CN107586741B - 一种植物乳杆菌及其在水果酵素产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011，其保藏编号为CCTCC M 2017366，其胞内物质、代谢产物中的DPPH自由基的清除率分别为3.5%、35.8%。将植物乳杆菌CCTCC M 2017366用于水果酵素产品的制备，结果表明含植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011发酵的水果酵素产品较自然发酵的水果酵素产品的DPPH自由基清除率至少提高40%，因此植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品中具有非常好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌，特别涉及一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SIT10011及其培养方法和其在发酵食品，特别是在水果酵素产品制备过程中的应用，属于微生物技术领域。
上述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SIT10011，其保藏编号为CCTCC M2017366。
背景技术
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（以下简称DPPH）自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基，其甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，深紫色的自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式。DPPH法是评价体外抗氧化活性的重要途径（Brand-Williams W, Cuvelier M E, Berset C. Use of a freeradical method to evaluate antioxidant activity[J]. LWT - Food Science andTechnology, 1995, 28(1):25-30.），DPPH自由基清除率是抗氧化性的一个重要指标。
常用的抗氧化剂主要是通过化学合成的，然而近年来的研究证实，许多化学合成的抗氧化物存在安全问题。随着消费者安全和健康意识的提高，天然的功能性食品越来越受到青睐。而，所以研究开发天然抗氧化功能性食品就成为一大趋势。
随着人们对自然、健康的追求，微生物来源的抗氧化剂成为当下研究的热点，随着科学技术不断发展以及研究方法的多样化和实用化，高抗氧化活性的菌株大量被发现。乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵性糖产生大量乳酸的细菌总称。它们不仅被广泛是非常安全的菌种（GRAS, Generally Regarded as Safe）而且在发酵过程中，可以代谢出对人体有益的各种物质。研究证实，乳酸菌具有不同的抗氧化活性，在合适条件下，这些具有氧化活性的菌种，有可能成为应用微生物学和科学食品工业的理想材料。
酵素产品是近年来新兴起来的食品品类，是含有丰富的维生素、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品。但就目前而言，酵素产品中大多采用自然发酵的方式生产，存在发酵时间长、发酵不可控等缺陷。研究表明，可以将乳酸菌应用于酵素产品的生产，不仅能很大程度上改善食品的风味，还可以增加产品的生物活性，提高产品的整体可接受性。但存在产生的生物活性较低的缺陷，如苹果酵素发酵后期DPPH自由基清除率提高24%（李飞, 王凤舞, 潘越,等. 苹果酵素抗氧化活性初步研究[J]. 青岛农业大学学报(自然科学版), 2016, 33(1):40-44.），蓝莓酵素发酵后期DPPH自由基清除率提高3.5%（管章瑞, 田裕, 赵娜,等. 蓝莓酵素发酵过程中的抗氧化活性变化研究[J]. 现代食品科技, 2016(12):74-80.），故筛选具有生物活性的乳酸菌生产兼具生物活性的酵素食品具有十分重要的研究意义和价值。
发明内容
本发明的目的之一是为了解决上述的乳酸菌对DPPH自由基清除率低等技术问题，而提供一种具有高DPPH自由基清除率的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011，其保藏编号为CCTCC M 2017366。
本发明的目的之二是提供上述的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的培养方法。
本发明的目的之三是提供上述的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品制备中的应用方法。
本发明的技术方案
一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011，是一种属于乳杆菌属的菌株，该菌株是从发酵果蔬制品中筛选出的高抗氧化性的乳酸菌生活环境中采集样品，通过DPPH自由基清除的方式筛选到的高抗氧化性的乳酸菌野生菌株，并通过DPPH自由基清除法确定菌株具有高抗氧化性，该菌种已保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址：湖北省武汉市武昌珞珈山 武汉大学 保藏中心，邮编：430072，保藏日期：2017年6月23日，其保藏编号为CCTCC M 2017366。
上述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011具有如下微生物学特征：
（1）、菌落特征：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌株在MRS平板上划线分离，37℃厌氧培养48h，菌株生长良好。其菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色稍微有点偏黄，不透明，表面湿润光滑，挑取能拉丝。
（2）、菌体特征：菌体呈杆状，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列，菌体大小一般为0.6μm×1.5μm，不产芽孢，革兰氏染色阳性。
（3）、培养学特征：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，在30-40℃生长温度最佳；最高和最低初始生长pH为9.0和4.0，最适生长初始pH为6.0；菌株CCTCC M 2017366的延迟期相对较短，3h进入对数生长期，10h达到稳定期。
（4）、遗传学特征
与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011同源性最高 菌株的是 L.plantarum c52 (Sequence ID：KX057697.1)，同源性为98％，16S rDNA见SEQ IDNO：1。
上述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011来源于传统发酵食品，属公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)菌种，可作为发酵剂用于乳酸菌食品中。
上述的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011，由于来源于传统发酵食品，因此可在发酵食品制备中应用，其中，所述的发酵食品是水果酵素产品，优选为苹果酵素、梨酵素、草莓酵素或黄桃酵素等。
上述的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品制备过程中的应用方法之一，具体包括如下步骤；
