后，加入3.0mg/ml胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液。

(2)模拟肠液的制备方法：将PBS灭菌后，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟肠液。

(3)胃肠液耐受性实验方法：

将所述乳双歧杆菌M8菌株活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml复筛菌体悬液加入到4.5ml由(1)制备的pH＝2.5模拟胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。

之后，取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml的模拟肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数，每个样品做4个平行。

根据下式I分别计算菌株在模拟胃液以及模拟肠液中的存活率：

其中，N₁表示经过模拟胃液或者模拟肠液处理后菌株体系中的活菌数；

N₀表示菌株体系中初始活菌数。

实验结果如图1所示，由图1可知，乳双歧杆菌M8在模拟胃液(pH＝2.5)条件下存活3h后的活菌数呈现下降的趋势，在3h时的存活率为85.38％，在pH＝2.5人工胃液中37℃保持3h后，转入pH＝8.0的人工肠液中保持8h，其存活率高达97.25％。

由上述实验结果可知，本发明提供的所述乳双歧杆菌M8具有优良的胃肠液耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，并存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，发挥健康功效，而上述特性是菌株作为益生菌的基础。

f.生化特征

所述乳双歧杆菌M8是一种严格厌氧菌，在37℃显示出最佳的生长能力。

实验方法：采用API 50CH试剂条对乳双歧杆菌Bifidobacterium Lactis M8进行糖发酵特性的检测，具体Bifidobacterium Lactis M8的API 50CH鉴定结果如下表所示：

表1 Bifidobacterium Lactis M8糖发酵实验结果

其中，“+”表示能够被Bifidobacterium Lactis M8利用的底物，“-”表示不能够Bifidobacterium Lactis M8利用的底物。

由表1可知，Bifidobacterium Lactis M8可以很好地利用D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D- 核糖、D-木糖、L-木糖、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-棉子糖，不能利用半乳糖、果糖、甘露糖、山梨醇、海藻糖、松三糖、淀粉、葡糖糖酸钾等。

实施例2：BifidobacteriumLactis M8在低温搅拌型发酵乳中的应用

搅拌型发酵乳制备方法如下：

将鲜牛奶加热至55-60℃，加入8wt％白砂糖，搅拌至完全溶解，预热至65℃左右，20Mpa 压力下均质，95℃杀菌5分钟，冷却至35℃，接种基础发酵剂YF-L904和乳双歧杆菌M8，其中，乳双歧杆菌M8接种量为7×10⁶cfu/mL。发酵终点为pH值为4.5，发酵至发酵终点后冷却，放置于4℃下后熟12h，即得含有活性乳双歧杆菌M8的发酵乳。

将所述发酵乳在4℃条件下存放21d，每7天取适量样品检测其中活菌数、pH值和滴定酸度变化，结果如表2所示。

表2 Bifidobacterium Lactis M8在低温发酵乳贮藏试验结果

由表2可知，在低温发酵乳中添加所述乳双歧杆菌M8，在贮藏期间持续保持较高的活菌数，且产品后酸化程度较弱，具有良好的滋味和气味。

实施3 Bifidobacterium LactisM8在低温饮用型酸乳中的应用

低温饮用型酵乳制备方法如下：

将鲜牛奶加热到55-60℃，加入8wt％白砂糖，搅拌至完全溶解，预热至65℃左右，20Mpa 压力下均质，95℃杀菌5分钟，冷却至35℃，接种基础发酵剂YF-L904和乳双歧杆菌M8，其中，乳双歧杆菌M8接种量7×10⁶cfu/mL。发酵终点为pH＝4.5，发酵至发酵终点后冷却，在无菌条件下进行二次均质，均质条件为一级压力5Mpa，二级压力15Mpa，再放置于4℃下后熟12h，即得含有活性乳双歧杆菌M8的低温饮用型酸乳。

将制得的低温饮用型酸乳在4℃条件下存放26d，分别于第0天、第14天以及第26天取适量样品测定其中活菌数、pH值和滴定酸度变化，结果如表3所示。

表3 Bifidobacterium Lactis M8在低温饮用型酸乳中的应用贮藏试验结果

由表3可知，在低温饮用型酸乳中添加乳双歧杆菌BifidobacteriumLactis M8，在贮藏期间可以保持较高的活菌数，且产品后酸化程度较弱，感官状态良好。

