CN102533588B - 一株产胞外多糖的短乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产胞外多糖的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)及其应用。本发明的短乳杆菌BDLB0001保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5223。本发明的短乳杆菌BDLB 0001胞外多糖产量较高，所产的胞外多糖能够刺激B淋巴细胞增殖，增强免疫，在提高免疫力的药品、保健品、食品的应用方面具有广阔的前景。

Description

一株产胞外多糖的短乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产胞外多糖的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)及其在食品中的应用。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌总称，目前在自然界已发现的这类细菌在分类学上至少有23个属。在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等。乳酸菌是益生菌最主要的来源，许多乳酸菌是人体肠道固有的益生菌，已具有改善人体肠道菌群，调节机体免疫力，抑肿瘤，降低血清胆固醇，调节血压等重要的生理活性。
人类对乳酸菌在发酵乳制品和微生态制剂中的应用已取得了显著的进展。目前研究的热点是如何通过新型微生物发酵剂的开发而赋予发酵乳特定的功能性质。已知的乳酸菌发挥主要功能特性的作用机理，除了定殖、通过主要代谢产物(乳酸等)改善肠道内环境等以外，一些次生代谢产物如细菌素、胞外多糖等也发挥着非常重要的作用。其中具有理论和实际应用价值的乳酸菌胞外多糖(LAB EPS)引起了国内外许多学者的研究兴趣。
乳酸菌胞外多糖是乳酸菌产生并分泌到细胞外的一种多糖。与其他微生物多糖相比，乳酸菌EPS具有自己的特点，如良好的流变学特性，能改善发酵乳的风味、质地和性质，使产品增稠、稳定、乳化、保湿及胶凝，质地细腻均匀，口感润滑，是一种安全的食品添加剂。EPS还具有良好的生理功能，如增强黏膜吸附作用、抗肿瘤、抗溃疡、免疫调节、降胆固醇、降血压等。因此，开展产胞外多糖乳酸菌的研究，对于改善乳制品生产加工、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品，具有十分重要的研究意义和经济价值。开发具有益生功能的LAB EPS成为目前研究的热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有技术中缺乏高产胞外多糖的乳酸菌的不足，提供一株较高产胞外多糖的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。
本发明的技术方案如下：
本发明技术方案一：一株产胞外多糖的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5223。
本发明的技术方案二：一种短乳杆菌CGMCC No.5223的工作发酵剂，由包括以下步骤(a)或(b)的方法制备而得：
(a)将短乳杆菌CGMCC No.5223菌种接种于灭菌乳中培养至凝乳，连续培养活化两代作为母发酵剂；将母发酵剂按3-5％(v/v)接种于灭菌乳中培养至凝乳，即得工作发酵剂；
(b)将短乳杆菌CGMCC No.5223菌种接种于液体培养基中连续活化两代，然后将活化培养物按2-4％(v/v)接种于液体培养基中培养16-18h，固液分离得到细胞沉淀，将沉淀用无菌乳悬浮，即得工作发酵剂。
步骤(a)中，培养至凝乳的方法是常规方法，较佳的在37℃条件下培养14-16h。
步骤(b)中，在液体培养基中活化的方法是短乳杆菌的常规活化方法，较佳的在37℃条件下培养12-16h。所用的液体培养基是常规的短乳杆菌液体培养基，较佳的如MRS液体培养基。固液分离的方法是常规的菌体发酵液的固液分离方法，包括离心法、过滤法等，本发明优选离心法，更优选在4℃条件下4000r/min离心15min。
本发明所述的短乳杆菌CGMCC No.5223的工作发酵剂中，活菌数优选109cfu/mL以上。
本发明技术方案三：短乳杆菌CGMCC No.5223在发酵食品中的用途。
其中，所述的发酵食品是常规的发酵类食品，优选乳酸菌奶饮料或者发酵乳。
优选的，所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备的：原料乳灭菌后冷却然后加入短乳杆菌CGMCC No.5223工作发酵剂混合均匀，使短乳杆菌CGMCC No.5223浓度达到106cfu/mL以上，即得到含有所述短乳杆菌的乳酸菌奶饮料。
