CN103060219A - 一种发酵乳饮料制造方法及其所应用的干酪乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌Lc JY68，其保藏号为CGMCC No：3567。本发明还公开一种发酵乳制品的制造方法，一，准备干酪乳杆菌Lc JY68的菌株培养液和双歧杆菌的菌株培养液进行活化、培养；二，制备原料乳；三，将干酪乳杆菌Lc JY68的菌株培养液添加到杀菌后的原料乳中进行培养，培养后的细菌、酵母和霉菌为零，大肠菌群为阴性；四，制备调配液；五，将步骤三中培养后的原料乳和步骤四中的调配液与干酪乳杆菌Lc JY68的菌株培养液进行混合搅拌后制得发酵乳制品，然后将成品进行冷藏保存。

Description

一种发酵乳饮料制造方法及其所应用的干酪乳杆菌

技术领域

本发明涉及一种发酵乳饮料制造方法及其所应用的干酪乳杆菌。

背景技术

目前一般采用的发酵乳饮料的制作方法是将乳酸菌接种到牛奶或其他兽乳或植物乳中进行培养，在培养物中添加适量的甜味料、香料和果汁，然后再经过稀释和均质处理后制得，其中有活菌型和培养后进行杀菌的灭菌型乳酸菌饮料两种，目前活性乳酸菌乳饮料商品中所使用的菌株均以一般益生菌所固有的改善肠内菌群和提高免疫力为主，但是这种乳饮料存在的缺点是：(1)对于牛奶蛋白过敏者无法使用，(2)且由于生产活性乳酸菌乳饮品需要很高的无菌操作技术，致使大部分国内企业还停留在生产非活性产品的地步。目前在活性乳酸菌乳饮料商品中，主要是以单一菌株或以数株乳杆菌发酵为主，还未见同时使用乳杆菌和双歧杆菌进行发酵的产品。目前的活性乳酸菌乳饮料中均以一般益生菌所固有的改善肠内菌群和提高免疫力为主要健康诉求点，还未见尤其是对牛奶蛋白过敏儿童也可以放心饮用的商品。另外活性乳酸菌乳饮料中均以砂糖为主要糖份原料，含热量高。目前国内市场上销售的活性乳酸菌乳饮料商品中活菌含量太低，再加上含乳饮料国家标准设定的下限值较低，一般均在10⁵个/毫升以下。

(1)至今在酸奶等乳制品和乳饮料中一般均使用保加利亚菌和嗜热链球菌，但该菌株不耐受胃酸和胆汁酸而不能活着到达肠道，因此也就起不到有效作用。

(2)目前生产厂家所使用菌株的功能性，均以一般益生菌所固有的改善肠内菌群和提高免疫力为主要健康声称。在国内还未见降低牛奶蛋白抗原性的菌株。由于生产发酵型乳酸菌乳饮料需要很高的无菌操作技术，致使大部分国内企业还停留在生产发酵后灭菌型(非活性)产品的地步。

一般降低了热量的产品其口感上很难达到消费者的要求。

由于发酵工艺的差异，目前对发酵乳饮料在保质期内很难保持10⁶个/毫升以上活菌数量级。

发明内容

本发明提供了一种发酵乳饮料制造方法及其所应用的干酪乳杆菌，它不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量。

本发明采用了以下技术方案：一种干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68，其保藏号为CGMCC No：3567。

本发明还公开了一种发酵乳饮料制造方法，它包括以下步骤：步骤一，准备干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液和双歧杆菌的菌株培养液进行活化，将活化后的干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液和双歧杆菌的菌株培养液分别接种到灭菌后的质量浓度为10-20％w/v的脱脂奶粉中进行培养；步骤二，制备原料乳：在质量浓度为10-20％w/v的脱脂乳粉中添加质量浓度为2-4％w/v葡萄糖进行搅拌形成原料乳，然后对原料乳进行杀菌冷却；步骤三，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液添加到杀菌后的原料乳中进行培养，培养后的细菌、酵母和霉菌为零，大肠菌群为阴性；步骤四，制备调配液：将发酵后的原料乳和无菌水按照1∶1的比例混合加入0.2-0.4％w/v的食品香料中，搅拌均匀制备成调配液；步骤五，将步骤三中培养后的原料乳和步骤四中的调配液与干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液进行混合搅拌后制得发酵乳制品，然后将成品进行冷藏保存。