（1）、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：5-10的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用浓度为1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0-7.0，然后控制温度为105℃进行灭菌10min，然后自然冷却至37-40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩苹果汁、浓缩梨汁、浓缩黄桃汁或浓缩草莓汁等；优选为德乐食品饮品配料 上海 有限公司生产；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为0.5-5g：100mL的比例计算；
上述优选的，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为105℃进行灭菌10min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
（2）、菌种活化
用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种一环在MRS琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养至长出单菌落，优选培养24-48h，即得到平板活化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种；
（3）工作发酵剂的制备
用接种环取步骤（2）所得的平板活化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种一环接入装有50mL MRS肉汤培养基的250mL规格的三角瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养8-16h，得到培养液；
将上述所得的培养液控制转速为4000-6000 r/min进行离心15-30min，优选为5000 r/min进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1（所述的无菌磷酸盐缓冲溶液1，按每升计算，含磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，定容到1L，pH7.4，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存待用）1清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液2（同上述无菌磷酸盐缓冲溶液1）经4000-6000 rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液2的加入量以保证所得的工作发酵剂中植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
（4）发酵培养
将步骤（3）得到的工作发酵剂接入步骤（1）所得的发酵原料液中，然后控制温度为25-35℃进行发酵24-72h，所得的发酵液即为含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品；
上述工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为1-5：100；
优选的，将步骤（3）得到的工作发酵剂接入步骤（1）所得的发酵原料液中，然后控制温度为30℃进行发酵30h，工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为1：100。
上述的一种具有高DPPH自由基清除率的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品制备过程中的应用方法之二，具体包括如下步骤；
（1）、发酵原料液的制备同上述具有高DPPH自由基清除率的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品制备过程中的应用方法之一的步骤（1）；
（2）、菌种活化
用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种一环在MRS琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养至长出单菌落，优选培养24-48h，即得到平板活化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种；
然后挑取上述平板活化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011菌种并接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10-12h，得到活化一代的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌液；
然后将上述所得的活化一代的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011菌液，按体积比为2%的比例，将其接种到MRS液体培养基中，于37℃条件下培养10-12h，得到连续活化两代的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种培养物；
（3）、工作发酵剂的制备
将上述步骤（2）所得的连续活化两代的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种培养物按体积百分比2-5%接种于MRS肉汤液体培养基中，控制温度为37℃进行培养8-16h，得到培养液；
将上述所得的培养液控制温度为4℃，转速为4000-6000 r/min进行离心15-30min，优选离心转速为4000 r/min离心15min，离心所得的沉淀用步骤（1）所得的发酵原料液悬浮，即得工作发酵剂；
发酵原料液的用量，按最终所得的工作发酵剂中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
（4）发酵培养
同上述具有高DPPH自由基清除率的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品制备过程中的应用方法之一的步骤（4）。
上述的植物乳杆菌植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的胞内物质中的DPPH自由基清除率为3.5%，代谢产物中的DPPH自由基的清除率为35.8%，因此可以用于水果酵素产品制备中的进行应用；特别是在苹果酵素、黄桃酵素、梨酵素或草莓酵素等水果酵素产品制备中的应用。
本发明的有益效果
本发明的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011，经试验证明它具有DPPH自由基清除能力，其胞内物质中的DPPH自由基的清除率为3.5%，代谢产物中的DPPH自由基的清除率为35.8%。由于其具有很好的DPPH自由基清除能力，清除率越大表明抗氧化能力越强。因此具有一定的抗氧化活性。
进一步，本发明的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011用于水果酵素产品制备过程中，由于制备过程中利用低温杀菌、严格控制发酵温度，有效的降低了酵素产品营养成分的损失，最大限度的保留了酵素活性，因此，最终所得的水果酵素产品具有一定的抗氧化活性。
更进一步的，利用本发明的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011制备所得的水果酵素产品，其DPPH自由基清除率比自然发酵的水果酵素产品至少提高40%，且发酵时间短，发酵过程可控，因此该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素的制备中有非常好的应用前景。
附图说明
图1、实施例2中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的细胞形态（×1600）；
图2、实施例3中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的生长曲线；