其中，所述的灭菌方法是常规的原料乳灭菌方法，较佳的如超高温瞬时灭菌，更佳的如在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s。待灭菌乳冷却后再加入所述的短乳杆菌工作发酵剂，冷却温度常规，较佳的冷却到40℃。
优选的，所述的发酵乳是按照下述步骤制备的：原料乳灭菌后冷却然后加入3-5％(V/V)短乳杆菌CGMCC No.5223工作发酵剂和3-5％(V/V)可共生的发酵乳商品发酵剂，混匀后发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7，即得到含有所述短乳杆菌的发酵乳。
其中，所述的灭菌方法是常规的原料如灭菌方法，较佳的如超高温瞬时灭菌，更佳的如在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s。待灭菌乳冷却后再加入所述的短乳杆菌工作发酵剂，冷却温度常规，较佳的冷却到37℃。发酵温度常规，较佳的为37℃。可共生的发酵乳商品发酵剂是常规的商品发酵剂，如保加利亚乳杆菌。
本发明的技术方案四：从短乳杆菌CGMCC No.5223中提取的胞外多糖。
其中，所述的提取的方法是常规的微生物胞外多糖的提取方法，优选的包括将短乳杆菌CGMCC No.5223的发酵液煮沸后离心以除去菌体和凝结蛋白，上清液用三氯乙酸法沉淀除去蛋白，然后用醇沉淀，沉淀溶解于水后再用水透析。
其中，所述的短乳杆菌的发酵液是常规的短乳杆菌发酵液，较佳的是将所述的短乳杆菌以5％(V/V)的接种量接种于含1％(w/v)葡萄糖的12％(w/w)脱脂乳中发酵培养而得的发酵液。较佳的是在30℃条件下培养30h而得发酵液。
其中，优选的离心条件是20min，10000g，4℃。三氯乙酸法是除蛋白的常规方法，较佳的添加三氯乙酸至终浓度4％(w/v)，静置过夜，4℃，10000g，离心20min除去沉淀蛋白。醇沉淀法也是常规的方法，较佳的采用乙醇，加乙醇至终浓度75％(v/v)，4℃静置24h，离心(20min，10000g，4℃)取沉淀。
本发明的技术方案五：所述的从短乳杆菌CGMCC No.5223中提取的胞外多糖在增强免疫药物、保健品或食品中的用途。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供了一株短乳杆菌CGMCC No.5223，其胞外多糖产量较高，所产的胞外多糖能够刺激B淋巴细胞增殖，增强免疫，在提高免疫力的药品、保健品、食品的应用方面具有广阔的前景。
保藏信息
本发明提供的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株BDLB0001，已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，其保藏编号为CGMCCNo.5223。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1示本发明所述短乳杆菌CGMCC No.5223的菌落形态。
图2示本发明所述短乳杆菌CGMCC No.5223的细胞形态(×1000)。
图3示本发明所述短乳杆菌CGMCC No.5223的生长曲线。
图4示本发明所述短乳杆菌CGMCC No.5223的最适生长温度。
图5示本发明所述短乳杆菌CGMCC No.5223的最适pH。
具体实施方式
本发明从乳酸菌生境中采集样品，筛选产胞外多糖的乳酸菌野生菌株，研究其多糖的生物活性，开发新的益生菌。
本发明提供一株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株BDLB0001。
本发明从自然发酵的泡菜中筛选出一株乳酸菌BDLB0001，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA对该乳酸菌BDLB0001鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，该菌株已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.5223。
本发明短乳杆菌CGMCC No.5223的形态学特征：
菌落特征：菌株在MRS平板上划线分离，37℃厌氧培养48h，菌株生长良好，其菌落形态如图1所示。菌落大小0.2-2mm，菌落圆形，边缘整齐，正面微凸起，颜色乳白中带点微黄色，不透明，表面湿润光滑，挑取能拉丝。
菌体特征：菌体呈短杆状(图2)，两端圆形，成对或单个排列，着色均匀，菌体大小一般为0.9μm×1.8μm，不产芽孢，革兰氏染色阳性。
本发明短乳杆菌CGMCC No.5223的培养特征：