步骤一中的Lactobacillus casei JY68的菌株培养液包含有干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68或包含有干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus和保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus，步骤一种的双歧杆菌的菌株培养液为短双歧杆菌Bifidobacterium breve、长双歧杆菌Bifidobacterium longum或者短双歧杆菌Bifidobacterium breve和长双歧杆菌Bifidobacterium longum的混合，脱脂奶粉含22-30％w/v的葡萄糖，步骤一种干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68的菌株培养液接种到脱脂奶粉中培养的温度在37℃，培养的时间为24-48小时，双歧杆菌的菌株培养液接种到脱脂奶粉中培养的温度在24℃，培养的时间为24-48小时。步骤三中培养的温度为35-37℃，培养的时间为7天。步骤五中冷藏保存的温度为2-7℃。

本发明具有以下有益效果：本发明的发酵乳制品中含有干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68和短双歧杆菌，干酪乳杆菌Lactobacilluscasei JY68不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，而且可以具有高耐酸性，强繁殖性，并且能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量，另外热量降低一半，保持爽口不腻的口感，满足了糖尿病患者或渴望低热量食品的消费者的需求，在保质期内的活菌数能维持在108CFU/毫升以上，大大高于现在市场上的商品含量。为使益生菌在保质期内能保持活菌数在108CFU/毫升以上的高数量级并且能以存活状态到达肠内，本发明中采用三段式发酵技术，其中大型发酵时间也从168小时发酵。同时在生产线上设定多个关键控制点，生产前后都对每个关键控制点进行细致的人工洗净和酸碱杀菌，使用高度的无菌操作技术进而预防了二次污染的发生。该专利产品属于低热量商品，使用甘素等零热量糖类代替部分白砂糖和葡萄糖。使对摄取砂糖有抵触感的人群也能放心饮用。

附图说明

图1为本发明的利用MEGA3.1生物学软件构建的系统发育树

具体实施方式

本发明为一种干酪乳杆菌，分类名称为干酪乳杆菌Lactobacilluscasei，参据的生物材料(株)：JY68，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.3567，保藏日期为2010年1月12日，结果是存活。干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68的菌株发酵后的产品其抗原价能减低到发酵前的1/1000，它是通过以下实验制得的：

一、乳酸菌株蛋白酶活性和肽酶活性试验：首先从日本购买4个菌株：lactobacillus casei subsp.casei L-14，Streptococcus lactissubsp.cremoris H-61，Streptococcus lactis subsp.lactis 527；Streptococcus thermophilus 510；又从Hansen公司购买的4个菌株：lactobacillus bulgaricus C2，lactobacillus helveticus C1，lactobacilluslactis C1，Streptococcus thermophilus C1；以及分离自新疆传统发酵乳的2个菌株：Lactobacillus casei JY68，Streptococcus diacetylactis F1菌株的蛋白酶活性和肽酶活性使用Forin法进行了测定。以对Glu-pNA等8种合成基质及酪蛋白的分解程度作为活性判断指标，发现Lactobacillus casei JY68和Streptococcus diacetylactis F1菌株有较大的蛋白酶活性和肽酶活性。

二、降低β乳球蛋白抗原性试验：接着将蛋白酶活性和肽酶活性较高的两个菌株接种至10％的灭菌脱脂乳中，对培养液中β乳球蛋白的抗原性利用ELISA法进行测试。酵液脱苦效果的感官评价试验。