图3、实施例3中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在不同温度下培养的培养液的OD600nm值情况；
图4、效果实施例1-4得到的应用实施例1-4含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品和相应对比实施例1-4中的空白水果酵素产品对DPPH自由基清除率的柱状图对比情况。
具体实施方式
下面通过具体的实施例并结合附图对本发明进一步进行阐述，但并不限制本发明。
本发明各实施例中所用的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011，其生物学名称为：Lactobacillus plantarum，于2017年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山 武汉大学 保藏中心。邮编：430072，其保藏编号为CCTCC M 2017366。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
本发明的各实施例中所用的无菌磷酸盐缓冲溶液1、2相同，以无菌磷酸盐缓冲溶液1为例，按每升计算，含磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，余量为蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存待用nog，其配制方法如下：
分别称取磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，用蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存，即得到无菌磷酸盐缓冲溶液1。
MRS琼脂培养基、MRS肉汤液体培养基（乳杆菌选择性培养基，北京陆桥公司购得）；
M17琼脂培养基（乳球菌培养基北京陆桥公司）；
本发明各实施例中所用的浓缩果汁如浓缩苹果汁、浓缩梨汁、浓缩草莓汁、浓缩黄桃汁等，为德乐食品饮品配料 上海 有限公司生产。
本发明的实施例中的DPPH自由基清除法，见“钟远声, 李熙灿, 谢学明,等. 荜茇清除DPPH自由基能力的研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2007, 9(1):144-145.”。
实施例1
一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的采集、分离，步骤如下：
（1）、样品采集
从自然发酵果蔬制品、传统发酵乳制品（乳扇、乳饼、酸奶、酸马奶酒等）、生牛乳、生面团、开菲尔粒（藏灵菇）、青贮饲料等中取样，将收集的样品放入冰盒内冷藏，保持在较低温度下带回实验室并放置于4℃冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离；
（2）、样品预处理
取固体样品10g（液体样品20mL）放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶（含玻璃珠）中，振荡后静置20min，备用；
（3）、具有高DPPH自由基清除能力乳酸菌的初步分离
使用无菌水以体积计按照1:10对上述样品进行连续稀释，在每个稀释度取0.1mL稀释样品，分别涂布MRS琼脂平板和M17琼脂平板在37℃厌氧条件下恒温培养24-48h，用无菌牙签挑取粘稠且有明显拉丝的单菌落。然后在相应的琼脂平板上划线分纯，得到纯的单菌落，进行革兰氏染色，接触酶实验。纯化菌株保藏在相应的分离培养基中，添加30％的甘油作为保护剂，-20℃冻存；
不同样品在MRS琼脂培养基和M17琼脂培养基上共分离出665株菌，这些菌株在分离平板上表现出粘丝状、粘稠状和粘液状。
（4）、菌株代谢产物中的DPPH自由基清除率
将从平板上得到的分离出665株分离株分别接种到MRS液体培养基中，在37℃培养24h，所得的培养液于4℃、4000 r/min离心15min，取上清液，采用DPPH自由基清除法测定菌株代谢产物的抗氧化性，实验结果列于表1中；
表1. 具有高DPPH自由基清除率的乳酸菌的初步分离(37℃，24h培养)
| 菌株编号 | DPPH自由基清除率（%） |
| 11-2 | 23.8 |
| 11-5 | 25.9 |
| 9-4 | 26.7 |
| 9-6 | 30.6 |
| 8-34 | 25.5 |
| 8-69 | 22.5 |
| 6-5 | 25.7 |
| 6-44 | 27.8 |
| 4-7 | 23.9 |
| 4-11 | 22.5 |
| 5-6 | 27.6 |
| 5-17 | 27.9 |
| 2-3 | 25.8 |
| 2-7 | 27.8 |
| 3-6 | 25.2 |
| 3-57 | 23.3 |
| P3 | 35.8 |
| P18 | 27.6 |
| YC-11 | 23.5 |
| YF-L811-2 | 22.9 |
从表1中可以看出，菌株P3的代谢产物的抗氧化性较高，结合菌落的拉丝性能，选取这株菌，命名为SITCC No.10011。
实施例2
将实施例1的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011进行微生物学鉴定
（1）、菌落特征：
将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌株在MRS平板上划线分离，37℃厌氧培养48h，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌株生长良好，其菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色稍微有点偏黄，不透明，表面湿润光滑，挑取能拉丝；
（2）、菌体形态特征：
采用革兰氏染色法法（周德庆. 微生物学教程[J]. 2011.）对步骤（1）中所得的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的菌体进行革兰氏染色观察，结果见图1所示，从图1中可以看出，菌体呈不运动的杆状，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列，菌体大小一般为0.6μm×1.5μm，不产芽孢，革兰氏染色阳性；
（3）、培养学特征：
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在30-40℃生长温度最佳；
最高生长pH为9.0、最低生长pH为4.0，最适生长pH为6.0；
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的延迟期相对较短，3h进入对数生长期，10h达到稳定期；
（4）、生理生化鉴定：
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011过氧化酶阴性；
（5）、遗传学特性：
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的16S rDNA序列分析
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011基因组DNA提取方法：挑取纯化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011单菌落接种到10mL MRS肉汤液体培养基中，37℃培养8h后将菌液离心(4000r/min，15min)收集菌体。
采用基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程（上海）股份有限公司)提取。PCR扩增采用两种合成的通用引物（16s 27F: GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，具体见SEQ IDNO：2；16s1492R：CGGCTACCTTGTTACGACTT，具体见 SEQ IDNO：3）PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程（上海）股份有限公司) 回收，纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所得植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的16S rDNA 核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO：1，为1477bp。