短乳杆菌BDLB0001的最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，在30-40℃生长温度最佳；最高和最低初始生长pH为8.0和4.0，最适生长初始pH为6.0；菌株BDLB0001的延迟期相对较短，2h进入对数生长期，10h达到稳定期；菌株在胆盐浓度0.1％-0.4％范围内生长良好，具有良好的胆盐耐受性；BDLB 0001在≤7％NaCl浓度下生长良好，能够耐受9％NaCl。
本发明的短乳杆菌BDLB0001来源于传统发酵食品，属公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)菌种，可用于乳酸菌食品中。
因此，本发明还涉及所述的短乳杆菌BDLB0001在发酵食品中的用途。所述含有短乳杆菌BDLB0001的发酵食品是乳酸菌奶饮料和发酵乳。
本发明还提供所述短乳杆菌BDLB0001工作发酵剂。
本发明工作发酵剂较佳的是采用下述制备方法制备的：将短乳杆菌BDLB0001菌种接种于12％(w/v)的脱脂乳中，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使用；将母发酵剂按3-5％(v/v)接种于上述的灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，此时凝乳中活菌数约在109cfu/mL，得到所述的工作发酵剂；或者将短乳杆菌BDLB0001菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4％(v/v)接种于MRS培养基中，培养16-18h，在4℃条件下4000r/min离心15min，去除上清液，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂。
本发明中优选的所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备得到的：原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到40℃，再加入所述的短乳杆菌BDLB0001工作发酵剂，使其浓度达到106cfu/mL以上，在4℃冷藏保存即得到含有短乳杆菌BDLB0001的乳酸菌奶饮料。
本发明中优选的所述的发酵乳是按照下述步骤制备得到的：原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到37℃，再按照3-5％(V/V)加入所述短乳杆菌BDLB0001，再加入3-5％(V/V)可共生的制备发酵乳商品发酵剂，混匀后在37℃下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7，然后冷却至40℃，再进行冷藏保存得到含有短乳杆菌BDLB0001的发酵乳。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例1 短乳杆菌BDLB 0001的采集、分离
(1)、样品采集
从自然发酵的泡菜、传统发酵乳制品(酸奶、酸马奶酒等)、生牛乳、生面团、发酵香肠、腊肠、开菲尔粒(藏灵菇)、青贮饲料、婴儿粪便等中取样。将收集的样品放入冰盒内冷藏，保持在较低温度下带回实验室并放置于4℃冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离。
(2)、样品预处理
取固体样品20g(液体样品20mL)放入装有180mL 0.1％无菌蛋白胨水(蛋白胨1g，蒸馏水1000g)的250mL三角瓶(含玻璃珠)中，振荡后静置20min，备用。
(3)、产糖菌株的初步分离
使用0.1％无菌蛋白胨水以体积计按照1∶10对上述样品进行连续稀释，在每个稀释度取0.1mL稀释样品，分别涂布MRS琼脂平板、M17琼脂平板和SM琼脂平板，Modified MRS琼脂平板和ESM平板，在37℃厌氧条件下恒温培养24-48h，用无菌牙签挑取粘稠且有明显拉丝的单菌落。然后在相应的琼脂平板上划线分纯，得到纯的单菌落，进行革兰氏染色，接触酶实验。纯化菌株保藏在相应的分离培养基中，添加20％的甘油作为保护剂，-20℃冻存。
其中使用的培养基配方如下：
SM培养基(g/L)：120g脱脂乳粉，10g葡萄糖，880g水。
ESM培养基(g/L)：90g脱脂乳粉，3.5g酵母抽提物，3.5g蛋白胨，20g葡萄糖。(Van den Berg，D.J.C.，A.Smits，B.Pot，A.M.Ledeboer，K.Kersters，J.M.A.Verbakel，and C.T.Verrips.1993.Isolation，screening andidentification of lactic acid bacteria from traditional food process and culturecollections.Food Biotechnol.7：189-205.)