三、然后将具有β乳球蛋白抗原性低减效果的2个菌株：Lactobacilluscasei JY68，Streptococcus diacetylactis F1添加到10％脱脂乳蛋白酶水解液中，以0.04％咖啡因的苦度为对照，对其脱苦效果进行了感官评价试验。通过以上试验，优选出不但具有较强的蛋白酶和肽酶活性，而且可以降低β乳球蛋白抗原性以及其发酵液不呈现苦味的干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68菌株。

干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的分离方法：以新疆采取的传统发酵乳分离样品，取1mL上述样品放入灭菌小试管中，接种于10mL石蕊牛乳培养基中，置于37℃恒温培养箱中增菌培养至酸化凝固并呈现粉红色时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中，将其放入厌氧培养罐中，置于37℃条件下培养48小时，形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，置于37℃条件下培养24小时，待菌株生长好后，再次划线接种于BL琼脂培养集中，37℃下厌氧培养48小时，记录观察菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为乳杆菌。将所述乳杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存。

干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的鉴定方法：

一、生理生化鉴定：参照伯爵氏细菌鉴定系统，对被试菌体的形态以及生理生化特性进行鉴定，采用梅里埃API 50CHL鉴定试剂盒对其生理生化特性进行鉴定。

二、16S rRNA序列鉴定：

1、采用的试剂：Taq酶、dNTP、DNAmarker、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB、SDS(购自北京宝杰罗生物科技有限公司)GoldView(购自北京塞百盛基因技术有限公司)。

2、PCR引物：16S rRNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：L1：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

L2：5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

3、菌体培养：将送检样品在平板上划线分离，培养24-30h后挑取单菌落接种到20ml液体培养基中，30℃200rpm培养20-24h。

4、基因组DNA提取：基因组DNA提取参照文献。

用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA(Wilson，1987)。(1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在37℃下培养24h；(2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清；(3)沉淀重悬于1.0ml 0.85％NaCl中。(4)室温13,000rpm离心2min，弃上清；(5)沉淀重悬于550μl1×TE中；(6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min；(7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育30min；(8)加30μl 10％SDS，37℃温育30min；(9)加100μl 5M NaCl充分混匀；(10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min；(11)加等体积(0.7-0.8ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀；(12)室温，13,000rpm离心10min；(13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)轻轻振荡混匀；(14)重复第12)步；(15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻振荡混匀；(16)重复第12)步；(17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后4℃静置30min；(18)20℃13,000rpm离心7min；(19)弃上清，加500μl 70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)；(20)4℃15,000rpm离心7min；(21)重复洗盐两次；(22)倒置离心管，干燥DNA沉淀7min。DNA沉淀溶于100μl 1×TE缓冲液，-20℃保存备用。

5、PCR扩增

反应体系为100μl：Taq(5U/μl)0.8μl；10×PCR Buffer(Mg2+Plus)10μl；dNTP Mixture(2.5mM/each)8μl；模板DNA 2.5ng；引物27F(10mol/L)2μl，引物1541R(10μmol/L)2μl；ddH₂O补足到100μl。

PCR反应条件：94℃for4min；94℃for 1min，58℃for 1min，72℃for1min30sec，30cycles；72℃for 5min；4℃save，end。

6、电泳检测

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。显色剂为GoldView。

7、序列测定

纯化后的PCR产物采用ABI3730基因测序仪测序。测序工作由上海生工技术有限公司完成。

8、序列分析与系统树的构建

采用序列图谱软件Chromas，参照正、反向序列图谱，对序列人工校对。从GenBank核酸序列数据库中下载戈登氏菌属相关模式菌株的16S rRNA基因序列，与所测的RR和RY菌株序列一起，用Clustal X软件进行序列比对(alignment)；然后利用MEGA3.1生物学软件构建系统发育树，采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析，并进行1000次重复的Bootstraps统计学检验。

三结果与分析

1、生理生化鉴定结果

经生理生化试验初步鉴定，JY68细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，接触酶阴性能在15℃和45℃条件下生长，能利用葡萄糖和果糖，初步鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)其生理生化特性见表1。