送 GenBank(GenBank accetion number ：GQ359860)做Blast 分析。菌株SITCCNo.10011同源性最高菌株的是 L.plantarum c52 (Sequence ID：KX057697.1)，同源性为98％。
根据Goodfellow和O′ Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及16S rRNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当16S rRNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株SITCC No.10011与L.plantarum c52属于同一个种。因此菌株SITCC No.10011鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
依据上述的菌落、菌体形态、培养学、生理生化鉴定等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA对乳酸菌SITCC No.10011鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），该菌株已于2017 年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），其保藏编号为CCTCCM 2017366。
实施例3
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的生长特性
（1）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的生长曲线
将活化好的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011按2％ (v/v)接种量接入MRS肉汤液体培养基中，37℃恒温培养16h，每隔1-2h在600nm测定培养液的OD值，以OD600nm值对时间作图得到植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在MRS肉汤液体培养基 中的生长曲线，其结果如图2所示，从图2中可以看出，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在MRS肉汤液体培养基中生长迅速，在3h左右进入对数期，10h左右进入稳定期；
(2)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011最适生长温度的测定
将活化好的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011按2％ (V/V)接种量分别接于10mL MRS肉汤液体培养基中，分别置于15℃、25℃、32℃、37℃、40℃和45℃条件下恒温培养10h，以未接种的MRS肉汤液体培养基作对照，于600nm测定不同温度下培养的培养液的OD值，结果如图3所示，依据OD600nm值的大小确定最适生长温度，从图3中可以看出植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的生长温度范围较广，从15℃到45℃都生长，在30℃-40℃生长良好，最适生长温度为37℃。
实施例4
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011胞内物质中的DPPH自由基清除率测定，具体步骤如下：
（1）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的培养
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10h进行活化，连续活化两代，所得的菌种活化液控制温度为4℃、转速为10000r/min离心20min，弃上清液，所得的沉淀用磷酸盐缓冲溶液（按每升计算，含磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，余量为蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存）重悬，使OD600nm=1，得到植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011细胞重悬液；
然后，按体积比计算，加入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011细胞重悬液1%（v/v）的溶菌酶（购买于生工生物工程（上海）股份有限公司，为白色晶体，溶于水，活性>22800U/mg），在37℃下，控制频率为50Ｈz，功率为200W进行超声破碎30min，每处理2s停顿2s，在显微镜下观察细胞形态，可以看出无完整细胞结构；
超声破碎结束后，控制温度为4℃条件下，10000rpm离心20min，取上清液作为待测样品液，待用；
（2）、用DPPH清除自由基法测植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011胞内物质中的DPPH 自由基清除率，步骤如下：
①、先进行预实验，取0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液2mL，往其中加入步骤（1）所得的待测样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下待测样品液的加样量，即为最大加样量；
取最大加样量的一半测其DPPH自由基清除率；
②、分别取最大加样量的一半的待测样品液于多孔板的A1、B1孔中，并在A1、B1孔中分别加入与待测样品液体积相等的无水乙醇；C1孔中加入为待测样品2倍体积的无水乙醇，
然后向A1孔中加入0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
向B1孔中再加入无水乙醇；
向C1中再加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量；
上述A1孔中0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的加入量为A1孔中加入的待测样品液的2倍；
B1孔中无水乙醇的加入量，,与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量相同；
C1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量，与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量相同；
混匀，黑暗环境反应30min；
③、用酶标仪在517nm处分别测A1、B1、C1孔中所得的反应液的OD值，A1、B1、C1孔中所得的反应液，每样至少做3次平行，取其平均值，根据DPPH自由基清除率公式计算植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） SITCC No.10011胞内物质中的DPPH 自由基清除率，测定结果为该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的胞内物质中的DPPH自由基清除率为3.5%，由此表明植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011可用于水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用。