MRS培养基(乳杆菌选择性培养基，德国Merck公司)
M17培养基(乳球菌培养基BD Difco公司)
Modified MRS培养基：MRS培养基中葡萄糖的含量改为50g/L，其他组分不变。
不同样品在MRS琼脂培养基、M17琼脂培养基、Modified MRS琼脂平板、ESM琼脂培养基和SM琼脂培养基上共分离出700株菌。这些菌株在分离平板上表现出粘丝状、粘稠状和粘液状。
(4)菌株产胞外多糖
将从平板上得到的分离株接种到MRS液体培养基中培养18h，再按1％(V/V)的接种量接种到含50g/L葡萄糖的MRS液体培养基中，在30℃发酵24h。量取20mL培养液，沸水浴10min，冷却到室温，上清液加80％质量分数的三氯乙酸至终浓度4％(m/v)，4℃静置过夜，10000g离心20min，轻倾上清液于截留分子量14000的透析袋中，去离子水透析72h，每8h换水一次，定容。采用硫酸-苯酚法(Dubois M，Gilles KA，Hamilton JK，Pebers PA，SmithF.(1956).Colorimetric method of determination of sugars and related substances.Analytical chemistry.28(3)：350-356.)测定胞外多糖的含量。这些实验结果列于表1中。从表1中可以看出，菌株22-22产的粗多糖的产量相对较高，选取这株菌，命名为BDLB0001。
表1.产胞外多糖乳酸菌的初步分离(30℃，24h培养)
Figure BDA0000116605860000091
实施例2 短乳杆菌BDLB 0001的鉴定
(1)生理生化试验
菌株BDLB0001为革兰氏阳性、过氧化酶阴性、不运动的杆菌，在15℃和40℃能够生长，不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢，发酵葡萄糖产酸不产气，联苯胺试验阴性、吲哚试验阴性、甲基红试验阳性。
(2)利用糖发酵试验鉴定菌株
挑取少许菌株BDLB0001培养物划线MRS固体平板37℃厌氧培养24-48h。从平板上挑取单菌落，接入API 50CHL液体培养基(生物梅里埃中国有限公司，API 50CHL Medium)中制成菌悬液，接入API 50CHL鉴定试剂条(生物梅里埃中国有限公司)，37℃厌氧培养24-48h，记录菌株对49种碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件API LAB PLUS，这些反应结果如表2所示。经数据库查询，本发明的BDLB0001与短乳杆菌Lactobacillus brevis具有99.8％的同源性，因此，将本发明的短乳杆菌BDLB0001菌株初步鉴定为短乳杆菌。
表2.菌株BDLB0001碳源利用情况
Figure BDA0000116605860000101
注：“+”为反应阳性，“-”为反应阴性，“-+”为不能确定是否利用该碳源
(3)菌株BDLB0001的16s rDNA序列分析
菌株BDLB0001基因组DNA提取方法：挑取纯化的BDLB0001单菌落接种到1mL MRS液体培养基中，37℃培养14h后将菌液离心(5000g，10min)收集菌体。采用基因组DNA抽提试剂盒(TIAN GEN公司)提取。PCR扩增采用两种合成的通用引物(16s 27F：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16s1492R：CGGCTACCTTGTTACGACTT)，PCR产物采用切胶回收试剂盒(BioFlux)回收，纯化后送Invitrogen生物技术公司测序。所得菌株BDLB0001的16s rDNA核苷酸序列为1442bp(序列表中的SEQ ID NO：1)，送GenBank(GenBank accetion number：JN86880)做Blast分析。菌株BDLB0001同源性最高菌株的是L.brevis  ATCC 14687(GenBank accetion number：EF120367)，同源性为99％。
根据Goodfellow和O′Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及16SrRNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当16s rRNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株BDLB0001与L.brevis ATCC 14687属于同一个种。菌株BDLB0001鉴定为短乳杆菌。