表1生理生化特征

注：+表示阳性；-表示阴性；W表示轻微利用

2 基于16S rRNA基因的分子生物学鉴定

2.1 16S rRNA基因测序结果

将JY68菌株的PCR反应产物送至上海生工技术公司测序，测得序列结果见如下序列表：

1    CTATACATGC AAGTCGAACG AGTTCTCGTT GATGATCGGT GCTTGCACCG AGATTCAACA

61   GGAACGAGT  GGCGGACGGG TGAGTAACAC GTGGGTAACC TGCCCTTAAG TGGGGGATAA

121  CATTTGGAAA CAGATGCTAA TACCGCATAG ATCCAAGAAC CGCATGGTTC TTGGCTGAAA

181  GATGGCGTAA GCTATCGCTT TTGGATGGAC CCGCGGCGTA TTAGCTAGTT GGTGAGGTAA

241  TGGCTCACCA AGGCGATGAT ACGTAGCCGA ACTGAGAGGT TGATCGGCCA CATTGGGACT

301  GAGACACGGC CCAAACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTAGGGA ATCTTCCACA ATGGACGCAA

361  GTCTGATGGA GCAACGCCGC GTGAGTGAAG AAGGCTTTCG GGTCGTAAAA CTCTGTTGTT

421  GGAGAAGAAT GGTCGGCAGA GTAACTGTTG TCGGCGTGAC GGTATCCAAC CAGAAAGCCA

481  CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGTG GCAAGCGTTA TCCGGATTTA

541  TTGGGCGTAA AGCGAGCGCA GGCGGTTTTT TAAGTCTGAT GTGAAAGCCC TCGGCTTAAC

601  CGAGGAAGCG CATCGGAAAC TGGGAAACTT GAGTGCAGAA GAGGACAGTG GAACTCCATG

661  TGTAGCGGTG AAATGCGTAG ATATATGGAA GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTGTCTGGT

721  CTGTAACTGA CGCTGAGGCT CGAAAGCATG GGTAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG

781  TCCATGCCGT AAACGATGAA TGCTAGGTGT TGGAGGGTTT CCGCCCTTCA GTGCCGCAGC

841  TAACGCATTA AGCATTCCGC CTGGGGAGTA CGACCGCAAG GTTGAAACTC AAAGGAATTG

901  ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTC GAAGCAACGC GAAGAACCTT

961  ACCAGGTCTT GACATCTTTT GATCACCTGA GAGATCAGGT TTCCCCTTCG GGGGCAAAAT

1021 GACAGGTGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA

1081 CGAGCGCAAC CCTTATGACT AGTTGCCAGC ATTTAGTTGG GCACTCTAGT AAGACTGCCG

1141 GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA TGACCTGGGC

1201 TACACACGTG CTACAATGGA TGGTACAACG AGTTGCGAGA CCGCGAGGTC AAGCTAATCT

1261 CTTAAAGCCA TTCTCAGTTC GGACTGTAGG CTGCAACTCG CCTACACGAA GTCGGAATCG

1321 CTAGTAATCG CGGATCAGCA CGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC

1381 CGTCACACCA TGAGAGTTTG TAACACCCGA AGCCGGTGGC GTAACCCTTT TAGGGAGCGA

1441 GCCGT

2.2 BLAST同源性比较结果

将所得16S rRNA测得序列，在NCBI网站中进行同源性搜索，JY68菌株与Lactobacillus casei 16Sr RNA相似度高达100％。

从Genbank中选择了菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X软件进行序列比对(alignment)，然后利用MEGA3.1生物学软件构建系统发育树，所构建的系统发育树见图1，JY68与Lactobacillus L.casei Shirota-AB531131亲缘关系最近，因此，进一步证明，JY68菌株为Lactobacillus casei。将其命名为Lactobacillus casei JY68。