上述DPPH自由基清除率的计算公式如下：
A1-对照组吸光度，即B1孔中的待测样品溶液和无水乙醇溶液的吸光度；
A2-样品组吸光度，即A1孔中的待测样品溶液和DPPH无水乙醇溶液的吸光度；
A0-空白组吸光度，即C1孔中的等体积无水乙醇溶液和等体积DPPH无水乙醇溶液的吸光度。
实施例5
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的代谢产物中的DPPH自由基清除率测定，具体步骤如下：
（1）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的培养
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10h进行活化，得到活化一代的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌液；
然后将上述所得的活化一代的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011菌液，按体积比为2%的比例，将其接种到MRS液体培养基中，于37℃条件下培养10h，得到的连续活化两代的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种培养物，控制温度为4℃、转速为10000r/min离心20min，取上清液作为待测样品液待用；
（2）、用DPPH清除自由基法测植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011的代谢产物中的DPPH自由基清除率，步骤如下：
①、先进行预实验，取0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液2mL，往其中加入步骤（1）所得的待测样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下待测样品液的加样量，即为最大加样量；
取最大加样量的一半测其DPPH自由基清除率；
②、分别取最大加样量的一半的待测样品液于多孔板的A1、B1孔中，并在A1、B1孔中分别加入与待测样品液体积相等的无水乙醇；C1孔中加入为待测样品2倍体积的无水乙醇，
然后向A1孔中加入0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
向B1孔中再加入无水乙醇；
向C1中再加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量；
上述A1孔中0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的加入量为A1孔中加入的待测样品液的2倍；
B1孔中无水乙醇的加入量，与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量相同；
C1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量，与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量相同；
混匀，黑暗环境反应30min；
③、用酶标仪在517nm处分别测A1、B1、C1孔中所得的反应液的OD值，A1、B1、C1孔中所得的反应液，每样至少做3次平行，取其平均值，根据DPPH自由基清除率公式（具体与实施例4中的DPPH自由基清除率公式相同）计算植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011的代谢产物中的DPPH自由基清除率为35.8%。
应用实施例1
一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在苹果酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
（1）、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩苹果汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
（2）、菌种活化
用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种一环在MRS琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养48h至长出单菌落，即得到平板活化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） SITCCNo.10011菌种；
（3）工作发酵剂的制备
用接种环取步骤（2）所得的平板活化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011菌种一环接入装有50mL MRS肉汤培养基的250mL规格的三角瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养12h，得到培养液；
将上述所得的培养液控制转速为5000 r/min进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入50ml无菌磷酸盐缓冲溶液2经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液2的加入量以保证所得的工作发酵剂中植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
（4）发酵培养
将步骤（3）得到的工作发酵剂接入步骤（1）所得的发酵原料液中，然后控制温度为30℃进行发酵30h，所得的发酵液即为含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011的苹果酵素产品；
上述工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为2：100；
应用实施例2
一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在梨酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
（1）、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩梨汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
（2）、菌种活化
同应用实施例1的步骤（2）；
（3）工作发酵剂的制备
同应用实施例1的步骤（3）；
（4）发酵培养
同应用实施例1的步骤（4），即将步骤（3）得到的工作发酵剂接入步骤（1）所得的发酵原料液中，然后控制温度为30℃进行发酵30h，所得的发酵液即为含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的梨酵素产品；
上述工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为2：100
应用实施例3
一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在黄桃酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
（1）、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩黄桃汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
（2）、菌种活化
同应用实施例1的步骤（2）；
（3）工作发酵剂的制备
同应用实施例1的步骤（3）；
（4）发酵培养
同应用实施例1的步骤（4），即将步骤（3）得到的工作发酵剂接入步骤（1）所得的发酵原料液中，然后控制温度为30℃进行发酵30h，所得的发酵液即为含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的黄桃酵素产品；