依据形态特征、生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA对乳酸菌BDLB0001鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，该菌株已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.5223。
实施例3 BDLB0001菌株的生长特性
(1)BDLB0001菌株生长曲线的绘制
将活化好的短乳杆菌BDLB0001按1％(V/V)接种量接入MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h，每隔2h在600nm测定培养液的活菌数和pH值。培养液pH值用pH计测定，活菌数采用平板计数法，以活菌数对数值和pH值对时间作图得到菌株BDLB0001在MRS液体培养基中的生长曲线，其结果(图3)表明：短乳杆菌BDLB0001在MRS液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，10h左右进入稳定期。随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，进入稳定期后，pH下降趋势渐缓。24h培养结束时，培养液的pH值为4.63，培养液中活菌浓度可以达到108CFU/mL。
(2)BDLB0001菌株最适生长温度测定
将活化好的短乳杆菌BDLB0001按1％(V/V)接种量分别接于10mL MRS液体培养基中，分别置于15℃、37℃、40℃、45℃和65℃条件下恒温培养8h，以未接种的MRS液体培养基作对照，于620nm测定不同温度下培养的培养液的OD值，依据OD值的大小确定最适生长温度。结果表明：(图4)短乳杆菌BDLB0001的生长温度范围较广，从15℃到40℃都生长，在30℃-40℃生长良好，最适生长温度为35℃。
(3)BDLB0001菌株最适生长pH测定
将短乳杆菌BDLB0001接种到不同初始pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的MRS液体培养基中，在37℃下培养16h，以未接种的同pH值MRS液体培养基作对照，于620nm处测定培养液的OD值，依据OD值的大小确定最适生长pH值。结果表明(图5)：菌株BDLB0001在初始pH值4.0-7.0的MRS液体培养基中菌体生长良好，最适生长pH测定为6.0。
(4)短乳杆菌BDLB 0001对胆汁的耐受性试验
将活化的短乳杆菌BDLB 0001按1％(V/V)的接种量接种于含不同浓度(质量分数为0.0％，0.05％，0.1％，0.15％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％和0.4％)牛磺胆酸钠(TCA)的MRS液体培养基中，37℃恒温培养，于24h测定OD620，依据OD值的大小确定菌株对胆汁的耐受能力。人体小肠中胆盐含量在0.03％-0.3％之间波动，能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道转运过程中存活。如表3所示，随着胆盐浓度的增大，OD值在下降，菌株表现出不适应性。菌短乳杆菌BDLB 0001表现出良好的胆盐耐受性，胆盐浓度在0.1％-0.4％范围内菌株生长良好。说明菌株在人体小肠中可正常存活并生长繁殖，有开发为益生菌的潜力。
表3.短乳杆菌BDLB 0001在不同胆盐浓度培养基中的生长情况
(5)短乳杆菌BDLB 0001对NaCl的耐受性试验
将活化的短乳杆菌BDLB 0001按1％(V/V)的接种量接种于含不同浓度(质量分数为0％，2％，4％，6％，7％，8％，9％，10％和11％)NaCl的MRS液体培养基中，37℃恒温培养，以溴钾酚紫为指示剂，观察菌株NaCl的耐受性。结果列于表4中。短乳杆菌BDLB 0001在含≤7％NaCl浓度的培养基中生长良好，在9％NaCl浓度下生长缓慢，10％NaCl以上不生长，说明BDLB 0001具有良好的NaCl耐受性。
表4.短乳杆菌BDLB 0001对NaCl的耐受性
Figure BDA0000116605860000132
注：++为生长良好，+为生长，-为不生长
实施例4 短乳杆菌BDLB0001产胞外多糖的提取
(1)菌种活化：将短乳杆菌BDLB0001菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代。
(2)种子培养：短乳杆菌BDLB0001经活化后，接种于含1％葡萄糖的12％(w/v)脱脂乳在115℃灭菌15min的脱脂乳中，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵剂。
(3)发酵培养：将短乳杆菌BDLB0001以5％(v/v)的接种量接种于含1％葡萄糖的12％(w/v)脱脂乳中，在30℃条件下培养30h。