本发明还公开了一种发酵乳饮料制造方法，它包括以下步骤：步骤一，准备干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液和双歧杆菌的菌株培养液进行活化，Lactobacillus casei JY68的菌株培养液包含有干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68或包含有干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus和保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus，双歧杆菌的菌株培养液为短双歧杆菌Bifidobacterium breve、长双歧杆菌Bifidobacterium longum或者短双歧杆菌Bifidobacterium breve和长双歧杆菌Bifidobacterium longum的混合，将活化后的干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液和双歧杆菌的菌株培养液分别接种到灭菌后的质量浓度为10-20％w/v的脱脂奶粉中进行培养，干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液接种到脱脂奶粉中培养的温度在37℃，培养的时间为24-48小时，双歧杆菌的菌株培养液接种到脱脂奶粉中培养的温度在24℃，培养的时间为24-48小时，脱脂奶粉含22-30％w/v的葡萄糖；步骤二，制备原料乳：在质量浓度为10-20％w/v的脱脂乳粉中添加质量浓度为2-4％w/v葡萄糖进行搅拌形成原料乳，然后对原料乳进行杀菌冷却；步骤三，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液添加到杀菌后的原料乳中进行培养，培养的温度为35-37℃，培养的时间为7天，培养后的细菌、酵母和霉菌为零，大肠菌群为阴性；步骤四，制备调配液：将发酵后的原料乳和无菌水按照1∶1的比例混合加入0.2-0.4％w/v的食品香料中，搅拌均匀制备成调配液；步骤五，将步骤三中培养后的原料乳和步骤四中的调配液与干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液进行混合搅拌后制得发酵乳制品，然后将成品进行冷藏保存，冷藏保存的温度为2-7℃。

Claims (5)

1.一种干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68，其保藏号为CGMCCNo：3567。

2.一种发酵乳饮料制造方法，它包括以下步骤：

步骤一，准备干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液和双歧杆菌的菌株培养液进行活化，将活化后的干酪乳杆菌Lactobacillus caseiJY68的菌株培养液和双歧杆菌的菌株培养液分别接种到灭菌后的质量浓度为10-20％w/v的脱脂奶粉中进行培养；

步骤二，制备原料乳：在质量浓度为10-20％w/v的脱脂乳粉中添加质量浓度为2-4％w/v葡萄糖进行搅拌形成原料乳，然后对原料乳进行杀菌冷却；

步骤三，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液添加到杀菌后的原料乳中进行培养，培养后的细菌、酵母和霉菌为零，大肠菌群为阴性；

步骤四，制备调配液：将发酵后的原料乳和无菌水按照1∶1的比例混合加入0.2-0.4％w/v的食品香料中，搅拌均匀制备成调配液；

步骤五，将步骤三中培养后的原料乳和步骤四中的调配液与干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液进行混合搅拌后制得发酵乳制品，然后将成品进行冷藏保存。

3.根据权利要求2所述的发酵乳饮料制造方法，其特征是步骤一中的Lactobacillus casei JY68的菌株培养液包含有干酪乳杆菌Lactobacilluscasei JY68或包含有干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus和保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus，步骤一种的双歧杆菌的菌株培养液为短双歧杆菌Bifidobacterium breve、长双歧杆菌Bifidobacterium longum或者短双歧杆菌Bifidobacterium breve和长双歧杆菌Bifidobacterium longum的混合，脱脂奶粉含22-30％w/v的葡萄糖，步骤一种干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液接种到脱脂奶粉中培养的温度在37℃，培养的时间为24-48小时，双歧杆菌的菌株培养液接种到脱脂奶粉中培养的温度在24℃，培养的时间为24-48小时。

4.根据权利要求2所述的发酵乳饮料制造方法，其特征是步骤三中培养的温度为35-37℃，培养的时间为7天。

5.根据权利要求2所述的发酵乳饮料制造方法，其特征是步骤五中冷藏保存的温度为2-7℃。

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