上述工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为2：100。
应用实施例4
一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在草莓酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
（1）、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度95℃下加热杀菌20min或在140℃下高温热杀菌2s，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩草莓汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
（2）、菌种活化
同应用实施例1的步骤（2）；
（3）工作发酵剂的制备
同应用实施例1的步骤（3）；
（4）发酵培养
同应用实施例1的步骤（4），即将步骤（3）得到的工作发酵剂接入步骤（1）所得的发酵原料液中，然后控制温度为30℃进行发酵30h，所得的发酵液即为含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的草莓酵素产品；
上述工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为2：100。
对比实施例1
空白苹果酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩苹果汁按体积比，即浓缩苹果汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白苹果酵素产品。
对比实施例2
空白梨酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩梨汁按体积比，即浓缩梨汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白梨酵素产品。
对比实施例3
空白黄桃酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩黄桃汁按体积比，即浓缩黄桃汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白黄桃酵素产品。
对比实施例4
空白草莓酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩草莓汁按体积比，即浓缩草莓汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白草莓酵素产品。
效果实施例1
含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的苹果酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比：
将上述应用实施例1和对比实施例1中的酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明应用实施例1中的含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011的苹果酵素产品的DPPH自由基清除率为84.0%，而对比实施例1中的空白酵素产品的DPPH自由基清除率为53.0%，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011的苹果酵素产品较空白酵素产品的DPPH自由基清除率提高了58.5%，即在发酵过程中可以大幅提高水果酵素产品的DPPH自由基清除率，由此表明，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品具有较高的DPPH自由基清除率，因此植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，具有高抗氧化性的潜能。
效果实施例2
含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的梨酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比：
将上述应用实施例2和对比实施例2中的酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明应用实施例2中含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的梨酵素产品的DPPH自由基清除率为67.8%，而对比实施例2中的空白酵素产品的DPPH自由基清除率为44.6%，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的梨酵素产品较空白酵素产品的DPPH自由基清除率提高了52.0%，即在发酵过程中可以大幅提高水果酵素产品的DPPH自由基清除率，由此表明，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品具有较高的DPPH自由基清除率，因此植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） SITCC No.10011在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，具有高抗氧化性的潜能。
效果实施例3
含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） SITCC No.10011的黄桃酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比：
将上述应用实施例3和对比实施例3中的酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明应用实施例3中含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的黄桃酵素产品的DPPH自由基清除率为64.5%，而对比实施例3中的空白酵素产品的DPPH自由基清除率为43.6%，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的黄桃酵素产品较空白酵素产品的DPPH自由基清除率提高了47.9%，即在发酵过程中可以大幅提高水果酵素产品的DPPH自由基清除率，由此表明，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品具有较高的DPPH自由基清除率，因此植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，并且具有高抗氧化性的潜能。
效果实施例4
含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的草莓酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比：
将上述应用实施例4和对比实施例4中的酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明应用实施例4中含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的草莓酵素产品的DPPH自由基清除率为79.6%，而对比实施例4中的空白酵素产品的DPPH自由基清除率为47.9%，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的草莓酵素产品较空白酵素产品的DPPH自由基清除率提高了66.2%，即在发酵过程中可以大幅提高水果酵素产品的DPPH自由基清除率，由此表明，含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品具有较高的DPPH自由基清除率，因此植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，并且具有高抗氧化性的潜能。