(4)EPS的提取纯化：将上述制备的发酵液首先经过沸水浴10min，以失活可降解多糖的酶，然后离心(20min，10000g，4℃)除去菌体和凝结蛋白，上清液浓缩至原体积的1/2，添加80％(w/v)三氯乙酸至终浓度4％(w/v)，静置过夜，离心(20min，10000g，4℃)除去沉淀蛋白，浓缩液加95％(v/v)乙醇至终浓度75％(v/v)，4℃静置24h，离心(20min，10000g，4℃)，取沉淀去离子水溶解，离心(20min，10000g，4℃)去沉淀，上清液去离子水透析72h，每8h换水一次，冷冻干燥得粗多糖样品。
实施例5 多糖的体外免疫活性研究
EPS细胞毒性实验及对T/B淋巴细胞的增殖反应
无菌操作取出BALB/C小鼠脾脏，制成脾细胞悬液。用淋巴细胞分离液(上海华美生物工程公司)分离淋巴细胞，PBS缓冲液(每升含0.144gKH2PO4，9.0g NaCl，0.795g Na2HPO4 7H2O，pH7.4)洗涤2次，用RPMI1640培养液(Biosharp Amresco公司)调整细胞浓度至1×106/mL的脾淋巴细胞悬液。96孔培养板每孔加入150μL脾淋巴细胞悬液和50μL不同浓度(10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL)的多糖样品，用有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA，5μg/mL，Sigma)诱导T淋巴细胞增殖，脂多糖(LPS，10μg/mL)诱导B淋巴细胞增殖，设阴性对照组(只含脾淋巴细胞悬液)和阳性对照组(添加有丝分裂原)，细胞毒性检验时不添加有丝分裂原。每实验组设3孔重复，置37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养72h。
(1)细胞毒性检验：采用MTT法(许德义，贾宏彬.大鼠杏仁核5-HT3受体参与免疫调制[J].生理学报，2001，53(5)：349-354)，培养结束前4h，每孔加入20μL MTT(5g/L，Sigma)，继续培养4h。培养结束后加二亚基砜DMSO150μL。酶联免疫检测仪于570nm测定A570值。其中：MTT溶液的配制：用D-hank′s液溶解MTT，搅拌使之完全溶解，定容，使MTT浓度为5mg/mL。
MTT法以实验周期短、操作简便、灵敏度高、重复性好而得到迅速发展和广泛应用，在细胞生物学、辐射生物学和免疫学等研究领域具有重要地位。MTT比色法的原理在于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使黄色的MTT还原为难溶性的蓝紫色结品物并沉积在细胞中(死细胞无此功能)，经二甲亚砜(DMSO)溶解后，利用酶联免疫检测仪在一定波长下测定的吸光度与活细胞线粒体的代谢能力呈正相关，进而反映细胞的增殖活性。经MTT比色法测定可知，添加不同浓度的粗多糖体外培养的小鼠脾淋巴细胞培养液与对照组相比，OD值之间没有显著差异，结果见表5。这说明粗多糖未显示细胞毒性。
表5.粗多糖的细胞毒性检测
Figure BDA0000116605860000151
(2)细胞增殖检验：采用3H-TdR掺入法(郭曲练，张阳德，邹望远等.鞘内泵入吗啡对大鼠细胞免疫功的影响[J].中华麻醉学杂志，2005，25(2)：118-121)，培养结束8h，每孔内加入20μL，3H-TdR(370kBq/mL)。培养结束后将各管细胞收集在49型玻璃纤维滤纸上，将纸烘干并置于PPO-POPOP(Sigma)闪烁液内过夜，用液闪仪测出各管的CPM值。其中：
3H-TdR工作液：原液为37MBq/mL，放射性比强度为0.925TBq/mmol，临用前用RPMI 1640培养液稀释至所需浓度(370kBq/mL)，3H-TdR一般临用时稀释。
闪烁液：POPOP(0.1-0.3g)中加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO(5.0g)，然后补足二甲苯至1L。配好的闪烁液需要闭光保存。
ConA溶液的配制：精确称取10mg ConA，用RPMI 1640培养液充分溶解，定容至100mL，浓度为100μg/mL。
LPS溶液的配制：精确称取10mg LPS，用RPMI1640培养液充分溶解，定容至100mL，浓度为100μg/mL。
3H-TdR方法与MTT法相比灵敏度高、稳定性好、经济实惠。3H-TdR方法基于细胞增殖周期中DNA，RNA合成增加，3H-TdR能被作为原料摄入细胞，测定细胞内3H-TdR放射量，反映了细胞增殖情况。
脾脏淋巴细胞中包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，两者含量基本相近。ConA作为T淋巴细胞有丝分裂原，仅促进T淋巴细胞的增殖，对B淋巴细胞不起作用，相反LPS仅能诱导B淋巴细胞增殖。粗多糖对LPS激活的B淋巴细胞增殖具有明显的促进作用(P＜0.01)(表6)，并且具有明显的剂依赖关系。粗多糖对经ConA激活的体外小鼠T淋巴细胞增殖并没有促进作用量。