实施例4 Bifidobacterium LactisM8在低温褐色乳酸菌饮料中的应用

低温褐色乳酸菌饮料的制备方法如下：

将鲜牛奶加热到55-60℃，加入2wt％葡萄糖，搅拌至完全溶解，95℃保温2.5h，冷却至 37℃，接种干酪乳杆菌LC-01和乳双歧杆菌M8，其中，乳双歧杆菌M8接种量5×10⁶cfu/mL。发酵终点为pH值为3.7左右，发酵至发酵终点后冷却，在无菌条件下进行二次均质，均质条件为一级压力5Mpa，二级压力18Mpa，再按1:3的比例加入已预混的糖液中，再进行无菌均质，无菌均质冷却后，即得含有活性乳双歧杆菌M8的低温褐色乳酸菌饮料。

将制得的低温褐色乳酸菌饮料在4℃条件下存放21d，每7天取适量样品检测其中的活菌数、pH值和滴定酸度变化，结果如表4所示。

表4 Bifidobacterium Lactis M8在低温褐色乳酸菌饮料中的应用贮藏试验结果

由表4的测定结果可知，低温褐色乳酸菌饮料中添加乳双歧杆菌BifidobacteriumLactis M8，在贮藏期间M8的存活率达到85.07％，且产品后酸化程度较弱，口感良好。

实施例5 Bifidobacterium Lactis M8在鲜榨果汁中的应用

将乳双歧杆菌M8添加应用于市售鲜榨果汁中，所述果汁包括蓝莓草莓混合汁、水蜜桃汁、奇异果汁、橙汁和西柚汁中，其中，乳双歧杆菌M8接种量为5×10⁷cfu/mL，在15℃下贮藏21d，分别于1d、7d、14d、21d测定各组样品的pH值和活菌数，测定结果如表5和表 6所示。

表5 Bifidobacterium Lactis M8在鲜榨果汁中的应用贮藏试验结果

表6 Bifidobacterium Lactis M8在鲜榨果汁中的应用贮藏试验结果

表5及表6中，M8表示乳双歧杆菌M8。

由表5及表6中的测定结果可知，鲜榨果汁中添加Bifidobacterium Lactis M8，在贮藏期间能维持所述鲜榨果汁中保持较高的活菌数。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一株分离自母乳的乳双歧杆菌M8(Bifidobacterium Lactis M8)，其微生物保藏编号为CGMCC No.16070。

2.权利要求1所述乳双歧杆菌M8用作发酵剂或者添加剂的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述乳双歧杆菌M8用作酸奶或保健食品的发酵剂或者添加剂。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述乳双歧杆菌M8在所述酸奶或者保健食品中的添加量为7×10⁶cfu/mL，发酵或者添加方法为直投式发酵剂。

5.一种发酵食品，其特征在于，所述发酵食品包括权利要求1所述乳双歧杆菌M8和/或所述乳双歧杆菌M8的发酵产物。

6.根据权利要求5所述的发酵食品，其特征在于，所述发酵食品包括酸牛奶、饮用型酸奶、乳酸菌饮料、益生菌果汁、益生菌发酵剂和益生菌固体饮料。

7.一种制备发酵食品的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，将待发酵食品进行预处理；

步骤2，在步骤1预处理后的食品中接种乳双歧杆菌M8；

步骤3，对步骤2接种后的体系进行发酵，发酵至终点后进行冷却。

8.一种制备搅拌型酸乳的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1-1，将鲜牛奶加热，加入白砂糖，搅拌至完全溶解，预热，均质，杀菌，冷却；

步骤1-2，步骤1制得的体系中接种基础发酵剂和乳双歧杆菌M8；

步骤1-3，发酵至发酵终点后冷却，并进行后熟处理。

9.一种制备低温饮用型酵乳的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤2-1，将鲜牛奶加热，加入白砂糖，搅拌至完全溶解，预热，均质，杀菌，冷却；

步骤2-2，接种基础发酵剂和乳双歧杆菌M8；

步骤2-3，发酵至发酵终点后冷却，在无菌条件下进行二次均质，；

步骤2-4，进行后熟处理。

10.一种制备低温褐色乳酸菌饮料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤3-1，将鲜牛奶加热，加入葡萄糖，搅拌至完全溶解，保温，冷却；

步骤3-2，接种干酪乳杆菌LC-01和乳双歧杆菌M8；

步骤3-3，发酵至发酵终点后冷却；

步骤3-4，在无菌条件下进行二次均质；

步骤3-5，再加入已预混的糖液，所述糖液是指糖类物质与水的混合物，其中，所述糖类物质包括白砂糖，进行无菌均质。