将上述效果实施例1-4得到的应用实施例1-4含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品和对比实施例1-4中的空白水果酵素产品对DPPH自由基清除率作图，所得的柱状图如图4所示，图4中苹果酵素、梨酵素、黄桃酵素、草莓酵素对应于实施例1-4所得的含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011的苹果酵素产品、含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的梨酵素产品、含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的黄桃酵素产品、含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的草莓酵素产品，图4中的空白苹果酵素、空白梨酵素、空白黄桃酵素、空白草莓酵素对应于对比实施例1-4中所得的空白苹果酵素产品、空白梨酵素产品、空白黄桃酵素产品、空白草莓酵素产品，从图4中可以看出含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011的水果酵素产品其DPPH自由基清除率均明显高于自然发酵所得的空白水果酵素产品，且DPPH自由基清除率至少提高40%，由此表明了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCC No.10011可用于水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用。
综上所述，本发明提供的一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SITCCNo.10011，具有很好的DPPH自由基清除率作用，其胞内物质中的DPPH自由基清除率为3.5%，代谢产物中的DPPH自由基清除率为35.8%，因此可在水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用，使水果酵素产品的DPPH自由基清除率大幅提高，至少提高40%。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海应用技术大学
<120> 一种植物乳杆菌及其在水果酵素产品中的应用
<130> 2017
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1477
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)
<400> 1
ggcaagtggg ggcgtgctat acatgcagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60
atcatgattt agcatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 120
agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 180
ggtccgagtt tgaaagatgg cttcagctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 240
tagatggtgg ggtaacggct caccatggcr agtagtagcc gaactgagag aggatcgggc 300
cacattggga ctgagacacg ccaaactcta cggaggccag cagtagggaa tctccacaat 360
ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact 420
ctgttgttaa agaagaacat atctgagagt aactgttcag gtattgacgg gtatttaacc 480
cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540
tccgggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc 600
tttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660
tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720
cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 780
ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840
cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aaggctgaaa 900
ctcaaaggaa tttgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtgggttt aatttcgaag 960
ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa atctaagaga ttagacgttt 1020
cccttcgggg acatggaata caggtgggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttattatca gttgccagca ttaagttggg 1140
cactctggtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1200
tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga gttgcgaact 1260
cgcgagagta agctaatctc ttaaagccat tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc 1320
ctacatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1380
gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg 1440
taacctttag gaaccagccg ctaaggtgac agaatgg 1477
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
cggctacctt gttacgactt 20
Claims (6)
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011，其特征在于，所述植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO: M 2017366。
2.如权利要求1所述的一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011在发酵食品制备中的应用。
3.如权利要求1所述的一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011在水果酵素产品制备中的应用，所述的水果酵素产品为苹果酵素、黄桃酵素、梨酵素或草莓酵素。