表6.粗多糖对T/B淋巴细胞增值反应的影响
Figure BDA0000116605860000161
体外淋巴细胞培养实验显示，短乳杆菌BDLB0001产的胞外多糖无细胞毒性。体外免疫活性实验可知，短乳杆菌BDLB0001产的胞外多糖能显著增强B淋巴细胞的增殖反应，显示较强的免疫增强活性。
应用实施例1 短乳杆菌BDLB0001工作发酵剂
将短乳杆菌BDLB0001菌种接种于12％(w/w)在115℃灭菌15min的脱脂乳中，在37℃条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，作为母发酵剂使用；将母发酵剂按3-5％(v/v)接种于上述的灭菌乳中，培养14-16h至凝乳，此时凝乳中活菌数约在109cfu/mL，得到所述的工作发酵剂(1)。
将短乳杆菌BDLB0001菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养12-16h进行活化，连续活化两代，然后将活化培养物按2-4％(v/v)接种于MRS液体培养基中，培养16-18h，在4℃条件下4000r/min离心15min，去除上清液，得到细胞沉淀，将沉淀用一定量的无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂(2)。
应用实施例2 含有短乳杆菌BDLB0001的乳酸菌饮料
原料乳在95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后冷却到40℃，再加入应用实施例1所得的短乳杆菌BDLB0001工作发酵剂【工作发酵剂(1)或者(2)】，使其浓度达到106cfu/mL以上，在4℃冷藏保存即得到含有短乳杆菌BDLB0001的乳酸菌奶饮料。
应用实施例3 含有短乳杆菌BDLB0001的发酵酸乳
将原料乳鲜奶在95℃加热灭菌20min后，再冷却至37℃，以3-5％(v/v)的量加入应用实施例1所得的短乳杆菌BDLB0001工作发酵剂【工作发酵剂(1)或者(2)】，以及加入可共生的制备发酵酸乳的商业发酵剂保加利亚乳杆菌，该混合菌在37℃发酵至滴定酸度为0.6(以乳酸计)，冷藏至4℃并冷藏保存即得到含有短乳杆菌BDLB0001的发酵酸乳。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0000116605930000011
Figure IDA0000116605930000021

Claims (7)

1.一株产胞外多糖的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5223。 
2.一种包含权利要求1所述的短乳杆菌的工作发酵剂，其特征在于，由包括以下步骤（a）或（b）的方法制备而得： 
（a）将如权利要求1所述的短乳杆菌菌种接种于灭菌乳中培养至凝乳，连续培养活化两代作为母发酵剂；将母发酵剂按体积百分比3-5%接种于添加乳清蛋白的灭菌乳中培养至凝乳，即得工作发酵剂； 
（b）将如权利要求1所述的短乳杆菌菌种接种于液体培养基中连续活化两代，然后将活化培养物按体积百分比2-4%接种于液体培养基中培养16-18h，固液分离得到细胞沉淀，将沉淀用无菌乳悬浮，即得工作发酵剂，所述的工作发酵剂中活菌数为109cfu/mL以上。 
3.短乳杆菌CGMCC No.5223在发酵食品中的用途。 
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的发酵食品是乳酸菌奶饮料或者发酵乳。 
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的乳酸菌奶饮料是按照下述步骤制备的：原料乳灭菌后冷却然后加入如权利要求2所述的短乳杆菌的工作发酵剂混合均匀，使所述的短乳杆菌浓度达到106cfu/mL以上，即得到含有所述短乳杆菌的乳酸菌奶饮料。 
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的发酵乳是按照下述步骤制备的：原料乳灭菌后冷却然后加入体积百分比3-5%如权利要求2所述的包含短乳杆菌的工作发酵剂和体积百分比3-5%可共生的发酵乳商品发酵剂，混匀后发酵至滴定酸度以乳酸计0.6-0.7，即得到含有所述短乳杆菌的发酵乳。 
7.一种胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述胞外多糖的制备方法包括：将权利要求1所述的短乳杆菌的发酵液煮沸后离心以除去菌体和凝结蛋白，上清液用三氯乙酸法沉淀除去蛋白，然后用醇沉淀，沉淀溶解于水后再用水透析。 
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