4.如权利要求3所述的一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011在水果酵素制备中的应用方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：5-10的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用浓度为1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0-7.0，然后控制温度为105℃进行灭菌10min，然后自然冷却至37-40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩苹果汁、浓缩梨汁、浓缩黄桃汁或浓缩草莓汁；葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为0.5-5g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011菌种一环在MRS琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养24-48h至长出单菌落，即得到平板活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011菌种；
(3)工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)所得的平板活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCCNo.10011菌种一环接入装有50mL MRS肉汤培养基的250mL规格的三角瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养8-16h，得到培养液；
将上述所得的培养液控制转速为4000-6000r/min进行离心15-30min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液经4000-6000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液的加入量以保证所得的工作发酵剂中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
所述的无菌磷酸盐缓冲溶液，按每升计算，含磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，定容到1L，pH7.4，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存待用；
(4)发酵培养
将步骤(3)得到的工作发酵剂接入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为25-35℃进行发酵24-72h，所得的发酵液即为含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011的水果酵素产品；
上述工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为1-5：100。
5.如权利要求4所述的一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011在水果酵素制备中的应用方法，其特征在于：
步骤(1)发酵原料液的制备：
浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为105℃进行灭菌10min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
步骤(2)菌种活化：
在37℃培养箱中培养48h至长出单菌落，得到平板活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SITCC No.10011菌种；
步骤(3)工作发酵剂的制备：
用接种环取步骤(2)所得的平板活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCCNo.10011菌种一环接入装有50mL MRS肉汤培养基的250mL规格的三角瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养12h，得到培养液；
将上述所得的培养液控制转速为5000r/min进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到工作发酵剂；
步骤(4)发酵培养：
将步骤(3)得到的工作发酵剂接入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为30℃进行发酵30h，工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：发酵原料液为1：100。
6.如权利要求3所述的一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011在水果酵素制备中的应用方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：5-10的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用浓度为1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0-7.0，然后控制温度为105℃进行灭菌10min，然后自然冷却至37-40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩苹果汁、浓缩梨汁、浓缩黄桃汁或浓缩草莓汁；葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为0.5-5g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011菌种一环在MRS琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养24-48h至长出单菌落，即得到平板活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011菌种；
然后挑取上述平板活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011菌种并接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下培养10-12h，得到活化一代的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011菌液；
然后将上述所得的活化一代的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCCNo.10011菌液，按体积比为2％的比例，将其接种到MRS液体培养基中，于37℃条件下培养10-12h，得到连续活化两代的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011菌种培养物；
(3)、工作发酵剂的制备
将上述步骤(2)所得的连续活化两代的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCCNo.10011菌种培养物按体积百分比2-5％接种于MRS肉汤液体培养基中，控制温度为37℃进行培养8-16h，得到培养液；
将上述所得的培养液控制温度为4℃，转速为4000-6000r/min进行离心15-30min，离心所得的沉淀用步骤(1)所得的发酵原料液悬浮，即得工作发酵剂；
上述发酵原料液的用量，按最终所得的工作发酵剂中的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SITCC No.10011的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
(4)发酵培养
将步骤(3)得到的工作发酵剂接入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为25-35℃进行发酵24-72h，所得的发酵液即为含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SITCC No.10011的水果酵素产品；
上述工作发酵剂和发酵原料液的用量，按体积比计算，工作发酵剂：
发酵原料液为1-5：100。
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